JPH06500020A - サーモトガ・マリチマ由来の熱安定性核酸ポリメラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 サーモタガ・マリチマから精製された熱安定性核酸ポリメラーゼ酵素 技術分野 本発明は、超好熱性ニーバクテリア（ｅｕ　ｂａｃｔｅｒｉａ）サーモタガ・マ リチｖ　（Ｔｈｅｒｍｏｔａｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ）から精製された、熱安定 性ＤＮＡポリメラーゼおよび前記酵素を単離および生産する手段に関する。熱安 定性ＤＮＡポリメラーゼは、多数の組換えＤＮＡ技術、ことにポリメラーゼ連鎖 反応（ＰＣＲ）による核酸の増幅において有用である。

背景の技術 バクテリアであるサーモタガ・マリチｖ　（Ｔｈｅｒｍｏｔａｇａ　ｍａｒｉｔ ｉｍａ）の分離はＨｕｂｅｒら、１９８６．　Ａｒｃｈ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 、　１４４：３２４−３３３に記載されている。サーモタガ・マリチマ（Ｔ、　 ｍａｒｉｔｉｍａ）は、偏性嫌気性、樽形、発酵性、超好熱性であり、そして５ ５°Ｃ〜９０”Ｃにおいて増殖し、至適な増殖温度は約８０℃である。このニー バクテリウムは、イタリーおよびアゾレスにおける地熱で加熱された海底から単 離された。

サーモタガ−７リチ７　（Ｔｈｅｒｍｏｔａｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ）細胞は鞘 様構造および単毛の鞭毛を有する。サーモタガ・マリチマ（Ｔ、　ｍａｒｉｔｉ ｍａ）はムレインおよび脂肪酸含有脂質、ジフテリア毒素抵抗性延長因子２、Ｒ ＮＡポリメラーゼサブユニットのパターン、および抗生物質に対する感受性によ りニーバクテリア界に分類される。

広範な研究が中温性微生物、例えば、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）がらのＤＮＡポ リメラーゼの単離について実施されてきている。例えば、Ｂｅｓｓｍａｎら、１ ９５７．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２２３：１７１−１７７、およびＢｕ ｔｔｉｎおよびＫｏｒｎｂｅｒｇ、　１９９６．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、 　２４１：５４１９−５４２７を参照のこと。

好熱性細菌、例エバ、サーモタガ−７リチ７　（Ｔｈｅｒｍｏｔａｇａ　ｍａｒ ｉｔｉｍａ）からのＤＮＡポリメラーゼの単離および精製につＩ、ｚてなされて し）る研究は非常に少ない。サームス・アクアチフス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕ ａｔｉｃｕｓ）ＹＴ−１菌株の細胞からのＤＮＡポリメラーゼ活性（こりし１て の６エ程の単離および濃縮が、Ｋａｌｅｄｉｎら、１９８７．　Ｂｉｏｋｈｙｍ ｉｙａ、　４５：６４４−６５１ｉこ開示されている。これらの工程は、粗製の 抽出物の単離、ＤＥＡＥ−セルロースのクロマトグラフィー、ヒドロキシアノく タイト（こよる分Ｚ１、ＤＥＡＥ−セルロースによる分別、および−重鎖ＤＮＡ −セルロースのクロマトグラフィーを包含する。精製された酵素の分子量１′！ 、Ｋａｌｅｄｉｎらにより６２．０００ダルトン／モノマー単位として報告され た。

サームス・アクアチフス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）からのボ１ツ メラーゼの第２の濃縮のスキームは、Ｃｈｉｅｎら、１９７６、　Ｊ、Ｂａｃｔ ｅｒｉｏｌ、、　１２７：１５５０−１５５７に記載されている。この方法にお いては、粗製の抽出物をＤＥＡＥ−セファデックス（５ｅｐｈａｄｅｘ）カラム に適用する。次（為で、プールし透析した分画をホスホセルロースのカラムで処 理する。プールした分画を透析し、そしてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加 してポリメラーゼ活性の損失を防止する。生ずる混合物をＤＮＡ−セルロースカ ラムに負荷する。カラムからプールした物質を透析する。

精製されたタンパク質の分子量は約６３．０００〜６８．０００であると報告さ れている。

熱安定性酵素、例えば、ＣｈｉｅｎらおよびＫａｌｅｄｉｎらにより記載されて いる酵素を使用して、現存する核酸配列を最初に存在する量と比較して大量に増 幅することは、米国特許第４．６８３．１９５号；米国特許第４．６８３．２０ ２号および米国特許第４．９６５．１８８号に記載されており、これらはＰＣＲ 法を記載しており、それら開示の各々を引用によってここに加える。プライマー 、鋳型、ヌクレオシド三リン酸、適当な緩衝液および反応条件、およびポリメラ ーゼをＰＣＲ法において使用し、この方法は標的ＤＮＡの変性、プライマーのハ イブリダイゼーション、および相補的鎖の合成を包含する。各プライマーの伸長 生成物は、所望の核酸配列の生成のための鋳型となる。これらの特許が開示する ように、使用するポリメラーゼが熱安定性酵素である場合、ポリメラーゼは各変 性工程後に添加することは必要ではない。なぜなら、熱はポリメラーゼ活性を破 壊しないからである。

米国特許第４．８８９．８１８号、欧州特許公開第２５８．０１７号、およびＰ ＣＴ公開１１ｈ８３１０６６９１号（それらの開示をここに引用によって加える ）は、サームス・アクアチフス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）からの 約９４ｋＤａの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの単離および組み換え発現およびＰ ＣＲにおけるそのポリメラーゼの使用を記載している。サームス・アクアチフス （Ｔ、　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼはＰＣＲおよび他の組み換 えＤＮＡ技術における使用のためにことに好ましいが、他の熱安定性ポリメラー ゼが要求されている。

したがって、前述のＰＣＲ法を改良し、そして他の組換え技術、例えば、ＤＮＡ の配列決定、ニック翻訳、およびなお逆転写において熱安定性ＤＮＡポリメラー ゼを使用するとき、得られる結果を改良するために使用することができる、精製 された、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを生産することはこの分野において望まれ ている。本発明は、サーモタガ−ｖリチｖ　（Ｔｈｅｒｍｏｔａｇａ　ｍａｒｉ ｔｉｍａ）のＤＮＡポリメラーゼのための組み換え発現ベクターおよび精製のプ ロトコルを提供することによって、その要求を満足することを促進する。

発明の開示 本発明は、ヌクレオシド三リン酸の組合による、核酸鋳型鎖に対して相補的であ る核酸鎖の形成を触媒する、精製された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ■酵素を提 供する。精製された酵素（より−モタガ・であり、そして５ＤＳ−ＰＡＧＥによ り測定して約９７キロダルトン（ｋＤａ）の分子量および、１０２ｋＤａの、Ｔ ｍａ　ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列から推定される分子量有す る。この精製された物質（よＰＣＲにおいて使用して、最初に存在する量と比較 して大きし）量の所定の核酸配列を生産することができるので、これらの配Ｆｌ を容易（＝操作および／または分析することができる。

サーモタガ・マリチア　（Ｔｈｅｒｍｏｔａｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ）力１らの Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードする遺伝子も同定され、クローニング され、配列決定され、そして高いレベルで発現され、そしてなお本発明の熱安定 性酵素を調製するための他の手段を提供する。完全な遺伝子およびＴｍａ酵素の ためのコード配列に加えて、Ｔｍａ　ＤＮＡボ１ツメラーゼのためのコード配列 の誘導体もまた提供される。

本発明はまた、１種または２種以上の非イオン性ボＩＪマーの洗剤を含有する緩 衝液中の前述の精製された熱安定性Ｔｍａ酵素を含んでなる安定な酵素組成物を 包含する。

最後に、本発明は本発明の熱安定性ポリメラーゼを精製する方法を提供する。こ の方法は、サーモタガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔａｇａ物中のすべての核酸か ら解離するように、粗抽出物のイオン強度を調節し、該抽出物を疎水性相互作用 クロマトグラフィ一番二力１１敷該抽出物をＤＮＡ結合結合性タンパクツアフィ ニティークロマトグラフィーけ、該抽出物をアニオン交換クロマトグラフィーま た（よりチオン交換クロマトグラフィーまたはヒドロキシアノ（タイトクロマト グラフィーにかけることを包含する。好ましし１実施態様（こおし）て、これら の工程は順次に前述の順序で実施される。ヌクレオチド゛結合性タンパク質アフ ィニティークロマトグラフィーの工程は、ＤＮＡポリメラーゼをエンドヌクレア ーゼのタンパク質から単離するために好ましい。

発明を実施するための態様 本発明は、Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ配列および発現ベク ター、Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼの精製のプロトコル、精製されたＴｍａ　Ｄ ＮＡポリメラーゼの調製、およびＴｍａ　ＤＮＡポリメラーゼを使用する方法を 提供する。本発明の理解を促進するために、多数の用語を下に定義する。

用語「細胞」または「細胞系」は互換的に使用し、そしてすべてのこのような表 示は子孫を包含する。こうして、語「形質転換体」または「形質転換された細胞 」は、転移の数に無関係に、−次形質転換細胞、およびその細胞から誘導された 培養物を包含する。すべての子孫は、意図的のまたは偶発的突然変異のために、 ＤＮＡ含有が正確に同一でないことがある。もとの形質転換された細胞について スクリーニングしたとき同一の機能有する突然変異子孫は、形質転換体の定義の 中に含められる。

用語「コントロール」は、特定の宿主生物体における作用可能に連鎖したコード 配列の発現に必要なりＮＡ配列を呼ぶ。例えば、原核生物に適当なコントロール 配列はプロモーター、必要に応じて、オペレーター配列、リポソーム結合部位、 および可能ならば他の配列、例えば、転写停止配列を包含する。

用語「発現系」は、所望のコード配列およびコントロール配列を作用可能な連鎖 で含有するＤＮＡ配列を呼び、こうしてこれらの配列で形質転換された宿主はコ ードされたタンパク質を生産することができる。形質転換を実施するために、発 現系をベクター上に含めることかできる：関係するＤＮＡはまた、宿主の染色体 の中に組み込むことかできる。

用語「遺伝子」は、回収可能な生物活性ポリペプチドまたは前駆体の発現をコー ドするＤＮＡ配列を呼ぶ。こうして、Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子はポリ メラーゼおよびＴｍａ　ＤＮＡポリメラーゼのコード配列を含む。ポリペプチド は、全長のコード配列によるか、あるいは所望の酵素活性が保持されるかぎりコ ード配列の一部分によりコードされることかできる。

用語［作用可能に連鎖した」は、コントロール配列かコードされたタンパク質の 発現を推進するために機能するように、コード配列の位置を決定することに関す る。こうして、コントロール配列に「作用可能に連鎖した」コード配列は、コー ド配列がコントロール配列の指令下に発現されることができるようなコンフィグ レーションに関する。

用語「混合物」は、それかＴｍａポリメラーゼを含有する混合物に関係するとき 、Ｔｍａポリメラーゼを含むが、さらに他のタンパク質を含むことができる、物 質の集まりを呼ぶ。Ｔｍａポリメラーゼが組換え宿主細胞に由来する場合、他の タンパク質は通常宿主細胞に関連するであろう。宿主が細菌である場合、汚染す るタンパク質は細菌のタンパク質であろう。

用語「非イオン性ポリマー洗剤」は、イオンの電荷もせず、そして、本発明の目 的のために、約３．５〜約９．５のｐＨ範囲でＴｍａ酵素を可溶化する能力によ り特徴づけられる表面活性剤を意味する。適当な非イオン性ポリマー洗剤の多数 の例は、米国特許同時継続出願筒３８７、００３号、１９８９年７月２８日提出 （その開示をここに引用によって加える）に記載されている。

用語「オリゴヌクレオチド」は、ここで使用するとき、２またはそれより多く、 好ましくは３またはそれより多くの、通常ＩＯより多いデオキシリボヌクレオチ ドまたはりボヌクレオチドから構成された分子として定義される。正確な大きさ は多数の因子に依存し、次いでこれらの因子はオリゴヌクレオチドの究極の機能 またはその使用に依存する。オリゴヌクレオチドは合成的にまたはクローニング により誘導することができる。

用語「プライマー」は、ここで使用するとき、プライマーの発現か開始される条 件下に配置されたとき、合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレ オチドを呼ぶ。オリゴヌクレオチドの「プライマー」は、精製された制限消化物 におけるように、天然に存在することができるか、あるいは合成的に生成するこ とができる。

核酸鎖に対して相補的であるプライマーの発現生成物の合成は、４つの異なるヌ クレオシド三リン酸およびＴｍａ熱安定性酵素の存在下に適当な緩衝液の中で適 当な温度において開始される。「緩衝液」は、所望のｐＨに調節された、コファ クター（例えば、２価の金属イオン）および塩（適当なイオン強度を与えるため に）を含む。Ｔｍａポリメラーゼについて、緩衝液は好ましくは１〜３ｍＭのマ グネシウム塩、好ましくはＭｇＣｌ２．５０〜２００μＭの各ヌクレオシド三リ ン酸、および０．２〜ｌμＭの各プライマー、ならびに５０ｍＭのＫＣＩ、　１ ０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８，０〜８．４）、および１００μｇ／ｍｌのゼラ チン（しかしゼラチンは要求されず、そしである応用において、例えば、ＤＮＡ の配列決定において回避すべきである）を含有する。

プライマーは増幅における効率を最大とするためには一本鎖であるが、二本鎖で あることができる。二本鎖である場合、プライマーをまず処理してその鎖を単離 した後、発現生成物の調製のために使用する。プライマーは通常オリゴデオキシ リボヌクレオチドである。

プライマーは、ポリメラーゼ酵素の存在下に伸長生成物の合成をプライミングす るために十分に長くなくてはならない。プライマーの正確な長さは多数の因子、 例えば、プライマー源および所望の結果に依存し、そして反応温度は鋳型へのプ ライマーの適切なアニーリングを保証するためのプライマーの長さに依存して調 節しなくてはならない。標的配列の複雑さに依存して、オリゴヌクレオチドブラ イマーは典型的には！５〜３５ヌクレオチドを含有する。短いプライマー分子は 、一般に、十分に安定な鋳型との複合体を形成するために、より下い温度を必要 とするであろう。

プライマーは、鋳型の特定の配列の鎖に対して「実質的に」相補的であるように 選択すべきである。プライマーは、十分に相補的であって、プライマーの延長が 起こるように鋳型の鎖とハイブリダイゼーションしなくてはならない。プライマ ーの配列は、鋳型の正確な配列を反映することは必要ではない。例えば、非相補 的ヌクレオチドの断片は、プライマーの５′末端に結合することができ、プライ マーの配列の残部はその鎖に対して実質的に相補的である。非相補的塩基または より長い配列をプライマーの中に介在させることができるが、ただしプライマー は鋳型の配列と十分に相補的であって、ハイブリダイゼーションし、これにより プライマーの伸長生成物の合成のための鋳型／プライマー複合体を形成すること を条件とする。

用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」は、二本鎖ＤＮＡを特定の ヌクレオチド配列でまたはその付近で切断する細菌酵素を呼ぶ。

用語「熱安定性酵素」は、加熱に対して安定でありかつ耐熱性であり、そしてヌ クレオチドの結合を適切な方法で触媒（促進）して、核酸鎖に対して相補的であ る伸長生成物を形成する酵素を意味する。

一般に、プライマー伸長生成物の合成は、プライマーの３′末端において開始し 、そして合成が停止するまで鋳型の配列の５′末端に向かって進行する。熱安定 性酵素は、８０°Ｃ〜１０５°Ｃの温度に短時間（すなわち、５〜３０秒）暴露 した後、復元しかつ活性を再び獲得しなくてはならず、そして６０°Ｃ以上の至 適温度をもたな（ではならない。

本発明のＴｍａの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、ポリメラーゼ連鎖反応ま たはＰＣＲとして知られている増幅反応における有効な使用のための要件を満足 する。Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、ＰＣＲ法において主要な工程である 、二本鎖の核酸の変性を実施するために必要な時間の間、高温に暴露したとき、 不可逆的に変性（不活性化）しない。ここにおける目的のため、酵素の不可逆的 変性は、酵素的活性の永久的かつ完全な損失を意味する。

核酸の変性を実施するために必要な加熱条件は、例えば、緩衝液の塩濃度および 組成、変性される核酸の長さおよび量に依存するが、典型的には変性温度は数秒 〜数分間で約８０°Ｃ〜約１０５℃である。緩衝液の塩濃度および／または核酸 のＧＣ組成が増加するにつれて、より高い温度を必要とすることがある。Ｔｍａ 酵素は約８０℃〜１０５℃の温度に比較的短い暴露で不可逆的に変性しない。

Ｔｍａの熱安定性酵素は、約６０°Ｃより高い、それが機能する至適温度有する 。６０°Ｃより低い温度はプライマーの鋳型へのハイブリダイゼーシヨンを促進 するが、塩の組成および濃度およびプライマーの組成および長さに依存して、鋳 型へのハイブリダイゼーションはより高い温度（例えば、６０°Ｃ〜８０°Ｃ） において起こることができ、これはプライマー延長反応の特異性を促進すること ができる。酵素のための至適温度が高くなればなるほど、プライマー指令の伸長 反応の特異性および／または選択性はより大きくなるであろう。Ｔｍａ酵素は約 ４５°Ｃ〜９０℃の広い温度範囲にわたって活性を示す；好ましい至適温度は７ ５°Ｃ〜８０℃である。

本発明はまた、サーモタガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔａｇａ　ｍａｒｉｔｉｍ ａ）の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ■活性をコードするＤＮＡ配列を提供する。

この配列によりコードされるアミノ酸配列は、サームス・アクアチする相同性存 する。Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の５’−ＡＴＧ開始コドンからＴＧＡ −３’停止コドンへの完全なコード配列は下に記載されており、そして配列を列 挙する節において配列番号：ｌとして列挙されている。この配列に参照のために 番号を付しである。

