JPH05317054A - オキシダーゼ遺伝子 - Google Patents
オキシダーゼ遺伝子Info
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 アセトバクター属菌由来のオキシダーゼ複合
体を構成する構造遺伝子であって、この遺伝子は、オキ
シダーゼ複合体を構成する分子量約３４０００、７２０
００、２１０００、１３０００のタンパク質の構造遺伝
子を含んでいる。 【効果】 アセトバクター属菌の末端オキシダーゼの該
菌での生産性の向上や、改質が可能となる。
体を構成する構造遺伝子であって、この遺伝子は、オキ
シダーゼ複合体を構成する分子量約３４０００、７２０
００、２１０００、１３０００のタンパク質の構造遺伝
子を含んでいる。 【効果】 アセトバクター属菌の末端オキシダーゼの該
菌での生産性の向上や、改質が可能となる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アセトバクター属の微
生物に由来するオキシダーゼ複合体の構造遺伝子および
構造遺伝子を含む遺伝子に関するものである。
生物に由来するオキシダーゼ複合体の構造遺伝子および
構造遺伝子を含む遺伝子に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】アセトバクター属に属する微生物は、エ
タノールやアセトアルデヒドなどアルコール類やアルデ
ヒド類の強い酸化活性を有しており、食酢の製造や脱臭
などの用途に使用されており、また、微生物セルロース
の高生産菌としても使用されている有用な微生物であ
る。アセトバクター属に属する微生物は、グラム陰性の
絶対好気性菌であり、生育に酸素を要求するため、培養
には酸素の供給が必要である。生育に酸素の供給が必要
な理由は、アルコールやアセトアルデヒドなどの酸化な
どによって生じた電子の最終的な電子受容体として酸素
を使用しているためである。
タノールやアセトアルデヒドなどアルコール類やアルデ
ヒド類の強い酸化活性を有しており、食酢の製造や脱臭
などの用途に使用されており、また、微生物セルロース
の高生産菌としても使用されている有用な微生物であ
る。アセトバクター属に属する微生物は、グラム陰性の
絶対好気性菌であり、生育に酸素を要求するため、培養
には酸素の供給が必要である。生育に酸素の供給が必要
な理由は、アルコールやアセトアルデヒドなどの酸化な
どによって生じた電子の最終的な電子受容体として酸素
を使用しているためである。
【０００３】また、電子が酸素に伝達される反応に関与
している電子伝達鎖はチトクロームやユビキノンなどに
よって構成されているが、最も重要な成分は、呼吸鎖末
端に位置し、酸素と生成した電子との反応を触媒するオ
キシダーゼである。
している電子伝達鎖はチトクロームやユビキノンなどに
よって構成されているが、最も重要な成分は、呼吸鎖末
端に位置し、酸素と生成した電子との反応を触媒するオ
キシダーゼである。
【０００４】オキシダーゼは、単に電子伝達鎖の成分と
して重要だけでなく、酸化反応によってエネルギーを獲
得する反応にも関与しており、該微生物の生育上も非常
に重要な酵素である。
して重要だけでなく、酸化反応によってエネルギーを獲
得する反応にも関与しており、該微生物の生育上も非常
に重要な酵素である。
【０００５】従来、アセトバクター属に属する微生物の
末端オキシダーゼについては、Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａら
により、アセトバクター・アセチの１菌株について検討
され、２つのオキシダーゼ（チトクロームａ1とチトク
ロームｏ）が存在すること、培養条件によって主要なオ
キシダーゼが変化すること、２つのオキシダーゼのうち
チトクロームａ1は精製され、酵素学的性質が明らかに
されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ 第８７巻 第９８６３頁 １９９０年。Ｊ．Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ．第１７４巻 第１２２頁 １９９２
年）。上記の２つのオキシダーゼはいずれもユビキノー
ル還元活性を有していることが明らかにされている。
末端オキシダーゼについては、Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａら
により、アセトバクター・アセチの１菌株について検討
され、２つのオキシダーゼ（チトクロームａ1とチトク
ロームｏ）が存在すること、培養条件によって主要なオ
キシダーゼが変化すること、２つのオキシダーゼのうち
チトクロームａ1は精製され、酵素学的性質が明らかに
されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ 第８７巻 第９８６３頁 １９９０年。Ｊ．Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ．第１７４巻 第１２２頁 １９９２
年）。上記の２つのオキシダーゼはいずれもユビキノー
ル還元活性を有していることが明らかにされている。
【０００６】また、類縁であるグルコノバクター属に属
する微生物から、チトクロームｏ型のオキシダーゼが精
製されている（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃ
ｔａ第８９４巻 第３０４頁 １９８７年）。
する微生物から、チトクロームｏ型のオキシダーゼが精
製されている（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃ
ｔａ第８９４巻 第３０４頁 １９８７年）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】アセトバクター属に属
する微生物の呼吸鎖の末端に位置するオキシダーゼにつ
いて上記の知見があるが、アセトバクター属に属する微
生物の合成する主要ユビキノンは、イソブレノイド鎖の
長さの違うＱ9とＱ10の２種類が知られており、菌株に
より主要なユビキノンが異なっている。また、類縁のグ
ルコノバクター属に属する微生物は、種々の生理学的性
質や酵素学的性質を含め遺伝的にアセトバクター属と共
通しているが、Ｑ10を呼吸鎖成分として含有しているな
ど違いも認められている。
する微生物の呼吸鎖の末端に位置するオキシダーゼにつ
いて上記の知見があるが、アセトバクター属に属する微
生物の合成する主要ユビキノンは、イソブレノイド鎖の
長さの違うＱ9とＱ10の２種類が知られており、菌株に
より主要なユビキノンが異なっている。また、類縁のグ
ルコノバクター属に属する微生物は、種々の生理学的性
質や酵素学的性質を含め遺伝的にアセトバクター属と共
通しているが、Ｑ10を呼吸鎖成分として含有しているな
ど違いも認められている。
【０００８】Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａらは、アセトバクタ
ー属およびグルコノバクター属に属する微生物（酢酸菌
と総称されている）の呼吸鎖について検討を加え、前記
のようにオキシダーゼについて基礎的な知見を得ている
が、該酵素の精製が困難であり、しかも含量が低いた
め、該酵素の有効利用は困難であった。また該酵素の生
産性を改良しようとしたり、該酵素そのものを改質する
ことは、たとえばチトクロームａ1は、４つのサブユニ
ットタンパク質から構成される複合体であるため、技術
的に非常に困難であった。
ー属およびグルコノバクター属に属する微生物（酢酸菌
と総称されている）の呼吸鎖について検討を加え、前記
のようにオキシダーゼについて基礎的な知見を得ている
が、該酵素の精製が困難であり、しかも含量が低いた
め、該酵素の有効利用は困難であった。また該酵素の生
産性を改良しようとしたり、該酵素そのものを改質する
ことは、たとえばチトクロームａ1は、４つのサブユニ
ットタンパク質から構成される複合体であるため、技術
的に非常に困難であった。
【０００９】本発明は、アセトバクター属に属する微生
物の末端オキシダーゼの該微生物での生産性の向上や改
質を可能にする技術を提供することを目的としている。
また、本発明の他の目的は、類縁の微生物の改良に該酵
素を利用する手段を提供することにある。
物の末端オキシダーゼの該微生物での生産性の向上や改
質を可能にする技術を提供することを目的としている。
また、本発明の他の目的は、類縁の微生物の改良に該酵
