JPH05302916A

JPH05302916A - 高速液体クロマトグラフにおけるグラジエント装置

Info

Publication number: JPH05302916A
Application number: JP13168392A
Authority: JP
Inventors: Naoki Asakawa; 直樹浅川; Tomohito Watanabe; 知仁渡邊; Yoshiya Oda; 吉哉小田; Yutaka Yoshida; 豊吉田; Tadashi Sato; 忠里
Original assignee: Eisai Co Ltd
Current assignee: Eisai Co Ltd
Priority date: 1992-04-24
Filing date: 1992-04-24
Publication date: 1993-11-16
Anticipated expiration: 2017-07-22
Also published as: JP3304394B2

Abstract

(57)【要約】【目的】安価に構成でき、かつ、多成分の一斉分析を
高い再現性をもって行うことができる高速クロマトグラ
フにおけるグラジエント装置を得る。【構成】第１移動相を供給するラインと第２移動相を
供給するラインの間にサンプルループとミキシング機構
を設け、第１移動相はサンプルループ、ミキシング機構
の順で通過して試料をサンプルループ内へ注入する構成
とし、第２移動相はミキシング機構、サンプルループの
順で通過してカラムに試料を送り込む構成とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、サンプルループ及びス
イッチングカラムを使用して試料の成分分析を行う液体
クロマトグラフにおけるグラジエント装置に関するもの
である。

【０００２】

【従来の技術】従来の高速液体クロマトグラフのグラジ
エント装置は、図８に示したように、容器Ｆ1 、Ｆ2 内
に入れられた移動相Ｌ1 、Ｌ2 をそれぞれ送液する２台
のポンプＰ1 、Ｐ2 をコンピューター等の制御機能で制
御して、ライン１、ライン２に送液する流量を変えるこ
とにより、ライン３における移動相Ｌ1 、Ｌ2 の混合比
を変化させてグラジエント効果を得る手段を採ってい
る。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】上記の方法によると、
例えばライン３で１００μｌ（マイクロリットル）／ｍ
ｉｎの移動相をインジエクターＩを経て分離カラムＣ、
検出器ＭＳへ送液する場合、移動相Ｌ1と移動相Ｌ2 の
比率が９９：１であれば、ライン１に９９μｌ／ｍｉ
ｎ、ライン２に１μｌ／ｍｉｎ送液するようにポンプＰ
1 とポンプＰ2 を制御することになる。しかし、液体ク
ロマトグラフ等に使用されるような比較的安価なポンプ
の流量が保証されるのは、通常、５０μｌ／ｍｉｎ程度
以上であるので、この様なポンプで１μｌ／ｍｉｎを送
液すると、安定した送液が得られないことになる。その
ために正確に１μｌ／ｍｉｎ送液できる精度の高いポン
プが必要となるが、この様なポンプは極めて高価であ
る。また、ポンプＰ1 、Ｐ2 を制御する機構も必要であ
るが、この制御機構も高価なので、従来の方法による
と、再現性の得られる高速クロマトグラフのグラジエン
ト装置は高価なものとなっている。従って、本発明は安
価に構成でき、かつ、多成分の一斉分析を高い再現性を
もって行うことができる高速クロマトグラフにおけるグ
ラジエント装置を得ることを目的としている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】そこで、第１移動相を供
給するラインと第２移動相を供給するラインの間にサン
プルループとミキシング機構を設け、第１移動相はサン
プルループ、ミキシング機構の順で通過してから試料を
サンプルループ内へ注入する構成とし、第２移動相はミ
キシング機構、サンプルループの順で通過してカラムに
試料を送り込む構成とした。また、第２移動相は第１移
動相よりもカラムからの溶出力の強いものを用いるよう
にした。なお、本発明でいうミキシング機構とは、移
動相を貯留して撹拌できる機構を持った手段である。

【０００５】

【作用】第１移動相をサンプリングループ、ミキシング
機構の順で通過させてサンプリングループ内を満たし、
ミキシング機構へ貯留させた後、試料をサンプリングル
ープ内へ注入する。そして２移動相を送液しながらミキ
シング機構で第１移動相と第２移動相の混入を行い、ミ
キシング機構に貯留された移動相の第１移動相に対する
第２移動相の混合比を徐々に増加させる。このとき、第
２移動相は第１移動相よりもカラムからの溶出力の強い
ものを用いれば、混合液は徐々にカラムからの溶出力が
高くなる。この様な混合液でサンプルループから試料を
送り出して分離カラム、検出器へ送ればグラジエント効
果を発揮し、多成分の一斉分析を高精度かつ迅速に行う
ことができる。

