JPH05317058A - 耐熱性ｄｎａポリメラーゼの遺伝情報を有するｄｎａ断片およびその用途 - Google Patents
耐熱性ｄｎａポリメラーゼの遺伝情報を有するｄｎａ断片およびその用途Info
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を採取し、
一次構造を解析し、遺伝子工学的手法を応用することに
よって、高生産性の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの製造法
を提供する。 【構成】 サーマス サーモフィラス（Thermus thermo
phirus）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ又は該耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼと機能的同等物をコードしているＤ
ＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換えベクター、宿主細胞を
該組換えベクターで形質転換した形質転換体、及び該形
質転換体を培養して耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを採取す
ることを特徴とする耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの製造
法。
一次構造を解析し、遺伝子工学的手法を応用することに
よって、高生産性の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの製造法
を提供する。 【構成】 サーマス サーモフィラス（Thermus thermo
phirus）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ又は該耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼと機能的同等物をコードしているＤ
ＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換えベクター、宿主細胞を
該組換えベクターで形質転換した形質転換体、及び該形
質転換体を培養して耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを採取す
ることを特徴とする耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの製造
法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、サーマス サーモフィ
ラス（Thermus thermophilus）由来の耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼをコードするＤＮＡ、及び該ＤＮＡを含有する
組換えベクター、該組換えベクターを用いて得られる形
質転換体及び該形質転換体により該ＤＮＡの遺伝情報を
発現せしめて得られる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの製造
方法に関する。
ラス（Thermus thermophilus）由来の耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼをコードするＤＮＡ、及び該ＤＮＡを含有する
組換えベクター、該組換えベクターを用いて得られる形
質転換体及び該形質転換体により該ＤＮＡの遺伝情報を
発現せしめて得られる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの製造
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、ポリメラーゼ チェーン リアク
ション法（ＰＣＲ法，サイキ等Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０
巻、１３５０−１３５４頁（１９８５年））の普及およ
び、より解析の困難なＤＮＡの塩基配列の解析のために
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに対する需要が増大してい
る。しかるに、従来知られているサーマス アクアティ
カス（Thermus aquaticus ）由来の耐熱性ＤＮＡポリメ
ラーゼ（Taq ポリメラーゼ）は耐熱性が充分ではなく、
反応中に活性の低下が起こる問題があった。そこで我々
はTaq ポリメラーゼよりも熱安定性に優れた耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼを見いだし特願昭６３−２１３３３０を
出願した。
ション法（ＰＣＲ法，サイキ等Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０
巻、１３５０−１３５４頁（１９８５年））の普及およ
び、より解析の困難なＤＮＡの塩基配列の解析のために
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに対する需要が増大してい
る。しかるに、従来知られているサーマス アクアティ
カス（Thermus aquaticus ）由来の耐熱性ＤＮＡポリメ
ラーゼ（Taq ポリメラーゼ）は耐熱性が充分ではなく、
反応中に活性の低下が起こる問題があった。そこで我々
はTaq ポリメラーゼよりも熱安定性に優れた耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼを見いだし特願昭６３−２１３３３０を
出願した。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、特願昭
６３ー２１３３３０で見いだした耐熱性ＤＮＡポリメラ
ーゼ生産菌、例えばサーマス サーモフィラス ＨＢ８
（ＡＴＣＣ２７６３４）は耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの
生産性が低く、又制限酵素ＴｔｈＨＢ８も合わせて生産
するため、精製が煩雑になり、研究用試薬として広く用
いるには必ずしも満足の行くものではなかった。
６３ー２１３３３０で見いだした耐熱性ＤＮＡポリメラ
ーゼ生産菌、例えばサーマス サーモフィラス ＨＢ８
（ＡＴＣＣ２７６３４）は耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの
生産性が低く、又制限酵素ＴｔｈＨＢ８も合わせて生産
するため、精製が煩雑になり、研究用試薬として広く用
いるには必ずしも満足の行くものではなかった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは該耐熱性Ｄ
ＮＡポリメラーゼの生産性の向上を計るべく鋭意検討し
た結果、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の採取、なら
びに一次構造解析に成功すると共に、遺伝子工学的手法
を応用することによって、以下に述べるごとく、高生産
性である製法を確立した。
ＮＡポリメラーゼの生産性の向上を計るべく鋭意検討し
た結果、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の採取、なら
びに一次構造解析に成功すると共に、遺伝子工学的手法
を応用することによって、以下に述べるごとく、高生産
性である製法を確立した。
【０００５】すなわち、本発明の要旨はサーマス サー
モフィラス（Thermus thermophirus）由来の耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼ又は該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと機能
的同等物をコードしているＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する
組換えベクター、宿主細胞を該組換えベクターで形質転
換した形質転換体、及び該形質転換体を培養して耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼを採取することを特徴とする耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼの製造法に存する。
モフィラス（Thermus thermophirus）由来の耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼ又は該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと機能
的同等物をコードしているＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する
組換えベクター、宿主細胞を該組換えベクターで形質転
換した形質転換体、及び該形質転換体を培養して耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼを採取することを特徴とする耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼの製造法に存する。
【０００６】本発明の上記ＤＮＡとしては、例えば配列
表の配列番号１に記載された塩基配列を有するＤＮＡを
挙げることができる。なお、本発明のＤＮＡは遺伝子組
み換え技術により、基本となるＤＮＡの特定部位に、該
ＤＮＡがコードするものの基本的な特性を変化させるこ
となく、あるいはその特性を改善するように人為的に変
異を起こさせたものも含むものである。
表の配列番号１に記載された塩基配列を有するＤＮＡを
挙げることができる。なお、本発明のＤＮＡは遺伝子組
み換え技術により、基本となるＤＮＡの特定部位に、該
ＤＮＡがコードするものの基本的な特性を変化させるこ
となく、あるいはその特性を改善するように人為的に変
異を起こさせたものも含むものである。
【０００７】本発明のＤＮＡは、例えば耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼを生産する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子
の供与体である微生物より、該微生物のＤＮＡを分離・
精製した後、超音波，制限酵素などを用いてＤＮＡを切
断したものとリニヤーな発現ベクターとを両ＤＮＡの平
滑または接着末端部においてＤＮＡリガーゼなどにより
結合閉環させ、こうして得られた組み換えＤＮＡベクタ