素を利用する手段を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、オキシダ
ーゼを酵素学的に解明しそれらの知見をもとにして該微
生物を改変することは、技術的に非常に困難であるこ
と。一方、アセトバクター属に属する微生物の遺伝子組
み替え技術が著しく進展しており、該微生物の遺伝子が
数多くクローニングされていることに着目し、該酵素を
コードする遺伝子を利用すれば前記の課題を解決できる
との考えに至り、そのために該酵素の構造遺伝子を単離
するため鋭意検討し、本発明を完成した。
ーゼを酵素学的に解明しそれらの知見をもとにして該微
生物を改変することは、技術的に非常に困難であるこ
と。一方、アセトバクター属に属する微生物の遺伝子組
み替え技術が著しく進展しており、該微生物の遺伝子が
数多くクローニングされていることに着目し、該酵素を
コードする遺伝子を利用すれば前記の課題を解決できる
との考えに至り、そのために該酵素の構造遺伝子を単離
するため鋭意検討し、本発明を完成した。
【００１１】すなわち、本発明はアセトバクター属に属
する微生物に由来するオキシダーゼ遺伝子に関するもの
であり、さらに詳しくはオキシダーゼ複合体を構成する
分子量約３４０００のタンパク質の構造遺伝子、オキシ
ダーゼ複合体を構成する分子量約７２０００のタンパク
質の構造遺伝子、オキシダーゼ複合体を構成する分子量
約２１０００のタンパク質の構造遺伝子、オキシダーゼ
複合体を構成する分子量約１３０００のタンパク質の構
造遺伝子およびオキシダーゼ複合体を構成する分子量約
３４０００、約７２０００、約２１０００、約１３００
０のタンパク質の構造遺伝子を含む遺伝子に関する。
する微生物に由来するオキシダーゼ遺伝子に関するもの
であり、さらに詳しくはオキシダーゼ複合体を構成する
分子量約３４０００のタンパク質の構造遺伝子、オキシ
ダーゼ複合体を構成する分子量約７２０００のタンパク
質の構造遺伝子、オキシダーゼ複合体を構成する分子量
約２１０００のタンパク質の構造遺伝子、オキシダーゼ
複合体を構成する分子量約１３０００のタンパク質の構
造遺伝子およびオキシダーゼ複合体を構成する分子量約
３４０００、約７２０００、約２１０００、約１３００
０のタンパク質の構造遺伝子を含む遺伝子に関する。
【００１２】本発明におけるオキシダーゼ複合体は、ア
セトバクター属に属する微生物から実施例１に示すよう
な方法などで精製される比活性が１３５ユニットであ
り、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で４つのサブユニットに
解離し、各サブユニットの分子量が約７２０００、約３
４０００、約２１０００、約１３０００であり、ユビキ
ノンと反応性を示し、ヘムａ及びヘムｂを有するタンパ
ク質である。該タンパク質は、Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａら
の報告するＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ ＩＦ
Ｏ ３２８４のチトクロームａ1とは、ドデシル硫酸ナ
トリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で算出され
る各サブユニットの分子量がことなる以外は、調べた限
り同一の性質を示す。
セトバクター属に属する微生物から実施例１に示すよう
な方法などで精製される比活性が１３５ユニットであ
り、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で４つのサブユニットに
解離し、各サブユニットの分子量が約７２０００、約３
４０００、約２１０００、約１３０００であり、ユビキ
ノンと反応性を示し、ヘムａ及びヘムｂを有するタンパ
ク質である。該タンパク質は、Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａら
の報告するＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ ＩＦ
Ｏ ３２８４のチトクロームａ1とは、ドデシル硫酸ナ
トリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で算出され
る各サブユニットの分子量がことなる以外は、調べた限
り同一の性質を示す。
【００１３】該酵素の構造遺伝子を含む遺伝子断片は、
該酵素を生産するアセトバクター属に属する微生物の保
有する全ＤＮＡから常法により単離することができる。
該酵素を生産するアセトバクター属に属する微生物とし
ては、たとえばアセトバクター・アセチ Ｎｏ．１０２
３（ＦＥＲＭ ＢＰ−２２８７）、アセトバクター・ア
セチ ＩＦＯ３２８４、アセトバクター・アセチ・サブ
スピーシズ・キシリナム ＩＦＯ３２８８、アセトバク
ター・アルトアセチゲネス ＭＨ−２４（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−４９１）、アセトバクター・パストリアヌス ＩＦ
Ｏ３２２３などが挙げられる。
該酵素を生産するアセトバクター属に属する微生物の保
有する全ＤＮＡから常法により単離することができる。
該酵素を生産するアセトバクター属に属する微生物とし
ては、たとえばアセトバクター・アセチ Ｎｏ．１０２
３（ＦＥＲＭ ＢＰ−２２８７）、アセトバクター・ア
セチ ＩＦＯ３２８４、アセトバクター・アセチ・サブ
スピーシズ・キシリナム ＩＦＯ３２８８、アセトバク
ター・アルトアセチゲネス ＭＨ−２４（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−４９１）、アセトバクター・パストリアヌス ＩＦ
Ｏ３２２３などが挙げられる。
【００１４】全ＤＮＡから該酵素をコードする遺伝子を
単離する方法としては、たとえば該酵素のアミノ酸配列
の一部を決定し、決定したアミノ酸配列に対応する合成
ＤＮＡを調製し、プローブとして利用してサザン・ハイ
ブリダーゼーションなどにより目的の遺伝子を有するク
ローンを選択する方法や該酵素に対する抗体を調製し、
抗原抗体反応を利用して目的遺伝子を保有するクローン
を選択する方法、あるいは実施例３に示されているよう
なオキシダーゼの構造遺伝子に共通して存在する配列や
該酵素のアミノ酸配列の分析で決定された２ケ所の部分
配列をもとに対応するＤＮＡを合成し、合成したプライ
マーを用いて遺伝子増幅法（ポリメラーゼチェイン法、
ＰＣＲ法）で該酵素をコードする遺伝子領域を特異的に
増幅し、目的の遺伝子を含む断片を取得する方法などが
あり、該酵素の構造遺伝子を含む遺伝子断片を単離する
ことができる。
単離する方法としては、たとえば該酵素のアミノ酸配列
の一部を決定し、決定したアミノ酸配列に対応する合成
ＤＮＡを調製し、プローブとして利用してサザン・ハイ
ブリダーゼーションなどにより目的の遺伝子を有するク
ローンを選択する方法や該酵素に対する抗体を調製し、
抗原抗体反応を利用して目的遺伝子を保有するクローン
を選択する方法、あるいは実施例３に示されているよう
なオキシダーゼの構造遺伝子に共通して存在する配列や
該酵素のアミノ酸配列の分析で決定された２ケ所の部分
配列をもとに対応するＤＮＡを合成し、合成したプライ
マーを用いて遺伝子増幅法（ポリメラーゼチェイン法、
ＰＣＲ法）で該酵素をコードする遺伝子領域を特異的に
増幅し、目的の遺伝子を含む断片を取得する方法などが
あり、該酵素の構造遺伝子を含む遺伝子断片を単離する
ことができる。
【００１５】アミノ酸配列の決定は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
法で各サブユニットに分離後、各サブユニットタンパク
質を含むゲルを切り出し、切り出したゲルから電気透析
法などにより目的タンパク質を抽出する。抽出したタン
パク質はそのままあるいはＣＮＢｒや特異的に切断する
プロテアーゼ（ペプチダーゼ）などで切断後、切断物を
ゲル濾過法などで分画して得られる分取物をアミノ酸シ
ークエンサーなどを用いる通常の方法により、アミノ末
端のアミノ酸配列を決定できる。
法で各サブユニットに分離後、各サブユニットタンパク
質を含むゲルを切り出し、切り出したゲルから電気透析
法などにより目的タンパク質を抽出する。抽出したタン
パク質はそのままあるいはＣＮＢｒや特異的に切断する
プロテアーゼ（ペプチダーゼ）などで切断後、切断物を
ゲル濾過法などで分画して得られる分取物をアミノ酸シ