【０００６】

【実施例】以下に、本発明の実施例を説明する。図１に
示す様に、第１移動相Ｌ1 を供給するライン１と第２移
動相Ｌ2 を供給するライン２の間にスイッチングバルブ
Ｖ1 を介して、ライン３とライン４を接続してある。ラ
イン１は第１移動相Ｌ1 の入った容器Ｆ1 に接続してあ
る。この第１移動相Ｌ1 は、目的の成分を一時的にカラ
ムに吸着させるための移動相であり、カラムからの溶出
力が弱い移動相などを適宜選択して使用する。ライン１
の途中にはポンプＰ1 が設けてある。ライン２は第２移
動相Ｌ2 の入った容器Ｆ2に接続してある。この第２移
動相Ｌ2には、第１移動相Ｌ1 よりもカラムからの溶出
力が強い移動相を使用する。ライン２の途中にはポンプ
Ｐ2が設けてある。スイッチングバルブＶ1 はラインの
切り替えができる六方バルブであり、図示の実線で示さ
れるように、と、と、との出入口が連通し
ている状態と、点線で示されるように、と、と
、との出入口が連通している状態に適宜切り替え
ができるようになっている。以上のようなスイッチング
バルブＶ1 の出入口にライン１を接続し、出入口に
ライン２が接続してある。また、上記ライン３は出入口
に、ライン４は出入口に接続してある。その他、出
入口には分離カラムＣ、検出器Ｄに続く分離ラインが
接続してあり、検出器Ｄの延長ライン上に、必要に応じ
て質量分析計ＭＳが接続されている。また、出入口に
は第１移動相Ｌ1を排出するためのドレインライン６が
接続してある。

【０００７】ライン３とライン４の間にはスイッチング
バルブＶ2が設けてあり、ライン３はこのスイッチング
バルブＶ2 の出入口に、ライン４は出入口に接続し
てある。また、ライン４の途中にミキシング機構ＭＣが
設けてある。このミキシング機構ＭＣは、移動相を貯留
して攪拌できる機能を持った手段であり、例えば図２や
図３に示すような手段で構成される。図２は、ライン４
の途中に貯留槽１０を形成して、その内部にマグネッチ
ック撹拌器１１の撹拌子１２を投入した手段である。図
３は、ライン４の途中に形成した貯留槽１０の内部に撹
拌羽根１３を配設してモーター１４で回転撹拌する手段
である。なお、ライン４の出入口は図２のように貯留槽
１０の上方に同じ高さに設けるようにしても良いし、図
３のように上下に異なる高さに設けるようにしても良
い。

【０００８】スイッチングバルブＶ2 も、先に説明した
スイッチングバルブＶ1 と同様にラインの切り替えが可
能な六方バルブであり、図１の実線で示されるように、
と、と、との出入口が連通している状態
と、点線で示されるように、と、と、との
出入口が連通している状態に適宜切り替えができるよう
になっている。以上のようなスイッチングバルブＶ2 に
おいて、出入口とを結ぶようにライン７が接続して
あり、このライン７の途中にサンプルループＳＬが設け
られている。その他、出入口に、試料を注入するため
のインジェクターＩを設けたライン８が接続してあり、
出入口には余剰の液を排出するためのライン９が接続
してある。なお、以上のようなスイッチングバルブＶ2
において出入口にインジェクターを直接組み込んでラ
イン８を省略することもできる。即ち、図４に示すよう
に、市販の商品インジェクター（製造元レオダイン）は
出入口と出入口をつなぐライン７の途中にサンプル
ループＳＬがあり、出入口にインジェクターＩが組み
込まれた構成になっているので、この商品を用いても良
い。なお、以上の各ライン１〜９はステンレス管で構成
してある。