Ｉ　ＡＴＧＧＣＧＡＧＡＣＴＡＴＴＴＣＴＣＴＴ　ＴＧＡＴＧＧＡＡＣＴ　ＧＣ ＴＣＴＧＧＣＣＴ　ＡＣＡＧＡＧＣＧＴＡ５１　ＣＴＡＴＧＣＧＣＴＣＧＡＴＡ ＧＡＴＣＧＣＴＴＴＣＴＡＣＴＴＣＣＡＣＣＧＧＣＡＴＴ　ＣＣＣＡＣＡＡＡＣ Ｇｌｏｌ　ＣＣＡＣＡＴＡＣＧＧ　ＴＧＴＧＧＣＧＡＧＧ　ＡＴＧＣＴＧＧＴＧ Ａ　ＧＡＴＴＣＡＴＣＡＡ　ＡＧＡＣＣＡＴＡＴＣ１５１ＡＴＴＧＴＣＧＧＡＡ 　ＡＡＧＡＣＴＡＣＧＴ　ＴＧＣＴＧＴＧＧＣＴ　ＴＴＣＧＡＣＡＡＡＡ　ＡＡ ＧＣＴＧＣＣＡＣ２０１ＣＴＴＣＡＧＡＣＡＣＡＡＧＣＴＣＣＴＣＧ　ＡＧＡＣ ＴＴＡＣＡＡ　ＧＧＣＴＣＡＡＡＧＡ　ＣＣＡＡＡＧＡＣＴＣ２５１ＣＧＧＡＴ ＣＴＣＣＴ　ＧＡＴＴＣＡＧＣＡＧ　ＣＴＴＣＣＧＴＡＣＡ　ＴＡＡＡＧＡＡＧ ＣＴ　ＧＧＴＣＧＡＡＧＣＣ３０１ＣＴＴＧＧＡＡＴＧＡ　ＡＡＧＴＧＣＴＧＧ Ａ　ＧＧＴＡＧＡＡＧＧＡ　ＴＡＣＧＡＡＧＣＧＧ　ＡＣＧＡＴＡＴＡＡＴ３５ １　ＴＧＣＣＡＣＴＣＴＧ　ＧＣＴＧＴＧＡＡＧＧ　ＧＧＣＴＴＣＣＧＣＴ　Ｔ ＴＴＴＧＡＴＧＡＡ　ＡＴＡＴＴＣＡＴＡＧ４０１　ＴＧＡＣＣＧＧＡＧＡ　Ｔ ＡＡＡＧＡＣＡＴＧ　ＣＴＴＣＡＧＣＴＴＧ　ＴＧＡＡＣＧＡＡＡＡ　ＧＡＴＣ ＡＡＧＧＴＧ４５１　ＴＧＧＣＧＡＡＴＣＧ　ＴＡＡＡＡＧＧＧＡＴ　ＡＴＣＣ ＧＡＴＣＴＧ　ＧＡＡＣＴＴＴＡＣＧ　ＡＴＧＣＧＣＡＧＡＡ５０１　ＧＧＴＧ ＡＡＧＧＡＡ　ＡＡＡＴＡＣＧＧＴＧ　ＴＴＧＡＡＣＣＣＣＡ　ＧＣＡＧＡＴＣ ＣＣＧ　ＧＡＴＣＴＴＣＴＧＧ５５１　ＣＴＣＴＡＡＣＣＧＧ　ＡＧＡＴＧＡＡ ＡＴＡ　ＧＡＣＡＡＣＡＴＣＣＣＣＧＧＴＧＴＡＡＣＴＧＧＧＡＴＡＧＧＴ６０ １　ＧＡＡＡＡＧＡＣＴＧ　ＣＴＧＴＴＣＡＧＣＴ　ＴＣＴＡＧＡＧＡＡＧ　Ｔ ＡＣＡＡＡＧＡＣＣＴＣＧＡＡＧＡＣＡＴ６５１　ＡＣＴＧＡＡＴＣＡＴ　ＧＴ ＴＣＧＣＧＡＡＣＴＴＣＣＴＣＡＡＡＡ　ＧＧＴＧＡＧＡＡＡＡ　ＧＣＣＣＴＧ ＣＴＴＣ７０１ＧＡＧＡＣＡＧＡＧＡ　ＡＡＡＣＧＣＣＡＴＴ　ＣＴＣＡＧＣＡ ＡＡＡ　ＡＧＣＴＧＧＣＧＡＴ　ＴＣＴＧＧＡＡＡＣＡ７５１　ＡＡＣＧＴＴＣ ＣＣＡ　ＴＴＧＡＡＡＴＡＡＡ　ＣＴＧＧＧＡＡＧＡＡ　ＣＴＴＣＧＣＴＡＣＣ ＡＧＧＧＣＴＡＣＧＡ８０１　ＣＡＧＡＧＡＧＡＡＡ　ＣＴＣＴＴＡＣＣＡＣＴ ＴＴＴＧＡＡＡＧＡ　ＡＣＴＧＧＡＡＴＴＣＧＣＡＴＣＣＡＴＣＡ８５１　ＴＧ ＡＡＧＧＡＡＣＴ　ＴＣＡＡＣＴＧＴＡＣＧＡＡＧＡＧＴＣＣＧ　ＡＡＣＣＣＧ ＴＴＧＧ　ＡＴＡＣＡＧＡＡＴＡ９０１　ＧＴＧＡＡＡＧＡＣＣＴＡＧＴＧＧＡ ＡＴＴ　ＴＧＡＡＡＡＡＣＴＣＡＴＡＧＡＧＡＡＡＣＴＧＡＧＡＧＡＡＴＣ９５ １ＣＣＣＴＴＣＧＴＴＣＧＣＣＡＴＡＧＡＴＣＴＴＧＡＧＡＣＧＴＣＴＴＣＣＣ ＴＣＧＡＴ　ＣＣＴＴＴＣＧＡＣＴｌｏｏｌ　ＧＣＧＡＣＡＴＴＧＴ　ＣＧＧＴ ＡＴＣＴＣＴ　ＧＴＧＴＣＴＴＴＣＡ　ＡＡＣＣＡＡＡＧＧＡ　ＡＧＣＧＴＡＣ ＴＡＣ１０５１ＡＴＡＣＣＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＡＧＡＡＡ　ＣＧＣＣＣＡＧＡ ＡＣＣＴＧＧＡＣＧＡＡＡ　ＡＡＧＡＧＧＴＴＣＴｌｌｏｌ　ＧＡＡＡＡＡＧＣ ＴＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＧＧＡＧＧＡＣＣＣＣＧＧＡＧＣＡＡＡＧ　ＡＴＣ ＧＴＴＧＧＴＣ１１５１ＡＧＡＡＴＴＴＧＡＡ　ＡＴＴＣＧＡＴＴＡＣＡＡＧＧ ＴＧＴＴＧＡ　ＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧ　ＴＧＴＴＧＡＡＣＣＴ１２０１　ＧＴＴ ＣＣＴＣＣＴＴ　ＡＣＴＴＣＧＡＣＡＣＧＡＴＧＡＴＡＧＣＧ　ＧＣＴＴＡＣＣ ＴＴＣＴＴＧＡＧＣＣＧＡＡ１２５１　ＣＧＡＡＡＡＧＡＡＧ　ＴＴＣＡＡＴＣ ＴＧＧ　ＡＣＧＡＴＣＴＣＧＣＡＴＴＧＡＡＡＴＴＴ　ＣＴＴＧＧＡＴＡＣＡ１ ３０１　ＡＡＡＴＧＡＣＡＴＣＴＴＡＣＣＡＡＧＡＧ　ＣＴＣＡＴＧＴＣＣＴ　 ＴＣＴＣＴＴＴＴＣＣＧＣＴＧＴＴＴＧＧＴ１３５１　ＴＴＣＡＧＴＴＴＴＧ　 ＣＣＧＡＴＧＴＴＣＣＴＧＴＡＧＡＡＡＡＡ　ＧＣＡＧＣＧＡＡＣＴ　ＡＣＴＣ ＣＴＧＴＧＡ１４０１　ＡＧＡＴＧＣＡＧＡＣＡＴＣＡＣＣＴＡＣＡ　ＧＡＣＴ ＴＴＡＣＡＡ　ＧＡＣＣＣＴＧＡＧＣＴＴＡＡＡＡＣＴＣＣ１４５１ＡＣＧＡＧ ＧＣＡＧＡ　ＴＣＴＧＧＡＡＡＡＣＧＴＧＴＴＣＴＡＣＡ　ＡＧＡＴＡＧＡＡＡ Ｔ　ＧＣＣＣＣＴＴＧＴＧ１５０１　ＡＡＣＧＴＧＣＴＴＧ　ＣＡＣＧＧＡＴＧ ＧＡ　ＡＣＴＧＡＡＣＧＧＴ　ＧＴＧＴＡＴＧＴＧＧ　ＡＣＡＣＡＧＡＧＴＴ１ ５５１　ＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡ　ＣＴＣＴＣＡＧＡＡＧ　ＡＧＴＡＣＧＧＡＡＡ 　ＡＡＡＡＣＴＣＧＡＡ　ＧＡＡＣＴＧＧＣＡＧ１６０１　ＡＧＧＡＡＡＴＡＴ Ａ　ＣＡＧＧＡＴＡＧＣＴ　ＧＧＡＧＡＧＣＣＧＴ　ＴＣＡＡＣＡＴＡＡＡ　Ｃ ＴＣＡＣＣＧＡＡＧ１６５１　ＣＡＧＧＴＴＴＣＡＡ　ＧＧＡＴＣＣＴＴＴＴ　 ＴＧＡＡＡＡＡＣＴＣＧＧＣＡＴＡＡＡＡＣＣＡＣＧＴＧＧＴＡＡ１７０１　Ａ ＡＣＧＡＣＧＡＡＡ　ＡＣＧＧＧＡＧＡＣＴ　ＡＴＴＣＡＡＣＡＣＧ　ＣＡＴＡ ＧＡＡＧＴＣＣＴＣＧＡＧＧＡＡＣ１７５１ＴＴＧＣＣＧＧＴＧＡ　ＡＣＡＣＧ ＡＡＡＴＣＡＴＴＣＣＴＣＴＧＡ　ＴＴＣＴＴＧＡＡＴＡ　ＣＡＧＡＡＡＧＡＴ Ａ１８０１　ＣＡＧＡＡＡＴＴＧＡ　ＡＡＴＣＡＡＣＣＴＡ　ＣＡＴＡＧＡＣＧ ＣＴ　ＣＴＴＣＣＣＡＡＧＡ　ＴＧＧＴＣＡＡＣＣＣ１８５１ＡＡＡＧＡＣＣＧ ＧＡ　ＡＧＧＡＴＴＣＡＴＧ　ＣＴＴＣＴＴＴＣＡＡ　ＴＣＡＡＡＣＧＧＧＧ　 ＡＣＴＧＣＣＡＣＴＧ１９０１　ＧＡＡＧＡＣＴＴＡＧ　ＣＡＧＣＡＧＣＧＡＴ 　ＣＣＣＡＡＴＣＴＴＣＡＧＡＡＣＣＴＣＣＣＧＡＣＧＡＡＡＡＧＴ１９５１　 ＧＡＡＧＡＧＧＧＡＡ　ＡＡＧＡＡＡＴＣＡＧ　ＧＡＡＡＧＣＧＡＴＡ　ＧＴＴ ＣＣＴＣＡＧＧ　ＡＴＣＣＡＡＡＣＴＧ２００１　ＧＴＧＧＡＴＣＧＴＣＡＧＴ ＧＣＣＧＡＣＴ　ＡＣＴＣＣＣＡＡＡＴ　ＡＧＡＡＣＴＧＡＧＧ　ＡＴＣＣＴＣ ＧＣＣＣ２０５１ＡＴＣＴＣＡＧＴＧＧ　ＴＧＡＴＧＡＧＡＡＴ　ＣＴＴＴＴＧ ＡＧＧＧ　ＣＡＴＴＣＧＡＡＧＡ　ＧＧＧＣＡＴＣＧＡＣ２１０１ＧＴＣＣＡＣ ＡＣＴＣＴＡＡＣＡＧＣＴＴＣＣＡＧＡＡＴＡＴＴＣＡＡＣＧＴＧＡＡＡＣＣＣ ＧＡＡＧＡＡＧＴ２１５１　ＡＡＣＣＧＡＡＧＡＡ　ＡＴＧＣＧＣＣＧＣＧ　Ｃ ＴＧＧＴＡＡＡＡＴ　ＧＧＴＴＡＡＴＴＴＴ　ＴＣＣＡＴＣＡＴＡＴ２２０１　 ＡＣＧＧＴＧＴＡＡＣＡＣＣＴＴＡＣＧＧＴ　ＣＴＧＴＣＴＧＴＧＡ　ＧＧＣＴ ＴＧＧＡＧＴ　ＡＣＣＴＧＴＧＡＡＡ２２５１　ＧＡＡＧＣＡＧＡＡＡ　ＡＧＡ ＴＧＡＴＣＧＴ　ＣＡＡＣＴＡＣＴＴＣＧＴＣＣＴＣＴＡＣＣＣＡＡＡＧＧＴＧ ＣＧ２３０１　ＣＧＡＴＴＡＣＡＴＴ　ＣＡＧＡＧＧＧＴＣＧ　ＴＡＴＣＧＧＡ ＡＧＣＧＡＡＡＧＡＡＡＡＡ　ＧＧＣＴＡＴＧＴＴＡ２３５１　ＧＡＡＣＧＣＴ ＧＴＴ　ＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡ　ＡＧＡＧＡＣＡＴＡＣＣＡＣＡＧＣＴＣＡＴ　 ＧＧＣＣＣＧＧＧＡＣ２４０１ＡＧＧＡＡＣＡＣＡＣＡＧＧＣＴＧＡＡＧＧ　Ａ ＧＡＡＣＧＡＡＴＴ　ＧＣＣＡＴＡＡＡＣＡ　ＣＴＣＣＣＡＴＡＣＡ２４５１　 ＧＧＧＴＡＣＡＧＣＡ　ＧＣＧＧＡＴＡＴＡＡ　ＴＡＡＡＧＣＴＧＧＣＴＡＴＧ ＡＴＡＧＡＡ　ＡＴＡＧＡＣＡＧＧＧ２５０１　ＡＡＣＴＧＡＡＡＧＡ　ＡＡＧ ＡＡＡＡＡＴＧ　ＡＧＡＴＣＧＡＡＧＡ　ＴＧＡＴＣＡＴＡＣＡ　ＧＧＴＣＣＡ ＣＧＡＣ２５５１ＧＡＡＣＴＧＧＴＴＴ　ＴＴＧＡＡＧＴＧＣＣＣＡＡＴＧＡＧ ＧＡＡ　ＡＡＧＧＡＣＧＣＧＣＴＣＧＴＣＧＡＧＣＴ２６０１　ＧＧＴＧＡＡＡ ＧＡＣＡＧＡＡＴＧＡＣＧＡ　ＡＴＧＴＧＧＴＡＡＡ　ＧＣＴＴＴＣＡＧＴＧ　 ＣＣＧＣＴＣＧＡＡＧ２６５１　ＴＧＧＡＴＧＴＡＡＣＣＡＴＣＧＧＣＡＡＡ　 ＡＣＡＴＧＧＴＣＧＴ　ＧＡＴｍａ　ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の完全なコード 配列、およびコードされた３文字の略号で表されるアミノ酸配列の両者は、配列 番号＝１として配列表の節に記載されている。便宜上、Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラ ーゼ遺伝子配列によりコードされたアミノ酸配列をまた、１文字の略号でアミノ 末端からカルボキシ末端に、下記に示す。この配列に参照のための番号が付され ている。

Ｉ　ＭＡＲＬＦＬＦＤＧＴ　ＡＬＡＹＲＡＹＹＡＬ　ＤＲ３ＬＳＴＳＴＧＩ　Ｐ ＴＮＡＴＹＧＶＡＲＭＬＶＲＰＩＫＤＨ［５１１ＶＧＫＤＹＶＡＶＡ　ＦＤＫＫ ＡＡＴＦＲＨＫＬＬＥＴＹＫＡＱＲＰＫＴＰＤＬＬＩＱＱ　ＬＰＹＩＫＫＬＶＥ Ａｌｏｌ　ＬＧＭＫＶＬＥＶＥＧ　ＹＥＡＤＤ［ＩＡＴＬ　ＡＶＫＧＬＰＬＦＤ Ｅ　ＩＦＩＶＴＧＤＫＤＭ　ＬＱＬＶＮＥＫＩＫＶ１５１　ＷＲＩＶＫＧＩＳＤ Ｌ　ＥＬＹＤＡＱＫＶＫＥ　ＫＹＧＶＥＰＱＱＩＰ　ＤＬＬＡＬＴＧＤＥＩ　Ｄ Ｎ［ＰＧＶＴＧＩＧ２０１　ＥＫＴＡＶＱＬＬＥＫ　ＹＫＤＬＥＤＩＬＮＩ（Ｖ ＲＥＬＰＱＫＶＲＫ　ＡＬＬＲＤＲＥＮＡＩ　ＬＳＫＫＬＡ［ＬＥＴ２５１　Ｎ ＶＰＩＥＩＮＷＥＥ　ＬＲＹＱＧＹＤＲＥＫ　ＬＬＰＬＬＫＥＬＥＦ　ＡＳＴＭ ＫＥＬＱＬＹ　ＥＥＳＥＰＶＧＹＲＩ３０１　ＶＫＤＬＶＥＦＥＫＬ　ＩＥＫＬ ＲＥＳＰＳＦ　ＡＩＤＬＥＴＳＳＬＤ　ＰＦＤＣＤ［ＶＧ［Ｓ　ＶＳＰＫＰＫＥ ＡＹＹ３５１　１ＰＬＨＨＲＮＡＱＮ　ＬＤＥＫＥＶＬＫＫＬ　ＫＥＩＬＥＤＰ ＧＡＫ　ＩＶＧＱＮＬＫＦＤＹ　ＫＶＬＭＶＫＧＶＥＰ４０１　ＶＰＰＹＦＤＴ ＭＩＡ　ＡＹＬＬＥＰＮＥＫＫ　ＦＮＬＤＤＬＡＬＫＦ　ＬＧＹＫＭＴＳＹＱＥ 　ＬＭＳＦＳＦＰＬＦＧ４５１　ＦＳＦＡＤＶＰＶＥＫ　ＡＡＮＹＳＣＥＤＡＤ 　ＩＴＹＲＬＹＫＴＬＳ　ＬＫＬＨＥＡＤＬＥＮ　ＶＦＹＫＩＥＭＰＬＶ５０１ 　ＮＶＬＡＲＭＥＬＮＧ　ＶＹＶＤＴＥＦＬＫＫ　ＬＳＥＥＹＧＫＫＬＥ　ＥＬ ＡＥＥＩＹＲＩＡ　ＧＥＰＦＮＩＮＳＰＫ５５１　ＱＶＳＲＩＬＦＥＫＬ　Ｇ［ ＫＰＲＧＫＴＴＫ　ＴＧＤＹＳＴＲＩＥＶ　ＬＥＥＬＡＧＥＦ（ＥＩ　ＩＰＬｒ ＬＥＹＲＫ［６０１ＱＫＬＫＳＴＹＩＤＡ　ＬＰＫＭＶＮＰＫＴＧ　Ｒ［ＨＡＳ ＦＮＱＴＧ　ＴＡＴＧＲＬＳＳＳＤ　ＰＮＬＱＮＬＰＴＫＳ６５１　ＥＥＧＫＥ ［ＲＫＡＩ　ＶＰＱＤＰＮＷＷＩＶ　５ＡＤＹＳＱＩＥＬＲＩＬＡＨＬＳＧＤＥ Ｎ　ＬＬＲＡＦＥＥＧＩＤ７０１　ＶＨＴＬＴＡＳＲＩＦ　ＮＶＫＰＥＥＶＴＥ Ｅ　ＭＲＲＡＧＫＭＶＮＦ　５ＩＩＹＧＶＴＰＹＧ　ＬＳＶＲＬＧＶＰＶＫ７５ １　ＥＡＥＫＭＩＶＮＹＦ　ＶＬＹＰＫＶＲＤＹＩ　ＱＲＶＶＳＥＡＫＥＫ　Ｇ ＹＶＲＴＬＦＧＲＫ　ＲＤ［ＰＱＬＭＡＲＤ８０１　ＲＮＴＱＡＥＧＥＲＩ　Ａ ［ＮＴＰＩＱＧＴＡ　ＡＤ［［ＫＬＡＭＩＥ　ＩＤＲＥＬＫＥＲＫＭ　ＲＳＫＭ ＩＩＱＶＨＤ８５１　ＥＬＶＦＥＶＰＮＥＥ　ＫＤＡＬＶＥＬＶＫＤ　ＲＭＴＮ ｖｖＫＬＳＶ　ＰＬＥＶＤＶＴ［ＧＫ　ＴＷＳアミノ酸のための１文字の略号を 便宜上下に示す。

Ｆ＝フェニルアラニン　Ｈ＝ヒスチジンＬ＝ロイシン　Ｑ＝グルタミン ■＝イソロイシン　Ｎ＝アスパラギン Ｍ−メチオニン　Ｋ＝リジン ■＝バリン　Ｄ＝アスパラギン酸 Ｓ＝セリン　Ｅ＝グルタミン酸 Ｐ＝プロリン　Ｃ＝システィン Ｔ＝スレオニン　Ｗ＝トリプトファン Ａ＝アラニン　Ｒ＝アルギニン Ｙ−チロシン　Ｇ＝グリシン Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼ■のためのコード配列は、「縮重（ｄｅｇｅｎｅｒ ａｔｅ）プライマー」法により同定され、この方法は広い実用性を育し、そして 本発明の重要な面である。縮重プライマー法において、既知の熱安定性ＤＮＡポ リメラーゼの保存されたドメインに対応する任意の熱安定性ポリメラーゼのコー ド配列のＤＮＡ断片を同定することができる。

縮重プライマー法の１つの態様において、対応する保存されたドメインは、Ｔａ ｑ、　ＴｍａおよびＴｔｈの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列のため のコード配列からのものである。縮重プライマー法は、Ｔａｑ、　Ｔｔｈ、　Ｔ および種々の保存された領域が同定されたＥ、ｃｏｌｉからのＤＮＡポリメラー ゼＩのタンパク質のアミノ酸配列を比較することによって開発された。次いで、 これらの保存された領域に相当するプライマーか設計された。本発明のＴｍａ配 列を使用して他の縮重プライマーを設計することかできる。縮重プライマー法の 一般的実用性を、ここで、Ｔｍａ遺伝子のクローニングに適用された方法を特別 に参照して例示する。

Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼ■遺伝子をクローニングするために、保存されたア ミノ酸配列をアミノ酸の各々のための可能なコドンのすへてに転換した。遺伝コ ードの縮重性のために、所定のアミノ酸はいくつかの異なるコドンにより表示す ることができる。所定のアミノ酸のためのコドンの中に複数の塩基が存在できる 場合、その配列は縮重性をもつと言われる。

次いで、所定のアミノ酸配列をコードすることができる、すべての可能なりＮＡ 配列のプールとして、プライマーを合成した。所定のプライマーのプールについ ての縮重の量は、各位置における可能なヌクレオチドの数を掛けることによって 決定することができる。

プライマーのプールがより縮重性をもつようになるほど（すなわち、プール内の 個々のユニークプライマーＤＮＡ配列の数かより大きくなるほど）、ユニークプ ライマー配列の１つが所望のもの以外の標的染色体ＤＮＡの領域に結合する確率 はより太き（なり−それゆえ、生ずる増幅の特異性はより少なくなる。縮重プラ イマーを使用して増幅の特異性を増加するために、プールをサブセットとして合 成し、こうしてサブセットの全体の群が所定のアミノ酸配列をコードするすべて の可能なりＮＡ配列を含むが、各個々のサブセットは一部分のみを含むようにす る：例えば、１つのプールはＧまたはＣを特定の位置に含有することができるが 、他のものは同一位置にＡまたはＴを含有する。これらのサブプールの各々はＤ Ｇ番号で表示される。

前方プライマー（非コード鎖に対して相補的である、遺伝子の５′−領域から３ ′−領域に向う方向）および逆プライマー（コード鎖に対して相補的である、遺 伝子の３′−領域から５′−領域に向う方向）の両者を、これらの保存された領 域の大部分について設計してＴ正ポリメラーゼをクローニングした。５′−末端 に制限部位をもつプライマーを設計して、クローニングを促進した。前方プライ マーはＢａ１ｌｌ制限部位（ＡＧＡＴＣＴ）を含有したか、逆プライマーはεｃ ｏＲＩ制限部位（ＧＡＡＴＴＣ）を含有した。さらに、プライマーは５′−末端 に２ヌクレオチドを含有して、その制限部位における切断効率を増加した。

次いで、縮重プライマーをＰＣＲ法において使用し、ここで標的核酸はサーモタ ガ・マリチｖ　（Ｔｈｅｒｍｏｔａｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ）からの染色体ＤＮ Ａであった。１系列の温度プロフィルと組み合わせて、前方プライマーおよび逆 プライマーのプールの組み合わせを使用するＰＣＲ法の生成物を比較した。Ｔａ ｑ染色体ＤＮＡを使用して発生させた生成物に対して特異的な同一の大きさの生 成物を生成したとき、ＰＣＲ断片をゲル精製し、再増幅し、そしてベクターＢＳ Ｍ１３Ｈ：　Ｂｇｌｌｒの中にクローニングした（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔ ａｇｅｎｃ）のベクターｐＢＳＭ＋の誘導体、ここでｐＢＳＭ＋のＨｉｎｄｌ１ １部位はＢｇｌＩＩ部位に転換されている）。配列がポリメラーゼタンパク質と くにＴａｑポリメラーゼおよび７ｔｈポリメラーゼの中の他の既知のアミノ酸配 列に対して相同性であるアミノ酸配列をコードすることが見出された場合、その 配列は可能性ある熱安定性ＤＮＡポリメラーゼコード配列として同定された。

次いで、Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼ酵素の部分が、ササンープロット分析によ り、サーモタガ−７リチ７　（Ｔｈｅｒｍｏｔａｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ）の染 色体ＤＮＡ中に同定された。Ｔｍａ染色体ＤＮＡを種々の酵素で消化し、そして ニトロセルロースのフィルターに移した。２１１ｐまたはビオチン−ｄＵＴＰで 標識したプローブを、クローニングしたＰＣＲ生成物からの遺伝子の種々の領域 について発生させた。プローブをニトロセルロースに結合したゲノムＤＮＡにハ イブリダイゼーションさせ、プローブにハイブリダイゼーションする染色体ＤＮ Ａ断片の大きさの同定を可能とした。遺伝子の５′および３′領域をカバーする プローブの使用により、ｌまたは２以上のＤＮＡ断片がポリメラーゼのための構 造遺伝子の全部でないにしても大部分を含有することが保証される。

クローニングを促進するために、単一のＤＮＡ断片またはいくつかのＤＮＡ断片 中に構造遺伝子を含有する断片を生成するために使用することができる制限酵素 を同定することができる。

いったん同定した後、Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をコードする染色体の ＤＮＡ断片をクローニングした。染色体ＤＮＡを同定された制限酵素で消化し、 そして大きさで分別した。所望の大きさの領域を含有する分画を濃縮し、脱塩し 、そして８３Ｍ１３Ｈ：　Ｂｇｌｌｌのクローニングベクター中にクローニング した。前にクローニングしたＰＣＲ生成物から発生した標識したプローブを使用 するハイブリダイゼーションによりクローンを同定した。次いで、ＰＣＲ生成物 をポリアクリルアミドゲル上で分析した。