ークエンサーなどを用いる通常の方法により、アミノ末
端のアミノ酸配列を決定できる。
【００１６】また、決定されたアミノ酸配列に対応する
ＤＮＡの合成は、ＤＮＡシンセサイザーなどを使用し、
常法に従えばよい。
ＤＮＡの合成は、ＤＮＡシンセサイザーなどを使用し、
常法に従えばよい。
【００１７】該酵素に対する抗体は、たとえば“Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”第７３巻、第
４６頁（１９８１年）の方法にしたがって得ることがで
きる。なお、該酵素とある程度の相同性を有するタンパ
ク質を大腸菌などでは生産しており、抗原抗体反応を利
用して目的クローンを選択する場合には、偽反応のため
に陽性と検出されることがあるので、特に反応性の高い
クローンを選択するように注意する必要がある。
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”第７３巻、第
４６頁（１９８１年）の方法にしたがって得ることがで
きる。なお、該酵素とある程度の相同性を有するタンパ
ク質を大腸菌などでは生産しており、抗原抗体反応を利
用して目的クローンを選択する場合には、偽反応のため
に陽性と検出されることがあるので、特に反応性の高い
クローンを選択するように注意する必要がある。
【００１８】また、サザンハイブリダイゼーションなど
ＤＮＡの相同性を指標として目的クローンを選択する場
合にも、同様な擬陽性のクローンが検出されるため、ハ
イブリダイゼーションの条件を適切に選択する必要があ
る。
ＤＮＡの相同性を指標として目的クローンを選択する場
合にも、同様な擬陽性のクローンが検出されるため、ハ
イブリダイゼーションの条件を適切に選択する必要があ
る。
【００１９】ＰＣＲを利用する場合には、大腸菌などの
他の微生物由来のＤＮＡ汚染の可能性は非常に低いた
め、前記のような擬陽性のクローンが得られる場合は少
ない。
他の微生物由来のＤＮＡ汚染の可能性は非常に低いた
め、前記のような擬陽性のクローンが得られる場合は少
ない。
【００２０】該酵素の構造遺伝子全長は、前記の方法で
得られた該酵素をコードする遺伝子をプローブとして、
該微生物の全ＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、切断物
をサザンハイブリダイゼーション法に供し、プローブ遺
伝子とハイブリダイズする該酵素の構造遺伝子を有する
遺伝子断片を常法により単離する方法やコスミッドベク
ターやファージベクターなどを使用し、あらかじめ大腸
菌等の宿主で遺伝子バンクを作成し、コロニーハイブリ
ダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションなど
の手法により、該酵素の構造遺伝子を有するベクターを
保持するクローンを選択する方法などにより全長を単離
できる。
得られた該酵素をコードする遺伝子をプローブとして、
該微生物の全ＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、切断物
をサザンハイブリダイゼーション法に供し、プローブ遺
伝子とハイブリダイズする該酵素の構造遺伝子を有する
遺伝子断片を常法により単離する方法やコスミッドベク
ターやファージベクターなどを使用し、あらかじめ大腸
菌等の宿主で遺伝子バンクを作成し、コロニーハイブリ
ダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションなど
の手法により、該酵素の構造遺伝子を有するベクターを
保持するクローンを選択する方法などにより全長を単離
できる。
【００２１】得られた遺伝子の塩基配列の決定は、常法
にしたがえばよく、たとえばＭ１３ファージを用いたジ
デオキシ法によればよい。
にしたがえばよく、たとえばＭ１３ファージを用いたジ
デオキシ法によればよい。
【００２２】このようにして単離したオキシダーゼ複合
体の各サブユニットをコードする構造遺伝子は、染色体
の特定領域にクラスターをなして存在しており、しかも
オペロンを形成しているため、複合体として発現させる
には４つのサブユニットをコードする遺伝子を別々のプ
ロモーターを使用して発現させる必要はなく、該酵素の
４つのサブユニットをコードする遺伝子が存在する遺伝
子断片を単一のプロモーターで発現させることが可能で
ある。
体の各サブユニットをコードする構造遺伝子は、染色体
の特定領域にクラスターをなして存在しており、しかも
オペロンを形成しているため、複合体として発現させる
には４つのサブユニットをコードする遺伝子を別々のプ
ロモーターを使用して発現させる必要はなく、該酵素の
４つのサブユニットをコードする遺伝子が存在する遺伝
子断片を単一のプロモーターで発現させることが可能で
ある。
【００２３】単離した該酵素の遺伝子を用いて、該酵素
タンパク質を宿主内で発現させるためには、宿主内で機
能するプロモーター活性を有する遺伝子と該構造遺伝子
を発現可能な形で連結させる必要がある。
タンパク質を宿主内で発現させるためには、宿主内で機
能するプロモーター活性を有する遺伝子と該構造遺伝子
を発現可能な形で連結させる必要がある。
【００２４】アセトバクター属やグルコノバクター属に
属する微生物内でタンパク質を生成させるために用いる
プロモーターとしては、該酵素の構造遺伝子本来のプロ
モーターも使用できるし、酢酸菌由来の他のプロモータ
ー活性を持つ遺伝子や酢酸菌で発現可能な大腸菌プラス
ミドｐＢＲ３２２のアンピシリン耐性遺伝子や大腸菌プ
ラスミドｐＡＣＹＣ１７７のカナマイシン耐性遺伝子や
大腸菌プラスミドｐＡＣＹＣ１８４のクロラムフェニコ
ール耐性遺伝子、大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子
のプロモーターなど酢酸菌以外の由来のプロモーター活
性を有する遺伝子も使用できる。
属する微生物内でタンパク質を生成させるために用いる
プロモーターとしては、該酵素の構造遺伝子本来のプロ
モーターも使用できるし、酢酸菌由来の他のプロモータ
ー活性を持つ遺伝子や酢酸菌で発現可能な大腸菌プラス
ミドｐＢＲ３２２のアンピシリン耐性遺伝子や大腸菌プ
ラスミドｐＡＣＹＣ１７７のカナマイシン耐性遺伝子や
大腸菌プラスミドｐＡＣＹＣ１８４のクロラムフェニコ
ール耐性遺伝子、大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子
のプロモーターなど酢酸菌以外の由来のプロモーター活
性を有する遺伝子も使用できる。
【００２５】また、酢酸菌内にオキシダーゼ複合体の構
造遺伝子を保持させるためのベクターとしては、たとえ
ば特開昭６０−９４８８号に開示されているｐＴＡ５０
０１（Ａ）、ｐＴＡ５００１（Ｂ）や染色体組み込み型
ベクターであるｐＭＶＬ１（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．，第５２巻 第３１２５頁 １９８８年）や酢
酸菌に導入可能な広宿主域ベクターＲＰ４：Ｍｕ．ＲＰ
４．ｐＲＫ２０１３．ＲＳＦ１０１０なども使用でき
る。
造遺伝子を保持させるためのベクターとしては、たとえ
ば特開昭６０−９４８８号に開示されているｐＴＡ５０
０１（Ａ）、ｐＴＡ５００１（Ｂ）や染色体組み込み型
ベクターであるｐＭＶＬ１（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．，第５２巻 第３１２５頁 １９８８年）や酢
酸菌に導入可能な広宿主域ベクターＲＰ４：Ｍｕ．ＲＰ
４．ｐＲＫ２０１３．ＲＳＦ１０１０なども使用でき
る。
【００２６】前記のプロモーターやベクターの使用にあ
たっては、宿主内でオキシダーゼ遺伝子を過剰量発現さ
せると、過剰に生産された該酵素タンパク質が宿主に影
響を及ぼすため、生育を阻害したり、死滅する場合もあ
るので、発現量やコピー数を適切に設定する必要があ
る。該酵素の各サブユニットの発現量は、宿主によって
は既に十分量含有しているサブユニットもあるので、こ
の場合にはサブユニット毎にプロモーターを変えたり、
各サブユニットをコードする構造遺伝子をコピー数の違
うベクターに組み込み、各サブユニットの発現量を適切
に制御する必要がある。
たっては、宿主内でオキシダーゼ遺伝子を過剰量発現さ
せると、過剰に生産された該酵素タンパク質が宿主に影
響を及ぼすため、生育を阻害したり、死滅する場合もあ
るので、発現量やコピー数を適切に設定する必要があ
る。該酵素の各サブユニットの発現量は、宿主によって