【０００９】しかして、図１においてライン１のポンプ
Ｐ1で送液された第１移動相は、スイッチングバルブＶ1
の出入口→ライン３→スイッチングバルブＶ2 の
出入口→ライン７に流入し、サンプルループＳＬを
通過する。こうして、サンプルループＳＬ内を満たした
第１移動相は、更に、スイッチングバルブＶ2 の出入口
→ライン４に流入し、ミキシング機構ＭＣに入って
貯留される。なお、ミキシング機構ＭＣで貯留しきれな
くなった余剰の第１移動相は、スイッチングバルブＶ1
の出入口を通過してライン６から排出される。一
方、ライン２において、ポンプＰ2で移動相Ｌ2を送液し
てスイッチングバルブＶ1 の出入口→ライン５→分
離カラムＣ→検出器Ｄ→必要に応じて質量分析計ＭＳの
順に移動相Ｌ2 を流しておく。次にスイッチングバルブ
Ｖ2 の流路を切り替えてと、と、との出入
口を連通させて、試料をインジェクターＩから注入す
る。注入された試料は、ライン８→スイッチングバルブ
Ｖ2 の出入口を通過して、ライン７に流入し、サン
プルループＳＬ内に入る。余剰の試料及び第１移動相Ｌ
1 は、スイッチングバルブＶ2 の出入口を通り、ラ
イン９から排出される。なお、図４に示したようにスイ
ッチングバルブＶ2の出入口にインジェクターＩを組
み込んだ機構では、注入された試料はスイッチングバル
ブＶ2 の出入口を通過してライン７に流入し、サンプ
ルループＳＬ内に入る。次に、以上のようにして試料が
サンプリングループＳＬ内に入った状態でスイッチング
バルブＶ1 とＶ2 を同時に切り替え、スイッチングバル
ブＶ1 をと、と、との出入口が連通した状
態とし、スイッチングバルブＶ2 をと、と、
との出入口が連通した状態にする。これにより、ポン
プＰ2 で送液された移動相Ｌ2 は、ライン２→スイッチ
ングバルブＶ1 の出入口を通過してライン４に流入
し、ライン４の途中にあるミキシング機構ＭＣへ入る。
ミキシング機構ＭＣ内で、第１移動相Ｌ1 と第２移動相
Ｌ2 は徐々に混合されるが、第２移動相Ｌ2を送液しな
がら混合を行っているので、ミキシング機構ＭＣに貯留
された第２移動相Ｌ2 は、徐々に第１移動相Ｌ1 に対す
る混合比を増し、こうしてグラジエント効果を発揮しな
がら、スイッチングバルブＶ2 の出入口を通過して
ライン７に流入し、ライン７の途中に設けてあるサンプ
ルループＳＬ内の試料を押し出す。押し出された試料は
第１移動相Ｌ1 と第２移動相Ｌ2 との混合液とともにス
イッチングバルブＶ2 の出入口→ライン３→スイッ
チングバルブＶ1の出入口を通過し、ライン５に流
入して分離カラムＣで分離され、検出器Ｄで検出され
る。また、必要に応じて質量分析器ＭＳで測定される。
なお、ポンプＰ1 で送液された第１移動相Ｌ1 は、スイ
ッチングバルブＶ1 の出入口を通過してライン５か
ら排出される。以上により、良好なグラジエント効果を
得ることができ、多成分の一斉分析を高精度かつ迅速に
行うことが可能になる。