上に示したＤＮＡ配列およびアミノ酸配列並びにそれらの配列をコードするＤＮ Ａ化合物を使用して、組み換えＤＮＡ発現ベクターを設計および構成して、広範 な種類の宿主細胞中でのＴｍａ　ＤＮＡポリメラーゼ活性の発現を推進すること ができる。上に示したＤＮＡ配列のすべてまたは一部分をコードするＤＮＡ化合 物もまた、プローブとして使用して、他の生物体からの熱安定性ポリメラーゼを コードするＤＮＡを同定することができ、そして上に示したアミノ酸配列を使用 して、熱安定性ポリメラーゼの同定および精製に使用できる抗体の調製における 免疫原として使用するためのペプチドを設計することができる。

しかしながら、上のアミノ酸配列をコードする組み換えベクターによるか、ある いは天然サーモタガ・マリチマ（７，１１ＩＢｒｉｔｉｍａ）細胞により生産さ れたかどうかにかかわらず、Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼは、典型的には、精製 した後、組み換えＤＮＡ技術において使用する。本発明はこのような精製法を提 供する。

天然タンパク質を回収するために、細胞を任意の適当な技術を使用して増殖させ る。簡単に述べると、細胞は次の成分を含有するｒ　ＭＭＳＪ培地の中で増殖さ せる（１リツトル当たり）　：　ＮａＣ１（６，９３ｇ　）　；　ｕｇｓｏ４　 ・７Ｈ＊０　（１，７５ｇ）　；　ＭｇＣ１＊　・６ＨｔＯ（１，３８ｇ）　； 　ＫＣＩ（０，１６ｇ）　：　ＮａＢｒ　（２５ｍｇ）　；　ＨｓＢＯｓ（７， ５ｍｇ）　；　５ｒＣ１ｔ　・６Ｈ２０（３，８ｍｇ）　；　Ｋｌ（０，０２５ ｍｇ）　；ＣａＣ１＊（０，３８ｇ）　；ＫＨ＊ＰＯ＜（０，５ｇ）　；Ｎａ＊ Ｓ（０，５Ｇ）　；（ＮＨ４）！Ｎｉ（ＳＯ４）２（２ｍｇ）　；微量のミレラ ル（Ｂａｌｃｈら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｒｅｖ、。

４３：２６０−２９６）（１５ｍｌ）　；レサズリン（１ｍｇ）；および澱粉（ ５ｇ）、ｐＨ６，５（ＨｔＳＯ４で調節した）。固体培地上での増殖のために、 ０．８％の寒天（Ｏｘｏｉｄ）を培地に添加することができる。細胞の合理的増 殖はまた、０．５％の酵母エキスを補充したｒ　ＳＭＥＪ培地（Ｓｔｅｔｔｅｒ ら、１９８３、５ｙｓｔ、Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、４　：５３５−５ ５１）中で、あるいはマリンブロス（ｍａｒｉｎｅ　ｂｒｏｔｈ）（Ｄｉｒｃｏ ２２１６）の中で起こる。

細胞の増殖後、酵素の単離および精製を６段階で実施し、それらの各々は、特記 しない限り、室温以下の温度、好ましくは約０″Ｃ〜約４℃において実施する。

第１段階または工程において、細胞を、それが凍結されている場合は、融解し、 アミンコ・フレッシュ・プレッシュアー・セル（Ａｍｉｎｃｏ　ｆｒｅｓｈ　ｐ ｒｅｓｓｕｒｅ　ｃｅｌｌ（８〜２０．０００ｐｓｉ）の中で溶解し、緩衝液（ 約ｐＨ７，５）中に懸濁させ、そして超音波処理して粘度を減少させる。

第２段階において、硫酸アンモニウムをリゼイトに添加して、Ｔｍａ　ＤＮＡポ リメラーゼがＤＮＡまたは細胞リゼイトのタンパク質に結合するのを防止する。

また、第２段階において、ボリミン（Ｐｏｌｙｍｉｎ）Ｐ（ポリエチレンイミン 、ＰＥＩ）をリゼイトに添加して、核酸を沈澱させ、そしてリゼイトを遠心する 。

第３工程において、硫酸アンモニウムを上澄み液に添加し、そして上澄み液を０ ．３Ｍの硫酸アンモニウムおよび０．５ｍＭのＤＴＴ（ジチオスレイトール）を 含有するＴＥ　（５０ｍＭのトリス−ＣＬ　ｐＨ７，５）により平衡化したフェ ニルセファローズ（５ｅｐｈａｒｏｓｅ）カラム上に負荷する。

次いでこのカラムを同一の緩衝液で、第２にＴＢ−ＤＴＴ（硫酸アンモニウムを 含まない）で、第３にエチレングリコール−ＴＥ　−ＤＴＴで、そして最後にエ チレングリコールを含有するＴＥ−ＤＴＴ中２Ｍの尿素で洗浄する。フェニルセ ファローズの容量を越える（すなわち、約２０〜３０ｍｇのタンパク質／ｍｌの 樹脂より多くを負荷することによって）ことがないかぎり、Ｔｍａポリメラーゼ 活性のすべてはカラムにより保持され、そしてエチレングリコールを含有するＴ Ｅ−ＤＴＴ中の２Ｍの尿素で溶出される。

第４段階において、尿素の溶離液を、０．０８ＭのＫＣＩ　１５０ｍＭのトリス −ＣＩ（１）Ｈ７，５）、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％のツイーン２０およ び０．５ｍＭのＤＴＴにより平衡化したヘパリンセファローズカラムに適用する 。

次いで、カラムを同一の緩衝液で洗浄し、そして酵素を０．０８Ｍ−０，５Ｍの ＫＣＩの直線の勾配で溶出する。ピーク活性分画は０．２２５Ｍ〜０、２７５Ｍ のＫＣＩにおいて見いだされた。

第５段階において、第４段階において集められた分画をＫＣＩを含まないアフィ ゲル（ａｆｆｉｇｅｌ）−ブルー緩衝液で希釈し、そして２５ｍＭのトリス−Ｃ Ｉ（ｐＨ７，５）、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％のツイーン２０．０．５ｍ ＭのＤＴＴ、および０．１５ＭのＫＣＩの中で平衡化したアフィゲル−ブルーカ ラムに適用する。このカラムを同一の緩衝液で洗浄し、そして同一の緩衝液中の ０．１５Ｍ〜０．７ＭのＫＣＩの直線勾配で溶出する。ピーク活性分画は勾配の ０．３Ｍ〜０．５５ＭのＫＣＩにおいて見いだされた。

次いでピーク活性のこれらの分画を、任意の適当な手順を使用して汚染デオキシ リボヌクレアーゼ（エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ）について試 験する。１例として、エンドヌクレアーゼ活性は、過剰のＤＮＡポリメラーゼと のインキュベーション後、ファージλＤＮＡまたはスーパーコイルドのプラスミ ドＤＮＡの分子量の変化から電気泳動的に決定することができる。同様に、エキ ソヌクレアーゼ活性は、過剰のＤＮＡポリメラーゼとのインキュベーション後、 制限酵素で消化したＤＮＡの分子量の変化から電気泳動的に決定することができ る。デオキシリボヌクレアーゼ活性をもたない分画をプールし、そして５０ｍＭ のＫＣＩを含有するホスホセルロースの緩衝液の中に透析濾過する。

最後に、第６段階において、第５段階からの透析濾過したプールを、２５ｍＭの トリス−ＣＩ（ｐＨ７，５）、５０ｍＭのＫＣＩ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０． ２％のツイーン２０および０．５ｍＭのＤＴＴの正しいｐＨおよびイオン強度に 平衡化した、ホスホセルロースのカラム上に負荷する。次いで、このカラムを同 一の緩衝液で洗浄し、そして０．０５Ｍ〜０．５ＭのＫＣＩの直線勾配で溶出す る。ピーク分画は０．２１５Ｍ〜０．３１ＭのＫＣＩにおいて溶出された。これ らの分画からの、分解していない精製されたＤＮＡポリメラーゼは、インーシチ ュ活性ゲルにおける変化しない移動パターンにより証明される。

サーモタガ−７リチｖ　（Ｔｈｅｒｍｏｔａｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ）から精製 されたＤＮＡポリメラーゼの分子量は、任意の技術により、例えば、タンパク質 の分子量マーカーを使用するＳＯＳ　−ＰＡＧＥによるか、あるいはコード配列 の計算により決定することができる。サーモタガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔａ ｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ）の精製されたＤＮＡポリメラーゼの分子量は、ＳＤＳ 　−ＰＡＧＥにより、約９７ｋＤａであると決定される。予測されたアミノ酸配 列に基づいて、分子量は約１０２ｋＤａで推定される。天然Ｔｍａ　ＤＮＡポリ メラーゼの精製のプロトコルは、実施例１により詳細に記載されている。本発明 の組換えＴｍａポリメラーゼの精製は、同様な方法により実施することができる 。

種々の分子量の生物学的に活性な組換えＴｍａポリメラーゼは、本発明の方法お よびベクターにより調製することができる。Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子 の完全なコード配列が大腸菌（ＩＥ、　ｃｏｌｉ）中の発現ベクターの中に存在 するときでさえ、細胞は、位置１４０におけるメチオニンのコドンで開始する翻 訳により形成された切頭されたポリメラーゼを生産する。また、Ｔｍａのコード 配列の位置２８４におけるメチオニンのコドンにおいて翻訳を開始することによ って生産されるタンパク質に相当する切頭ポリメラーゼの生産のために、組み換 え手段を使用することができる。アミノ酸１〜１３９（約８６ｋＤａ）を欠如す るポリメラーゼおよび野生型Ｔｍａポリメラーゼのアミノ酸１〜２８３（約７０ ｋＤａ）を欠如するポリメラーゼは、ポリメラーゼ活性を保持するが、弱化した ５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を有する。

さらに、７０ｋＤａのポリメラーゼは天然Ｔｍａポリメラーゼより有意にいっそ う熱安定性である。

こうして、完全なＴｍａ　ＤＮＡポリメラーゼＩ酵素の全体の配列は活性のため に要求されない。組換えＤＮＡ技術において、Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼ■の コード配列の部分を使用して、ＤＮＡポリメラーゼ活性をもつ生物学的に活性な 遺伝子生産物を生産することかできる。

Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼの配列をコードするＤＮＡの入手可能性はまた、Ｄ ＮＡポリメラーゼ活性を有するムティン（突然変異タンパク質）の形態を発生さ せるためにコード配列を修飾する機会を提供する。

Ｔｍａポリメラーゼのアミノ（Ｎ）−末端部分はポリメラーゼ活性に不必要であ り、むしろタンパク質の５′→３′エキソヌクレアーゼ活性をコードする。組換 えＤＮＡ法を使用して、Ｔｍａ遺伝子のＮ−末端のコード配列のほぼｌ／３を欠 失し、クローニングし、そしてポリメラーゼのアッセイにおいて非常に活性であ る遺伝子生産物を発現することができるが、欠失の程度に依存して、５′→３′ エキソヌクレアーゼ活性を有する。ポリメラーゼのある種のＮ−末端の短縮され た形態は活性であるので、これらのポリメラーゼの発現のために使用する遺伝子 構成体はコード配列の対応する短縮された形態を含むことができる。

Ｎ−末端の除去に加えて、Ｔｍａポリメラーゼのペプチド鎖中の個々のアミノ酸 残基は、酸化、還元、または他の誘導体化により修飾することができ、そしてタ ンパク質を切断して活性を保持する断片を得ることができる。活性を破壊しない このような変更は、そのタンパク質をＴｍａポリメラーゼ活性をもつタンパク質 の定義から除外せず、それゆえ本発明の範囲内に包含される。

Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼのコード配列の一次構造を欠失、付加または変更し て、そのコード配列から生成されたｍＲＮＡの翻訳の間にＴｍａＤＮＡポリメラ ーゼの中に組み込まれるアミノ酸配列を変化させることは、タンパク質の高温の ＤＮＡポリメラーゼ活性を破壊しないで、実施することができる。このような置 換または他の変更は、本発明の考えられる範囲内に入るＤＮＡによりコードされ るアミノ酸配列を有するタンパク質を生成する。同様に、Ｔｍａ　ＤＮＡポリメ ラーゼ遺伝子のクローニングされたゲノム配列または相同の合成配列を使用して 、Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼ活性をもつ融合ポリペプチドを発現すること、あ るいは天然Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を もつタンパク質を発現することかできる。さらに、このような発現は、Ｔｍａ　 ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のコントロール配列によるか、あるいはＴｍａ　ＤＮ Ａポリメラーゼを発現するために選択された宿主中で（その宿主かなにであろう と）機能するコード配列により、指令されることができる。

こうして、本発明は、種々の宿主系に適用可能な発現ベクターを構成することか できるＴｍａ　ＤＮＡポリメラーゼのためのコート配列および発現されるコード 配列を提供する。Ｔｍａポリメラーゼをコードする配列の部分はまた、種々の種 における他の熱安定性ポリメラーゼをコードする配列を回復するプローブとして 有用である。したがって、少なくとも４〜６つのアミノ酸をエンコードするオリ ゴヌクレオチドのプローブを合成し、そして熱安定性ポリメラーゼをエンコード する追加のＤＮＡを探索するために使用することができる。サーモタガ−ｖリチ ｖ　（Ｔｈｅｒｍｏｔａｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ）の熱安定性ＤＮＡポリメラー ゼの遺伝子のヌクレオチド配列と他の種の対応する遺伝子との間に正確な合致は 存在しないであろうから、誤った陽性を排除するために十分なストリンジエンシ ーの条件下にハイブリダイゼーションを得るために、はぼ１２〜１８ヌクレオチ ドを含有するオリゴマー（４〜６アミノ配列をコードする）か通常必要である。

６アミノ酸をコードする配列は、このようなプローブのために十分な情報を供給 する。このようなオリゴヌクレオチドのプローブを、本発明の縮重プライマー法 においてプライマーとして使用して、熱安定性ポリメラーゼをコードする解読配 列を得ることができる。

したがって、本発明は、Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼのためのコード配列および アミノ酸配列を提供することによって、他の熱安定性ポリメラーゼ酵素およびそ れらの酵素のためのコード配列の単離を可能とする。Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラー ゼ■タンパク質のアミノ酸配列は、Ｔａｑおよび７ｔｈの熱安定性ＤＮＡポリメ ラーゼのアミノ酸配列に非常に類似する。これらの類似性は、Ｔｍａ　ＤＮＡポ リメラーゼのコード配列の同定および単離を促進した。これらの３つの熱安定性 ＤＮＡポリメラーゼのコード配列における類似領域は、配列を整列させることに よって容易に観察することができる。

しかしながら、３つの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのコード配列の間の不一致の 領域をプローブとして使用しても、熱安定性ポリメラーゼの酵素をコードする他 の熱安定性ポリメラーゼのコード配列を同定することができる。例えば、Ｔａｑ のいくつかの性質およびＴｍａの他の多様な性質を有する熱安定性ポリメラーゼ のコード配列を、ＴａｑとＴｍａとの間の非類似性の領域をコードする配列に向 けられたプローブを使用することによって同定することかできる。詳しくは、こ のような領域は、アミノ酸配列コープネートにより同定される、次の任意の１ま たは２以上領域からの４またはそれ以上の隣接するアミノ酸のストレッチを包含 する（番号を包含する）：　５−１０．７３−７９゜１１３−１１９．１３４− １４５．１９１−１９６．３２８−３４０．３４８−３５２．３８２−３８７． ４０５−４１４．４６７−４７０．４９５−４９９．５０６−５１２．５５５− ５５９．５７９−５８４．５９５−５９９゜６５０−６５５．７３２−７４２． ８２０−８２５．８５０−８５６゜これらの領域は［ホールマークのモチーフ（ ｈａｌｌｍａｒｋ　ｍｏｔｉｆＳ）Ｊとして考えられ、そして熱安定性ＤＮＡポ リメラーゼの機能（例えば、５′→３′エキソヌクレアーゼ活性、３′→５′エ キソヌクレアーゼ活性、およびＤＮＡポリメラーゼ活性）のために重要なアミノ 酸のシグネチュア−（ｓ　ｉｇｎａｔｕｒｅ）配列の追加の領域を定める。

Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼの中に見いだされるが、天然Ｔａｑ　ＤＮＡポリメ ラーゼおよび天然７ｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼにおいて欠如する１つの性質は、 ３′→５′エキソヌクレアーゼ活性である。この３′→５′エキソヌクレアーゼ 活性は、一般に望ましいと考えられる。なぜなら、合成された核酸配列の誤って 組み込まれたまたは不一致の塩基がこの活性により排除されるからである。した がって、３′→５′エキソヌクレアーゼ活性をもつポリメラーゼ（例えば、Ｔｍ ａ　ＤＮＡポリメラーゼ）を利用するＰＣＲの信頼性は増加する。Ｔｍａ　ＤＮ Ａポリメラーゼの中に見いだされる３′→５′エキソヌクレアーゼ活性はまた、 ＰＣＲにおけるプライマー／２量体複合体の形成の確率を減少する。３′→５′ エキソヌクレ了−ゼ活性は、事実、非鋳型依存性の方式で結合されたヌクレオチ ドを除去することによって、非鋳型依存性の方式でのプライマーの３′末端への 余分のｄＮＴＰの結合を防止する。３′→５′エキソヌクレアーゼ活性は、−重 鎖のＤＮＡ、例えば、プライマーまたは一本鎖の鋳型を排除することができる。

本質的に、−重鎖のプライマーまたは鋳型の各ヌクレオチドは不一致として酵素 により処理され、したがって分解される。ＰＣＲにおけるプライマーの分解を回 避するために、ホスホロチオエートをプライマーの３′末端に付加することがで きる。ホスホロチオエートで修飾されたヌクレオチドは３′→５′エキソヌクレ アーゼによる除去に対していっそう抵抗性である。

熱安定性ＤＮＡポリメラーゼにおける３′→５′エキソヌクレアーゼ活性のため に重要なアミノ酸の「モチーフ」または特徴ある「シグネチュア配列」は、３つ の短いドメインからなるとして定義することができる。下において、これらのド メインはＡ、　ＢおよびＣとして定義され、重要なアミノ酸残基は１文字の略号 で示されておりそして重要でない残留はｒＸＪとして識別されている。

ドメイン　配　列　代表的なＴｍａｍミコーディネート　ＤｘＥｘｘｘＬ　３２ ３−３２９Ｂ　ＮｘｘｘＤｘｘｘＬ　３８５−３９３ＣＹｘｘｘＤ　４６４−４ ６８ 領域Ａと領域Ｂとの間の距離は５５−６５アミノ酸である。領域Ｂと領域Ｃとの 間の距離は６７−７５アミノ酸、好ましくは約７０アミノ酸である。Ｔｍａ　Ｄ ＮＡポリメラーゼにおいて、重要なモチーフのシグネチュア配列を定めないアミ ノ酸配列は、ドメインＡにおいて、それぞれ、ＬおよびＴＳＳ　、ドメインＢに おいて、それぞれ、ＬＫＦおよびＹＫＶ　；およびドメインＣにおいてＳＣＥで ある。したがって、Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼ■において、ドメインＡはＤＬ ＥＴＳＳＬであり；ドメインＢはＮＬＫＦＤＹＫＶＬであり；そしてドメインＣ はＹＳＣＥＤである。こうして、本発明は、ドメインＡ、ＢおよびＣを含んでな り、そして、さらに具体的ニハ、Ｄ−Ｘ−Ｅ−Ｘ’　−Ｌ−Ｘ”−”　−Ｎ−Ｘ ”　−Ｄ−Ｘ”　−Ｌ−Ｘ”−”　−Ｙ−Ｘ”−Ｄを含んでなる３′→５′エキ ソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを提供し、ここで１文 字の略号を使用し、そしてＸＮは特定したアミノ酸の間の重要でないアミノ酸の 番号（Ｎ）を表す。

熱安定性３′→５′エキソヌクレアーゼのドメインは、Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラ ーゼのアミノ酸２９１−４８４により表される。したかって、［ドメインのシャ フリング（ｄｏｍａｉｎ　ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）　Ｊまたはｒ熱安定性キメラＤ ＮＡポリメラーゼ」の構成を使用して、新規な性質を有する熱安定性ＤＮＡポリ メラーゼを得ることができる。例えば、コドン約２９１−約４８４を含んでなる Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼのコード配列によりサーマス・アクアチフス（Ｔｈ ｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）　ＤＮＡポリメラーゼのコドン２８９−４２ ２を置換すると、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼの５′→３′エキソヌクレアーゼ のドメイン（１−２８９）、Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼの３′→５′エキソヌ クレアーゼのドメイン（２９１−４８１）、およびＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ （４２３−８３２）のＤＮＡポリメラーゼのドメイン（４２３−８３２）を含有 する新規な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが生成するであろう。あるいは、Ｔｍａ 　ＤＮＡポリメラーゼの５′→３′エキソヌクレアーゼのドメインおよび３′→ ５′エキソヌクレアーゼのドメイン（約コドンｌ−４８４）を、Ｔａｑ　ＤＮＡ ポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼの（ｄＮＴＰ結合性およびプライマー／鋳型 結合性ドメイン）部分（約４２３〜８３２コドン）に融合することができる。ド ナーおよびレシピエンドはＴａｑおよびＴｍａ　ＤＮＡポリメラーゼに限定する ことは必要ではない。７ｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼはＴａｑ　ＤＮＡポリメラー ゼと類似するドメインを提供する。さらに、７ｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼの増強 した／好ましい逆転写酵素の性質は、上に例示した３′→５′エキソヌクレアー ゼのドメインを付加することによってさらに増強することかできる。

種々の手段の任意のものを使用してキメラＤＮＡポリメラーゼのコード配列（新 規な性質を有する）を発生することかできるか、好ましい方法は「オーバーラツ プＪ　ＰＣＲを使用する。この方法においては、意図する連結部配列をＰＣＲプ ライマー（それらの５′−末端）にデザインして入れる。個々のドメインの最初 の増幅の後、種々の生成物を希釈しく約１００〜１０００倍）そして組み合わせ 、変性し、アニーリングし、伸長し、次いで最終の前方プライマーのおよび逆プ ライマーをそれ以外は標準のＰＣＲのために添加する。

こうして、Ｔｎ＋ａ　ＤＮＡポリメラーゼの３′→５′エキソヌクレアーゼをコ ードする配列をＴｍａ　ＤＮＡポリメラーゼから除去するか、あるいは組換えＤ ＮＡ法によりこの活性を欠如する他のポリメラーゼに付加することができる。非 熱安定性ＤＮＡポリメラーゼにおいて、３′→５′エキソヌクレアーゼ活性のド メインをＴ＋ｎａポリメラーゼの熱安定性３′→５′エキソヌクレアーゼのドメ インで置換することさえ可能である。同様に、非熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの ３′→５′エキソヌクレアーゼ活性のドメインを使用して、Ｔｍａポリメラーゼ （または任意の他のポリメラーゼ）の３′→５′エキソヌクレアーゼのドメイン を置換して本発明の有用なポリメラーゼをつくることがてきる。当業者か認識す るように、上記のキメラポリメラーゼは組換えＤＮＡ技術により最も容易に構成 される。同様なキメラポリメラーゼは１つのＤＮＡポリメラーゼの５′→３′エ キソヌクレアーゼのドメインを他のＤＮＡポリメラーゼに移動させることによっ て構成することができる。