は既に十分量含有しているサブユニットもあるので、こ
の場合にはサブユニット毎にプロモーターを変えたり、
各サブユニットをコードする構造遺伝子をコピー数の違
うベクターに組み込み、各サブユニットの発現量を適切
に制御する必要がある。
【００２７】
【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明す
る。
る。
【００２８】実施例１（末端オキシダーゼの精製と性
質） グルコース３％、酵母エキス０．５％およびポリペプト
ン０．２％を含む液体培地を５００ｍｌ容の坂口フラス
コに１００ｍｌ分注し、オートクレーブ中で１２０℃、
１５分間殺菌した。冷却後エタノールを３％になるよう
添加し、これにアセトバクター アセチ（Ａｃｅｔｏｂ
ａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ）Ｎｏ．１０２３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−２２８７）を１白金耳接種し、往復振とう機（１
２０往復／分）で３０℃、２日間培養した。
質） グルコース３％、酵母エキス０．５％およびポリペプト
ン０．２％を含む液体培地を５００ｍｌ容の坂口フラス
コに１００ｍｌ分注し、オートクレーブ中で１２０℃、
１５分間殺菌した。冷却後エタノールを３％になるよう
添加し、これにアセトバクター アセチ（Ａｃｅｔｏｂ
ａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ）Ｎｏ．１０２３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−２２８７）を１白金耳接種し、往復振とう機（１
２０往復／分）で３０℃、２日間培養した。
【００２９】同じ組成の培地２０Ｌを３０Ｌのジャーフ
ァーメンターで作製し、前記の培養液１Ｌを接種し、６
Ｌ／分で通気し、攪はん（６００ｒｐｍ）しながら３０
℃、３０時間培養した。
ァーメンターで作製し、前記の培養液１Ｌを接種し、６
Ｌ／分で通気し、攪はん（６００ｒｐｍ）しながら３０
℃、３０時間培養した。
【００３０】培養終了後、培養液を５℃にて遠心分離
（８０００×ｇ．１０分）することにより湿重量３５ｇ
の菌体を得た。上記培養をさらに２度実施することによ
り合計１００ｇの湿菌体を得た。
（８０００×ｇ．１０分）することにより湿重量３５ｇ
の菌体を得た。上記培養をさらに２度実施することによ
り合計１００ｇの湿菌体を得た。
【００３１】この湿菌体を５０ｍＭリン酸カリウム緩衝
液（ｐＨ６．５）に懸濁し、２０，０００ｐｓｉでフレ
ンチプレス（アメリカン インストウルメント カンパ
ニー製）を通し菌体を破砕したのち、破砕液を６８，０
００×ｇ、４℃で６０分間超遠心分離し、沈澱物（膜画
分）を得た。
液（ｐＨ６．５）に懸濁し、２０，０００ｐｓｉでフレ
ンチプレス（アメリカン インストウルメント カンパ
ニー製）を通し菌体を破砕したのち、破砕液を６８，０
００×ｇ、４℃で６０分間超遠心分離し、沈澱物（膜画
分）を得た。
【００３２】末端オキシダーゼ活性の測定および蛋白の
定量はＭａｔｓｕｓｈｉｔａらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．第８７巻、第９８６
３頁、１９９０年）に準じて行った。膜画分の末端オキ
シダーゼの比活性は２．３単位／ｍｇ蛋白で、全活性は
１２０００単位であった。
定量はＭａｔｓｕｓｈｉｔａらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．第８７巻、第９８６
３頁、１９９０年）に準じて行った。膜画分の末端オキ
シダーゼの比活性は２．３単位／ｍｇ蛋白で、全活性は
１２０００単位であった。
【００３３】この沈澱物を５０ｍＭリン酸カリウム緩衝
液（ｐＨ６．５）に懸濁して全容量を２００ｍｌとし、
この懸濁液に２０％（Ｗ／Ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
溶液１０ｍｌ添加し、４℃で１時間攪拌した後、超遠心
分離（６８，０００×ｇ、４℃、６０分間）を行い沈澱
画分（膜残渣）を得た。この膜残渣を５０ｍＭリン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁して全容量を２００
ｍｌとしたのち、２０％（Ｗ／Ｖ）ｎ−オクチル−β−
Ｄ−グルコピラノシド溶液１０ｍｌを加えて４℃で１時
間攪拌した後、超遠心分離（６８，０００×ｇ、４℃、
６０分間）を行い上清液を得た。
液（ｐＨ６．５）に懸濁して全容量を２００ｍｌとし、
この懸濁液に２０％（Ｗ／Ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
溶液１０ｍｌ添加し、４℃で１時間攪拌した後、超遠心
分離（６８，０００×ｇ、４℃、６０分間）を行い沈澱
画分（膜残渣）を得た。この膜残渣を５０ｍＭリン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁して全容量を２００
ｍｌとしたのち、２０％（Ｗ／Ｖ）ｎ−オクチル−β−
Ｄ−グルコピラノシド溶液１０ｍｌを加えて４℃で１時
間攪拌した後、超遠心分離（６８，０００×ｇ、４℃、
６０分間）を行い上清液を得た。
【００３４】この上清液約２００ｍｌを５０ｍＭリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）であらかじめ平衡化した
ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｃ（樹脂量１００ｍｌ）を
充填したカラム（カラムサイズ ３×１５ｃｍ）に注入
し、最初に０．５％（Ｗ／Ｖ）ｎ−オクチル−β−Ｄ−
グルコピラノシドを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ６．５）を全量２００ｍｌ、流速４０ｍｌ／時間
で流して未吸着蛋白を溶出し、次に０．５％（Ｗ／Ｖ）
ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドを含む１５０
ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を全量３００
ｍｌ、流速４０ｍｌ／時間で流して不純蛋白を溶出し、
最後に１％（Ｗ／Ｖ）ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピ
ラノシドを含む１５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
６．５）を用いて全量３００ｍｌ、流速４０ｍｌ／時間
でオキシダーゼを溶出した。
カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）であらかじめ平衡化した
ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｃ（樹脂量１００ｍｌ）を
充填したカラム（カラムサイズ ３×１５ｃｍ）に注入
し、最初に０．５％（Ｗ／Ｖ）ｎ−オクチル−β−Ｄ−
グルコピラノシドを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ６．５）を全量２００ｍｌ、流速４０ｍｌ／時間
で流して未吸着蛋白を溶出し、次に０．５％（Ｗ／Ｖ）
ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドを含む１５０
ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を全量３００
ｍｌ、流速４０ｍｌ／時間で流して不純蛋白を溶出し、
最後に１％（Ｗ／Ｖ）ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピ
ラノシドを含む１５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
６．５）を用いて全量３００ｍｌ、流速４０ｍｌ／時間
でオキシダーゼを溶出した。
【００３５】２００ｍｌの位置に溶出した活性画分を集
めて濃縮し、比活性１３４単位／ｍｇ蛋白の活性を示す
末端オキシダーゼ標品５６ｍｇを得た。膜画分の全活性
を１００％としたときの回収率は６３％であった。
めて濃縮し、比活性１３４単位／ｍｇ蛋白の活性を示す
末端オキシダーゼ標品５６ｍｇを得た。膜画分の全活性