【００１０】次に図５は、図１のライン４に設けられて
いたミキシング機構ＭＣを省略し、その代わりにライン
７にミキシング機構ＭＣを設けた手段を示している。そ
の他の構成は図１のものと同様である。ライン７にはミ
キシング機構ＭＣとサンプルループＳＬの両方が設けて
ある。また、先と同様に図４に示すようにスイッチング
バルブＶ2 において出入口にインジェクターを直接組
み込んでライン８を省略してもよい。以上のものにあっ
ては、ライン１においてポンプＰ1 で送液された第１移
動相Ｌ1 は、スイッチングバルブＶ1の出入口→ラ
イン３→スイッチングバルブＶ2 の出入口を通過し
てライン７に流入し、ライン７の途中に設けてあるサン
プルループＳＬ内を満たしてミキシング機構ＭＣ内へ貯
留される。なお、ミキシング機構ＭＣで貯留しきれなく
なった余剰の第１移動相Ｌ1 は、スイッチングバルブＶ
2の出入口→ライン４→スイッチングバルブＶ1 の
出入口を通過してライン６から排出される。一方、
ライン２において、ポンプＰ2 で移動相Ｌ2 を送液して
スイッチングバルブＶ1 の出入口→ライン５→分離
カラムＣ→検出器Ｄ→必要に応じて質量分析計ＭＳの順
に移動相Ｌ2を流しておく。次にスイッチングバルブＶ2
の流路を切り替えてと、と、との出入口
を連通させて、試料をインジェクターＩに注入する。注
入された試料は、ライン８→スイッチングバルブＶ2 の
出入口を通過して、ライン７に流入し、サンプルル
ープＳＬ内へ入る。サンプルループＳＬ内の第１移動層
Ｌ1は、ミキシング機構ＭＣ、スイッチングバルブの出
入口を通過し、ライン９から排出される。次に、以
上のようにして試料がサンプルループＳＬ内に入った状
態で、スイッチングバルブＶ1 とＶ2 を同時に切り替
え、スイッチングバルブＶ1 をと、と、と
の出入口が連通した状態とし、スイッチングバルブＶ2
をと、と、との出入口が連通した状態にす
る。これにより、ポンプＰ2で送液された移動相Ｌ2 は
ライン２→スイッチングバルブＶ1の出入口→ライ
ン４→スイッチングバルブＶ2 の出入口を通過し、
ライン７に流入し、ライン７の途中にあるミキシング機
構ＭＣに入り、ミキシング機構ＭＣ内で徐々に混合され
る。第２移動相Ｌ2 を送液しながら混合を行うので、ミ
キシング機構ＭＣに貯留された移動相Ｌ2 は、徐々に第
１移動相Ｌ1に対する混合比を増し、こうしてグラジエ
ント効果を発揮しながら、サンプルループＳＬ内に試料
を押し出す。押し出された試料は、スイッチングバルブ
Ｖ2の出入口→ライン３→スイッチングバルブＶ1
の出入口を通過してライン５に流入し、分離カラム
Ｃで分離され、検出機Ｄで検出される。また、必要に応
じて質量分析計ＭＳで測定される。なお、ポンプＰ1 で
送液されている第１移動相Ｌ1 は、スイッチングバルブ
Ｖ1 の出入口を通過し、ライン６から排出される。
しかして、以上のような系によっても、先と同様に良好
なグラジエント効果を得ることができ、多成分の一斉分
析を高精度かつ迅速に行うことが可能である。

【００１１】次に図６は、第２移動相Ｌ2を送液するラ
イン２１と、試料と移動相を分析カラムＣ、検出機Ｄへ
送液するライン２２の間に、スイッチングバルブＶを介
して、ライン２３を設けた系を示している。スイッチン
グバルブＶは図１に示したスイッチングバルブＶ1 と同
様のものである。ライン２１は第２移動相Ｌ2 の入った
容器Ｆに接続してあり、ポンプＰの稼働で送液する。ラ
イン２１はスイッチングバルブＶの出入口に接続して
ある。ライン２３は、スイッチングバルブＶの出入口
と出入口をつなぐように接続してあり、ライン２３の
途中にミキシング機構ＭＣとサンプルループＳＬが設け
てある。ミキシング機構ＭＣは例えば図２や図３に示し
たような、移動相を貯留して撹拌できる手段である。ラ
イン２２は、スイッチングバルブＶの出入口と検出器
Ｄをつないでおり、途中に分離カラムＣがある。必要に
応じてライン２２を延長し、検出器Ｄの先に質量分析計
ＭＳをつなぐことも可能である。その他、スイッチング
バルブＶの出入口に試料を注入するための試料注入口
Ｉを設けたライン２４が接続してあり、出入口には余
剰の液を排出するためのライン２５が接続してある。し
かして先ず、インジェクターＩから注射器等により第１
移動相Ｌ1 を注入し、こうして注入された第１移動相Ｌ
1 がライン２４→スイッチングバルブＶの出入口を
通過し、ライン２３に流入する。更に、第１移動相Ｌ1
はサンプルループＳＬを通過し、サンプルループＳＬ内
を満たし、ミキシング機構ＭＣへ貯留される。ミキシン
グ機構ＭＣに貯留しきれなくなった第１移動相Ｌ1は、
スイッチングバルブＶの出入口を通過し、ライン２
５から排出される。次に、試料をインジェクターＩから
注入する。注入された試料はライン２４、スイッチング
バルブＶの出入口を通過し、ライン２３に流入して
サンプルループＳＬ内へ入る。サンプルループＳＬ内の
第１移動相Ｌ1はミキシング機構ＭＣを通過してスイッ
チングバルブＶの出入口を通過し、ライン２５から
排出される。次にスイッチングバルブＶの流路を切り替
えてから、ポンプＰにより第２移動相Ｌ2をライン２１
に送液する。第２移動相Ｌ2はスイッチングバルブＶの
出入口を通過してライン２３に流入し、ミキシング
機構ＭＣに入って第１移動相Ｌ1は徐々に混合される。
このとき第２移動相Ｌ2 は第１移動相Ｌ1 よりも分離カ
ラムＣからの溶出力の強いものを用いる。第２移動相Ｌ
2 を送液しながら混合が行われるので、ミキシング機構
ＭＣに貯留された移動相Ｌ2 は、徐々に第１移動相Ｌ1
に対する混合比を増し、こうしてグラジエント効果を発
揮しながら、スイッチングバルブＶの出入口を通過
してライン２２に入り、分離カラムＣで分離され、検出
器Ｄで検出される。また、必要に応じて質量分析計ＭＳ
で測定される。以上のように構成された系によっても良
好なグラジエント効果を得ることができ、多成分の一斉
分析を高精度かつ迅速に行うことが可能である。