ーを複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマ
ーカーと耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの活性とを指標とし
て、スクリーニングして取得した該組み換えＤＮＡベク
ターを保持する微生物を培養し、該培養菌体から該組み
換えＤＮＡベクターを分離・精製し、次いで該組み換え
ＤＮＡベクターから耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子で
あるＤＮＡを採取すればよい。
リメラーゼを生産する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子
の供与体である微生物より、該微生物のＤＮＡを分離・
精製した後、超音波，制限酵素などを用いてＤＮＡを切
断したものとリニヤーな発現ベクターとを両ＤＮＡの平
滑または接着末端部においてＤＮＡリガーゼなどにより
結合閉環させ、こうして得られた組み換えＤＮＡベクタ
ーを複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマ
ーカーと耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの活性とを指標とし
て、スクリーニングして取得した該組み換えＤＮＡベク
ターを保持する微生物を培養し、該培養菌体から該組み
換えＤＮＡベクターを分離・精製し、次いで該組み換え
ＤＮＡベクターから耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子で
あるＤＮＡを採取すればよい。
【０００８】以下に上記採取方法をより詳細に説明す
る。遺伝子の供与体である微生物に由来するＤＮＡは次
の如くにして採取される。すなわち、供与微生物である
上述した細菌のいずれかを例えば液体培地で約１〜３日
間通気撹拌培養し、得られる培養物を遠心分離して集菌
し、次いでこれを溶菌させることによって耐熱性ＤＮＡ
ポリメラーゼ遺伝子の含有溶菌物を調製することができ
る。溶菌方法としては例えばリゾチームなどの細胞壁溶
解酵素による処理が施され、必要によりプロテアーゼな
どの他の酵素やラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性
剤が併用され、さらに細胞壁の物理的破壊法である凍結
融解やフレンチプレス処理を上述の溶菌法との組み合せ
で行ってもよい。
る。遺伝子の供与体である微生物に由来するＤＮＡは次
の如くにして採取される。すなわち、供与微生物である
上述した細菌のいずれかを例えば液体培地で約１〜３日
間通気撹拌培養し、得られる培養物を遠心分離して集菌
し、次いでこれを溶菌させることによって耐熱性ＤＮＡ
ポリメラーゼ遺伝子の含有溶菌物を調製することができ
る。溶菌方法としては例えばリゾチームなどの細胞壁溶
解酵素による処理が施され、必要によりプロテアーゼな
どの他の酵素やラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性
剤が併用され、さらに細胞壁の物理的破壊法である凍結
融解やフレンチプレス処理を上述の溶菌法との組み合せ
で行ってもよい。
【０００９】この様にして得られた溶菌物からＤＮＡを
分離・精製するには常法に従って例えばフェノール抽出
による除蛋白処理，プロテアーゼ処理，リボヌクレアー
ゼ処理，アルコール沈澱遠心分離などの方法を適宜組み
合わせることにより行うことができる。
分離・精製するには常法に従って例えばフェノール抽出
による除蛋白処理，プロテアーゼ処理，リボヌクレアー
ゼ処理，アルコール沈澱遠心分離などの方法を適宜組み
合わせることにより行うことができる。
【００１０】分離・精製された微生物ＤＮＡを切断する
方法は、例えば超音波処理，制限酵素処理などにより行
うことができるが、得られるＤＮＡ断片とベクターとの
結合を容易ならしめるため制限酵素とりわけ特定ヌクレ
オチド配列に作用する例えばＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ，ＢａｍＨＩなどのＩＩ型制限酵素が適している。
方法は、例えば超音波処理，制限酵素処理などにより行
うことができるが、得られるＤＮＡ断片とベクターとの
結合を容易ならしめるため制限酵素とりわけ特定ヌクレ
オチド配列に作用する例えばＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ，ＢａｍＨＩなどのＩＩ型制限酵素が適している。
【００１１】ベクターとしては、宿主微生物で自律的に
増殖しうるファージまたはプラスミドから遺伝子組み換
え用として構築されたものが適している。ファージとし
ては、例えばエシェリシア コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａｃｏｌｉ）を宿主微生物とする場合には、λｇｔ
・１０，λｇｔ・１１などが使用できる。
増殖しうるファージまたはプラスミドから遺伝子組み換
え用として構築されたものが適している。ファージとし
ては、例えばエシェリシア コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａｃｏｌｉ）を宿主微生物とする場合には、λｇｔ
・１０，λｇｔ・１１などが使用できる。
【００１２】また、プラスミドとしては、例えばエシェ
リシア コリーを宿主微生物とする場合にはｐＢＲ３２
２，ｐＢＲ３２５，ｐＡＣＹＣＩ８４，ｐＵＣ１２，ｐ
ＵＣ１３，ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９、ｐＫＫ２２３−３
などが使用できる。このようなベクターを、先に述べた
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子供与体である微生物Ｄ
ＮＡの切断に使用した制限酵素と同じ制限酵素で切断し
て、ベクター断片を得ることが望ましい。
リシア コリーを宿主微生物とする場合にはｐＢＲ３２
２，ｐＢＲ３２５，ｐＡＣＹＣＩ８４，ｐＵＣ１２，ｐ
ＵＣ１３，ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９、ｐＫＫ２２３−３
などが使用できる。このようなベクターを、先に述べた
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子供与体である微生物Ｄ
ＮＡの切断に使用した制限酵素と同じ制限酵素で切断し
て、ベクター断片を得ることが望ましい。
【００１３】微生物ＤＮＡ断片とベクター断片とを結合
させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であ
ればよく、例えば微生物ＤＮＡ断片の接着末端とベクタ
ー断片の接着末端とのアニーリングの後、適当なＤＮＡ
リガーゼの使用により微生物ＤＮＡ断片とベクター断片
との組み換えＤＮＡを作成する。必要ならば、アニーリ
ングの後、宿主微生物に移入して、生体内のＤＮＡリガ
ーゼを利用し、組み換えＤＮＡを作成することもでき
る。
させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であ
ればよく、例えば微生物ＤＮＡ断片の接着末端とベクタ
ー断片の接着末端とのアニーリングの後、適当なＤＮＡ
リガーゼの使用により微生物ＤＮＡ断片とベクター断片
との組み換えＤＮＡを作成する。必要ならば、アニーリ
ングの後、宿主微生物に移入して、生体内のＤＮＡリガ
ーゼを利用し、組み換えＤＮＡを作成することもでき
る。
【００１４】宿主微生物としては、組み換えＤＮＡが安
定かつ自律的に増殖可能で、且つ外来性ＤＮＡの形質が
発現のできるものであればよく、例えば宿主微生物がエ
シェリシア コリーＤＨ５，エシェリシア コリーＨＢ
１０１，エシェリシア コリーＷ３１１０，エシェリシ
ア コリーＣ６００，エシェリシア コリーＪＭ１０９
などが利用できる。
定かつ自律的に増殖可能で、且つ外来性ＤＮＡの形質が
発現のできるものであればよく、例えば宿主微生物がエ
シェリシア コリーＤＨ５，エシェリシア コリーＨＢ
１０１，エシェリシア コリーＷ３１１０，エシェリシ
ア コリーＣ６００，エシェリシア コリーＪＭ１０９
などが利用できる。
【００１５】宿主微生物に組み換えＤＮＡを移入する方
法としては、例えば宿主微生物がエシェリシア属に属す
る微生物の場合には、市販のコンピーテントセルを用い
て組み換えＤＮＡの移入を行い、さらにマイクロインジ
ェクション法を用いても良い。こうして得られた形質転
換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより
多量の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを安定して産生し得る
ことを見出した。
法としては、例えば宿主微生物がエシェリシア属に属す
る微生物の場合には、市販のコンピーテントセルを用い
て組み換えＤＮＡの移入を行い、さらにマイクロインジ
ェクション法を用いても良い。こうして得られた形質転
換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより
多量の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを安定して産生し得る
ことを見出した。
【００１６】宿主微生物への目的組み換えＤＮＡ移入の
有無についての選択は、目的組み換えＤＮＡを保持する
ベクターの薬剤耐性マーカーと耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼとを同時に発現し得る微生物を検索する方法、選択培
地に成育したコロニーについて、アミノ酸配列を基に合
成したＤＮＡプローブとハイブリザイゼーションを行い
検索する方法等があげられる。
有無についての選択は、目的組み換えＤＮＡを保持する
ベクターの薬剤耐性マーカーと耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼとを同時に発現し得る微生物を検索する方法、選択培
地に成育したコロニーについて、アミノ酸配列を基に合
成したＤＮＡプローブとハイブリザイゼーションを行い
検索する方法等があげられる。
【００１７】上述の方法により得られた耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼ遺伝子の塩基配列はサイエンス（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ），２１４，１２０５〜１２１０（１９８１）に記
載されているジデオキシ法で解読し、また耐熱性ＤＮＡ
ポリメラーゼ遺伝子の全アミノ酸配列は塩基配列より推