天然Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼと同一の酵素またはその酵素の誘導体または相 同体を生産しようとするかどうかにかかわらず、Ｔｍａポリメラーゼの組換え形 の生産は、典型的には、発現ベクターの構成、そのベクターによる宿主細胞の形 質転換、および発現が起こる条件下での形質転換された宿主細胞の培養を包含す る。

発現ベクターを構成するために、成熟（ここで、すべてのキメラまたは変異タン パク質を包含するように使用する）酵素あるいは活性を破壊しない追加の配列へ の、または活性タンパク質を生成するコントロールされた条件（例えば、ペプチ ダーゼによる処理）下に切断可能な追加の配列へのＴｍａポリメラーゼの融合体 をコードするＤＮＡを得る。次いで、コード配列を発現ベクターの中の適当なコ ントロール配列と作用可能な連鎖で配置する。ベクターは宿主細胞の中で自律的 に複製するように、あるいは宿主細胞の染色体ＤＮＡの中に組み込むように設計 することができる。このベクターを使用して適当な宿主を形質転換し、そして形 質転換された宿主を組換えＴｍａポリメラーゼの発現のために適当な条件下で培 養する。このＴｍａポリメラーゼを培地または細胞から単離するが、タンパク質 の回収および精製はある場合において必要でないことがある。

前記の工程の各々は種々の方法で実施することができる。例えば、所望のコード 配列をゲノムの断片から獲得し、そして適当な宿主において直接使用することが できる。種々の宿主において作用可能な発現ベクターの構成は、一般に後述する ように、適当なレブリコンおよびコントロール配列を使用して実施する。所望の コード配列およびコントロール配列を含有する適当なベクターの構成は、この分 野においてよく理解されている標準的連結および制限技法を使用する。単離され たプラスミド、ＤＮＡ配列または合成されたオリゴヌクレオチドを切断し、修飾 し、そして所望の形態に再連結する。適当な制限部位を、通常存在しない場合、 下に例示するように、コード配列の末端に付加して発現ベクターの構成を促進す ることかできる。

部位特異的なりＮＡの切断は、一般にこの分野において理解されておりかつ商業 的に入手可能な酵素の製造業者により特定されている条件下に、適当な１種また は２種以上の制限酵素で処理することによって実施する。例えば、二ニー・イン グランド・バイオラプス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）の製品カ タログを参照ノコト。一般に、約ｌμｇのプラスミドまたは他のＤＮＡを約２０ μｍの緩衝液の中で１単位の酵素により切断する；下記の実施例において、過剰 の制限酵素を一般に使用してＤＮＡの完全な消化を保証する。約３７°Ｃにおい て約１〜２時間のインキュベーション時間が適当であるが、変更も許容されうる 。各インキュベーション後、タンパク質をフェノールまたはクロロホルムを使用 する抽出により取り除く：この抽出に引き続いて、エーテルの抽出およびエタノ ール沈澱により水性分画からのＤＮＡの回収を実施することができる。必要に応 じて、切断された断片のサイズ分離を、標準的技術を使用して、ポリアクリルア ミドゲルまたはアガロースゲルの電気泳動により実施することができる。

例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　１９８０．６５　： 　４９９−５６０を参照のこと。

一本鎖の「オーバーラッピング」末端をもつ制限切断された断片は、４種類のデ オキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下に約１５〜２５分のインキュ ベーション時間を使用して２０℃〜２５℃において、５０ｍＭのトリスｐＨ７， ６，５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣ１ｇ、１０ｎ＋ＭのＤＴＴおよび５ 〜ＩＯμＭのｄＮＴＰの中で、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　ＤＮＡポリメラーゼ Ｉ（クレノー）の大断片で処理することによって平滑末端化（二本鎖の末端）す ることができる。必要に応じて、突出する末端の性質により決定される制限内で １のみのまたは選択されたｄＮＴＰを供給することによって、選択的修復を実施 することかできる。クレノーによる処理後、この混合物をフェノール／クロロホ ルムで抽出し、そしてエタノール沈澱させる。同様な結果はＳ１ヌクレアーゼを 使用して達成することができる。なぜなら、適当な条件下の８１ヌクレアーゼに よる処理は核酸の一本鎖部分の加水分解を生ずるからである。

用して調製することができる。アニーリングの前のまたは標識化のための一本鎖 のキナーゼ処理は、５０ｍＭのトリス（ｐＨ７，６）　、１０ｍＭのＭｇＣ１ｔ 、５ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）および１〜２μＭのＡＴＰの存在下に ０．５μＭの基質に対して過剰の、例えば、はぼｌｏ単位のポリヌクレオチドキ ナーゼを使用して達成される。キナーゼ処理がプライマーの標識化のためである 場合、ＡＴＰは高い比活性のγ−３２ｐを含有するであろう。

連結は１５〜３０μｌの体積で次の標準的条件および温度で実施される：　２０ ｍ１のトリス−Ｃ１（ｆｔＨ７，５）　、１０＋ｎＭのＭｇＣ１−１、ｌ　Ｏｍ ＭのＤＴＴ、　３３μｇ／ｍｌのＢＳＡ、　１０ｍＭ〜５０ｍＭのＮａＣ１，お よび０″Ｃにおいて４０ｍＭのＡＴＰおよび０．０１〜０．０２　（Ｗｅｉｓｓ ）単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（相補的−重鎖の末端をもつ断片の結合のため）あ るいは１４℃において１［ＤＭのＡＴＰおよび０．３〜０．６単位の７４ＤＮＡ リガーゼ（「平滑末端」の結合のため）。相補的末端をもつ断片の分子相互の結 合は、通常、３３〜１００μｇ／ｍｌの合計ＤＮＡ濃度（５〜１１００ｎの合計 末端濃度）で実施する。分子相互の平滑末端の結合（必要に応じて、２０〜３０ 倍のモル過剰のリンカ−を使用する）はｌμＭの合計末端濃度において実施する 。

ベクターの構成において、ベクターの断片を細菌のまたは仔つシ腸アルカリ性ホ スファターゼ（ＢＡＰまたはＣＩＡＰ）で処理して５′のホスフェートを除去し 、そしてベクターの再結合および再構成を防止する。ＢＡＰおよびＣＩＡＰの消 化条件はこの分野においてよく知られており、そして発表されたプロトフルは通 常商業的に入手可能なりＡＰおよびＣＩＡＰ酵素に伴う。核酸断片を回収するた めに、調製物をフェノール−クロロホルムで抽出し、そしてエタノール沈澱させ てＡＰを除去し、そしてＤＮＡを精製する。あるいは、再結合は、所望のベクタ ーとの結合の前後に、不必要なベクターの制限酵素消化により防止することがで きる。

配列の修飾を必要とするベクターまたはコード配列の部分のために、種々の部位 特異的プライマー指令変異誘発法を利用することができる。ポリメラーゼ連鎖反 応（ＰＣＲ）を使用して部位特異的変異誘発を実施することができる。現在この 分野において標準的である他の技術において、所望の突然変異をコードする合成 オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、変異原プライマーの伸長生産 物の構成のための鋳型として働く一本鎖ベクター、例えば、ｐＢｓ１３＋の相補 的核酸配列の合成を指令する。変異原されたＤＮＡを宿主細菌中に形質転換し、 そして形質転換された細菌の培養物をプレートし、そして同定する。修飾された ベクターの同定は、ニトロセルロースのフィルターまたは他の膜への選択された 形質転換体の転移、および修飾された配列への正確な合致を許すが、もとの鎖へ のハイブリダイゼーションを防止する温度においてキナーゼ処理した合成ブラて 、プローブとハイブリダイゼーションするＤＮＡを含有する形質転換体を培養し 、そして修飾されたＤＮＡの溜めとして使用する。

下に記載する構成において、プラスミドの構成のために正しい連結は、大腸菌（ Ｅ、　ｃｏｌｉ）　ＤＧＩＯＩ株または他の適当な宿主をまず連結混合物で形質 転換することによって確認される。適当な形質転換体を、この分野において理解 されているように、プラスミドの構成のモードに依存して、アンピシリン、テト ラサイクリンまたは他の抗生物質耐性によるか、あるいは他のマーカーを使用す ることによって選択する。次いで、形質転換体からのプラスミドを、Ｃ１ｅｗｅ ｌｌら、１９６９、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　６２ 二１１５９、の方法に従い、必要に応じてクロランフニーコール増幅（Ｃ１ｅｗ ｅｌｌ、　１９７２．　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、。

１１０　：　６６７）後に調製する。プラスミドＤＮＡを得る他の方法は、ベセ スダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｉｅｓ）の刊行物のＦｏｃｕｓ、　Ｖｏｌ、５．　Ｎｏ、２、のベ ージＩｌｌ：：　ｒＢａｓｅ−Ａｃｉｄ」　として記載されており、そして非常 に純粋なプラスミドＤＮＡはそのプロトコルの工程１２〜１７をＤＮＡのＣｓＣ １／臭化エチジウムの超遠心で置き換えることによって得ることができる。単離 されたＤＮＡは、制限酵素の消化により分析し、そして／またはＳａｎｇｅｒら 、１９７７、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７４　：　５４６３、さらにＭ ｅｓｓｉｎｇら、１９８１．　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、、９　：　３０９ 　、に記載されているジデオキシ法によるか、またはＭａｘａｍら、１９８０． 　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　６５　：　４９９の方法に より配列決定する。

コントロール配列、発現ベクターおよび形質転換法は、遺伝子の発現に使用する 宿主細胞のタイプに依存する。一般に、原核生物、酵母菌、昆虫、または哺乳動 物の細胞を宿主として使用する。原核生物の宿主は、一般に、組換えタンパク質 の生産に最も効率よくかつ便利であり、したがってＴｒｎａポリメラーゼの発現 のために好まし組換えタンパク質の発現のために最も頻繁に使用されている原核 生物は大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）である。クローニングおよび配列のために、およ び大部分の細菌プロモーターのコントロール下の構成体の発現のために、大腸菌 （Ｅ、　ｃｏｌｉ）ジエネティック・ストック・センター（Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ）からＧＣＳＣ＃６１３５のもとに入手可能な、大腸菌 （Ｅ、　ｃｏｌｉ）　Ｋ１２　ＭＭ２９４株を宿主として使用することができる 。

ＰＬＮ□８コントロール配列をもつ発現ベクターのために、大腸菌（Ｅ。

ｃｏｌｉ）　Ｋ１２菌株ＭＣ１００Ｏラムダ溶系株、Ｎ７Ｎｓ２ｃｒ＊５ｔＳｕ ＳＰ＊ｏ、　ＡＴＣＣ３９５３１を使用することができる。１９８７年４月７日 にＡＴＣＣに（ＡＴＣＣ５３６０６）として受託された大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ ）　ＤＧ１１６および１９８５年３月２９日にＡＴＣＣに（ＡＴＣＣ５３０７５ ）として受託された大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　ＫＢ２もまた、有用な宿主であ る。ＭＩ３ファージ組換え体のために、ファージに感染されやすい大腸菌（Ｅ、 　ｃｏｌｉ）菌株、例えば大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　Ｋ１２菌株ＤＧ９Ｂを使 用する。ＤＧ９Ｂ菌株は１９８４年７月１３日にＡＴＣＣに（ＡＴＣＣ３９７６ ８）として受託された。

しかしながら、Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼの組換え発現のために、大腸菌（Ｅ 、　ｃｏｌｉ）以外の微生物の菌株、例えば、バチルス、例えば、枯草菌（Ｂａ ｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナスｍ　（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ ａｓ）の種々の菌株、および他の細菌の菌株をまた使用することができる。

このような原核生物系において、典型的には、宿゛主または宿主と適合性の種か ら誘導された複製起点およびコントロール配列を含有するプラスミドのベクター を使用する。

例えば、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）は、典型的には、Ｂｏｌｉｖａｒら、１９７ ７、Ｇｅｎｅ、２　：　９５に記載されているｐＢＲ３２２の誘導体を使用して 形質転換される。プラスミドｐＢＲ３２２はアンピシリン耐性およびテトラサイ クリン耐性のための遺伝子を含有する。これらの薬物耐性のマーカーは、所望の ベクターを構成するとき、保持または破壊することができ、それゆえ所望の組換 え体の存在の検出を促進することができる。

普通に使用される原核生物のコントロール配列、すなわち、リポソーム結合部位 の配列と共に、必要に応じてオペレーターを伴う、転写開始のためのプロモータ ーは次のものを包含する：β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトー ス（ｌａｃ）プロモーター系（Ｃｈａｎｇら、１９７７、　Ｎａｔｕｒｅ、　１ ９８　：　１０５６）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄ ｅｌら、１９８０．　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、８　：　４０５７）お よびラムダ由来ＰＬプロモーター（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら、１９８１．　Ｎａｔ ｕｒｅ、　２９２−１２８）およびＮ−遺伝子リポソーム結合部位（Ｎ１．、　 ）。ポータプルのコントロールシステムのカセットは、米国特許第４．７１１． ８４５号（１９８７年１２月８日発行）に記載されている。このカセットは、Ｎ ＋ｔＢ！配列の６ｂｐの３′内で切断可能とする少なくとも１つの制限部位を有 する第３　ＤＮＡ配列より上流に位置するＮ。８に作用可能に連鎖し〉　たＰ、 プロモーターを含む。また、ｃｈａｎｇら、欧州特許公開環２９６．８６４号（ １９８６年ＩＯ月８日発行）に記載されているホスファターゼＡ　（ｐｈｏＡ） は有用である。しかしながら、原核生物と適合性の任意の入手可能なプロモータ ー系を使用して、本発明のＴｍａ発現ベクターを構成することができる。

Ｔｍａインサートのヌクレオチド配列は、上流のリポソーム結合部位の効率にマ イナスに影響を与え、低いレベルの翻訳されたポリメラーゼを生ずることができ る。Ｔｍａ遺伝子の翻訳は、発現ベクターの［翻訳的にカップリングされた」誘 導体の構成により増強することができる。短いコード配列のための停止コドンが Ｔｍａ遺伝子コード配列のためのＡＴＧ開始コドンとｒカップリング」するよう に、Ｔｍａ遺伝子のコード配列からちょうど上流に第２翻訳開始シグナルおよび 短いコード配列をもつ発現ベクターを構成することができる。

翻訳を効率よく開始する第２の翻訳開始シグナルを、Ｔｍａ遺伝子の開始コドン の上流に挿入することかできる。例えば、１つの発現系は、ＴｒｐＨの最後の６ コドンにイン−フレームで融合されたＴ７バクテリオフアージの主要キャプシド タンパク質（遺伝子１０）の最初の１０コドンおよび翻訳開始シグナルを利用す ることができる。ＴｒｐＨのためのＴＧＡ　（停止）コドンを、Ｔｍａ遺伝子の コード配列のためのＡＴＧｌｊ＃始）コドンとｒカップリングツさせて、ＴＧＡ ＴＧを形成する。

短いコード配列の翻訳とＴｍａのコード配列の翻訳との間に、１塩基のフレーム −シフトが要求される。これらの誘導体の発現ベクターは組換えＤＮＡ法により 構成することができる。

遺伝コードの重複もまた、低い翻訳効率に関係づけることができる。典型的には 、同一のアミノ酸をコードする多数のコドンが存在するとき、可能なコドンの１ つが生物体において優先的に使用される。しばしば生物体は稀に使用されるコド ンに相当するものより高いレベルで好ましいコドンに相当するｔＲＮＡ種を蓄積 する。コドン使用のパターンがサーモタガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔａｇａ　 ｍａｒｉｔｉｍａ）と宿主細胞との間で異る場合、Ｔｍａポリメラーゼの遺伝子 の翻訳に必要なｔＲＮＡ種は豊富でない場合がある。Ｔｍａのコード配列におい て、アルギニンはｒ　ＡＧＡＪ　コドンにより最も頻繁にコードされるが、この で存在する。結局、ｒ　ＡＧＡＪコドンのためのｒＡｒｇＵＪ　ｔＲＮＡの大腸 菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）宿主細胞における低い濃度は、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ） 宿主細胞におけるＴｍａポリメラーゼ遺伝子のＲＮＡの翻訳効率を制限すること がある。大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）宿主細胞内のＴｍａのコード配列の翻訳効率 は、このｔＲＮＡ遺伝子の多数のコピーを宿主細胞の中で発現させることによっ て、このＡｒｇｔＲＮＡの濃度を増加することによって改良することができる。

細菌に加えて、真核性微生物、例えば、酵母菌もまた組換え宿主細胞として使用 することができる。サツカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の実験室味のパン酵母は最も頻繁に使用されるが、 他の多くの菌株が普通に入手可能である。２ミクロン複製起点を使用するベクタ ーが普通である（Ｂｒｏａｃｈ、　１９８３．　ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ 、、　１０１　：　３０７）が、酵母菌の発現に適当な他のプラスミドベクター が既知である（参照、Ｓ　ｔ　ｉｎｃｈｃｏｍｂら、１９７９．　Ｎａｔｕｒｅ 、　２８２：３９　；　Ｔｃｈｅｍｐｅら、１９８０．　Ｇｅｎｅ、　１０　： 　１５７；およびＣ１ａｒｋｅら、１９８３゜Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ 、、　１０１　：　３００）。酵母ベクターのためのコントロール配列は、解糖 系酵素の合成のためのプロモーターを包含する（Ｈｅｓｓら、１９６８．　Ｊ、 Ａｄｖ、Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｇ、、７　：　１４９；　Ｈｏ１ｌａｎｄら、１９ ７８゜Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ′ｇｙ、　１７　：　４９００　；および）ｌｏ ｌｌａｎｄら、１９８１．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、。

２５６：　１３８５）。この分野において知られている追加のプロモーターは、 次のものを包含する＝３−ホスホグリセレートキナーゼのためのプロモーター（ Ｈｔｚｃｍａｎら、１９８０．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２５５　：　２ ０７３）および他解糖系酵素、例えば、グリセルアルデヒド３−ホスフェートデ ヒドロゲナーゼ、ヘキドキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフル クトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセ レートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリセホスフェートイソメラーゼ、ホス ホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼのためのプロモーター。増殖 条件によりコントロールされる転写の追加の利点を有する他のプロモーターは、 アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソサイトクロムｃ１酸性ボスフエターゼ、窒 素の代謝に関連する分解系酵素、並びにマルトースおよびガラクトースの利用に 関係する酵素のためのプロモーターである。

コード配列の３′末端に配置するとき、ターミネータ−配列もまた使用して発現 を増大することかできる。このようなターミネータ−は、酵母誘導遺伝子の中で コード配列の後の３′非翻訳領域において見いだされる。酵母と適合性のプロモ ーター、複製起点、および他の調節配列を含有する任意のベクターは、酵母菌の Ｔｍａの発現ベクターを構成するときの使用に適する。

Ｔｍａ遺伝子はまた、多細胞の生物体から誘導された真核生物の宿主細胞の培養 物の中で発現させることができる。例えば、Ｔｉ５ｓｕｒｅＣｕｌｔｕｒｅ、　 Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ＣｒｕｚおよびＰａｔｔｅｒｓｏｎ編（１９ ７３）参照ノコト。通常す宿主細胞系は、ＣＯ３−７，Ｃ０５−Ａ２．　ＣＶ− １，ネズミの細胞、例えば、ネズミの骨髄腫Ｎ５１およびＶＥＲＯ，Ｈｅ１ａ細 胞、およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を包含する。このような 細胞のための発現ベクターは通常、次のものを包含する二哺乳動物細胞と適合す るプロモーターおよびコントロール配列、例えば、シミアンウィルス４０　（Ｓ Ｖ４０）からの普通に使用される前期および後期プロモーター（Ｆｉｅｒｓら、 １９７８．　Ｎａｔｕｒｅ、　２７３　：　１３３）、または他のウィルスのプ ロモーター、例えば、ポリオーマ、アデノウィルス２、ウシ乳頭腫ウィルス（Ｂ ＰＶ）、または鳥類の肉腫ウィルスから誘導されたプロモーター、または免疫グ ロブリンのプロモーターおよびヒートショックプロモーター。哺乳動物の系にお いてＢＰＶベクター系を使用してＤＮＡを発現するための系は、米国特許第４． ４１９．４４６号に開示されている。この系の変更は米国特許第４．６０１．９ ７８号に記載されている。曙乳動物細胞の一般的面は、Ａｘｅｌ、米国特許第４ ．３９９．２１６号に記載されている。「エンハンサ−」領域もまた、発現を最 適化するために重要である；これらは、一般に、プロモーター領域の上流に見い だされる配列である。複製起点は、必要に応じて、ウィルス源から得ることがで きる。しかしながら、染色体の中への組み込みは真核生物におけるＤＮＡの複製 のための普通のメカニズムである。

植物の細胞もまた宿主として使用することができ、そして植物の細胞と適合する コントロール配列、例えば、ノパリンシンサーゼプロモーターおよびポリアデニ ル化シグナル配列、（Ｄｅｐｉｃｋｅｒら、１９８２、　Ｊ、Ｍｏ１．Ａｐｐｌ 、Ｇｅｎｅｔ、、ｌ　：５６１）が入手可能である。バキュロウィルスベクター により提供される制御系を利用する昆虫を使用する発現系もまた、記載されてい る（Ｍｉｌｌｅｒら、１９８６．　ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｅｎｅｅｒｉｎｇ　（ Ｓｅｔｌｏｗら、編、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）　８　：　２７７ −２９７）。

昆虫に基づく発現はスボドプテラ・フルギペイダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕ ｇｉｐｅｉｄａ）において達成することができる。これらの系を使用しても組み 換えＴｍａポリメラーゼを生産することができる。

宿主細胞に依存して、形質転換はこのような細胞に適当な標準的技術を使用して 実施される。Ｃｏｈｅｎ、　１９７２．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、ＵＳＡ。

６９　：　２１１０に記載されているような、塩化カルシウムを使用するカルシ ウム処理は原核生物または実質的な細胞壁のバリヤーを含有する他の細胞のため に使用される。アグロバクテリウム・ツムファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｕｍ　ｔｕｍｆａｃｉｅｎｓ）による感染（Ｓｈａｗら、１９８３．　Ｇｅｎ ｅ。

２３　：　３１５）は、ある種の植物細胞について使用される。哺乳動物細胞に ついて、Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、　１９７８．　Ｖｉｒｏｌ ｏｇｙ、　５２　：　５４６のリン酸カルシウム沈澱方法が好ましい。酵母の中 への形質転換は、Ｖａｎ　Ｓｏｌｉｎｇｅｎら、１９７７、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒ ｉｏｌ、、１３０：９４６およびＨａｓｉｏら、１９７９、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７６　：　３８２９の方法に従い実施される 。