【００１２】（実験例）以下、図１で説明したラインに
おいて、本発明者らが行った実験の結果を示す。安息
香酸メチル、安息香酸エチル、安息香酸プロピル、安息
香酸ブチル、安息香酸ペンチル、安息香酸ヘキシル、安
息香酸ヘプチル、安息香酸オクチルを各々１. ０ｍｇ／
ｍｌ含有する試料を使用し、第１移動相Ｌ1 にアセトニ
トリルと水の３０：７０の割合の混合液を用い、送液流
速１. ０ｍｌ／ｍｉｎの条件とした。また、移動相Ｌ2
はアセトニトリルとエタノールの５０：５０の割合の混
合液を用い、送液流速を２０μｌ／ｍｉｎの条件とし、
分離カラムＣはInertsil ＯＤＳ−２（φ０.７ｍｍ×
１５０ｍｍ）、検出ＵＶ２５４ｍｍを使用した。以上の
条件の元における実験結果を図７に示す。図中、横軸は
分離カラムＣで試料を各成分に分離するのに要した時間
を示し、縦軸はそのように分離された各成分の検出量を
示している。その結果、図７に示すように、非常に良好
な分離が得られた。また、移動相は同じものを用い、送
液流速を１００μｌ／ｍｉｎの条件とし、分離カラムＣ
はInertsil ＯＤＳ−２（φ２. １ｍｍ×２５０ｍｍ）
を用いた時の各成分の溶出時間を１０回繰り返して実験
したところ、各成分の溶出時間の変動係数は０. １％以
下と非常に精度の高いグラジエントが得られた。

【００１３】

【発明の効果】本発明の高速液体クロマトグラフのグラ
ジエント装置によれば以下の効果を得ることができる。（１）グラジエントを安価な装置により得ることができ
る。（２）低流速でのグラジエントは再現性があり、精度が
高いので信頼性のある実験データを得ることができる。（３）高極性から低極性の化合物が同時に分離分析がで
きるため、多成分の一斉分析が可能となる。（４）各成分の分離が向上する。（５）拡散が減少するため、各成分のピークがシャープ
となり高感度となる。（６）高速液体クロマトグラフの各設定条件の設定が容
易になり、特に第２移動相は溶出力の強い溶媒を画一的
に使用するとができる。（７）この様に、経済性、精度、簡便性、分離性及び感
度面が飛躍的に向上するため、実用上極めて優れた価値
を有する。

【図面の簡単な説明】

【図１】グラジエント装置のブロック図

【図２】ミキシング機構の断面図

【図３】ミキシング機構の断面図

【図４】スイッチングバルブＶ2の拡大図

【図５】他の実施例にかかるグラジエント装置のブロッ
ク図

【図６】他の実施例にかかるグラジエント装置のブロッ
ク図

【図７】本発明装置による測定結果を示すグラフ図

【図８】従来技術を示すクロマトグラフのブロック図

【符号の説明】

Ｌ1 第１移動相Ｌ2 第２移動相１第１移動相を供給するライン２第２移動相を供給するラインＳＬサンプルループＭＣミキシング機構

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者吉田豊埼玉県本庄市本庄４−５−18 (72)発明者里忠千葉県我孫子市つくし野７−20−10

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】第１移動相を供給するラインと第２移動
相を供給するラインの間にサンプルループとミキシング
機構を設け、第１移動相はサンプルループ、ミキシング
機構の順で通過してサンプルループ内へ試料を注入する
構成とし、第２移動相はミキシング機構、サンプルルー
プの順で通過してカラムに試料を送り込む構成とした高
速液体クロマトグラフにおけるグラジエント装置。
【請求項２】第２移動相は第１移動相よりもカラムか
らの溶出力の強いものを用いることを特徴とする請求項
１の高速液体クロマトグラフにおけるグラジエント装
置。