定した。この様にして一度選択された耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼ遺伝子を保有する組み換えＤＮＡは、形質転換
微生物から取り出され、他の宿主微生物に移入すること
も容易に実施できる。また、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
遺伝子を保持する組み換えＤＮＡから制限酵素などによ
り切断して、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子であるＤ
ＮＡを切り出し、これを同様な方法により切断して得ら
れるベクター断片とを結合させて、宿主微生物に移入す
ることも容易に実施できる。
リメラーゼ遺伝子の塩基配列はサイエンス（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ），２１４，１２０５〜１２１０（１９８１）に記
載されているジデオキシ法で解読し、また耐熱性ＤＮＡ
ポリメラーゼ遺伝子の全アミノ酸配列は塩基配列より推
定した。この様にして一度選択された耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼ遺伝子を保有する組み換えＤＮＡは、形質転換
微生物から取り出され、他の宿主微生物に移入すること
も容易に実施できる。また、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
遺伝子を保持する組み換えＤＮＡから制限酵素などによ
り切断して、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子であるＤ
ＮＡを切り出し、これを同様な方法により切断して得ら
れるベクター断片とを結合させて、宿主微生物に移入す
ることも容易に実施できる。
【００１８】形質転換体である宿主微生物の培養形態は
宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すれば
良く、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には
通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源とし
ては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用さ
れ得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であれば
よく、例えばグルコ−ス，シュクロース，ラクトース，
マルトース，フラクトース，糖蜜，ピルビン酸などが使
用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であれ
ばよく、例えばペプトン，肉エキス，酵母エキス，カゼ
イン加水分解物，大豆粕アルカリ抽出物などが使用され
る。その他、リン酸塩，炭酸塩，硫酸塩，マグネシウ
ム，カルシウム，カリウム，鉄，マンガン，亜鉛などの
塩類，特定のアミノ酸，特定のビタミンなどが必要に応
じて使用される。
宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すれば
良く、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には
通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源とし
ては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用さ
れ得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であれば
よく、例えばグルコ−ス，シュクロース，ラクトース，
マルトース，フラクトース，糖蜜，ピルビン酸などが使
用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であれ
ばよく、例えばペプトン，肉エキス，酵母エキス，カゼ
イン加水分解物，大豆粕アルカリ抽出物などが使用され
る。その他、リン酸塩，炭酸塩，硫酸塩，マグネシウ
ム，カルシウム，カリウム，鉄，マンガン，亜鉛などの
塩類，特定のアミノ酸，特定のビタミンなどが必要に応
じて使用される。
【００１９】培養温度は菌が発育し、耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリ
シア コリーの場合、好ましくは２０〜４２℃程度であ
る。培養時間は条件によって多少異なるが、耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼが最高収量に達する時期を見計らって適
当な時期に培養を終了すれば良く、通常は１２〜４８時
間程度である。培地ｐＨは菌が発育し、耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、特に好
ましくはｐＨ６．０〜８．０程度である。
メラーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリ
シア コリーの場合、好ましくは２０〜４２℃程度であ
る。培養時間は条件によって多少異なるが、耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼが最高収量に達する時期を見計らって適
当な時期に培養を終了すれば良く、通常は１２〜４８時
間程度である。培地ｐＨは菌が発育し、耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、特に好
ましくはｐＨ６．０〜８．０程度である。
【００２０】培養物中の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、
培養物を濾過または遠心分離などの手段により、菌体を
採取し次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームな
どの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等
のキレート剤および／または界面活性剤を添加して耐熱
性ＤＮＡポリメラーゼを可溶化し、水溶液として分離採
取する。
培養物を濾過または遠心分離などの手段により、菌体を
採取し次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームな
どの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等
のキレート剤および／または界面活性剤を添加して耐熱
性ＤＮＡポリメラーゼを可溶化し、水溶液として分離採
取する。
【００２１】この様にして得られた耐熱性ＤＮＡポリメ
ラーゼ含有溶液を、例えば減圧濃縮，膜濃縮，更に硫酸
アンモニウム，硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるい
は親水性有機溶媒、例えばメタノール，エタノール，ア
セトンなどによる分別沈澱法により沈澱せしめればよ
い。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段であ
る。吸着剤あるいはゲル濾過剤などによるゲル濾過，吸
着クロマトグラフィー，イオン交換クロマトグラフィ
ー，アフィニティークロマトグラフィーにより、精製さ
れた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを得る。
ラーゼ含有溶液を、例えば減圧濃縮，膜濃縮，更に硫酸
アンモニウム，硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるい
は親水性有機溶媒、例えばメタノール，エタノール，ア
セトンなどによる分別沈澱法により沈澱せしめればよ
い。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段であ
る。吸着剤あるいはゲル濾過剤などによるゲル濾過，吸
着クロマトグラフィー，イオン交換クロマトグラフィ
ー，アフィニティークロマトグラフィーにより、精製さ
れた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを得る。
【００２２】以下、実施例で本発明を詳細に説明する。
実施例１〔染色体ＤＮＡの分離〕 サーマス サーモフィラスＨＢ８の染色体ＤＮＡを次の
方法で分離した。同菌株を１５０ｍｌの１．５％ポリペ
プトン、１．５％酵母エキス、０．２％NaCl（ｐＨ７．
５）よりなる液体培地で７０℃一晩振盪培養後、遠心
（８０００ｒｐｍ，１０分）により集菌した。１０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡを含んだ
溶液２４ｍｌに懸濁させ、３ｍｌのリゾチーム溶液（２
０ｍｇ／ｍｌ）を加えて、その後１０％ＳＤＳ溶液を６
ｍｌ加えた。３０ｍｌのフェノールを加えてゆるやかに
撹拌混合し、１０，０００ｒｐｍ，１５分間の遠心で水
層と溶媒層に分け、水層を合取した。この操作を再びお
こない、この水層に２倍量のエタノールを静かに重層
し、ガラス棒でゆっくり撹拌しながらＤＮＡをガラス棒
にまきつかせて分離した。これを１０ｍＭトリス塩酸
（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡを含んだ溶液（以下
ＴＥと記載）で溶解した。これを等量のクロロホルム・
フェノール溶液で処理後、遠心により水層を分取し、２
倍量のエタノールを加えて、上記の方法でもう一度ＤＮ
Ａを分離し２ｍｌのＴＥで溶解した。エシェリシア コ
リーＪＭ１０９のコンピテントセルは市販（東洋紡社
製）のものを使用し、ライブラリー作成の宿主として用
いた。
方法で分離した。同菌株を１５０ｍｌの１．５％ポリペ
プトン、１．５％酵母エキス、０．２％NaCl（ｐＨ７．
５）よりなる液体培地で７０℃一晩振盪培養後、遠心
（８０００ｒｐｍ，１０分）により集菌した。１０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡを含んだ
溶液２４ｍｌに懸濁させ、３ｍｌのリゾチーム溶液（２
０ｍｇ／ｍｌ）を加えて、その後１０％ＳＤＳ溶液を６
ｍｌ加えた。３０ｍｌのフェノールを加えてゆるやかに
撹拌混合し、１０，０００ｒｐｍ，１５分間の遠心で水
層と溶媒層に分け、水層を合取した。この操作を再びお
こない、この水層に２倍量のエタノールを静かに重層
し、ガラス棒でゆっくり撹拌しながらＤＮＡをガラス棒
にまきつかせて分離した。これを１０ｍＭトリス塩酸
（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡを含んだ溶液（以下