一旦Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼが組み換え宿主細胞の中で発現されると、タン パク質の精製が望ましいことがある。種々の精製手順を使用して本発明の組み換 え熱安定性ポリメラーゼを精製することができるが、より少ない工程を使用して 等しい純度の発現調製物を製造する必要があろう。大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）宿 主のタンパク質は感熱性であるので、組換え熱安定性Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラー ゼを粗製のリゼイトを加熱不活性化することによって実質的に濃縮することかで きる。

この工程は、宿主ＤＮＡからのＴｍａ　ＤＮＡポリメラーゼの解離を確実にしか つＴｍａ　ＤＮＡポリメラーゼと他の細胞リゼイトのタンパク質とのイオンの相 互作用を減少するために十分な量の塩（典型的には０．０３Ｍの硫酸アンモニウ ム）の存在下に実施する。さらに、０．３Ｍの硫酸アンモニウムの存在はフェニ ルセファ０−ズ力ラムとの疎水性相互作用を促進する。疎水性相互作用のクロマ トグラフィーは分離技術であり、ここで物質は疎水性基を含有する非帯電ベッド 材料との疎水性相互作用の異なる強さに基づいて分離される。典型的には、カラ ムをまず疎水性結合に好適な条件、例えば、高イオン強度の下で平衡化する。そ の時、下降する塩の勾配を使用して試料を溶出することができる。

本発明によれば、水性混合物（組み換えＴｍａ　ＤＮＡポリメラーゼを含有する ）を、比較的強い疎水性ゲル、例えば、フェニルセファローズ（Ｐｈａｒｍａｃ 　ｉａ製）またはフェール（Ｐｈｅｎｙｌ）　ＴＳＫ（東洋ソーダ製）を含有す るカラムに負荷する。フェニルセファローズのカラムとの相互作用を促進するた めに、例えば、０．３Ｍより高いか、あるいは低い、好ましい０．３Ｍの硫酸ア ンモニウム、あるいは０．５Ｍの高いか、あるいは低いＮａＣ１を含有する溶媒 を使用する。カラムおよび試料を、また、０．５ｍＭのＤＴＴを含有する５０ｍ Ｍのトリス（ｐＨ７，５）および１．０ｍＭのＥＤＴＡ　（ｒＴＥＪ　）緩衝液 中の０．３Ｍ硫酸アンモニウムに調節し、そして試料をカラムに適用する。この カラムを０．３Ｍの硫酸アンモニウム緩衝液で洗浄する。次いで、酵素を疎水性 相互作用を弱くする溶媒、例えば、減少する塩の勾配、エチレンまたはプロピレ ングリコール、または尿素で溶離することかできる。天然Ｔ＋ｎａＤＮＡポリメ ラーゼについて、好ましい態様はＴＥ−ＤＴＴ中の２Ｍの尿素および２０％のエ チレングリコールでカラムを洗浄することを包含する。

長期間の安定性のために、Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼ酵素を１種または２種以 上の非イオン性ポリマー洗剤を含有する緩衝液の中に貯蔵することかできる。こ のような洗剤は、一般に、はぼ１００〜２５０．０００ダルトン、好ましくは約 ４．０００〜２００．０００ダルトンの範囲の分子量を有し、そして酵素を約３ ．５〜約９．５、好ましくは約４〜８．５のｐＨにおいて安定化するものである 。このような洗剤の例は、次の文献ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ　Ｄｉｖｉｓｏｎ発行 、米国ニュージャーシイ州グレンロック、ロックロード１７５、の２９５〜２９ ８ページおよび同時継続出願第３８７、００３号、１９８９年７月２８日提出、 その開示をここに引用によって加える。

好ましくは、洗剤はエトキシル化脂肪酸アルコールエーテルおよびラウリルエー テル、エトキシル化アルキルフェノール、オクチルフェノキシポリエトキシエタ ノール化合物、変性オキシエトキシル化および／またはオキシプロピル化直鎖状 アルコール、ポリエチレングリコールモノオレエート化合物、ポリソルベート化 合物、およびフェノール系脂肪族アルコールエーテルから成る群より選択される 。ツイーン２０、ポリオキシエチル化（２０）ソルビタンモノラウレート（ＩＣ ｒ　Ａｍｅｒｉｃａｓ　Ｉｎｃ、　、プラウエア州つィルミントン）およびＩｃ ｏｎｏｌ　ＮＰ−４０、エトキシル化アルキルフェノール（ノニル）　（ＢＡＳ ＦＷｙａｎｄｏｔｔｅ　Ｃｏｒｐ、　、ニュージャーシイ州パルシバニイ製）は 、さらに一層好ましい。

本発明の熱安定性酵素は、このような酵素が必要であるか、あるいは望ましい、 任意の目的に使用することができる。とくに好ましい態様において、酵素はＰＣ Ｒとして知られている核酸増幅反応を触媒する。この核酸配列を増幅する方法は 、米国特許第４．６８３．２０２号および米国特許第４．８６５．１８８号（そ れらの各々をここに引用によって加える）に開示および特許請求されている。Ｐ ＣＲ核酸増幅法は、核酸または核酸の混合物の中に含有されている少なくとも１ つの特定の核酸配列を増幅することを包含し、そして最も普通の態様において、 二本鎖ＤＮＡを生成する。

説明を容易とするために、下に記載するプロトコルは増幅すべき特定の配列が二 本鎖の核酸の中に含有されていると仮定する。しかしながら、この方法は一本鎖 の核酸、例えば、ｍＲＮＡの増幅においても同様に有用であるが、好ましい実施 態様において究極の生成物はなお二本鎖ＤＮＡである。−重鎖の核酸の増幅にお いて、第１工程は相補的鎖の合成（２つの増幅プライマーの１つをこの目的に使 用することができる）を包含し、そして連続する工程は下に記載する二本鎖の増 幅法におけるように進行する。

増幅は、工程： （ａ）各核酸鎖を、４つの異なるヌクレオシド三リン酸および増幅されるべき各 特定の配列のための２つのオリゴヌクレオチドのプライマーと接触させ、ここで 各プライマーを、特定の配列の異なる鎖に対して相補的であり１つのプライマー から合“成された伸長生成物がその相補的体から分離されたとき、他のプライマ ーの伸長生成物の合成のための鋳型として働くように選択し、前記接触を各プラ イマーが相補的核酸鎖に対してハイブリダイゼーションすることができるような 温度において実施し、 （ｂ）各核酸鎖を、工程（ａ）と同時にまたはその後に、サーモタガ−ｖリチｖ 　（Ｔｈｅｒｍｏｔａｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ）からのＤＮＡポリメラーゼと接 触させ、前記ＤＮＡポリメラーゼはヌクレオシド三リン酸を結合させて特定の核 酸配列の各鎖に対して相補的であるプライマー伸長生成物を形成することができ るものであり、（Ｃ）工程（ｂ）からの混合物を、酵素の活性を促進しかつ、増 幅される各員なる配列について、各核酸鎖の鋳型に対して相補的である各プライ マーの伸長生成物を合成するために有効であるが、各伸長生成物を相補的鎖の鋳 型から分離するほど高くない温度において有効な時間の間維持し、 （ｄ）工程（Ｃ）からの混合物を、プライマー伸長生成物をそれらがその上で合 成されて一本鎖の分子を生成する鋳型から分離するために有効であるが、酵素を 不可逆的に変性するほど高（ない温度に有効な時間の間加熱し、 （ｅ）工程（ｄ）からの混合物を、工程（ｄ）において生成された一本鎖の分子 の各々へのプライマーのハイブリダイゼーションを促進するために有効な温度に 有効な時間の間冷却し、そして（ｆ）工程（ｅ）からの混合物を、酵素の活性を 促進しかつ、増幅される各員なる配列について、工程（ｄ）において生成された 各核酸鎖の鋳型に対して相補的である各プライマーの伸長生成物を合成するため に有効であるが、各伸長生成物を相補的鎖の鋳型から分離するほど高くない温度 に有効な時間の間維持する、ことを含んでなる。工程（ｅ）およびＣｆ）におけ る有効な時間および温度を一致させて、工程（ｅ）および（ｆ）を同時に実施で きるようにすることができる。工程（ｄ）〜（ｆ）は、所望のレベルの増幅が得 られるまで、反復する。

この増幅方法は既知配列の特定の核酸配列を大量に生産するために有用であるば かりでなく、かつまた存在することが知られているが、完全には特定されていな い核酸配列を生産するために有用である。配列の両端における十分な数の塩基を 十分に詳細に知り、こうして配列に沿った相対的位置における所望の配列の異な る鎖にハイブリダイゼーションする２つのオリゴヌクレオチドのプライマーを調 製できるようにし、こうして一方のプライマーから合成された伸長生成物が、鋳 型（相補的）から分離されたとき、定義された長さの核酸配列への他方のプライ マーの伸長のための鋳型として働くことができるようにする。配列の両端におけ る塩基についての知識が深くなればなるほど、標的核酸配列に対するプライマー の特異性およびこの方法の効率をより大きくすることができる。

いずれの場合においても、増幅すべき配列の初期のコピーは入手可能でな（ては ならないが、配列は純粋である必要はなく、あるいは個別の分子である必要はな い。一般に、増幅方法は連鎖反応を包含し、この連鎖反応は、（ａ）要求される 配列の末端が十分に詳細に知られていて、それらにハイブリダイゼーションする オリゴヌクレオチドを合成することができ、且つ（ｂ）連鎖反応を開始するため に少量の配列が入手可能であると、関係する反応工程の数に関して指数的な量で 、少なくとも１つの特定の核酸配列を生産する。連鎖反応の生産物は、使用され た特定のプライマーの５′末端に対応する末端をもつ個別の核酸二重鎖であろう 。

任意の核酸配列を、精製されたまたは精製されない形態で出発核酸として利用す ることができるが、ただしそれは増幅しようとする特定の核酸配列を含有するか 、あるいは含有すると思われるものであることを条件とする。増幅すべき核酸は 、任意の源、例えば、プラスミド、例えば、ｐＢＲ３２２から、クローニングし たＤＮＡまたはＲＮＡから、あるいは、細菌、酵母菌、ウィルス、細胞小器官、 および高等生物、例えば、植物および動物を包含する任意の源からの天然ＤＮＡ またはＲＮＡから得ることができる。ＤＮＡまたはＲＮＡは、血液、組織材料、 例えば、絨毛膜の絨毛、または羊膜細胞から種々の技術により抽出することがで きる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、前掲、ｐｐ、　２８０−２８１を参照のこ と。この方法は、例えば、メツセンジャーＲＮＡを包含するＤＮＡまたはＲＮＡ を使用することができ、前記ＤＮＡまたはＲＮＡは一本鎖または二本鎖であるこ とができる。さらに、各々の１つの鎖を含有するＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを 利用することができる。

これらの核酸の任意の混合物もまた、使用することができ、また前の増幅反応か ら核酸を生成することができる（同一であるか、あるいは異なるプライマーを使 用する）。増幅すべき特定の核酸配列は大きい分子の一部分のみであるか、ある いは特定の配列が全体の核酸を構成するように、個別の分子として最初から存在 することができる。

増幅すべき配列は最初に純粋な形態で存在することは必要ではない；配列は複雑 な混合物の小さい部分、例えば、全ヒトＤＮＡの中に含有されるβ−グロブリン 遺伝子の一部分（Ｓａｉｋｉら、１９８５．５ｃｉｅｎｃｅ。

２３旧１５３０−１５３４において例示されているように）または特定の微生物 のために核酸配列の一部分（この生物体は特定の生物学的試料の非常に小さい部 分のみを構成するであろう）であることができる。

細胞の溶解および細胞内の成分の分散が起こるまで（一般に１〜１５分）低張緩 衝液の中の懸濁および約９０℃〜１００℃の熱処理後、細胞を増幅法において直 接使用することができる。加熱工程後、増幅試薬を溶解した細胞に直接添加する ことができる。出発核酸配列は！より多い所望の核酸配列を含有することができ る。増幅方法は大量の１つの特定の核酸配列の生産のためにばかりでなく、かつ また同一であるか、あるいは異なる核酸分子上に位置するｌより多い異なる特定 の核酸配列を同時に増幅するために有用である。

プライマーはＰＣＲ法において主要な役割を演する。語「プライマー」は、増幅 法の説明において使用するとき、と（に増幅すべき断片の末端の１または２以上 の配列に関する情報が多少不明瞭である場合、あるいは本発明の縮重プライマー 法を使用する場合、１より多いプライマーを意味する。例えば、核酸配列をタン 、＜り質配列の情報から推理される場合、遺伝コードの縮重性に基づいてすべて の可能なコドンの多様性を表す配列を含有する１集団のプライマーを各鎖のため に使用する。この集団からの１つのポリメラーゼは、増幅すべき所望の配列の末 端と十分に相同性であって、増幅のため（こ有用であろう。

さらに、適当な数のオリゴヌクレオチドブライマーを利用するかぎり、１より多 い特定の核酸配列を最初の核酸または核酸の混合物から増幅することができる。

例えば、２つの異なる特定の核酸配列を生成しようとするとき、４つのプライマ ーを利用する。プライマーのうちの２つは特定の核酸配列の１つに対して特異的 であり、そして他の２つのプライマーは第２の特定の核酸配列に対して特異的で ある。このようにして、２つの異なる特定の配列の各々を本発明の方法により指 数的に生産することができる。

所定の配列内の配列は、反応においてより大きい特異性をえるための所定の増幅 サイクル後、少なくとも１つの増幅サイクル後、増幅すべき配列の内部の配列（ すなわち、末端上に存在しない配列）に対して相補的であるプライマーの組を添 加することにより増幅することができる。このようなプライマーは任意の段階に おいて添加することができ、そしてより短い増幅された断片を与えるであろう。

あるいは、より長い断片は、非相補性の末端をもつが増幅において前に利用した プライマーと多少のオーバーラツプを有するプライマーを使用することによって 調製することができる。

プライマーはまた、増幅法をｉｎ　ｖｉｔｒｏの突然変異誘発のために使用する とき、主要な役割を演する。使用するプライマーかもとの鋳型に正確に相補的で ない、増幅反応の生産物は、鋳型よりむしろプライマーの配列を含有し、それゆ えｉｎ　ＶｉｔｒＯの突然変異を導入するであろう。それ以上のサイクルにおい て、それ以上の誤対合のブライミングが要求されないので、突然変異は減少しな い効率で増幅されるであろう。前述したように変更されたＤＮＡ配列をつくる方 法を、異なるプライマーを使用して、変更されたＤＮＡについて反復して、それ 以上の配列の変化を導入することができるであろう。このようにして、■系列の 突然変異した配列を徐々に生成することができ、ここでその系列への各新しい付 加は最後のものと小さい程度に異なるが、もとのＤＮＡ源の配列と非常に大きく 異なる。

プライマーはその配列の一部分として非相補的配列を含有できるので、プライマ ーの十分な量が増幅すべき鎖に対して相補的である配列を含有するかぎり、多数 の他の利点を実現することができる。

例えば、鋳型の配列に対して相補的でないヌクレオチド配列（例えば、プライマ ー、リンカ−、コード配列など）をプライマーの１つまたは両方の５′末端に取 り付けることができ、それゆえ増幅法の生成物に付加することができる。伸長プ ライマーを添加した後、十分なサイクルを実施して、非相補的ヌクレオチドのイ ンサートを含有する所望の量の新しい鋳型を得る。これにより、簡単な技術を使 用して比較的短い時間（例えば、２時間以内に）で、大量の組み合わされた断片 を生産することができる。

オリゴヌクレオチドのプライマーは、任意の適当な方法、例えば、前述のホスホ トリエステルまたはホスホジエステルの方法、またはそれらの自動化された態様 を使用して調製することができる。１つのこのような自動化された態様において 、ジエチルホスホルアミダイトを出発物質として使用し、そしてＢｅａｕｃａｇ ｅら、１９ｇ１．７’ＣｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ、　２２　：　１８ ５９−１８６２、に記載されているようにして合成することができる。固体支持 体上でオリゴヌクレオチドを合成する１つの方法は、米国特許第４．４５８．０ ６６号に記載されている。また、生物学的源（例えば、制限エンドヌクレアーゼ 消化物）から単離されたプライマーを使用することができる。

しかしながら、どのプライマーを使用しても、反応混合物はＰＣＲが起こすため の鋳型を含有しなくてはならない。なぜなら、特定の核酸配列は鋳型としてその 配列を含有する核酸を使用して生成されるからである。第１工程は、増幅または 検出されるべき各特定の核酸配列について、各核酸鎖を４つの異なるヌクレオシ ド三リン酸および２つのオリゴヌクレオチドのプライマーと接触することを包含 する。増幅または検出すべき核酸がＤＮＡである場合、ヌクレオシド三リン酸は 通常ｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰであるが、種々のヌクレ オチドの誘導体もまたこの方法において使用することができる。

ヌクレオシド三リン酸の濃度は広く変化することができる。典型的には、濃度は 増幅のための緩衝液の中で各ｄＮＴＰにおいて５０〜２００μＭであり、モして ＭｇＣ１ｚは緩衝液の中に１〜３ｍＭの量で存在して、ポリメラーゼを活性化し かつこの反応の特異性を増加する。しかしながら、１〜２０μＭのｄＮＴＰの濃 度がいくつかの応用、例えば、ＤＮＡの配列決定または高い比活性の放射線標識 したプローブの発生のために好ましいことがある。

標的核酸の核酸鎖は、プライマーの伸長生成物である追加の核酸鎖の合成のため の鋳型として働く。この合成は任意の適当な方法を使用して実施できるが、一般 に緩衝化された溶液の中で、好ましくはｐＨ７〜９において、最も好ましくはｐ Ｈ約８において起こる。合成を促進するために、モル過剰の２つのオリゴヌクレ オチドブライマーを鋳型鎖を含有する緩衝液に添加する。実際には、増幅すべき 配列は複雑な長鎖核酸鎖の混合物の中に含有される場合、プライマーの添加量は 相補的鎖（鋳型）の量を越えたモル過剰である。大モル過剰がこの方法の効率を 改良するために好ましい。したがって、少なくとも１００：１またはそれ以上の プライマー：鋳型の比を一般にクローニングされたＤＮＡの鋳型について使用し 、そして約１０”：１またはそれ以上のプライマー二鋳型の比を一般に複雑なゲ ノムの混合物について使用する。

次いで、鋳型、プライマーおよびヌクレオシド三リン酸の混合物を、増幅または 検出されるべき核酸が一本鎖または二本鎖であるかどうかに従い、処理する。核 酸が一本鎖である場合、第１伸長サイクルの前に変性工程は不必要であり、そし て反応混合物をプライマーのその相補的標的（鋳型）配列へのハイブリダイゼー ションを促進する温度に保持する。このような温度は、一般に、有効な時間、一 般に数秒〜５分、好ましくは３０秒〜１分について、約３５°Ｃ〜６５°Ｃまた はそれ以上、好ましくは約３７℃〜６０°Ｃである。３５℃〜７０℃のハイブリ ダイゼ一シヨン温度をＴｍａ　ＤＮＡポリメラーゼについて使用することができ る。長さが１５ヌクレオチドまたはそれより長いプライマーを使用して、プライ マーのハイブリダイゼーションの特異性を増加する。より短いプライマーはより 低いノへイブリダイゼーション温度を必要とする。

もとの−木組核酸に対する相補体は、適当な緩衝液、ｄＮＴＰおよび１または２ 以上のオリゴヌクレオチドのプライマーの存在下にＴｍａＤＮＡポリメラーゼを 添加することによって合成することができる。

適当な単一のプライマーを添加する場合、プライマー伸長生成物は一本鎖核酸に 対して相補的であり、そして等しいか、あるいは等しくない長さくプライマーが 鋳型にハイブリダイゼーションするかどうかに依存する）の鎖の二重鎖となって 核酸鎖とハイブリダイゼーシヨンし、次いでこれを前述したように一本鎖に分離 して、２つの単一の、分離された、相補的な鎖を生産することができる。次いで 第２プライマーを添加し、こうしてプライマーの伸長の引き続くサイクルを鋳型 としてもとの一本鎖の核酸および第１プライマーの伸長生成物の両者を使用して 実施する。あるいは、２またはそれ以上の適当なプライマー（それらの１つは他 の伸長生成物を鋳型として使用して合成をブライミングするであろう）を−重鎖 の核酸に添加し、そして反応を実施することができる。

二本鎖の増幅または一本鎖標的の第２サイクルの増幅の場合におけるように、核 酸が２つの鎖を含有する場合、プライマーのハイブリダイゼーションの前に、核 酸の鎖を分離しなくてはならない。この鎖の分離は、物理的、化学的または酵素 的手段を包含する、任意−の適当な変性法により達成することができる。核酸の 鎖を分離する１つの好ましい物理的方法は、核酸を完全な（〉９９％）変性が起 こるまで加熱することを包含する。典型的な加熱変性は、核酸の組成および大き さに依存して、一般に約数秒〜数分の範囲の時間の間、約８０℃〜１０５°Ｃの 温度を用いる。好ましくは、有効な変性温度は数秒〜１分間について９０℃〜１ ００℃である。鎖の分離はまた、ヘリカーゼ（Ｈｅｌｉｃａｓｅｓ）として知ら れている酵素または酵素ＲｃｃＡ　（これらはヘリカーゼの活性を有しそしてｒ ｉｂｏＡＴＰの存在下にＤＮＡを変性することが知られている）のクラスからの 酵素により誘発することができる。へりカーゼにより核酸鎖を分離するために適 当な反応条件はＫｕｈｎ　）Ｉｏｆｆｍａｎｎ−Ｂｅｒｌｉｎｇ、　１９７８． 　Ｃ５Ｈ−Ｑｕｎａｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　４３　：６３に記載 されており、そしてＲｅｃＡを使用する技術はＲａｄｄｉｎｇ、　１９８２゜性 は等しいか、あるいは等しくない長さの２つの分離された鎖を生成する。

二本鎖の核酸を熱により変性する場合、反応混合物を各プライマーの相補的標的 （鋳型）配列へのハイブリダイゼーションを促進する温度に冷却する。この温度 は、試薬に依存して、通常約２５℃〜６５°Ｃ１好ましくは３７°Ｃ〜６０℃で ある。ハイブリダイゼーション温度は有効な時間、一般に数秒〜数分、好ましく は１０秒〜１分の間維持される。実際には、温度は単に約９５°Ｃから３７°Ｃ 程度に低く低下させ、そしてハイブリダイゼーシヨンはこの範囲内の温度におい て起こる。