を１００％としたときの回収率は６３％であった。
【００３６】得られた標品は、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（７．５％アクリルアミド、ｐＨ８．５）で単
一のバンドを与え、またＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（アクリルアミド濃度４−２０％グラディエ
ント、ｐＨ８．３）によって、約７２０００、約３４０
００、約２１０００、および約１３０００の４つのサブ
ユニットから構成されていることが明らかになった。
電気泳動（７．５％アクリルアミド、ｐＨ８．５）で単
一のバンドを与え、またＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（アクリルアミド濃度４−２０％グラディエ
ント、ｐＨ８．３）によって、約７２０００、約３４０
００、約２１０００、および約１３０００の４つのサブ
ユニットから構成されていることが明らかになった。
【００３７】また精製酵素標品をジチオナイト１ｍｇを
添加することによって還元すると、５６２ｎｍおよび４
２９ｎｍに吸収極大がみられ、ヘムｂを含有する末端オ
キシダーゼであることを確認した。
添加することによって還元すると、５６２ｎｍおよび４
２９ｎｍに吸収極大がみられ、ヘムｂを含有する末端オ
キシダーゼであることを確認した。
【００３８】また、生化学実験講座第１２巻『エネルギ
ー代謝と生体酸化（下）』第５４５頁（１９７６年）
（株式会社東京化学同人）に記載の方法にしたがってピ
リジンフェロヘムクロムを調製し、α吸収帯の位置を調
べたところ、５５６ｎｍおよび５８７ｎｍに吸収極大が
見られ、前者はヘムｂ、後者はヘムａに由来することか
ら、ヘムａとヘムｂを含有する蛋白であることを確認し
た。
ー代謝と生体酸化（下）』第５４５頁（１９７６年）
（株式会社東京化学同人）に記載の方法にしたがってピ
リジンフェロヘムクロムを調製し、α吸収帯の位置を調
べたところ、５５６ｎｍおよび５８７ｎｍに吸収極大が
見られ、前者はヘムｂ、後者はヘムａに由来することか
ら、ヘムａとヘムｂを含有する蛋白であることを確認し
た。
【００３９】実施例２（アミノ酸配列およびアミノ酸組
成の決定） 実施例１で得た精製標品２ｍｇをＳＤＳ−ポリアクリル
アミド電気泳動に供し、４つのサブユニットに解離後、
分子量約７２０００のサブユニットと分子量約３４００
０のサブユニットを常法によりゲルから溶出し、以下に
示す方法によりそれぞれのＮ末端アミノ酸配列とアミノ
酸組成を決定した。
成の決定） 実施例１で得た精製標品２ｍｇをＳＤＳ−ポリアクリル
アミド電気泳動に供し、４つのサブユニットに解離後、
分子量約７２０００のサブユニットと分子量約３４００
０のサブユニットを常法によりゲルから溶出し、以下に
示す方法によりそれぞれのＮ末端アミノ酸配列とアミノ
酸組成を決定した。
【００４０】得られた各々の標品１００μｇをプロテイ
ンシーケンサー（島津製作所製 ＰＳＱ−１）でＮ末端
アミノ酸配列分析を行ったところ、分子量約７２０００
のサブユニットはＮ末端がブロックされているために配
列決定ができなかった。また分子量約３４０００のサブ
ユニットは、Ｎ末端よりＣｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓ
ｐ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−と決定
された。なおここでＣｙｓはＬ−システイン、Ｇｌｕは
Ｌ−グルタミン酸、ＬｅｕはＬ−ロイシン、ＡｓｐはＬ
−アスパラギン酸、ＶａｌはＬ−バリン、ＰｒｏはＬ−
プロリン、ＬｙｓはＬ−リジンを示している。
ンシーケンサー（島津製作所製 ＰＳＱ−１）でＮ末端
アミノ酸配列分析を行ったところ、分子量約７２０００
のサブユニットはＮ末端がブロックされているために配
列決定ができなかった。また分子量約３４０００のサブ
ユニットは、Ｎ末端よりＣｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓ
ｐ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−と決定
された。なおここでＣｙｓはＬ−システイン、Ｇｌｕは
Ｌ−グルタミン酸、ＬｅｕはＬ−ロイシン、ＡｓｐはＬ
−アスパラギン酸、ＶａｌはＬ−バリン、ＰｒｏはＬ−
プロリン、ＬｙｓはＬ−リジンを示している。
【００４１】また各々の標品１０μｇを６Ｎ塩酸、１１
０℃の条件で２４時間加水分解し、アミノ酸分析計（日
立製作所製 Ｌ−８５００型）を用いアミノ酸分析を行
ったところ、下記の表１に示されるような組成であるこ
とが分かった。
０℃の条件で２４時間加水分解し、アミノ酸分析計（日
立製作所製 Ｌ−８５００型）を用いアミノ酸分析を行
ったところ、下記の表１に示されるような組成であるこ
とが分かった。
【００４２】
【表１】
【００４３】実施例３（末端オキシダーゼ遺伝子の一部
クローニング） 微生物および高等生物のチトクロームｃオキシダーゼに
見出されているアミノ酸の保存配列をもとに図１に示す
２種類のプライマー（プライマー１およびプライマー
２）をＤＮＡシンセサイザー（アブライドバイオシステ
ムズ社製 ＤＮＡシンセサイザー３９１型）で合成し
た。
クローニング） 微生物および高等生物のチトクロームｃオキシダーゼに
見出されているアミノ酸の保存配列をもとに図１に示す
２種類のプライマー（プライマー１およびプライマー
２）をＤＮＡシンセサイザー（アブライドバイオシステ
ムズ社製 ＤＮＡシンセサイザー３９１型）で合成し
た。
【００４４】作製したプライマー（各約１μｇ）を用
い、テンプレートＤＮＡとして常法により調製したＡｃ
ｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ Ｎｏ．１０２３（Ｆ
ＥＲＭＢＰ−２２８７）の全ＤＮＡを約１０ｎｇ使用
し、全容量１００μｌとし、Ｔａｑ ポリメラーゼを使
い常法に従い、９４℃で１．５分間、続いて３７℃で２
分間、さらに７４℃で２分間処理を１サイクルとするポ
リメラーゼチエインリアクションを２５サイクル繰り返
し、オキシダーゼ遺伝子の増幅をおこなった。
い、テンプレートＤＮＡとして常法により調製したＡｃ
ｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ Ｎｏ．１０２３（Ｆ
ＥＲＭＢＰ−２２８７）の全ＤＮＡを約１０ｎｇ使用
し、全容量１００μｌとし、Ｔａｑ ポリメラーゼを使
い常法に従い、９４℃で１．５分間、続いて３７℃で２
分間、さらに７４℃で２分間処理を１サイクルとするポ
リメラーゼチエインリアクションを２５サイクル繰り返
し、オキシダーゼ遺伝子の増幅をおこなった。
【００４５】反応液の一部をアガロースゲル電気泳動に
供し、約０．５ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されていること
を確認した。この増幅されたＤＮＡをｐＵＣ９のＳａｍ
Ｉサイトへ常法に従いクローン化した。
供し、約０．５ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されていること
を確認した。この増幅されたＤＮＡをｐＵＣ９のＳａｍ
Ｉサイトへ常法に従いクローン化した。
【００４６】クローン化した約０．５ｋｂＤＮＡ断片の
塩基配列をＭ１３を用いたダイデオキシ法（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，第７４巻、第５
４６３−５４６７頁、１９７７年）に従い決定したとこ
ろ配列表の配列番号１に示すような塩基配列であった。
この配列からコードされるアミノ酸配列を他のバクテリ
ア由来のチトクロームｃオキシダーゼのものと比較した
ところ、５０−６０％の相同性を示し、増幅されたＤＮ
Ａが末端オキシダーゼの一部をコードすることを確認し
た。
塩基配列をＭ１３を用いたダイデオキシ法（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，第７４巻、第５
４６３−５４６７頁、１９７７年）に従い決定したとこ
ろ配列表の配列番号１に示すような塩基配列であった。
この配列からコードされるアミノ酸配列を他のバクテリ
ア由来のチトクロームｃオキシダーゼのものと比較した
ところ、５０−６０％の相同性を示し、増幅されたＤＮ
Ａが末端オキシダーゼの一部をコードすることを確認し