ＴＥと記載）で溶解した。これを等量のクロロホルム・
フェノール溶液で処理後、遠心により水層を分取し、２
倍量のエタノールを加えて、上記の方法でもう一度ＤＮ
Ａを分離し２ｍｌのＴＥで溶解した。エシェリシア コ
リーＪＭ１０９のコンピテントセルは市販（東洋紡社
製）のものを使用し、ライブラリー作成の宿主として用
いた。
【００２３】実施例２〔耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコ
ードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片及び該ＤＮＡ断片
を有する組み換えベクターの調製〕 実施例１で得たＤＮＡ１μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ
（東洋紡製）５ユニットで３７℃，１５分反応させ、限
定分解を行った後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩにて完全に
切断したｐＵＣ１９ ０．５μｇとＴ4 −ＤＮＡリガー
ゼ（東洋紡製）１ユニットで１６℃、１２時間反応させ
ＤＮＡを連結した。連結したＤＮＡは、エシェリシア
コリーＪＭ１０９のコンピテントセルを用いて形質転換
した。使用したＤＮＡ１μｇ当り約１×１０6 個の形質
転換体のコロニーが得られた。得られたコロニーは５０
μｇ／ｍｌアンピシリン入りＬ培地（１％ポリペプト
ン，０．５％酵母エキス，０．５％塩化ナトリウム、
０．２５ｍＭＩＰＴＧ）で３７℃で１８時間培養し、菌
体を破砕し、７５℃、３０分処理した液を用いて以下の
方法により耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定した。
ードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片及び該ＤＮＡ断片
を有する組み換えベクターの調製〕 実施例１で得たＤＮＡ１μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ
（東洋紡製）５ユニットで３７℃，１５分反応させ、限
定分解を行った後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩにて完全に
切断したｐＵＣ１９ ０．５μｇとＴ4 −ＤＮＡリガー
ゼ（東洋紡製）１ユニットで１６℃、１２時間反応させ
ＤＮＡを連結した。連結したＤＮＡは、エシェリシア
コリーＪＭ１０９のコンピテントセルを用いて形質転換
した。使用したＤＮＡ１μｇ当り約１×１０6 個の形質
転換体のコロニーが得られた。得られたコロニーは５０
μｇ／ｍｌアンピシリン入りＬ培地（１％ポリペプト
ン，０．５％酵母エキス，０．５％塩化ナトリウム、
０．２５ｍＭＩＰＴＧ）で３７℃で１８時間培養し、菌
体を破砕し、７５℃、３０分処理した液を用いて以下の
方法により耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定した。
【００２４】（試薬） Ａ．６７０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ８．８） １６６ｍＭ 硫酸アンモニウム ６７ｍＭ 塩化マグネシウム １０ｍＭ ２−メルカプトエタノール Ｂ． １μg/μl 活性化仔牛胸線ＤＮＡ Ｃ． ２ｍＭ ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ/ ｐｍｏｌ
「3H］ｄＴＴＰ） Ｄ． ２０％ トリクロロ酢酸（２ｍＭ ピロリン
酸） Ｅ． １μg/μl キャリアーＤＮＡ
「3H］ｄＴＴＰ） Ｄ． ２０％ トリクロロ酢酸（２ｍＭ ピロリン
酸） Ｅ． １μg/μl キャリアーＤＮＡ
【００２５】（方法）Ａ液、Ｂ液、Ｃ液各５μl 、及び
滅菌水３０μl をエッペンドルフチューブに加えて撹拌
混合後、菌体破砕液、あるいは上記熱処理液５μl を加
え、７５℃で３０分間反応する。その後氷冷しＥ液５０
μl 、Ｄ液１００ｍｌを加え、更に１０分間氷冷する。
この液をガラスフィルター（ワットマンＧＦ／Ｃフィル
ター）で濾過しＤ液及び冷エタノールで充分洗浄し、フ
ィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター
（パッカード社製）で計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオ
チドの取り込みを測定した。 酵素活性の１単位は、こ
の条件下で３０分間当り１０ｎｍｏｌのヌクレオチドを
酸不溶性画分に取り込む酵素量とした。
滅菌水３０μl をエッペンドルフチューブに加えて撹拌
混合後、菌体破砕液、あるいは上記熱処理液５μl を加
え、７５℃で３０分間反応する。その後氷冷しＥ液５０
μl 、Ｄ液１００ｍｌを加え、更に１０分間氷冷する。
この液をガラスフィルター（ワットマンＧＦ／Ｃフィル
ター）で濾過しＤ液及び冷エタノールで充分洗浄し、フ
ィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター
（パッカード社製）で計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオ
チドの取り込みを測定した。 酵素活性の１単位は、こ
の条件下で３０分間当り１０ｎｍｏｌのヌクレオチドを
酸不溶性画分に取り込む酵素量とした。
【００２６】上記方法により約３，０００個のコロニー
の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定したところ、２
個の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するコロニーを
得た。これらの保有するプラスミドには内部にＨｉｎｄ
ＩＩＩサイトを１ケ 所含む約６ｋｂｐの挿入ＤＮＡ断片
が存在しており、このプラスミドをｐＵＰＬ０とした。
次いでｐＵＰＬ０よりHindＩＩＩにて約２．８ｋｂ
ｐ、及び３．２ｋｂｐの挿入ＤＮＡ断片を切り出し、そ
れぞれｐＵＣ１９へ導入してｐＵＰＬ０１及びｐＵＰＬ
０２を構築した。それぞれをE.coliJM109 に形質転換
し、この形質転換体を培養後上記方法により耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼ活性を測定したところ活性は認められな
かった。次に ｐＵＰＬ０２をＰｓｔＩ、ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ処理して得られる１．４ｋｂｐの断片をｐＵＣ１９に
導入し、ｐＵＰＬ０３を構築した。更にｐＵＰＬ０１を
ＨｉｎｄＩＩＩ処理して得られる３．２ｋｂｐの断片を
ｐＵＰＬ０３のＨｉｎｄＩＩＩサイトに導入しｐＵＰＬ
１を構築した。ｐＵＰＬ１の構築方法を図１に示す。こ
のｐＵＰＬ１でエシェリシア コリーＪＭ１０９を形質
転換した菌株の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの生産性はサ
ーマス サーモフィラスＨＢ８の約２倍であった。
の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定したところ、２
個の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するコロニーを
得た。これらの保有するプラスミドには内部にＨｉｎｄ
ＩＩＩサイトを１ケ 所含む約６ｋｂｐの挿入ＤＮＡ断片
が存在しており、このプラスミドをｐＵＰＬ０とした。
次いでｐＵＰＬ０よりHindＩＩＩにて約２．８ｋｂ
ｐ、及び３．２ｋｂｐの挿入ＤＮＡ断片を切り出し、そ
れぞれｐＵＣ１９へ導入してｐＵＰＬ０１及びｐＵＰＬ
０２を構築した。それぞれをE.coliJM109 に形質転換
し、この形質転換体を培養後上記方法により耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼ活性を測定したところ活性は認められな
かった。次に ｐＵＰＬ０２をＰｓｔＩ、ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ処理して得られる１．４ｋｂｐの断片をｐＵＣ１９に
導入し、ｐＵＰＬ０３を構築した。更にｐＵＰＬ０１を
ＨｉｎｄＩＩＩ処理して得られる３．２ｋｂｐの断片を
ｐＵＰＬ０３のＨｉｎｄＩＩＩサイトに導入しｐＵＰＬ
１を構築した。ｐＵＰＬ１の構築方法を図１に示す。こ
のｐＵＰＬ１でエシェリシア コリーＪＭ１０９を形質
転換した菌株の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの生産性はサ
ーマス サーモフィラスＨＢ８の約２倍であった。
【００２７】
【表１】
【００２８】実施例３〔塩基配列の決定〕 ｐＵＰＬ０１の約２．８ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ断片、
及びｐＵＰＬ０３の約１．４ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ-
ＰｓｔＩ断片について、ＴＡＫＡＲＡ ｋｉｌｏ ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｋｉｔを用いてｄｅ
ｌｅｔｉｏｎｍｕｔａｎｔの作製を行った。ｄｅｌｅｔ
ｉｏｎ ｍｕｔａｎｔは常法に従い一本鎖ＤＮＡとし、
得られた一本鎖ＤＮＡについて、Ｔｔｈシークエンシン
グキット（Ｔｔｈ Ｓｅｑｕｅｎ−ｃｉｎｇ ｋｉｔ、
東洋紡製）を用いて、塩基配列の決定を行った。決定し
た塩基配列及びアミノ酸配列を配列１に示した。
及びｐＵＰＬ０３の約１．４ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ-
ＰｓｔＩ断片について、ＴＡＫＡＲＡ ｋｉｌｏ ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｋｉｔを用いてｄｅ
ｌｅｔｉｏｎｍｕｔａｎｔの作製を行った。ｄｅｌｅｔ
ｉｏｎ ｍｕｔａｎｔは常法に従い一本鎖ＤＮＡとし、
得られた一本鎖ＤＮＡについて、Ｔｔｈシークエンシン
グキット（Ｔｔｈ Ｓｅｑｕｅｎ−ｃｉｎｇ ｋｉｔ、
東洋紡製）を用いて、塩基配列の決定を行った。決定し
た塩基配列及びアミノ酸配列を配列１に示した。
【００２９】
【発明の効果】本発明によって、耐熱性ＤＮＡポリメラ
ーゼ遺伝子の塩基配列および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
のアミノ酸配列が明らかになり、また遺伝子工学的手法
による効率的な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの製造法を提