核酸が一本鎖または二本鎖であるかどうかにかかわらず、サーモタガ−ｖリチｖ 　（Ｔｈｅｒｍｏｔａｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ）からのＤＮＡポリメラーゼを、 変性の前にまたはその間に、あるいは温度がハイブリダイゼーションを促進する 範囲に低下しつつあるとき、あるいはその範囲にあるとき、添加することができ る。Ｔｍａポリメラーゼの熱安定性は任意の時間におけるＴｍａポリメラーゼの 反応混合物への添加を可能とするが、混合物がストリンジェントのハイブリダイ ゼーション温度以下に冷却されない時点において、ポリメラーゼを反応混合物に 添加することによって、非特異的増幅を実質的に阻止することができる。

ハイブリダイゼーション後、酵素の活性が促進されまたは最適化される温度、す なわち、ハイブリダイズしたプライマーおよび鋳型からのプライマー伸長生成物 の合成を促進するにあたり酵素の活性を増加するために十分な温度に、反応混合 物を加熱するか、あるいは維持する。温度は、実際に、各核酸の鋳型に対して相 補的である各プライマーの伸長生成物を合成するために十分であるが、その泪補 的鋳堅からの各伸長生成物を変性するほど高くあってはならない（すなわち、温 度は一般に約り０℃〜９０’Ｃ以下である）。

使用するｌまたは２以上の核酸に依存して、この合成反応に有効な典型的な温度 は一般に約４０℃〜８０”Ｃ１好ましくは５０’Ｃ〜７５℃の範囲である。サー モタガ−ｖリチｖ　（ＴｈｅｒＩｌｌｏｔａｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ）のＤＮＡ ポリメラーゼについて、温度はより好ましくは約６５℃〜７５℃の範囲である。

この合成に要求される時間は、温度、核酸の長さ、酵素、および核酸混合物の複 雑さに依存して、約ｌθ秒〜数分またはそれ以上の範囲であることができる。伸 長時間は、通常、約３０秒〜数分である。核酸がより大きい場合、より長い時間 が相補的鎖の合成に要求される。

新しく合成された鎖および相補的核酸鎖は、増幅法の次の工程において使用され る二本鎖の分子を形成する。次の工程において、二本鎖の分子の鎖は加熱変性に より分離され、この加熱変性はその分子を変性するために有効な温度および時間 の間実施されるが、熱安定性酵素が完全にかつ不可逆的に変性または不活性化さ れる温度ではなくかつそれほど時間は長くてはならない。この鋳型の変性後、温 度は、前述したように、前の工程から生成した相補的−重鎖の核酸（鋳型）への プライマーのハイブリダイゼーションを促進するレベルに低下させる。

このハイブリダイゼーション工程後、あるいはハイブリダイゼーション工程と同 時に、温度は、熱安定性酵素の活性を促進して、新しく合成された鎖およびもと の鎖の両者を鋳型として使用するプライマー伸長生成物の合成を可能とするため に有効な温度に調節される。温度はやはり前述したように、伸長生成物をその鋳 型から分離（変性）するほど高くあってはならない。ハイブリダイゼーションは この工程において起こることができるので、変性後の冷却の前の工程は不必要で ある。このような場合において、同時の工程を使用して、好ましい温度範囲は５ ０℃〜７０℃である。

鎖の分離、ハイブリダイゼーション、および伸長生成物の合成の１サイクルに関 係する加熱および冷却の工程を、所望の量の特定の核酸配列を生成するために必 要な回数だけ反復することができる。

唯一の制限は存在するプライマー、熱安定性酵素およびヌクレオシド三リン酸の 量である。通常、１５〜３０サイクルが完了する。増幅されたＤＮＡの診断的検 出について、サイクルの数は試料の性質および試料の中種的の濃度に依存するで あろう。例えば、増幅される試料が純粋である場合、より少ないサイクルが要求 される。試料が核酸の複雑な混合物である場合、より多いサイクルが検出のため に十分なシグナルを増幅するために要求されるであろう。一般の増幅および検出 のために、この方法は約１５回反復される。増幅を使用して、標識された配列特 異的プローブで検出すべき配列を発生するとき、およびヒトゲノムＤＮＡが増幅 の標的であるとき、明瞭に検出可能なシグナルを生成するために、すなわち、バ ックグラウンドのノイズが検出を妨害しないようにするために十分に配列を増幅 するためには、この方法を１５〜３０回反復する。

主要な試薬が使い尽くされず、そして酵素が変性されるかあるいは不可逆的に不 活性化されないことを条件して、追加のヌクレオシド、プライマー、または熱安 定性酵素は初期の添加後に不必要であるが、そのようになった場合において、追 加のポリメラーゼまたは他の試薬を反応を続けるために添加しなくてはならない であろう。

しかしながら、各工程におけるこのような物質の添加は反応に悪影響を及ぼさな いであろう。適当な数のサイクルを完結して、所望の量の特定の核酸配列を生成 した後、通常の方法で、例えば、ＥＤＴＡ。

フェノール、ＳＤＳ、またはＣＨＣｌ、を添加して酵素を不活性化するか、ある いは反応の成分を分離することによって、反応を停止させることができる。

増幅の方法は連続的に実施することができる。自動化された方法の１つの態様に おいて、温度がある時間の間あるレベルでコントロールされるように、反応混合 物を温度サイクルすることができる。

この目的のための１つのこのような機器は、パーキン−エルマー・セツス・イン スッルメ：／”７　（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　Ｉｎｓｔｒｕｍ ｅｎｔｓ）により開発されかつ市販されている、増幅反応を取り扱うための自動 化された機械である。この計器を使用してＰＣＲを実施するための詳細なインス トラクションは、この機器の購入するとき入手可能である。

Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼは、ポリメラーゼ連鎖反応による核酸配列の増幅が 有用である多様な方法において非常に有用である。増幅方法を米国特許第４．８ ００．１５９号に記載するように利用して、適当な発現ベクター中への挿入のた めの特定の核酸配列をクローニングすることができる。このベクターを使用して 、組み換えＤＮＡ技術の標準的方法により、適当な宿主生物体を形質転換して遺 伝子生産物を生成することができる。このようなりローニングは、平滑末端の結 合を使用するベクターの中への直接の結合、または制限酵素を使用するプライマ ー内に含有された部位における切断を包含することができる。Ｔｍａポリメラー ゼに適当な他の方法は、米国特許第４．６８３．１９５号および米国特許第４． ６８３．２０２号並びに欧州特許公開環２２９．７０１号；欧州特許公開環２３ ７．３６２号；および欧州特許公開環２５８．０１７号（これらの開示をここに 引用によって加える）に記載されているものを包含する。さらに、本発明の酵素 は非対称のＰＣＲ（参照、ＧｙｌｌｅｎｓｔｅｎおよびＥｒ１ｉｃｈ、　１９８ ８．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８５ニア６５２−７ ６５６、その開示をここに引用によって加える）：逆ＰＣＢ　（Ｏｃｂｍａｎら 、１９８８゜ゼはまた、逆転写酵素活性を有すると信じられる。　ＰＣＴ特許公 開第９１１０９９４４号、１９９１年７月１１日公開を参照のこと、その開示を ここに引用によって加える。

Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼの逆転写酵素活性は、ＲＮＡを転写および増幅する 方法におけるこの酵素の使用を可能とする。このような方法の改良は単一の酵素 の使用にあるが、従来の方法は１より多い酵素を必要とした。

改良された方法は、工程二（ａ）　ＲＮＡ鋳型と適当なプライマーとを、該プラ イマーが対応するＲＮＡ鋳型にアニーリングする条件下に組み合わせ；そして（ ｂ）アニーリングされたプライマー−ＲＮＡ鋳型の混合物をＴｍａ　ＤＮＡポリ メラーゼと、そのＤＮＡポリメラーゼがデオキシヌクレオシド三リン酸の重合を 触媒してＲＮＡ鋳型の配列に対して相補的なりＮＡ配列を形成するために十分な 条件下に、インキュベーションすることによって、ＲＮＡを逆転写する、ことを 含んでなる。

上記の方法の他の面において、ＲＮＡ鋳型にアニーリングするプライマーはまた 、ＰＣＨによる増幅のために適当であることがある。

ＰＣＲにおいて、逆転写されたｃＤＮＡ鎖に対して相補的である第２プライマー は伸長生成物の合成の開始部位を提供する。既に述べたように、Ｔｍａ　ＤＮＡ ポリメラーゼはｃＤＮＡ鋳型上のこの伸長反応を触媒することができる。

Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ分子の増幅において、第１伸長反応は 逆転写であり、ここでＤＮＡ鎖はＲＮＡ／　ｃＤＮＡハイブリッドの分子の形態 で生成される。ＤＮＡ鎖を鋳型として使用する第２伸長反応は、二本鎖ＤＮＡ分 子を生成する。こうして、Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼを使用するＲＮＡ鋳型か らの相補的ＤＮＡ鎖の合成は、ＰＣＲによる増幅のための出発物質を提供する。

Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼをＲＮＡ鋳型からの核酸の転写に使用するとき、Ｍ ｇ！＋を含有する緩衝液の使用は、従来使用されたＭｇ　２−を含有する逆転写 緩衝液と比較して、Ｔｍａ逆転写酵素活性の改良された刺激を提供する。結局、 増加したｃＤＮＡの収量はまたこれらの方法から生ずる。

前述したように、Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写の生成物はＲＮ Ａ／　ｃＤＮＡハイブリッドの分子である。このＲＮＡを加熱変性あるいはアル カリ、熱、または酵素処理を包含する任意の他の既知の方法により除去する。次 いで残留するｃＤＮＡ鎖は自己相補的銀の重合のための鋳型として働き、これに より増幅または他の取り扱いに適当二本鎖ｃＤＮＡ分子を提供する。第２鎖の合 成は配列特異的プライマーおよびＴｍａ　ＤＮＡポリメラーゼを必要とする。

第２　ｃＤＮＡ鎖の合成後、生ずる二本鎖ｃＤＮＡ分子は、ＤＮＡ配列決定、Ｐ ＣＲによる増幅または特定の核酸配列の検出を包含する、ある数の目的に役立つ ことができる。ｃＤＮＡのセグメントの増幅に有用な特定のプライマーを、逆転 写後に、添加することができる。また、第１組のプライマーを使用して特定のｃ ＤＮＡを合成し、そして第２の入れ子の組のプライマーを使用して所望のｃＤＮ Ａセグメントを増幅することができる。これらの反応のすべてはＴｍａ　ＤＮＡ ポリメラーゼにより触媒される。

Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼはまた、試料の中のＲＮＡ標的分子を検出する方法 を簡素化および改良するために使用できる。これらの方法において、Ｔｍａ　Ｄ ＮＡポリメラーゼは次の反応を触媒する：　（ａ）逆転写：（ｂ）第２鎖ｃＤＮ Ａの合成；および必要に応じて（Ｃ）　ＰＣＨによる増幅。単一の酵素のみを必 要とする改良に加えて、記載する方法におけるＴｍａ　ＤＮＡポリメラーゼの使 用は、各手順の工程のために異なる酵素の使用のために必要であった、２組のイ ンキュベーション条件の従来の要件を排除する。Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼの 使用は、ＲＮＡの転写および相補的ＤＮＡの増幅を増強された特異性をもって、 従来のＲＮＡのクローニングおよび診断的方法より工程の数を少なくして提供す る。これらの方法は実験室および臨床的分析のためのキットにおける使用に適合 可能である。

上の方法において転写されそして増幅されたＲＮＡは、多数の源に由来すること ができる。ＲＮＡ鋳型は、任意の生物体からの核酸の調製物、例えば、ウィルス またはバクテリアの核酸の調製物の中に含有されていることができる。この調製 物は細胞の破片および他の成分、精製されたＲＮＡ、または精製されたｍＲＮＡ を含有することができる。ＲＮＡ鋳型はまた試料の中の不均一なＲＮＡ分子の集 団であることができる。さらに、標的ＲＮＡは生物学的試料の中に含有されるこ とがあり、そして試料はＲＮＡがほんの小さい部分である、異種の試料であるこ とができる。このような生物学的試料の例は、血液の試料およびバイオプシーの 組織試料を包含する。

上の方法の逆転写工程における使用するプライマーはＲＮＡ鋳型に対して一般に 完全に相補的であるが、プライマーは完全に相補的である必要はない。ＰＣＨに おけるように、逆転写が起こるためにはプライマーのすべてが鋳型にアニーリン グしなくてもよい。例えば、非相補的ｓｎはプライマーの５′末端に存在するこ とができ、プライマーの残部はＲＮＡに対して相補的である。あるいは、非相補 的塩基がプライマーの中に介在することができるが、ただしプライマーの配列は ハイブリダイゼーションが起こりかっ相補的ＤＮＡ鎖の合成を可能とするために 十分なＲＮＡ鋳型と相補性をもっことを条件とする。

以下の実施例は例示のみに提供され、そして特許請求される本発明の範囲をいか なる方法においても限定することを意図しない。これらの実施例において、特記 しない限り、すべての百分率は固体について重量により、そして液体について容 量により、そしてすべての温度は℃である。

実施例１ サーモタガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔａｇａ　ｍａｒｉｔｉｏ＋ａ）のＤＮＡ ポリメラーゼからのＴｍａ　ＤＮＡポリメラーゼの単離を記載する。ＤＮＡポリ メラーゼは、Ｌａｗｙｅｒら、１９８９．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　 ２６４　（１１）　：　６４２７−６４３７（その開示をここに引用によって加 える）の中にＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼについて記載されている１つの変更（ １ｍＭのＭｇＣ１＊）を有する方法に従い精製の間に、種々の時点で測定した。

典型的には、この測定は２５ｍＭのＴＡＰＳ−）１ｃＩ、ｐＨ９，５（２０℃） 　；　５０ｍＭのＫＣＩ　；　１ｍＭのＭｇＣ１ｔ　；　１ｍＭのβ−メルカプ トエタノール：２０ｇＭの各々のｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰおよび買Ｐ 　；　１０ｍＭのα−”Ｐ　−ｃｃＴＰ　（０，０３。

〜０．０７μＣｉ／ｎＭ）　；　１２．５μｇの活性化サケ精子ＤＮＡ　、並び にポリメラーゼから構成された反応混合物の５０μｌの合計体積で実施する。

反応を、希釈物（希釈物は１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、　ｐＨ８，０，５０ｍＭ のＫＣＩ。

０、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｌ　ｍｇ／ｍｌのオートクレーブ処理したゼラチン、０ ．５％のＮｐ４０．　０．５％のツイーン２０およびＩＯＩＭのβ−メルカプト エタノールから構成されている）中のポリメラーゼの添加により開始し、そして 反応を７５℃において実施する。下に示す計算のために、添加したポリメラーゼ （および希釈物）の体積を５μｍであり、そして合計反応体積を５０μｌである と仮定する。１０分間のインキュベーション後、１０μｌの６００１ＭのＥＤＴ Ａの添加により反応を停止させる。反応混合物を遠心し、そして５０μｌの反応 混合物を１０ｍ１の２ｍＭのＥＤＴＡ中５０μｇ／ａ＋１のキャリヤーＤＮＡ　 （０℃）に移す。等しい体積（１ｍｌ）の２０％のＴＣＡ、２％のピロリン酸ナ トリウムを添加し、そして混合する。この混合物を０℃において１５〜２０分間 インキュベーションし、次いでワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）　ＧＦ／　Ｃフィ ルターで濾過し、そして５％のＴＣＡおよび１％のピロリン酸ナトリウムを含有 する混合物（６＊５ｍｌ）でよく洗浄し、次いで冷９５９６のエタノールで洗浄 する。次いでフィルターを乾燥し、そして放射能を計数する。バックグラウンド （酵素なし）は通常インプットＣＩ）０１の０．００１％〜０．Ｏ１％である。

約５０〜２５０ピコモルのＳ″Ｐ　−ｄＣＴＰ標準を単位の計算のためにスポツ ティングする。１単位は７５℃において３０分間で組込まれた１０ｎＭのｄＮＴ Ｐに等しい。単位は次のようにして計算する：４．１６７の係数は、停止溶液の 添加後の反応体積（６０μｍ）の５／６（５０μｍ）のみを計数することから生 ずる。

すべての操作は、特記しない限り、Ｏ℃〜４℃において実施した。

すべてのガラス器は使用前にベーキングし、そして精製に使用した溶液は、可能 ならば、使用前にオートクレーブ処理した。

約５０ｇの凍結したサーモタガ・マリチｖ　（Ｔｈｅｒｎ＋ｏｔａｇａ　ｍａｒ ｉｔｉｍａ）菌株ＭＳＢ８の細胞（教授に、　００Ｓｔｅｔｔｃｒ博士、ドイツ 国しゲンスバーグ、により提供された）を、２．４ｍＭのＰＭＳＦ（ＤＭＦ中１ ４４ｍＭのストックから）を含有する２５ｍ１の３ＸＴＥ−Ｄ買緩衝液（１５０ ｍＭのトリス−ＣＩ（ｐＨ７，５）。

３ｍＭのＥＤＴＡ、および３ａ＋Ｍのジチオスレイトール）の中で融解し、そし て磁気撹拌機により低速で均質化した。融解した細胞をアミツク（Ａｍｉｎｃｏ ）フレンチ圧力セル（８〜２０．０００ｐｓｉ）の中で溶解した。リゼイトを追 加の２．４ｍＭのＰＭＳＦを含有する１　ｘＴＥ−ＤＴＴ緩衝液で最終５．５× 細胞湿潤重量に希釈し、そして超音波処理して粘度を減少させた（４０−１００ ％のアウトプット、９分、５０％の使用サイクル）。

生ずる分画、分画Ｉ　（２７５０＋１）は５．３１　ｇのタンパク質および１５ ．５Ｘ１０’単位の活性を含有した。硫酸アンモニウムを０．２Ｍ　（７，２５ ｇ）に添加し、そしてリゼイトを氷上で１５分間撹拌した。硫酸アンモニウムは Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼが粗製のリゼイトの中のＤＮＡに結合するのを防止 し、そしてＤＮＡポリメラーゼと他の細胞リゼイトのタンパク質とのイオン性相 互作用を減少する。

実験的試験は、０．２％のボリミン（Ｐｏｌｙｍｉｎ）　Ｐ　（ポリエチレンイ ミン、ＰＨ１）が全核酸の≧９２％を沈澱させることを示した。ボリミンＰ　（ ｐＨ７，５）を０．２％（５，４９ｍ１の１０％のＰＥＩ）にゆっくり添加し、 そしてこのスラリーを氷上で３０分間撹拌し、次いで３０．０００　Ｘ　ｇで４ ℃において３０分間遠心した。上澄み液を分画１ｆ（２４６ｍｌ）と表示し、そ して３．０５　ｇのタンパク質および１２．５Ｘ１０’単位の活性を含有した。

分画ＩＩを３．２４　ｇの固体硫酸アンモニウムの添加により０．３Ｍ硫酸アン モニウムに調製し、ＤＮＡポリメラーゼのフェニルセファローズへの完全な結合 を保証した。次いで分画ＩＩを２，２Ｘ６．６ＣＩ１１　（２５ｍｌ）のフェニ ルセファローズＣＬ−４Ｂ（＋ｊプツトＭ０８０１２．　Ｐｈａｒｍａｃｉａ− ＬＫＢから購入した）カラム（０，３Ｍの硫酸アンモニウムおよび０．５ｍＭの ＤＴＴを含有するＴＨの中で平衡化したもの）上に３８ｍ１／時（１０ｍｌ／　 ｃｍ”７時）で負荷した。すべての樹脂は製造業者のインストラクションに従い 平衡化しそして再循環した。カラムを１５０ｍ１の同一の緩衝液で洗浄しく基線 に対してＡ、。）、次いで０．６ｍＭのＤＴＴを含有する（硫酸アンモニウムを 含まない）　９０ａ＋ｌのＴＥで洗浄し、次いで０．５ｍＭのＤＴＴを含有する ＴＥ中２０％のエチレングリコール９５ｍ１で洗浄し、そして最後に２０％のエ チレングリコールおよび０．５ｍＭのＤＴＴを含有するＴＥ中２Ｍの尿素で溶出 した。カラムの分画を測定するとき、活性の大きい比率が流過分画および洗浄分 画の中に見いだされ、カラムの容量を越えたことを示した。この最初のフェニル セファローズのカラムに結合したＤＮＡポリメラーゼのほぼ７０％は低い塩にお いて溶出され（ＴＥ−ＤＴＴ洗浄液で）、そして結合した物質の残部は２ＭのＴ Ｅ−Ｄ買洗浄液中２０％のエチレングリコール中２Ｍの尿素で溶離された。

第１フエニルセフアローズのカラムからの流通液の活性はＰＳＩＩ負荷と表示し く２２６ｍ１）　、そして１．７６ｇのタンパク質を含有した。分画ｐｓｒｒ負 荷を第２フエニルセフアローズカラム（同一のロフトおよび寸法）に適用し、そ して実験を同一の方法で反復した。再び、カラムの容量を越え、そして活性は低 い塩および２Ｍの尿素の洗浄液の両者で溶出されることがわかった。結合したＤ ＮＡポリメラーゼのわずかに１０％がＴＥ−ＤＴＴ洗浄液で溶離された；主要な 部分（約９０％）はＴＥ−ＤＴＴ洗浄液中２０％のエチレングリコール中２Ｍの 尿素で溶出された。

第２フエニルセフアローズカラムからの流通液の活性を第１および第２のフェニ ルセファローズのカラムからのＴＥ−ＤＴＴ溶出液と一緒にし、そして０．３Ｍ の硫酸アンモニウムに調節した。この分画（ＰＳＩＩＩ負荷、２５９．４ｍ１） は８３１ｍｇのタンパク質を含有し、そして５０ｍ１のベッド体積の第３フエニ ルセフアローズカラムに１０ｍ１／　ｃｍ”７時で適用した。この時、適用した 活性のすべてはこのカラムにより保持され、そしてＴＥ−ＤＴＴ洗浄液中２０％ のエチレングリコール中の２Ｍの尿素でのみ溶出された。

３つのすべての尿素溶出液を別々にアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）　ＹＭ３０上テ約 ３〜４倍に濃縮し、そして溶出機短時間でヘパリンセファローズ負荷緩衝液の中 に透析して、尿素への延長された暴露を回避した（カルバミル化を回避するため に）。透析しかつ濃縮した尿素溶出液をタンパク質濃度について測定し、そして それらの比活性が大きく変化することが発見された。第２フエニルセフアローズ カラムからの尿素溶出液は他の２つの溶出液に比べて、有意に高い比活性（約１ ００単位／ｍｇのタンパク質において約８Ｘ１０’単位の活性）で活性の大部分 を含有したので、これをそれらと別に処理した。

透析しそして濃縮したフェニルセファ０−ズＩＩ尿素溶出液を、０．０８ＭのＫ ＣＩ、　５０ｍＭのトリス−Ｃ１，ｐＨ７，５、０，１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２ ％のツイーン２０および０．５ｍＭのＤＴＴにより平衡化した５ｍｌのベッド体 積のヘパリンセファローズＣＬ６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢから購入した ）カラムに適用した。二〇カラムおよびすべての引き続くカラムを１ベッド体積 ／時で展開した。適用したＤＮＡポリメラーゼ活性のすべてはこのカラムにより 保持された。このカラムを１７ｍ１の同一緩衝液で洗浄しく基線に対してＡ□。