た。
【００４７】実施例４（オキシダーゼ遺伝子全長のクロ
ーニング） 次に、前記で得られた約０．５ｋｂの遺伝子断片をプロ
ーブとして全長のクローニングを行った。まずＡｃｅｔ
ｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ Ｎｏ．１０２３のコスミ
ドバンクを、Ｆｕｋａｙａらの方法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．，第１７２巻、第２０９６−２１０４頁、１９
９０年）に従って大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１）を
宿主として作製した。
ーニング） 次に、前記で得られた約０．５ｋｂの遺伝子断片をプロ
ーブとして全長のクローニングを行った。まずＡｃｅｔ
ｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ Ｎｏ．１０２３のコスミ
ドバンクを、Ｆｕｋａｙａらの方法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．，第１７２巻、第２０９６−２１０４頁、１９
９０年）に従って大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１）を
宿主として作製した。
【００４８】次にベーリンガー マンハイム社製Ｇｅｎ
ｉｕｓ Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ＤＮＡ Ｌａ
ｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを
用いて標識化した前記の約０．５ｋｂの断片をプローブ
として用い、コスミドバンクを構成する各クローンのプ
ラスミドＤＮＡを常法により調製し、得られたＤＮＡを
ＰｓｔＩで切断したものをターゲットＤＮＡとしてサザ
ンハイブリダイゼーション法を行い、コスミドバンクよ
りポジティブクローン１株（保有するコスミドＤＮＡを
ｐＭＣＯＸ８と命名）を得た。
ｉｕｓ Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ＤＮＡ Ｌａ
ｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを
用いて標識化した前記の約０．５ｋｂの断片をプローブ
として用い、コスミドバンクを構成する各クローンのプ
ラスミドＤＮＡを常法により調製し、得られたＤＮＡを
ＰｓｔＩで切断したものをターゲットＤＮＡとしてサザ
ンハイブリダイゼーション法を行い、コスミドバンクよ
りポジティブクローン１株（保有するコスミドＤＮＡを
ｐＭＣＯＸ８と命名）を得た。
【００４９】このｐＭＣＯＸ８は、ベクター以外に約３
０ｋｂの遺伝子断片を有していた。次に約３０ｋｂの遺
伝子断片をＫｐｎＩで切断し、サザンハイブリダイゼー
ション法により、約０．５ｋｂ断片とハイブリダイズし
た約４．３ｋｂの断片をｐＵＣ１８のＫｐｎＩサイトに
クローニングした。
０ｋｂの遺伝子断片を有していた。次に約３０ｋｂの遺
伝子断片をＫｐｎＩで切断し、サザンハイブリダイゼー
ション法により、約０．５ｋｂ断片とハイブリダイズし
た約４．３ｋｂの断片をｐＵＣ１８のＫｐｎＩサイトに
クローニングした。
【００５０】この断片の制限酵素地図は常法により図２
のように決定された。
のように決定された。
【００５１】約４．３ｋｂのＫｐｎＩ断片の塩基配列を
ダイデオキシ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，第７４巻、第５４６３−５４６７頁、１９
７７年）により決定した。
ダイデオキシ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，第７４巻、第５４６３−５４６７頁、１９
７７年）により決定した。
【００５２】決定された塩基配列をもとにコードするタ
ンパク質のアミノ酸配列を決定したところ、分子量約７
２０００と分子量３４０００のサブユニットに対応する
と考えられるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）
が存在しており、しかも分子量約２１０００のサブユニ
ットに対応すると推定されるオープンリーディリングフ
レームも存在していた。
ンパク質のアミノ酸配列を決定したところ、分子量約７
２０００と分子量３４０００のサブユニットに対応する
と考えられるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）
が存在しており、しかも分子量約２１０００のサブユニ
ットに対応すると推定されるオープンリーディリングフ
レームも存在していた。
【００５３】また分子量約１３０００のサブユニットに
対応すると推定されるオープンリーディリングフレーム
も見いだされたが、そのＣ末端をコードする遺伝子の一
部が欠失していると推定された。そこで、分子量約１３
０００のサブユニットのＣ末端部分を完全に保有する遺
伝子断片を以下の方法でクローニングした。
対応すると推定されるオープンリーディリングフレーム
も見いだされたが、そのＣ末端をコードする遺伝子の一
部が欠失していると推定された。そこで、分子量約１３
０００のサブユニットのＣ末端部分を完全に保有する遺
伝子断片を以下の方法でクローニングした。
【００５４】上記の約４．３ｋｂのＫｐｎＩ断片中の分
子量約１３０００のサブユニットをコードする遺伝子を
含む約０．７ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ断片（図２参
照）をプローブとして、前記と同様な方法でコスミドバ
ンクよりプローブとハイブリダイズするプラスミドを単
離した。単離したプラスミドの挿入断片からサザンハイ
ブリダイゼーションでプローブと特異的にハイブリダイ
ズした約５ｋｂのＣｌａＩ断片をｐＵＣ１８のＡｃｃＩ
サイトに常法によりクローニングした。
子量約１３０００のサブユニットをコードする遺伝子を
含む約０．７ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ断片（図２参
照）をプローブとして、前記と同様な方法でコスミドバ
ンクよりプローブとハイブリダイズするプラスミドを単
離した。単離したプラスミドの挿入断片からサザンハイ
ブリダイゼーションでプローブと特異的にハイブリダイ
ズした約５ｋｂのＣｌａＩ断片をｐＵＣ１８のＡｃｃＩ
サイトに常法によりクローニングした。
【００５５】約５ｋｂのＣｌａＩ断片の制限酵素地図は
図３のようであり、図２に示す約４．３ｋｂのＫｐｎＩ
断片と約１．２ｋｂの共通領域を有していた。約５ｋｂ
のＣｌａＩ断片の塩基配列のダイデオキシ法（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，第７４巻、
第５４６３−５４６７頁、１９７７年）により決定した
ところ、分子量約１３０００のサブユニットのＣ末端部
分を完全にコードしていた。
図３のようであり、図２に示す約４．３ｋｂのＫｐｎＩ
断片と約１．２ｋｂの共通領域を有していた。約５ｋｂ
のＣｌａＩ断片の塩基配列のダイデオキシ法（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，第７４巻、
第５４６３−５４６７頁、１９７７年）により決定した
ところ、分子量約１３０００のサブユニットのＣ末端部
分を完全にコードしていた。
【００５６】前記の約４．３ｋｂＫｐｎＩ断片をＫｐｎ
Ｉサイトに保有するｐＵＣ１８（組換えプラスミド、ｐ
ＵＫＯＸ１と命名）および約５ｋｂのＣｌａＩ断片をＡ
ｃｃＩサイトに保有するｐＵＣ１８（組換えプラスミ
ド、ｐＵＣＯＸ２と命名）は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０
１に形質転換され、前者は、エシェリヒア・コリ ＯＸ
−１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＯＸ−１菌
株名で微工研にＦＥＲＭＢＰ−３８５１として寄託さ
れ、後者は、エシェリヒア・コリ ＯＸ−２、Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＯＸ−２菌株名で微工研に
ＦＥＲＭ ＢＰ−３８５２として寄託されている。
Ｉサイトに保有するｐＵＣ１８（組換えプラスミド、ｐ