供した。また本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子
と種々の遺伝子工学的手法とを用いることにより、より
効率的な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの製造法をもたらし
めるものである。
ーゼ遺伝子の塩基配列および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
のアミノ酸配列が明らかになり、また遺伝子工学的手法
による効率的な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの製造法を提
供した。また本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子
と種々の遺伝子工学的手法とを用いることにより、より
効率的な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの製造法をもたらし
めるものである。
【００３０】
配列番号：１ 配列の長さ：３２２１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： genomic DNA 起源 生物名：サーマス サーモフィラス(Thermus thermophi
lus) 株名：ＨＢ８（ＡＴＣＣ２７６３４） TCTAGAGGAA GCATGAGCCT CACCCTGGCA GACAAGGTGG TCTACGAGGA GGAGATCCAG 60 AAAAGCCGCT TCATCGCCAA GGCGGCCCCC GTGGCCTCGG AGGAGGAGGC CTTGGCGTTT 120 TTGGCCGAGA ACCGGGAGCC TGAGGCCACC CACAACGGCC ACGCCTACAA GATCGGCCTC 180 CTCTACCGCT TCTCTGACGA CGGGGAGCCC TCGGGCACCG CAGGCAGGCC CATCCTCCAC 240 GCCATAGAGG CCCAGGGCCT GGACCGGGTG GCGGTCCTGG TGGTGCGCTA CTTCGGCGGG 300 GTGAAGCTCG GGGCCGGGGG GCTTGTGCGG GCCTACGGGG GGGTGGCGGC GGAGGCCTTA 360 AGGCGGGCGC CCAAGGTCCC CTTGGTGGAG CGGGTGGGGC TCGCCTTCCT CGTGCCCTTC 420 GCCGAGGTGG GCCGGGTCTA CGCCCTCCTG GAGGCCCGCG CCCCTGAAGG CCGAGGAGAC 480 CTACACCCCG GAGGCGTGCG CTTCGCCCTC CTCCTCCCCA AGCCCGAGCG GGAAGGTTTC 540 CTCAGGGCGC TCCTGGACGC CACCCGGGGA CAGGTGGCCC TGGAGTAGC ATG GAG 595 Met Glu 1 GCG ATG CTT CCG CTC TTT GAA CCC AAA GGC CGG GTC CTC CTG GTG GAC 643 Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu Val Asp 5 10 15 GGC CAC CAC CTG GCC TAC CGC ACC TTC TTC GCC CTG AAG GGC CTC ACC 691 Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly Leu Thr 20 25 30 ACG AGC CGG GGC GAA CCG GTG CAG GCG GTC TAC GGC TTC GCC AAG AGC 739 Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala Lys Ser 35 40 45 50 CTC CTC AAG GCC CTG AAG GAG GAC GGG TAC AAG GCC GTC TTC GTG GTC 787 Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala Val Phe Val Val 55 60 65 TTT GAC GCC AAG GCC CCC TCC TTC CGC CAC GAG GCC TAC GAG GCC TAC 835 Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu Ala Tyr 70 75 80 AAG GCG GGG AGG GCC CCG ACC CCC GAG GAC TTC CCC CGG CAG CTC GCC 883 Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu Ala 85 90 95 CTC ATC AAG GAG CTG GTG GAC CTC CTG GGG TTT ACC CGC CTC GAG GTC 931 Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu Glu Val 100 105 110 CCC GGC TAC GAG GCG GAC GAC GTT CTC GCC ACC CTG GCC AAG AAG GCG 979 Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys Lys Ala 115 120 125 130 GAA AAG GAG GGG TAC GAG GTG CGC ATC CTC ACC GCC GAC CGC GAC CTC 1027 Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg Asp Leu 135 140 145 TAC CAA CTC GTC TCC GAC CGC GTC GCC GTC CTC CAC CCC GAG GGC CAC 1075 Tyr Gln Leu Val Ser Asp Arg Val Ala Val Leu His Pro Glu Gly His 150 155 160 CTC ATC ACC CCG GAG TGG CTT TGG GAG AAG TAC GGC CTC AGG CCG GAG 1123 Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro Glu 165 170 175 CAG TGG GTG GAC TTC CGC GCC CTC GTG GGG GAC CCC TCC GAC AAC CTC 1171 Gln Trp Val Asp Phe Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp Asn Leu 180 185 190 CCC GGG GTC AAG GGC ATC GGG GAG AAG ACC GCC CTC AAG CTC CTC AAG 1219 Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu Leu Lys 195 200 205 210 GAG TGG GGA AGC CTG GAA AAC CTC CTC AAG AAC CTG GAC CGG GTA AAG 1267 Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Val Lys 215 220 225 CCA GAA AAC GTC CGG GAG AAG ATC AAG GCC CAC CTG GAA GAC CTC AGG 1315 Pro Glu Asn Val Arg Glu Lys Ile Lys Ala His Leu Glu Asp Leu Arg 230 235 240 CTC TCC TTG GAG CTC TCC CGG GTG CGC ACC GAC CTC CCC CTG GAG GTG 1363 Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val 245 250 255 GAC CTC GCC CAG GGG CGG GAG CCC GAC CGG GAG GGG CTT AGG GCC TTC 1411 Asp Leu Ala Gln Gly Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg Ala Phe 260 265 270 CTG GAG AGG CTG GAG TTC GGC AGC CTC CTC CAC GAG TTC GGC CTC CTG 1459 Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu 275 280 285 290 GAG GCC CCC GCC CCC CTG GAG GAG GCC CCC TGG CCC CCG CCG GAA GGG 1507 Glu Ala Pro Ala Pro Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly 295 300 305 GCC TTC GTG GGC TTC GTC CTC TCC CGC CCC GAG CCC ATG TGG GCG GAG 1555 Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Pro Glu Pro Met Trp Ala Glu 310 315 320 CTT AAA GCC CTG GCC GCC TGC AGG GAC GGC CGG GTG CAC CGG GCA GCA 1603 Leu Lys Ala Leu Ala Ala Cys Arg Asp Gly Arg Val His Arg Ala Ala 325 330 335 GAC CCC TTG GCG GGG CTA AAG GAC CTC AAG GAG GTC CGG GGC CTC CTC 1651 Asp Pro Leu Ala Gly Leu Lys Asp Leu Lys Glu Val Arg Gly Leu Leu 340 345 350 GCC AAG GAC CTC GCC GTC TTG GCC TCG AGG GAG GGG CTA GAC CTC GTG 1699 Ala Lys Asp Leu Ala Val Leu Ala Ser Arg Glu Gly Leu Asp Leu Val 355 360 365 370 CCC GGG GAC GAC CCC ATG CTC CTC GCC TAC CTC CTG GAC