）そして６０ｍ１の同一緩衝液中８０〜５００ｍＭのＫＣＩの直線勾配で溶出し た。

０．２１〜０．３１５ＭのＫＣＩで溶出する分画（０，５３ｍ１）を５ＯＳ−Ｐ ＡＧＥにより分析した。０．２５〜０．２７５ＭのＫＣＩで溶出するピーク分画 を別々に集めた。前後の分画を後に他の分画と一緒にするために保持した。

ピーク分画（アフィゲル■負荷）のプールをＫＣＩを含まないアフィゲル−ブル ー緩衝液で希釈して、そのイオン強度を０．１５ＭのＫＣＩに減少した。

アフィゲルＩ負荷の分画は３．４ｍｇのタンパク質を含有しそして、２５０１１ のトリス−Ｃ１，ｐＨ７，５，０，１ＭのＥＤＴＡ、０．２％のツイーン２０゜ ０、５ｍｌのＤＴＴおよび０．１５ＭのＫＣＩの中で平衡化した４、　３ｍｌの アフィゲル−ブルーカラム（ＢｉｏＲａｄから購入した）に適用した。適用した Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼのすべては保持された。このカラムを１５ｍ１の同 一緩衝液で洗浄し、そして６６ｍ１の同一緩衝液中０．１５〜０．７ＭのＫＣＩ の直線勾配で溶出した。

０、３５〜０．５５ＭのＫＣＩで溶出する分画（０，５８ｍ１）を５ＤＳ−ＰＡ ＧＥにより分析し、そして〉９０％の純度であるように思われた。ポリメラーゼ のピーク分画は部位特異的エンドヌクレアーゼで汚染されていなかった（６５° Ｃにおいて２単位のＴｍａポリメラーゼと６００ｎｇのプラスミドｐＬｓＧＩ　 （Ｃｃｅ−ＤＮＡ）を使用してｌまたは２時間インキュベーションした後、低分 子量の特定のＤＮＡ断片の不存在により示された）。０．３〜０．５Ｍで溶出す るポリメラーゼのピークをプールし、そしてアミコンＹＭ３０膜上で約２０倍に 濃縮した。次いでこの分画を２．５×貯蔵緩衝液（５０ｍＭのトリス−Ｃ１，ｐ Ｈ７，５、２５０ｍＭのＫＣＩ、　０．２５ｍＭのＥＤＴＡ。

２、５ｍＭのＤＴＴおよび０．５％のツイーン２０　［Ｐｉｅｒｃｅ、　Ｓｕｒ ｆａｃｔ−Ａｍｐｓｌ）中で透析濾過し、モして４°Ｃにおいて貯蔵した。

第１および第３のフェニルセファ０−ズのカラムからの尿素溶出液を、第１ヘパ リンセフアローズカラムからの前後分画と一緒にした。このプール（ＨＳＩＩ負 荷）は約２００ｍｇのタンパク質を含有し、そしてＫＣＩを含まないヘパリンセ ファローズ緩衝液で８０ｍＭのＫＣＩにそのイオン強度を調節した。ＨＳＩＩ負 荷を１６ｍ１のベッド体積のヘパリンセファローズカラム（８０ｍＭのＫＣｌ、 　５０ｍＭのトリス−Ｃ１，ｐＨ７，５、０，１ｍＭのＥＤＴＡ、０−２％のツ イーン２０および０．５ｍＭのＤＴＴの中で平衡化したもの）に適用した。検出 可能な活性は流過分画の中に現れなかっ。

た。

このカラムを８０ｍ１の同一緩衝液で洗浄し、そして２００ｍ１の同一緩衝液中 ８０〜７５０［１１ＭのＫＣＩ勾配で溶出した。０．２２５〜０．３３５ＭのＫ ＣＩで溶出する分画（２ｍｌ）を−緒にし、そしてアミコンＹＭ３０膜上で約５ 倍に濃縮し、そしてヒドロキシアパタイト緩衝液の中に透析した。

この分画（ＨＡ負負荷は９．３ｍｇのタンパク質を含有し、そして４ｍｌのベッ ド体積のヒドロキシアパタイト（高い分離能のＨＰＴ、　Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ から購入した）カラム（１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７，５、０，５ ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡおよび０．２％のツイーン２０の中で平衡 化したもの）上に負荷した。

このカラムを１２ｍ１の同一緩衝液で洗浄し、そして６０ｍ１の１０〜５００ｍ Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７，５）の直線勾配で溶出した。０．１０５〜０．２３ ０Ｍのリン酸カリウムで溶出する分画（０，８ｍ１）を５ＤＳ−ＰＡＧＥにより 分析した。アフィゲルカラム■の分画（これは５ＯＳ−ＰＡＧＥにより約ｌＯ〜 ２０％の純度であると思われた）と比較して、これらの分画は約５倍純度が低か った。０．１０５〜０．２５５Ｍのリン酸カリウムで溶出するＤＮＡポリメラー ゼのピーク分画を一緒にし、アミコンＹＭ３０膜上で３倍番＝濃縮し、そしてア フィゲル−ブルー緩衝液中で透析濾過した。

アフィゲル■１負荷分画を、アフィゲル−ブルー緩衝液中で平衡化した３ｍｌの ベッド体積のアフィゲル−ブルーカラムに適用した。検出可能なりＮＡポリメラ ーゼの活性は流過分画中に現れなかった。このカラムを９ｍｌの同一緩衝液で洗 浄し、そして５０ｍ１の同一緩衝液中の０．２〜０．７ＭのＫＣＩ直線勾配で溶 離した。０．３３〜０．５０５ＭのＫＣＩで溶出する分画（０，５８ｍ１　）を ５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。早期に溶出する分画はそれらの銀染色パター ンによりわずかに一層きれいに見えたので、２つのプールをつくった。０．３１ 〜０．４ＭのＫＣＩで溶出する分画をプールＩの中に一緒にした；０．４〜０． ５１５ＭのＫＣＩで溶出する分画をプールＩＩの中に一緒にした。２つのプール の各々を別々にアミコンＹＭ３０膜上で約７倍に濃縮した。

３つのすべてのアフィゲル−ブルーのプールはなお高いレベルの汚染非特異的ヌ クレアーゼを含有した。７０℃において１．５単位のＤＮＡポリメラーゼと共に インキュベーションすることにより、−重鎖Ｍ１３のＤＮＡ鋳型およびプラスミ ドの多断片の制限消化物の両者は数時間以内に分解した。インーシチュ活性ゲル を展開し、そしてＤＮＡポリメラーゼの分画がタンパク質分解的分解を受けなか ったことを示した。

第２アフィゲル−ブルーカラムからの２つのプールを一緒にし、そしてホスホセ ルロースカラム緩衝液の中に透析した。透析した分画（ｐＨＩ負荷）を３ｍｌの ホスホセルロースカラム（２５ｍＭのトリス−Ｃ１，ｐＨ７，５、５０ｍＭのＫ Ｃｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％のツイーン２０および０．５ｍＭのＤＴ Ｔで一夜洗浄したもの）上に負荷した。この洗浄は後にホスホセルロース樹脂の ｐＨの平衡化のために不十分であったことが証明された。不都合なことには、こ れは試料がカラム上に負荷された後に見出された。適用した活性のすべてはカラ ムに結合した。

このカラムを９ｍｌの負荷緩衝液で洗浄し、そして４５［Ｄｌの５０〜７００ｍ ＭのＫＣＩの直線勾配で溶出した。０．４６〜０．５７５ｍＭのＫＣＩで溶出す るＤＮＡポリメラーゼのピーク分画（０，５８ｍ１）を５ＯＳ−ＰＡＧＥにより 分析した。

汚染タンパク質の分離はピークを通して観察された：約４５ｋＤａの汚染バンド は０．５３Ｍで溶出する；約８５ｋＤａの汚染バンドは０．５４ＭのＫＣＩにお ける溶出ピークを有する。したがって、このカラムを反復した（ポリメラーゼの 溶出のプロフィルを考慮して、多少高いイオン強度で負荷する）。第１ホスホセ ルロースのカラムから０．４７５〜０、５６ＭのＫＣＩで溶出するピーク分画を 第１アフイゲルカラムからのプールと一緒にした。−緒にした分画（ｐＨＩＩ負 負荷は今や、精製されたポリメラーゼのすべて（約７．５Ｘ１０’）を含有した 。

分画ｐＨＩＩ負負荷ホスホセルロース緩衝液で希釈して、イオン強度を０．５Ｍ のＫＣＩに調節した。ｐＨＩＩ負負荷９ｍｌのベッド体積のホスホセルロースカ ラム（この場合、２５ｍＭのトリス−ＣＩ、　ｐＨ７，５、２００ｍＭのＫＣＩ 、０．１０１ＭのＥＤＴＡ、０．２％のツイーン２０および０．５ｍＭのＥＤＴ Ａの正しいｐＨおよびイオン強度に平衡化された）上に負荷した。このカラムを ２７ｍ１の同一緩衝液で洗浄し、そして１４０ｍ１の０．２〜０．８ＭのＫＣＩ の直線勾配で溶出することを意図した。しかしながら、０．８ＭのＫＣＩの上限 緩衝液の代わりに、緩衝液は５２（ＤＭのＫＣＩの濃度を有し、これは塩の減少 勾配を生じた。次いでこのカラムを３２ｍ１の０．２ＭのＫＣｌ−ホスホセルロ ース緩衝液により再び平衡化し、モして１４０ｍｌの０．２〜０．８ＭのＫＣＩ の直線勾配を再び適用した。

流通液、洗浄液、および勾配分画の日常的アッセイにより、このより高いｐＨ（ ｐＨ７，５）において、ＤＮＡポリメラーゼはホスホセルロース樹脂に０．２Ｍ のＫＣＩにおいて結合しないことが示された。流通液、洗浄液、および塩減少勾 配の分画からのＤＮＡポリメラーゼ活性を含有する分画を一緒にした。生ずるプ ールをアミコンＹＭ３０膜上で濃縮した。しかしながら、濃縮装置の故障はＤＮ Ａポリメラーゼ活性のそれ以上の損失に導いた。回収された活性を５０ｍＭのＫ ＣＩのホスホセルロース緩衝液の中に透析し、そしてｐＨＩＩＩ負荷と表示した 。

この分画を５０ｍＭのＫＣＩを含むホスホセルロース緩衝液により平衡化した５ ｍｌのベッド体積のホスホセルロースのカラム上に負荷した。

適用した活性のすべてはこのカラムにより保持された。このカラムを１５ｍ１の 同一緩衝液で洗浄し、そして５００１１の同一緩衝液中の５０〜５００ＤＩＭの ＫＣＩの直線勾配で溶出した。０．１６〜０．３３ＭのＫＣＩで溶出する分画（ ０，８７ｍ１）を５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびインーシチュ活性ゲルにより分析した 。

銀染色パターンに基づいて、２つのプールを作った。０．２１５〜０．３１Ｍの ＫＣＩで溶出するピーク分画を、先行する分画および後の分画から別々に保持し 、これらを−緒にして副分画プールにした。両者のプールをセントリコン（ｃｅ ｎｔｒｉｃｏｎ）　３０膜上で濃縮し、そして２．５×貯蔵緩衝液（５０ｍＭの トリス−Ｃ１，ｐＨ７，５、２５０ｍＭのＫＣｌ、２．５ｍＭのＥＤＴＡ、２． ５ｍＭのＤＴＴおよび０．２％のツイーン２０Ｊ　Ｐｉｅｒｃｅ、　Ｓｕｒｆａ ｃｔ−Ａｍｐｓｌ）中で透析濾過し、引き続いて１．５体積の８０９６のグリセ ロールと混合した。

約３．ｌＸ１０’単位がピーク分画において回収され；副プールは追加のｌＸｌ ０’単位の活性をもたらす。精製されたＤＮＡポリメラーゼは、インーシチュ活 性ゲルの中の不変化の移動パターンにより証明されるように、分解しなかった。

精製されたＤＮＡポリメラーゼのゲル電気泳動により決定された分子量はほぼ９ ７ｋＤａである。Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ のアミノ酸残基５６９−５８７（ＤＧＴＰＩ）および７１８−７３２　（ＤＧＴ Ｐ３）に相当する、エピトープ特異的抗体により認識される。

合成オリゴデオキシリボヌクレオチドＤＧ１６４〜ＤＧ１６７は、熱安定性ＤＮ Ａポリメラーゼの鋳型結合ドメイン（最も３′−側の１４ヌクレオチド）におけ るモチーフの１つに対する「前方ｊプライマーと表示される、４つの異なる１６ 倍の縮重の（各々）２２マーのプールである。このモチーフはアミノ酸配列Ｇｌ ｙ−Ｔｙｒ−Ｖａｔ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒであり、そ対応する。このモチーフはすべ てのサームス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）種におけるＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の中に見 いだされる。−緒にしたプライマーのプールは６４倍の縮重性であり、そしてプ ライマーはそれらの５′末端においてＢｇｌｌｌ認識部位をコードする。

前方プライマーＤＣ１６４〜ＤＧ１６７を下に示す：ＤＧ１６４　配列番号：　 ２　５’　ＣＧＡＧＡＴＣＴＧＧＮＴＡＹＧＴＷＧＡＡＡＣＤＧ１６５　配列番 号：　３　５’　ＣＧＡＧＡＴＣＴＧＧＮＴＡＹＧＴＷＧＡＧＡＣＤＧ１６６　 配列番号：　４　５’　ＣＧＡＧＡＴＣＴＧＧＮＴＡＹＧＴＳＧＡＡＡＣＤＧ１ ６７　配列番号：　５　５’　ＣＧＡＧＡＴＣＴＧＧＮＴＡＹＧＴＳＧＡＧＡに れらの前のプライマーにおいて：Ａはアデニンであり：Ｃはシチジンであり；Ｇ はグアニジンであり；Ｔはチミンであり；ＹはＣ十Ｔ　（ｐＹｒｉｍｉｄｉｎｅ ）であり：ＳはＧ＋Ｃ（Ｓｔｒｏｎｇ相互作用；３Ｈ−結合）であり；ＷはＡ＋ Ｔ　（Ｗｅｅｋ相互作用；２Ｈ−結合）であり；そしてＮはＡ　＋　Ｃ＋　Ｇ　 ＋　Ｔ　（ａＮｙ）である。

合成オリゴデオキシリボヌクレオチドＤＧ１６０〜ＤＧ１６３は、熱安定性ＤＮ Ａポリメラーゼの鋳型結合ドメイン（最も３′−側の１４ヌクレオチド）におけ るモチーフの１つに対する「逆Ｊプライマーと表示される、４つの異なる８倍の 縮重の（各々）２０マーのプールである。

これらのプライマーは相補的（＋）鎖ＤＮＡ配列に帰属され、そしてモチーフＧ ｉｎ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕをコードし、モしてＴａｑ　ＤＮＡポリ メラーゼのアミノ酸７８２−７８６および７ｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼのアミノ 酸７８４−７８８に同一に対応する。このモチーフはすべてのサームス（Ｔｈｅ ｒｍｕｓ）種におけるＤＮＡポリメラーゼ遺伝子中に見いだされる。

−緒にしたプライマーのプールは３２倍の縮重性であり、そしてプライマーはそ れらの５′末端においてＥｃｏＲＩ認識部位をコードする。

逆プライマーＤＧ１６０〜ＤＧ１６３を下に示す；ＤＧ１６０　配列番号：　６ 　５’　ＣＧＧＡＡＴＴＣＲＴＣＲＴＧＷＡＣＣＴＧＤＧ１６１　配列番号：　 ７　５’　ＣＧＧＡＡＴＴＣＩ？ＴＣｆ？ＴＧＩＶＡＣＴＴＧＤＧ１６２　配列 番号：　８　５’　ＣＧＧＡＡＴＴＣＲＴＣＲＴＧＳＡＣＣＴＧＤＧ１６３　配 列番号＋　９　５’　ＣＧＧＡＡＴＴＣＲＴＣＲＴＧＳＡＣＴＴＧこれらの逆プ ライマーにおいて、Ａ、　Ｃ，Ｇ、　Ｔ、　ＳおよびＷは上に定義した通りであ り、そしてＲはＧ＋Ａ　（ｐｕＲｊｎｅ）である。

Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の約２３０ｂｐの断片を増幅するために、Ｍ ｇＣ１＊を使用しないで８０μｌの中に次の成分を含有するＰＣＲ増幅管を調製 した：　（１）５Ｈｇの変性したＴｍａゲノムＤＮＡ；　（２）　５０ピコモル （合計）の−緒にした前方プライマーの組ＤＧ１６４−ＤＧ１６７　；　（３） ５０ピコモル（合計）の−緒にした逆プライマーの組ＤＧ１６０−ＤＧ１６３　 。

（４）２単位のＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ；　（５）　５０℃１Ｍ　（最終） の各ｄＮＴＰ　：　（６）０．０５％のラウレス（１，ａｕｒｅｔｈ）　−１２ ；および（７）標準的ＰＣＲＩＩｉ衝液、塩化マグネシウムを含まない。

試料を一７０℃でフラッシュ凍結し、そして−２０℃において貯蔵した。凍結し た試料を２０μｌの１０ｍＭのＭｇＣ１ｚ（最終濃度２　ＤＩＭ）で層状にし、 直ちに５０ｍ１の鉱油をオーバーレイし、そしてパーキン・エルマー・セッス・ サイクラ−（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　Ｃｙｃｌｅｒ）で次の７ フイルに従いサイクリングした＋（１）９８℃への段階−５０秒の保持；（２） ５０℃への段階−１０秒の保持；　（３）４分かけて７５℃への傾斜；および（ ４）９８℃への上昇。このファイルを合計３０サイクル反復した。増幅生成物の １１５　（２０ｔｔ）を３％のヌシープ（Ｎｕｓｉｅｖｅ）　／　１％のシーケ ム（Ｓｅａｋｅｍ）アガロース複合ゲル上で精製し、そしてほぼ２３０ｂｐの断 片を溶出し、濃縮し、そしてＢｇｌｒｌおよびＥｃｏＲＩで消化した。

合成オリゴデオキシリボヌクレオチドＤＧ１５４およびＤＧ１５５は、熱安定性 ＤＮＡポリメラーゼのプライマー：鋳型結合ドメイン（最も３′−側の１１ヌク レオチド）におけるモチーフの１つに対する「前方」プライマーと表示される２ つの異なる３２倍の縮重の（各々）１９マーのプールである。このモチーフはテ トラペプチドの酸配列Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙであり、モしてＴａｑ　 ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸５６９−５７２および７ｔｈ　ＤＮＡポリメラー ゼのアミノ酸５７１−５７４に同一に対応する。

このモチーフはすべてのサームス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）種におけるＤＮＡポリメラ ーゼ遺伝子の中に見いだされる。−緒にしたプライマーのプールは６４倍の縮重 性であり、そしてプライマーはそれらの５′末端においてＢｇｌｌｌ認識部位を コードする。

前のプライマーＤＧ１５４およびＤＧ１５５を下に示す：ＤＧ１５４　配列番号 ：　１０　ＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＮＧＣＮＡＣＷＧＧＤＧ１５５　配列番号：　 １１　ＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＮＧＣＮＡＣＳＧＧこれらの前方プライマーにおい て、Ａ、　Ｃ，Ｇ、　Ｔ、Ｓ、　Ｗおよびｎは上に定義した通りである。

Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のほぼ約６６７ｂｐの断片を増幅するために 、ＭｇＣ１ｔを使用しないで８０μｌの中に次の成分を含有するＰＣＲ増幅管を 調製した：（１）５ｎｇの変性したＴｍａゲノムＤＮＡ：（２）５０ピコモル（ 合計）の−緒にした前方プライマーの組ＤＧ１５４−ＤＧ１５５　：（３）５０ ピコモル（合計）の−緒にした逆プライマーの組ＤＧ１６０−ＤＧ１６３　；　 （４）　２単位のＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ；　（５）５０μＭ　（最終）の 各ｄＮＴＰ　；　（６）　０．０５％のラウレス（Ｌａｕｒｅｔｈ）　−１２； および（７）標準のＰＣＲ緩衝液、塩化マグネシウムを含まない。

試料を一７０°Ｃでフラッシュ凍結し、そして−２０℃において貯蔵した。凍結 した試料を２０μｌの１０ｍＭのＭｇＣ１ｚ　（最終濃度２　ｍＭ）で層状にし 、直ちに５０ｍ１の鉱油をオーバーレイし、そしてパーキン・エルマー・セツス ・サイクラ−（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　Ｃｙｃｌｅｒ）で次の ファイルに従いサイクリングした：（１）９８℃への段階−５０秒の保持；（２ ）５０°Ｃへの段階−１Ｏ秒の保持；　（３）４分かけて７５°ｃへの傾斜；お よび（４）９８℃への上昇。このファイルを合計３０サイクル反復した。

増幅生成物の１１５（２０μ）を１．５％のアガロースゲル上で精製し、そして ほぼ６７０ｂｐの断片を溶出し、濃縮し、そしてＢｇｌｌ［およびＥｃａＲＩで 上のようにして消化した。

これらの増幅反応は、６６７ｂｐの断片、および６６７ｂｐの断片の下位断片で ある２３０ｂｐの断片を生じた。これらの断片は、以下の実施例に記載するよう に、Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼＩ遺伝子のための完全なコード配列を得るとき 有用であることが証明された。

実施例３ サーモタガ−７リチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔａｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ）（Ｔｍａ） 　ＤＮＡポリメラーゼ■遺伝子のクローニング この実施例は、サーモタガ−ｖリチｖ　（Ｔｈｅｒｍｏｔａｇａ　ｍａｒｉｔｉ ｍａ）の細ａ　ＤＮＡポリメラーゼ■遺伝子（Ｔｍａ　Ｐｏ１ｌ）をクローニン グする戦略および方法を記載する。

プライマーＤＧ１６４−１６７およびＤＧ１６０−１６３（２３０ｂｐ）および ＤＧ１５４゜１５５およびＤＧ１６０−１６３（６ｓ７ｂｐ）により発生したＰ ＣＲ生成物のＤＮＡ配列は、Ｘｍａ　［制限部位の認識配列５　’　ＣＣＣＧＧ Ｇを含有する。オリゴヌクレオチドを、Ｘｍａ　ｒ部位の上流および下流の配列 にハイブリダイゼーションするように設計した。ＤＧ２２４は２１７−であり、 Ｘｍａ　Ｉ部位に対して５９−７９ｂｐだけ３′−末梢のＰＣＲ生成物に対して 相同性である。

ＤＧ２２５は２２７−であり、Ｘｍａ　１部位からＸｍａ　Ｉ部位より２１ｂｐ 上流（５′）までのＰＣＲ生成物に対して相同性である。ＤＧ２２４およびＤＧ ２２５の配列を下に示す（ＫはＧまたはＴである）。