ＵＫＯＸ１と命名）および約５ｋｂのＣｌａＩ断片をＡ
ｃｃＩサイトに保有するｐＵＣ１８（組換えプラスミ
ド、ｐＵＣＯＸ２と命名）は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０
１に形質転換され、前者は、エシェリヒア・コリ ＯＸ
−１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＯＸ−１菌
株名で微工研にＦＥＲＭＢＰ−３８５１として寄託さ
れ、後者は、エシェリヒア・コリ ＯＸ−２、Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＯＸ−２菌株名で微工研に
ＦＥＲＭ ＢＰ−３８５２として寄託されている。
【００５７】約４．３ｋｂのＫｐｎＩ断片および約５ｋ
ｂのＣｌａＩ断片の塩基配列をもとに配列表の配列番号
２に示したように塩基配列が決定された。この配列番号
２で示した遺伝子が末端オキシダーゼをコードしている
ことは、コードする蛋白と精製した酵素標品の（１）ア
ミノ酸配列（２）アミノ酸組成（３）分子量が一致する
こと、（４）他の微生物起源のオキシダーゼとの相同性
があること、から明白である。
ｂのＣｌａＩ断片の塩基配列をもとに配列表の配列番号
２に示したように塩基配列が決定された。この配列番号
２で示した遺伝子が末端オキシダーゼをコードしている
ことは、コードする蛋白と精製した酵素標品の（１）ア
ミノ酸配列（２）アミノ酸組成（３）分子量が一致する
こと、（４）他の微生物起源のオキシダーゼとの相同性
があること、から明白である。
【００５８】以下に具体的に述べる。
【００５９】（１）アミノ酸配列：配列番号２の遺伝子
の塩基２８０番目から３０６番目がコードするアミノ酸
配列は、Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌ
ｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−となるが、これはサブ
ユニットII（分子量約３４０００のサブユニット）の精
製標品を用いたＮ末端アミノ酸配列決定結果と完全に一
致する。
の塩基２８０番目から３０６番目がコードするアミノ酸
配列は、Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌ
ｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−となるが、これはサブ
ユニットII（分子量約３４０００のサブユニット）の精
製標品を用いたＮ末端アミノ酸配列決定結果と完全に一
致する。
【００６０】（２）アミノ酸組成：配列番号２の遺伝子
の塩基２８０番目から１１３１番目のコードする蛋白
（ＯＲＦ Ｉ）および１１４０番目から３１３１番目の
コードする蛋白（ＯＲＦ II）のアミノ酸組成は、それ
ぞれ下記の表２になるが、表１の分析結果と比較する
と、ＯＲＦ Ｉは、サブユニットII（分子量約３４００
０のサブユニット）と、ＯＲＦ IIは、サブユニットＩ
（分子量約７２０００のサブユニット）とよく一致す
る。
の塩基２８０番目から１１３１番目のコードする蛋白
（ＯＲＦ Ｉ）および１１４０番目から３１３１番目の
コードする蛋白（ＯＲＦ II）のアミノ酸組成は、それ
ぞれ下記の表２になるが、表１の分析結果と比較する
と、ＯＲＦ Ｉは、サブユニットII（分子量約３４００
０のサブユニット）と、ＯＲＦ IIは、サブユニットＩ
（分子量約７２０００のサブユニット）とよく一致す
る。
【００６１】
【表２】
【００６２】（３）分子量：配列番号２の遺伝子の塩基
２８０番目から１１３１番目（ＯＲＦ Ｉ）、１１４０
番目から３１３１番目（ＯＲＦ II）、３１３６番目か
ら３７３８番目（ＯＲＦ III）、３７４１番目から４
０６７番目（ＯＲＦ IV）のコードする蛋白の分子量
は、ＯＲＦ Ｉ、７５１００；ＯＲＦ II、３４９０
０；ＯＲＦ III、２２７００；ＯＲＦ IV、１２３０
０であり、精製酵素を構成する４つのサブユニットの分
子量とほぼ一致する。
２８０番目から１１３１番目（ＯＲＦ Ｉ）、１１４０
番目から３１３１番目（ＯＲＦ II）、３１３６番目か
ら３７３８番目（ＯＲＦ III）、３７４１番目から４
０６７番目（ＯＲＦ IV）のコードする蛋白の分子量
は、ＯＲＦ Ｉ、７５１００；ＯＲＦ II、３４９０
０；ＯＲＦ III、２２７００；ＯＲＦ IV、１２３０
０であり、精製酵素を構成する４つのサブユニットの分
子量とほぼ一致する。
【００６３】（４）他の微生物起源のオキシダーゼとの
相同性：ＯＲＦ Ｉ、II、III、IVは、それぞれ精製酵
素のサブユニットII、Ｉ、III（分子量約２１０００の
サブユニット）、IV（分子量約１３０００のサブユニッ
ト）に対応するが、これらのサブユニットをコードする
遺伝子は、本発明の末端オキシダーゼと機能的のみなら
ず蛋白的にも類似の同じグラム陰性の大腸菌のユビキノ
ールオキシダーゼ遺伝子（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
第２６５巻、第１１１８５頁、１９９０年）と同様にク
ラスターを形成しており、しかも各サブユニットをコー
ドする遺伝子の配列順序が同一である。
相同性：ＯＲＦ Ｉ、II、III、IVは、それぞれ精製酵
素のサブユニットII、Ｉ、III（分子量約２１０００の
サブユニット）、IV（分子量約１３０００のサブユニッ
ト）に対応するが、これらのサブユニットをコードする
遺伝子は、本発明の末端オキシダーゼと機能的のみなら
ず蛋白的にも類似の同じグラム陰性の大腸菌のユビキノ
ールオキシダーゼ遺伝子（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
第２６５巻、第１１１８５頁、１９９０年）と同様にク
ラスターを形成しており、しかも各サブユニットをコー
ドする遺伝子の配列順序が同一である。
【００６４】また、塩基配列から決定されたサブユニッ
トII、Ｉ、III、IVのアミノ酸配列は、大腸菌のユビキ
ノールオキシダーゼ遺伝子のｃｙｏＡ、ｃｙｏＢ、ｃｙ
ｏＣ、ｃｙｏＤのアミノ酸配列とそれぞれ５１％、６５
％、５６％、５０％のホモロジーを有していた。
トII、Ｉ、III、IVのアミノ酸配列は、大腸菌のユビキ
ノールオキシダーゼ遺伝子のｃｙｏＡ、ｃｙｏＢ、ｃｙ
ｏＣ、ｃｙｏＤのアミノ酸配列とそれぞれ５１％、６５
％、５６％、５０％のホモロジーを有していた。
【００６５】本発明に係るオキシダーゼ複合体遺伝子の
塩基配列、アミノ酸配列は、配列表に示したとおりであ
る。
塩基配列、アミノ酸配列は、配列表に示したとおりであ
る。
【００６６】すなわち、オキシダーゼ遺伝子全長のクロ
ーニング用のプローブとして用いるための遺伝子断片で
あって、ポリメラーゼチェインリアクション法（ＰＣＲ
法）で増幅した約０．５ｋｂの遺伝子断片の塩基配列、
及び、該塩基配列から決定されたアミノ酸配列を、下記
の表３から表５で示される配列表の配列番号１に示す。
ーニング用のプローブとして用いるための遺伝子断片で
あって、ポリメラーゼチェインリアクション法（ＰＣＲ
法）で増幅した約０．５ｋｂの遺伝子断片の塩基配列、
及び、該塩基配列から決定されたアミノ酸配列を、下記
の表３から表５で示される配列表の配列番号１に示す。
【００６７】
【表３】
【００６８】
【表４】
【００６９】
【表５】
【００７０】オキシダーゼ複合体の全構造遺伝子を含む
遺伝子の塩基配列、及び、該塩基配列から決定されたア
ミノ酸配列を、下記の表６から表１６で示される配列表
の配列番号２に示す。
遺伝子の塩基配列、及び、該塩基配列から決定されたア
ミノ酸配列を、下記の表６から表１６で示される配列表
の配列番号２に示す。
【００７１】
【表６】
【００７２】
【表７】
【００７３】
【表８】
【００７４】
【表９】
【００７５】
【表１０】
【００７６】
【表１１】
【００７７】
【表１２】
【００７８】
【表１３】
【００７９】
【表１４】
【００８０】
【表１５】
【００８１】
【表１６】
【００８２】オキシダーゼ複合体の分子量約３４０００
のサブユニットの構造遺伝子の塩基配列、及び、該塩基
配列から決定されたアミノ酸配列を、下記の表１７から
表２０で示される配列表の配列番号３に示す。
のサブユニットの構造遺伝子の塩基配列、及び、該塩基
配列から決定されたアミノ酸配列を、下記の表１７から
表２０で示される配列表の配列番号３に示す。
【００８３】
【表１７】
【００８４】
【表１８】