CCC TCC AAC 1747 Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn 375 380 385 ACC ACC CCC GAG GGG GTG GCG CGG CGC TAC GGG GGG GAG TGG ACG GAG 1795 Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu 390 395 400 GAC GCC GCC CAC CGG GCC CTC CTC TCG GAG AGG CTC CAT CGG AAC CTC 1843 Asp Ala Ala His Arg Ala Leu Leu Ser Glu Arg Leu His Arg Asn Leu 405 410 415 CTT AAG CGC CTC GAG GGG GAG GAG AAG CTC CTT TGG CTC TAC CAC GAG 1891 Leu Lys Arg Leu Glu Gly Glu Glu Lys Leu Leu Trp Leu Tyr His Glu 420 425 430 GTG GAA AAG CCC CTC TCC CGG GTC CTG GCC CAC ATG GAG GCC ACC GGG 1939 Val Glu Lys Pro Leu Ser Arg Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly 435 440 445 450 GTA CGG CGG GAC GTG GCC TAC CTT CAG GCC CTT TCC CTG GAG CTT GCG 1987 Val Arg Arg Asp Val Ala Tyr Leu Gln Ala Leu Ser Leu Glu Leu Ala 455 460 465 GAG GAG ATC CGC CGC CTC GAG GAG GAG GTC TTC CGC TTG GCG GGC CAC 2035 Glu Glu Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His 470 475 480 CCC TTC AAC CTC AAC TCC CGG GAC CAG CTG GAA AGG GTG CTC TTT GAC 2083 Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp 485 490 495 GAG CTT AGG CTT CCC GCC TTG GGG AAG ACG CAA AAG ACA GGC AAG CGC 2131 Glu Leu Arg Leu Pro Ala Leu Gly Lys Thr Gln Lys Thr Gly Lys Arg 500 505 510 TCC ACC AGC GCC GCG GTG CTG GAG GCC CTA CGG GAG GCC CAC CCC ATC 2179 Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile 515 520 525 530 GTG GAG AAG ATC CTC CAG CAC CGG GAG CTC ACC AAG CTC AAG AAC ACC 2227 Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Asn Thr 535 540 545 TAC GTG GAC CCC CTC CCA AGC CTC GTC CAC CCG AGG ACG GGC CGC CTC 2275 Tyr Val Asp Pro Leu Pro Ser Leu Val His Pro Arg Thr Gly Arg Leu 550 555 560 CAC ACC CGC TTC AAC CAG ACG GCC ACG GCC ACG GGG AGG CTT AGT AGC 2323 His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser 565 570 575 TCC GAC CCC AAC CTG CAG AAC ATC CCC GTC CGC ACC CCC TTG GGC CAG 2371 Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln 580 585 590 AGG ATC CGC CGG GCC TTC GTG GCC GAG GCG GGT TGG GCG TTG GTG GCC 2419 Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu Val Ala 595 600 605 610 CTG GAC TAT AGC CAG ATA GAG CTC CGC GTC CTC GCC CAC CTC TCC GGG 2467 615 620 625 GAC GAA AAC CTG ATC AGG GTC TTC CAG GAG GGG AAG GAC ATC CAC ACC 2515 Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Lys Asp Ile His Thr 630 635 640 CAG ACC GCA AGC TGG ATG TTC GGC GTC CCC CCG GAG GCC GTG GAC CCC 2563 Gln Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Pro Glu Ala Val Asp Pro 645 650 655 CTG ATG CGC CGG GCG GCC AAG ACG GTG AAC TTC GGC GTC CTC TAC GGC 2611 Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Val Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly 660 665 670 ATG TCC GCC CAT AGG CTC TCC CAG GAG CTT GCC ATC CCC TAC GAG GAG 2659 Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu 675 680 685 690 GCG GTG GCC TTT ATA GAG CGC TAC TTC CAA AGC TTC CCC AAG GTG CGG 2707 Ala Val Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg 695 700 705 GCC TGG ATA GAA AAG ACC CTG GAG GAG GGG AGG AAG CGG GGC TAC GTG 2755 Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly Tyr Val 710 715 720 GAA ACC CTC TTC GGA AGA AGG CGC TAC GTG CCC GAC CTC AAC GCC CGG 2803 Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Asn Ala Arg 725 730 735 GTG AAG AGC GTC AGG GAG GCC GCG GAG CGC ATG GCC TTC AAC ATG CCC 2851 Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro 740 745 750 GTC CAG GGC ACC GCC GCC GAC CTC ATG AAG CTC GCC ATG GTG AAG CTC 2899 Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu 755 760 765 770 Phe Pro Arg Leu Arg Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His 775 780 785 GAC GAG CTC CTC CTG GAG GCC CCC CAA GCG CGG GCC GAG GAG GTG GCG 2995 Asp Glu Leu Leu Leu Glu Ala Pro Gln Ala Arg Ala Glu Glu Val Ala 790 795 800 GCT TTG GCC AAG GAG GCC ATG GAG AAG GCC TAT CCC CTC GCC GTG CCC 3043 Ala Leu Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Ala Val Pro 805 810 815 CTG GAG GTG GAG GTG GGG ATG GGG GAG GAC TGG CTT TCC GCC AAG GGT 3091 Leu Glu Val Glu Val Gly Met Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Gly 820 825 830 TAGGGGGGCC CTGCCGTTTA GAGGAAGTTC AAGGGGTTGT CCCTCAGAAA CGCCTCCAGG 3151 GGAACGCCCT CTGGGCCTAC CAGGAGGCCT TTAGCCCCAA AGGTGCGGGT GAAGGCTTCC 3211 AGGCCCTGGG 3221
lus) 株名：ＨＢ８（ＡＴＣＣ２７６３４） TCTAGAGGAA GCATGAGCCT CACCCTGGCA GACAAGGTGG TCTACGAGGA GGAGATCCAG 60 AAAAGCCGCT TCATCGCCAA GGCGGCCCCC GTGGCCTCGG AGGAGGAGGC CTTGGCGTTT 120 TTGGCCGAGA ACCGGGAGCC TGAGGCCACC CACAACGGCC ACGCCTACAA GATCGGCCTC 180 CTCTACCGCT TCTCTGACGA CGGGGAGCCC TCGGGCACCG CAGGCAGGCC CATCCTCCAC 240 GCCATAGAGG CCCAGGGCCT GGACCGGGTG GCGGTCCTGG TGGTGCGCTA CTTCGGCGGG 300 GTGAAGCTCG GGGCCGGGGG GCTTGTGCGG GCCTACGGGG GGGTGGCGGC GGAGGCCTTA 360 AGGCGGGCGC CCAAGGTCCC CTTGGTGGAG CGGGTGGGGC TCGCCTTCCT CGTGCCCTTC 420 GCCGAGGTGG GCCGGGTCTA CGCCCTCCTG GAGGCCCGCG CCCCTGAAGG CCGAGGAGAC 480 CTACACCCCG GAGGCGTGCG CTTCGCCCTC CTCCTCCCCA AGCCCGAGCG GGAAGGTTTC 540 CTCAGGGCGC TCCTGGACGC CACCCGGGGA CAGGTGGCCC TGGAGTAGC ATG GAG 595 Met Glu 1 GCG ATG CTT CCG CTC TTT GAA CCC AAA GGC CGG GTC CTC CTG GTG GAC 643 Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu Val Asp 5 10 15 GGC CAC CAC CTG GCC TAC CGC ACC TTC TTC GCC CTG AAG GGC CTC ACC 691 Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly Leu Thr 20 25 30 ACG AGC CGG GGC GAA CCG GTG CAG GCG GTC TAC GGC TTC GCC AAG AGC 739 Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala Lys Ser 35 40 45 50 CTC CTC AAG GCC CTG AAG GAG GAC GGG TAC AAG GCC GTC TTC GTG GTC 787 Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala Val Phe Val Val 55 60 65 TTT GAC GCC AAG GCC CCC TCC TTC CGC CAC GAG GCC TAC GAG GCC TAC 835 Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu Ala Tyr 70 75 80 AAG GCG GGG AGG GCC CCG ACC CCC GAG GAC TTC CCC CGG CAG CTC GCC 883 Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu Ala 85 90 95 CTC ATC AAG GAG CTG GTG GAC CTC CTG GGG TTT ACC CGC CTC GAG GTC 931 Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu Glu Val 100 105 110 CCC GGC TAC GAG GCG GAC GAC GTT CTC GCC ACC CTG GCC AAG AAG GCG 979 Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys Lys Ala 115 120 125 130 GAA AAG GAG GGG TAC GAG GTG CGC ATC CTC ACC GCC GAC CGC GAC CTC 1027 Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg Asp Leu 135 140 145 TAC CAA CTC GTC TCC GAC CGC GTC GCC GTC CTC CAC CCC GAG GGC CAC 1075 Tyr Gln Leu Val Ser Asp Arg Val Ala Val Leu His Pro Glu Gly His 150 155 160 CTC ATC ACC CCG GAG TGG CTT TGG GAG AAG TAC GGC CTC AGG CCG GAG 1123 Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro Glu 165 170 175 CAG TGG GTG GAC TTC CGC GCC CTC GTG GGG GAC CCC TCC GAC AAC CTC 1171 Gln Trp Val Asp Phe Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp Asn Leu 180 185 190 CCC GGG GTC AAG GGC ATC GGG GAG AAG ACC GCC CTC AAG CTC CTC AAG 1219 Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu Leu Lys 195 200 205 210 GAG TGG GGA AGC CTG GAA AAC CTC CTC AAG AAC CTG GAC CGG GTA AAG 1267 Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Val Lys 215 220 225 CCA GAA AAC GTC CGG GAG AAG ATC AAG GCC CAC CTG GAA GAC CTC AGG 1315 Pro Glu Asn Val Arg Glu Lys Ile Lys Ala His Leu Glu Asp Leu Arg 230 235 240 CTC TCC TTG GAG CTC TCC CGG GTG CGC ACC GAC CTC CCC CTG GAG GTG 1363 Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val 245 250 255 GAC CTC GCC CAG GGG CGG GAG CCC GAC CGG GAG GGG CTT AGG GCC TTC 1411 Asp Leu Ala Gln Gly Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg Ala Phe 260 265 270 CTG GAG AGG CTG GAG TTC GGC AGC CTC CTC CAC GAG TTC GGC CTC CTG 1459 Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu 275 280 285 290 GAG GCC CCC GCC CCC CTG GAG GAG GCC CCC TGG CCC CCG CCG GAA GGG 1507 Glu Ala Pro Ala Pro Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly 295 300 305 GCC TTC GTG GGC TTC GTC CTC TCC CGC CCC GAG CCC ATG TGG GCG GAG 1555 Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Pro Glu Pro Met Trp Ala Glu 310 315 320 CTT AAA GCC CTG GCC GCC TGC AGG GAC GGC CGG GTG CAC CGG GCA GCA 1603 Leu Lys Ala Leu Ala Ala Cys Arg Asp Gly Arg Val His Arg Ala Ala 325 330 335 GAC CCC TTG GCG GGG CTA AAG GAC CTC AAG GAG GTC CGG GGC CTC CTC 1651 Asp Pro Leu Ala Gly Leu Lys Asp Leu Lys Glu Val Arg Gly Leu Leu 340 345 350 GCC AAG GAC CTC GCC GTC TTG GCC TCG AGG GAG GGG CTA GAC CTC GTG 1699 Ala Lys Asp Leu Ala Val Leu Ala Ser Arg Glu Gly Leu Asp Leu Val 355 360 365 370 CCC GGG GAC GAC CCC ATG CTC CTC GCC TAC CTC CTG GAC CCC TCC AAC 1747 Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn 375 380 385 ACC ACC CCC GAG GGG GTG GCG CGG CGC TAC GGG GGG GAG TGG ACG GAG 1795 Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu 390 395 400 GAC GCC GCC CAC CGG GCC CTC CTC TCG GAG AGG CTC CAT CGG AAC CTC 1843 Asp Ala Ala His Arg Ala Leu Leu Ser Glu Arg Leu His Arg Asn Leu 405 410 415 CTT AAG CGC CTC GAG GGG GAG GAG AAG CTC CTT TGG CTC TAC CAC GAG 1891 Leu Lys Arg Leu Glu Gly Glu Glu Lys Leu Leu Trp Leu Tyr His Glu 420 425 430 GTG GAA AAG CCC CTC TCC CGG GTC CTG GCC CAC ATG GAG GCC ACC GGG 1939 Val Glu Lys Pro Leu Ser Arg Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly 435 440 445 450 GTA CGG CGG GAC GTG GCC TAC CTT CAG GCC CTT TCC CTG GAG CTT GCG 1987 Val Arg Arg Asp Val Ala Tyr Leu Gln Ala Leu Ser Leu Glu Leu Ala 455 460 465 GAG GAG ATC CGC CGC CTC GAG GAG GAG GTC TTC CGC TTG GCG GGC CAC 2035 Glu Glu Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His 470 475 480 CCC TTC AAC CTC AAC TCC CGG GAC CAG CTG GAA AGG GTG CTC TTT GAC 2083 Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp 485 490 495 GAG CTT AGG CTT CCC GCC TTG GGG AAG ACG CAA AAG ACA GGC AAG CGC 2131 Glu Leu Arg