【００８５】
【表１９】
【００８６】
【表２０】
【００８７】オキシダーゼ複合体の分子量約７２０００
のサブユニットの構造遺伝子の塩基配列、及び、該塩基
配列から決定されたアミノ酸配列を、下記の表２１から
表２７で示される配列表の配列番号４に示す。
のサブユニットの構造遺伝子の塩基配列、及び、該塩基
配列から決定されたアミノ酸配列を、下記の表２１から
表２７で示される配列表の配列番号４に示す。
【００８８】
【表２１】
【００８９】
【表２２】
【００９０】
【表２３】
【００９１】
【表２４】
【００９２】
【表２５】
【００９３】
【表２６】
【００９４】
【表２７】
【００９５】オキシダーゼ複合体の分子量約２１０００
のサブユニットの構造遺伝子の塩基配列、及び、塩基配
列から決定されたアミノ酸配列を、下記の表２８から表
３０で示される配列表の配列番号５に示す。
のサブユニットの構造遺伝子の塩基配列、及び、塩基配
列から決定されたアミノ酸配列を、下記の表２８から表
３０で示される配列表の配列番号５に示す。
【００９６】
【表２８】
【００９７】
【表２９】
【００９８】
【表３０】
【００９９】オキシダーゼ複合体の分子量約１３０００
のサブユニットの構造遺伝子の塩基配列、及び、該塩基
配列から決定されたアミノ酸配列を、下記の表３１から
表３２で示される配列表の配列番号６に示す。
のサブユニットの構造遺伝子の塩基配列、及び、該塩基
配列から決定されたアミノ酸配列を、下記の表３１から
表３２で示される配列表の配列番号６に示す。
【０１００】
【表３１】
【０１０１】
【表３２】
【０１０２】
【発明の効果】本発明を用いることにより、該微生物の
オキシダーゼ含量を高めたり、電子伝達鎖の流れを改変
することが可能になり、該遺伝子を該微生物や類縁のグ
ルコノバクター属の微生物に導入することにより、たと
えば酸化反応で生成する電子の流れがより円滑になり、
エタノール酸化能やアルデヒド酸化能が向上し、最終的
には酢酸発酵能を向上させることができる。
オキシダーゼ含量を高めたり、電子伝達鎖の流れを改変
することが可能になり、該遺伝子を該微生物や類縁のグ
ルコノバクター属の微生物に導入することにより、たと
えば酸化反応で生成する電子の流れがより円滑になり、
エタノール酸化能やアルデヒド酸化能が向上し、最終的
には酢酸発酵能を向上させることができる。
【０１０３】また、オキシダーゼ複合体を構成する各サ
ブユニットタンパク質の機能を明確化できるだけでな
く、オキシダーゼ複合体の各サブユニットの構成単位を
制御したり、各サブユニットごとに改変することが可能
になり、オキシダーゼ反応と共役するエネルギー生成反
応の効率を高めるように該遺伝子を改変し該微生物に導
入し発現させることにより、たとえば該微生物の生育を
高めたり、生合成に多量のエネルギーを必要とする微生
物セルロースの生産性を向上させることができる。
ブユニットタンパク質の機能を明確化できるだけでな
く、オキシダーゼ複合体の各サブユニットの構成単位を
制御したり、各サブユニットごとに改変することが可能
になり、オキシダーゼ反応と共役するエネルギー生成反
応の効率を高めるように該遺伝子を改変し該微生物に導
入し発現させることにより、たとえば該微生物の生育を
高めたり、生合成に多量のエネルギーを必要とする微生
物セルロースの生産性を向上させることができる。
【０１０４】さらに、該微生物以外の微生物に導入し、
発現させることにより、導入微生物の電子伝達鎖の流れ
を改変することも可能になる。
発現させることにより、導入微生物の電子伝達鎖の流れ
を改変することも可能になる。
【図１】オキシダーゼ遺伝子の一部のクローニングに用
いるプライマー１及びプライマー２を示す。
いるプライマー１及びプライマー２を示す。
【図２】オキシダーゼ複合体の構造遺伝子を含むＫｐｎ
Ｉ断片の制限酵素地図を示す。
Ｉ断片の制限酵素地図を示す。
【図３】オキシダーゼ複合体の分子量約１３０００のサ
ブユニットのＣ末端領域をコードする遺伝子を含むＣｌ
ａＩ断片の制限酵素地図を示す。
ブユニットのＣ末端領域をコードする遺伝子を含むＣｌ
ａＩ断片の制限酵素地図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 川 村 吉 也 愛知県江南市古知野町古渡132
Claims (9)
- 【請求項１】 アセトバクター属の微生物に由来し、配
列表の配列番号３の塩基配列で示されるオキシダーゼ複
合体を構成する分子量約３４０００のタンパク質の構造
遺伝子。 - 【請求項２】 アセトバクター属の微生物に由来し、配
列表の配列番号４の塩基配列で示されるオキシダーゼ複
合体を構成する分子量約７２０００のタンパク質の構造
遺伝子。 - 【請求項３】 アセトバクター属の微生物に由来し、配
列表の配列番号５の塩基配列で示されるオキシダーゼ複
合体を構成する分子量約２１０００のタンパク質の構造
遺伝子。 - 【請求項４】 アセトバクター属の微生物に由来し、配
列表の配列番号６の塩基配列で示されるオキシダーゼ複
合体を構成する分子量約１３０００のタンパク質の構造
遺伝子。 - 【請求項５】 アセトバクター属の微生物に由来し、配
列表の配列番号２の塩基配列で示されるオキシダーゼ複
合体を構成する分子量約３４０００、約７２０００、約
２１０００、約１３０００のタンパク質の構造遺伝子を
含む遺伝子。 - 【請求項６】 アセトバクター属の微生物に由来し、配
列表の配列番号３のアミノ酸配列で示されるオキシダー
ゼ複合体を構成する分子量約３４０００のタンパク質の
構造遺伝子。 - 【請求項７】 アセトバクター属の微生物に由来し、配
列表の配列番号４のアミノ酸配列で示されるオキシダー
ゼ複合体を構成する分子量約７２０００のタンパク質の
構造遺伝子。 - 【請求項８】 アセトバクター属の微生物に由来し、配
列表の配列番号５のアミノ酸配列で示されるオキシダー
ゼ複合体を構成する分子量約２１０００のタンパク質の
構造遺伝子。 - 【請求項９】 アセトバクター属の微生物に由来し、配
列表の配列番号６のアミノ酸配列で示されるオキシダー
ゼ複合体を構成する分子量約１３０００のタンパク質の
構造遺伝子。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15425192A JP3335191B2 (ja) | 1992-05-22 | 1992-05-22 | オキシダーゼ遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15425192A JP3335191B2 (ja) | 1992-05-22 | 1992-05-22 | オキシダーゼ遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05317054A true JPH05317054A (ja) | 1993-12-03 |
| JP3335191B2 JP3335191B2 (ja) | 2002-10-15 |
Family
ID=15580138
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15425192A Expired - Fee Related JP3335191B2 (ja) | 1992-05-22 | 1992-05-22 | オキシダーゼ遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3335191B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007000184A (ja) * | 2005-06-21 | 2007-01-11 | Yoshimi Shinohara | 脱臭剤及び臭気を発生しない堆肥化法 |
-
1992
- 1992-05-22 JP JP15425192A patent/JP3335191B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007000184A (ja) * | 2005-06-21 | 2007-01-11 | Yoshimi Shinohara | 脱臭剤及び臭気を発生しない堆肥化法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3335191B2 (ja) | 2002-10-15 |
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