Leu Pro Ala Leu Gly Lys Thr Gln Lys Thr Gly Lys Arg 500 505 510 TCC ACC AGC GCC GCG GTG CTG GAG GCC CTA CGG GAG GCC CAC CCC ATC 2179 Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile 515 520 525 530 GTG GAG AAG ATC CTC CAG CAC CGG GAG CTC ACC AAG CTC AAG AAC ACC 2227 Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Asn Thr 535 540 545 TAC GTG GAC CCC CTC CCA AGC CTC GTC CAC CCG AGG ACG GGC CGC CTC 2275 Tyr Val Asp Pro Leu Pro Ser Leu Val His Pro Arg Thr Gly Arg Leu 550 555 560 CAC ACC CGC TTC AAC CAG ACG GCC ACG GCC ACG GGG AGG CTT AGT AGC 2323 His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser 565 570 575 TCC GAC CCC AAC CTG CAG AAC ATC CCC GTC CGC ACC CCC TTG GGC CAG 2371 Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln 580 585 590 AGG ATC CGC CGG GCC TTC GTG GCC GAG GCG GGT TGG GCG TTG GTG GCC 2419 Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu Val Ala 595 600 605 610 CTG GAC TAT AGC CAG ATA GAG CTC CGC GTC CTC GCC CAC CTC TCC GGG 2467 615 620 625 GAC GAA AAC CTG ATC AGG GTC TTC CAG GAG GGG AAG GAC ATC CAC ACC 2515 Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Lys Asp Ile His Thr 630 635 640 CAG ACC GCA AGC TGG ATG TTC GGC GTC CCC CCG GAG GCC GTG GAC CCC 2563 Gln Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Pro Glu Ala Val Asp Pro 645 650 655 CTG ATG CGC CGG GCG GCC AAG ACG GTG AAC TTC GGC GTC CTC TAC GGC 2611 Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Val Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly 660 665 670 ATG TCC GCC CAT AGG CTC TCC CAG GAG CTT GCC ATC CCC TAC GAG GAG 2659 Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu 675 680 685 690 GCG GTG GCC TTT ATA GAG CGC TAC TTC CAA AGC TTC CCC AAG GTG CGG 2707 Ala Val Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg 695 700 705 GCC TGG ATA GAA AAG ACC CTG GAG GAG GGG AGG AAG CGG GGC TAC GTG 2755 Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly Tyr Val 710 715 720 GAA ACC CTC TTC GGA AGA AGG CGC TAC GTG CCC GAC CTC AAC GCC CGG 2803 Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Asn Ala Arg 725 730 735 GTG AAG AGC GTC AGG GAG GCC GCG GAG CGC ATG GCC TTC AAC ATG CCC 2851 Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro 740 745 750 GTC CAG GGC ACC GCC GCC GAC CTC ATG AAG CTC GCC ATG GTG AAG CTC 2899 Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu 755 760 765 770 Phe Pro Arg Leu Arg Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His 775 780 785 GAC GAG CTC CTC CTG GAG GCC CCC CAA GCG CGG GCC GAG GAG GTG GCG 2995 Asp Glu Leu Leu Leu Glu Ala Pro Gln Ala Arg Ala Glu Glu Val Ala 790 795 800 GCT TTG GCC AAG GAG GCC ATG GAG AAG GCC TAT CCC CTC GCC GTG CCC 3043 Ala Leu Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Ala Val Pro 805 810 815 CTG GAG GTG GAG GTG GGG ATG GGG GAG GAC TGG CTT TCC GCC AAG GGT 3091 Leu Glu Val Glu Val Gly Met Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Gly 820 825 830 TAGGGGGGCC CTGCCGTTTA GAGGAAGTTC AAGGGGTTGT CCCTCAGAAA CGCCTCCAGG 3151 GGAACGCCCT CTGGGCCTAC CAGGAGGCCT TTAGCCCCAA AGGTGCGGGT GAAGGCTTCC 3211 AGGCCCTGGG 3221
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＵＰＬ１の構築方法を示す図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01）
Claims (5)
- 【請求項１】 サーマス サーモフィラス（Thermus th
ermophirus）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ又は該耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼと機能的同等物をコードしてい
るＤＮＡ。 - 【請求項２】 ＤＮＡが配列表の配列番号１に記載され
た塩基配列又はそれらと均等な塩基配列をコードしてい
る請求項１に記載されたＤＮＡ。 - 【請求項３】 請求項１のＤＮＡを含有する組換えベク
ター。 - 【請求項４】 宿主細胞を請求項３の組換えベクターで
形質転換した形質転換体。 - 【請求項５】 請求項４の形質転換体を培養して、耐熱
性ＤＮＡポリメラーゼを産生させ、ついで該耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼを採取することを特徴とする耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12464392A JPH05317058A (ja) | 1992-05-18 | 1992-05-18 | 耐熱性ｄｎａポリメラーゼの遺伝情報を有するｄｎａ断片およびその用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12464392A JPH05317058A (ja) | 1992-05-18 | 1992-05-18 | 耐熱性ｄｎａポリメラーゼの遺伝情報を有するｄｎａ断片およびその用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05317058A true JPH05317058A (ja) | 1993-12-03 |
Family
ID=14890485
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12464392A Pending JPH05317058A (ja) | 1992-05-18 | 1992-05-18 | 耐熱性ｄｎａポリメラーゼの遺伝情報を有するｄｎａ断片およびその用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05317058A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110023493A (zh) * | 2016-11-22 | 2019-07-16 | 东洋纺株式会社 | 经改变的耐热性dna聚合酶 |
-
1992
- 1992-05-18 JP JP12464392A patent/JPH05317058A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110023493A (zh) * | 2016-11-22 | 2019-07-16 | 东洋纺株式会社 | 经改变的耐热性dna聚合酶 |
| CN116376869A (zh) * | 2016-11-22 | 2023-07-04 | 东洋纺株式会社 | 经改变的耐热性dna聚合酶 |
| US12241095B2 (en) | 2016-11-22 | 2025-03-04 | Toyobo Co., Ltd. | Modified heat-resistant DNA polymerase |
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