ＤＧ２２４　配列番号：　１２　５’　ＡＣＡＧＣＡＧＣＫＧＡＴＡＴＡＡＴＡ ＡＡＧＤＧ２２５　配列番号：　１３　５’　ＧＣＣＡＴＧＡＧＣＴＧＴＧＧＴ ＡＴＧＴＣＴＣＤＧ２２４およびＤＧ２２５を、はぼ８ビオチン−ｄＵＭＰ残基 をオリゴヌクレオチドの３′末端に付加するように設計した反応において、ビオ チン−ｄＵＴＰおよびトランスフェラーゼでティリングすることによって標識し た。これらの標識したオリゴヌクレオチドをゲノムのＴｍａＤＮＡの制限消化の ササンプロット分析においてプローブとして使用した。ササン分析の結果、およ び実施例２に記載するように生産したＰＣＲ生成物のＤＮＡ配列に基づいて、予 備的制限地図を作成した。

予備的地図は、全体のＴｍａ　ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子が２つのＸｍａ　１制 限部片を含有することを示した。５′末端を包含する、遺伝子の大部分はほぼ２ ．６ｋｂのＸｍａ　Ｉ断片上に位置する。この遺伝子の残部（および３′末端） はほぼ４．２）［ｂのＸｍａｒ断片上に位置する。全体のＴｍａ　ＤＮＡポリメ ラーゼ遺伝子を含有する２つのＸｍａ　［断片を、後述するように、プラスミド ｐＢ３２３＋　（また、ｐＢｓＭｌ　３＋呼ぶ）の中にクローニングした。

約４０μｇのＴｍａゲノムＤＮＡをＸｍａ　Ｉで完全に消化した。Ｘｍａ　Ｉ消 化物を電気溶出によりサイズ分画した。γ−”Ｐ−ＡＴＰ−キナーゼ処理したＤ Ｇ２２４およびＤＧ２２５プローブを使用する、各分画の小部分のスロットプロ ット分析は、４．２ｋｂの３′−断片（ＤＧ２２４とハイブリダイゼーションす る）および２．６ｋｂの５′−断片（ＤＧ２２５とハイブリダイゼーションする ）を含有する分画を同定した。分画をエタノール沈澱により濃縮し、次いでＸｍ ａ　Ｉ消化したｐＢｓ１３＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と連結した。アンピシリ ン耐性の形質転換体をニトロセルロースのフィルター上で選抜し、そしてフィル ターを適当ならばγ−”Ｐ−ＡＴＰ−キナーゼ処理したＤＧ２２４およびＤＧ２ ２５のプローブでブロービングした。プラスミドＤＮＡをプローブとハイブリダ イゼーションしたコロニーから単離した。制限分析を実施して、断片が期待した ものであることを確証し、そしてｐＢＳ１３＋ベクターに関する断片の向きを決 定した。クローニングした断片のＤＮＡ配列の分析を、［ユニバーサル」および 「逆Ｊ配列決定プライマー（これらはベクター中で、制限部位のポリリンカー領 域の外側でブライミングする）を使用して実施した。さらに、５′−クローンに ついて、ＤＧ１５４−１５５／ＤＧ１６０−１６３の６６７ｂｐのクローンのＤ ＮＡ配列の決定に使用したプライマーを用いた。予備的ＤＮＡ配列の分析により 、Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有する所望のＤＮＡ断片がクローニン グされたことが確証された。

予備的ＤＮＡ配列から、断片のより内部の領域のＤＮＡ配列を得るように、それ 以上の配列決定プライマーを設計した。さらに、ＤＮＡ配列の分析を促進するた めに、２つのＸｍａ　Ｉ断片のいくつかの欠失を作った。２．６ｋｂの５′−断 片の両者の向きについて、ＥｃｏＲＩ、　５ａｃ４、およびＸｂａ　Ｉの消化物 の各々を欠失し、そして分子内の結合に好適な条件下に結合し、こうしてベクタ ーＥｃｏＲＩ、　５ａｃｌ、およびＸｂａ　１部位とＴｍａ　Ｘｍａｌ断片の対 応する部位との間のＤＮＡを欠失した。このような内部の欠失は、「ユニバーサ ル」または「逆の」配列決定プライマーを使用する容易なりＮＡ配列の分析を可 能とする。

同様に、ベクターのＢａｍＨ［部位を、そのクローン中のＴｍａ　Ｐｏ１Ｉの内 部のＸｍａ　１部位からほぼ６５０ｂｐのＢｇｌ１１部位と融合して、４．２ｋ ｂの３′−断片の欠失を作った（ＢａｍＨＩおよびＢｇｌｌｌは互いに容易に結 合する同一のＧＡＴＣ粘着末端を有する）。この欠失はＴｍａ　Ｐｏ１ｌ遺伝子 の３′末端のＤＮＡ配列の分析を可能とする。

制限部位分析において、２．６ｋｇの５′−断片および４．２ｋｂの３′−断片 の両者はＮｃｏＩ、　ＮｄｅｌおよびＡｓｅ　［制限部位を欠如することが明ら かにされる。Ｔｍａ　Ｐｏ１ｌ遺伝子のＡＴＧ開始およびコード配列を知ると、 ＤＮＡ配列をＡＴＧ開始部位において変更して、オリゴヌクレオチドの部位特Ｅ ６突然変異によりＮｃｏｌ、　ＮｄｅｌおよびＡｓｅｌ制限部位を含めるような オリゴヌクレオチドを設計することができる。さらに、ｐＢｓＭ＋ベクターのプ ロモーターとＴｍａ　Ｐｏ１ｌ遺伝子の開始部位との間の配列の欠失が、ＡＴＧ 開始部位におけるＮｄｅ　ｒまたはＡｓｅ　Ｉ認識部位の包含と同時になされる ように、突然変異のオリゴヌクレオチドを設計することができる。

ベクターの中のｌａｃプロモーターとＴｍａ　Ｐａ１ｌ遺伝子の開始部位との間 の配列の欠失はまた、欠失された領域におけるＸｍａ　ｒ制限部位を排除し、こ うしてこの分野において普通の技術を使用する発現プラスミド中への全体コード 配列のアセンブリングを便利にする（例えば、同時継続出願第４５５．９６７号 、１９８９年１２月２２日提出、その開示をここに引用によって加える、の中の ｐＤＧ１７４−ｐＤＧ１８１ζこつｐｚての合成のプロトコルを参照のこと）。

実施例４ Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼを使用するＰＣＲ約１．２５単位の実施例１におい て精製したＴｍａ　ＤＮＡボ１ツメラーゼを使用して、ＴｔｈゲノムＤＮＡから のｒＲＮＡ配列を増幅する。反応体積（よ５０μｍであり、そして反応混合物は ５０ピコモＪしのプライマー１）Ｃ７３゜１０’　〜１０’の７ｔｈのコピー（ 約２Ｘ１０’コピーのゲノム／ｎｇのＤＮＡ）。

５０ビ）％ルのブライｖ　−ＤＧ７４．　２００　μＭの各ｄＮＴＰ、２　ｍＭ のＭｇＣ１ｚ。

１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、　ｐＨ８，３、５０ｍＭのＫＣＬおよび１００μｇ ／ｌｌ１１のゼラチン（必要に応じて、ゼラチンを省略すること力（できる）を 含有する。

反応はパーキン−エルマー・セツス・インス゛ツルメン゛ソ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｂ ｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）のＤＮＡサーマＪレサイクラ −（ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ）で実施する。２０〜３０サイクルの９６℃で １５秒；５０°Ｃで３０秒、および７５°Ｃで３０秒を実施する。２０サイクル 番二おｐｚて、増幅生成物（１６０ｂｐの大きさ）が臭化エチジウム染色したゲ ル上に力為すか（＝見ることができ、そして３０サイクルにおいて、生成物（ま 臭化エチジウム染色したゲル上で容易に見ることができる（紫外線下）。

より少ない単位のＴｍａ　ＤＮＡポリメラーゼ使用する場合（すなわち、０゜３ １単位１５０μｍの反応）、ＰＣＲはより少ｆ（ｐｓ非特異的生成物を生ずるで あろう。さらに、非イオン性洗剤、例えば、ラウレス−１２を反応混合物に約０ ．５％〜１％の最終濃度に添加すると、ＰＣＲ生成物の収量を改良することがで きる。

プライマーＤＧ７３およびＤＧ７４を下に示す：ＤＧ７３　配列番号：　１４　 ５’　ＴＡＣＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＴＴＧＴＡＣＤＧ７４　配列番号：　１５ 　５’　ＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＡＣＣＧＣＡ実施例５ Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼの組換えベクターＡ、　Ｔｍａ　Ｐｏ１ｌ遺伝子の ５′および３′末端の変異誘発ベクターｐｕｓ　：　Ｔｍａ７−１　（ＡＴＣＣ Ｎｏ、　６８４７１、後で改名ｐＴｍａ０１）中のＴｍａ遺伝子の５′末端を、 オリゴヌクレオチドＤＧ２４０およびＤＧ２４４でオリゴヌクレオチドの部位特 異的変異により変異誘発した。プラスミドｐＢｓ　：　Ｔｍａ７−１は、ベクタ ーｐＢＳ＋の中にクローニングされた２、　６ｋｂの５　’　Ｘｍａｒ断片を含 んで成る。両者の変異誘発から生ずる変異体は、ｐＢＳ＋ベクター中のβ−ガラ クトシダーゼのＡＴＧとＴｍａ　Ｐｏ１ｌのＡＴＧとの間に欠失を有するので、 Ｔｍａコード配列はベクター１ａｃプロモーター、オペレーターおよびリポソー ム結合部位（ＲＢＳ）を利用する発現のために配置された。両者の組の変異体は また、Ｔｍａ　Ｐｏ１ｌのための第２および第６のコドン中に変更を有して、コ ードされたタンパク質のアミノ酸配列を変化させないで、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌ ｉ）のコドンの使用といっそう適合性となった。さらに、ＤＧ２４０はＮｄｅ　 Ｉ制限部位をコード配列のＡＴＧ開始部に配置しく　５　’　ＣＡＴＡＴＧ）　 、そしてＤＧ２４４はＮｅｏ　ｒ制限部位をコード配列のＡＴＧ開始部に配置さ せた（　５　’　ＣＣＡＴＧＧ）。ＤＧ２４０変異ノ候補＝＋Ｏニーｔ−［７” ＰＩ　標ｉ１ｃシ？＝オリゴヌクレオチドＤＧ２４１でスクリーニングし、そし てＤＧ２４４変異の候補コロニーを［γＩＩＰＩ標識したオリゴヌクレオチドＤ Ｇ２４５でスクリーニングした。プラスミドＤＮＡを適当なプローブとハイブリ ダイゼーションしたコロニーから単離し、そして変異は制限分析およびＤＮＡ配 列の分析により確証された。ＤＧ２４０の変異体をｐＴｍａ５’Ｎｄｅ＃９と命 名し、そして後にｐＴｍａ０７と改名された）。

Ｔｍａ　Ｐｏ１ｌ遺伝子の３′末端を、ｐＢｓＴｍａ３　’　１１−　ＩＢａｍ ／Ｂｇｌ　（ＡＴＣＣＮｏ、　６８４７２　、後の改名ｐＴｍａ０４）中で変異 誘発オリゴヌクレオチドＤＧ２３８で変異誘発した。プラスミドｐＢＳＴｍａ３ 　’　１１−ＩＢａｍ／Ｂｇｌは、実施例３に記載するように、４．２ｋｂの３ ’Ｘｍａｌ断片をｐＢＳ十中（こクローニングし、生ずるプラスミドをＢａｍＨ ｒおよびＢｇｌ［Ｉで消化し、そして消化からの大きい断片を結合することによ って環化して構成された。ＤＧ２３８はＥｅｏＲＶおよびＢａｍＨ１部位をＴＧ Ａ停止コドンの直く“下流に挿入する。変異コロニーの候補を［γ３２Ｐ］標識 した才１ノゴヌクレ才チドＤＧ２３９で同定した。陽性のコロニーから単離した プラスミドＤＮＡを適当な制限消化のノ（ターンについてスクリーニングし、そ してＤＮＡ配列を確認した。得られた１つの正しし１プラスミドをｐＴｍａ　３ 　’　ｍｕｔ　８段して表示し、そして後にｐＴｍａ０５と改名した。

（ここで高いレベルの発現は細胞を殺すことがあるが、低し）レベルは救済また は補完することができる）を研究する目的で、Ｔｍａ　Ｐａ１ｌ遺伝子をｐＢｓ １３＋クローニングベクターの中でアセシブ１ノングした。

ｐＴｍａ３　’　ｍｕｔ＃　１からの約３００ｂｐのＸｍａ　１ＥｃｏＲＶ断片 を、アガロースゲルの電気泳動および臭化エチジウムの染色後、約３００ｂｌｌ の断片を含有するアガロースゲルのスライスを切除しそしてコスタ−（Ｃｏｓｔ ａｒ）スピネックスのフィルターユニット中で凍結することによって、単離およ び精製した。融解すると、このユニットをマイクロフージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ ）で回転し、そしてＤＮＡ断片を含有する液体を集めた。

エタノール沈澱後、断片を２つの５′ベクター、ｐＴｍａ５’　Ｎｄｅ＃３およ びｐＴｍａ５’　ＮｃｏＩ９の各々と連結し、これらの各々をＡｓｐ７１８で消 化し、クレノーおよびすべてのｄＮＴＰで修復しく反応条件は次の通りである： 　５６ｍＭのトリス−ＣＩ、　ｐ）１Ｂ、０　、５６ｍＭのＮａＣ１，６ｍＭの ＭｇＣ１ｔ、６ｍＭのＤＴＴ、５μＭのｄＮＴＰおよび１１単位のクレノー、３ ７°Ｃ９１５分：次いで７５°Ｃにおいて１０分間不活性化する）、次いでＸｍ ａ　Ｉでさらに消化した。

連結は２工程で実施した。Ｘｍａ　ｒ粘着末端を連結するために条件は次の通り であった：２０μｇ／ｍｌの合計のＤＮＡ、　２０ｍＭのトリス−ＣＩ。

１）Ｂ７．４　、５０ｍＭのＮａＣ１，１０ｍＭのＭｇＣ１ｔ、４０ｕｍのＡＴ Ｐ、および０．２Ｗｅｉｓｓ単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ／２０μｍの反応、０℃ 、−夜。ＡＳＩ）７１８消化しそしてクレノー修復した平滑末端をＥｃｏＲＶ消 化した平滑末端と連結するために、第１の連結物を、同一の結合緩衝液の中で４ 〜５倍に希釈しそして１５℃においてインキュベーションした。但し、１ｍＭの ＡＴＰおよび１ＯＷｃｉｓｓ単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを２０μｌの反応につい て使用した。連結物をＤＧＩＯＩ宿主細胞に形質転換した。候補を適当な制限部 位についてスクリーニングし、そしてクローニング部位付近のＤＮＡ配列を確認 した。所望のプラスミドをｐＴｍａ０８（ＡＴＧにおいてＮｄｅ　１部位）およ びｐＴｍａ０９（ＡＴＧ部位においてＮｃｏ１部位）と表示した。

Ｃ，Ｐ、発現ベクター中の全長遺伝子のアセンブリングλＰＬプロモーターのコ ントロール下に全長のＴｍａ　Ｐｏ１ｌをアセンブリングしかつ発現するために 使用したＰ、、プロモーターの発現ベクターを下表に記載する。

ｐＤＧ１７４　Ｎｄｅｌ　Ｔ７　ＤＧ１０６／ＤＧ１０７　Ａｍｐｌ）ＤＧ１７ ８　Ｎｄｅｌ　Ｎ　ＤＧＩＩＯ／ＤＧＩＩＩ　Ａｍｐｐｏｃｔｓｚ　Ｎｃｏｌ　 Ｔ７　＋　ＦＬ４２／ＦＬ４３　ＡｍｐｐＤＧ１８４　ＮｃｏＩ　Ｎ　＋　ＦＬ ４４／ＦＬ４５　ＡｍｐｐＤＧ１８５　ＮｃｏＩ　Ｎ　＋　ＦＬ４４／ＦＬ４５ 　Ｔｅｆ＊　ＰＢＳ−ファージ１７の遺伝子ＩＯまたはラムダ遺伝子Ｎのリポソ ーム結合部位。

ｉｓ　Ａｕ５ｌＩ部位をＣ５ｐ４５１で消化して破壊し、クレノーで修復し、そ して修復された末端を連結したもの。

零ネネ　抗生物質耐性の決定基アンピシリンまたはテトラサイクリン。

表の中の５つのベクターは、アンピシリン耐性の場合、プラスミドｐＤＧ１６０ の誘導体であるか、あるいはテトラサイクリン耐性の場合、ｐＤＧ１６１である 。プラスミドｐＤＧ１６０およびｐＤＧ１６１並びに表に示すｐＤＧベクターに 類似するベクターを構成するスキームは、米国特許出願第４５５．９６７号、１ ９８９年１２月２２日提出（その開示をここに引用によって加える）に記載され ている。ベクターはアンピシリンまたはテトラサイクリン耐性を与え、そしてす べてはサーモタガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔａｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ）から のδ−トキシン陽性のレトロレギュレーターおよび同一の点突然変異をＲＮＡ　 Ｉ　＋遺伝子の中に含有し、これらはプラスミドをコピー数について温度感受性 とする。

表に記載されているプライマーおよびオリゴヌクレオチドを下に示す。

ＤＧ２４０　配列番号：　１６　５’　ＣＣＡＴＣＡＡＡＡＡＧＡＡＡＴＡＧＴ ＣＴＡＧＣＣＡＴＡＴＧＴ’　ＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＤＧ２４ １　配列番号：　１７　５’　ＡＡＡＣＡＣＡＴＡＴＧＧＣＴＡＧＡＣＤＧ２４ ４　配列番号：　１８　５’　ＣＣＡＴＣＡＡＡＡＡＧＡＡＡＴＡＧＴＣＴＡＧ ＣＣＡＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＤＧ２４５　配列番号 ＋　１９　５’　ＡＡＡＣＡＡＣＣＡＴＧＧＣＴＡＧＡＣＤＧ２３８　配列番号 ：　２０　５’　ＧＣＡＡＡＡＣＡＴＧＧＴＣＧＴＧＡＴＡＴＣＧＧＡＴＣＣＧ ＧＡＧＧＴＧＴＴＡＴＣＴＧＴＧＧ ＤＣ２３９配列番号＋　２１　５’　ＣＣＧＡＴＡＴＣＡＣＧＡＣＣＡＴＧＤＧ １０６　配列番号：　２２　５’　ＣＣＧＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡ ＴＡＴＧＡＧＣＴＤＧ１０７　配列番号：　２３　５’　ＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡ ＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＤＧＩＩＯ配列番号：　２４　５’　ＣＣＧＧＡＧＧＡＧ ＡＡＡＡＣＡＴＡＴＧＡＧＣＴＤＧＩＩＩ　配列番号：　２５　５’　ＣＡＴＡ ＴＧＴＴＴＴＣＴＣＣＴＦＬ４２　配列番号：　２６　５’　ＣＣＧＧＡＡＧＡ ＡＧＧＡＧＡＡＡＡＴＡＣＣＡＴＧＧＧＣＣＣＧＴＡＣ ＦＬ４３　配列番号：　２７　５’　ＣＧＧＧＣＣＣＡＴＧＧＴＡＴＴＴＴＣＴ ＣＣＴＴＣＴＴＦＬ４４　配列番号：　２８　５’　ＣＣＧＧＡＧＧＡＧＡＡＡ ＡＴＣＣＡＴＧＧＧＣＣＣＧＧＴＡＣＦＬ４５　配列番号：　２９　５’　ＣＧ ＧＧＣＣＣＡＴＧＧＡＴＴＴＴＣＴＣＣＴ３つの断片の結合を使用して、ベクタ ー中でＴｍａ　Ｐｏ１ｌ遺伝子をアセンブリングした。ベクターをＳｍａｒおよ びＮｄｅ［（ｐＤＧ１７４．　ｐＤＧ１７８）またはＮｃｏＩ　（ｐＤＧ１８２ ．　ｐＤＧ１８４．　ｐＤＧ１８５）で消化する。Ｔｍａ　Ｐａ１ｌ遺伝子の５ ′末端はＮｄｅ　ＩおよびＸｍａ　ｒで消化したｐＴｍａ５’　Ｎｄｅ＃３から のものであるか、あるいはＮｅｏ　ＩおよびＸｍａ■で消化したｐＴｍａ５’　 Ｎｃｏ＃９からのものである。遺伝子の３′末端はＸｍａ　［およびＥｃｏＲＶ で消化したｐＴｍａ３’　ｍｕｔ＃１からのものでありそして約３００ｂｐの断 片を前述したように精製した。

表に示すプラスミド１ｌＤＧ１８２および上のスキームを使用して、発現ベクタ ーｐＴｍａ１３を構成した。プラスミドｐＤＧ１８４および上のスキームを使用 して、ベクターｐＴｍａ１２−１およびｐＴｍａ２−３を構成した。プラスミド ｐＴｍａ１２−３はｐＴｍａ１２−１と異なり、ｐＴｍａ１２−３は同一の連結 ／形質転換のプロトコルの間に生成した１）Ｃｔｌｌｌａ１２−１の２量体であ る。プラスミドｐＤＧ１８５および上のスキームを使用して、発現ベクターｐＴ Ｍａｌｌを構成した。

ベクターはポリメラーゼ全コード配列を含有することができるが、この酵素の短 縮された形態を独占的にあるいは全長のプラスミドとの組み合わせで発現するこ とができる。Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼのこれらの短縮された形態は、５　’ 　−ＡＴＧ以外のコード配列中のメチオニン（ＡＴＧ）コドンの１つにおいて起 こる翻訳開始から生ずる。モノマーのｐＴｍａ１２−１のプラスミドは、加熱誘 導すると、天然Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸１−１３９を欠如する生 物学的に活性な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを主として生成する。約８６ｋＤａ のクレノくり質は、Ｔｍａコード配列の位置１４０におけるメチオニンのコドン における翻訳開始の結果であり、モしてＭＥＴ１４０と呼ばれる。

適当な条件（３８℃ではなく、３４℃または３６°Ｃにおける加熱誘導）下の震 盪フラスコの研究において、マルチマーのｐＴｍａ１２−３の発現ベクターは、 有意なレベルの「全長のＪＴｍａＤＮＡポリメラーゼ（５ＤＳ−ＰＡＧＥにより ほぼ９７ｋＤａ）およびより少量のＭｅｔ１４０における翻訳開始から生ずる短 縮された（はぼ５ｓｋＤａ）の形態を生じた。全長のＴｍａＤＮＡポリメラーゼ のアミノ酸配列決定は、アミノ末端のメチオニンが除去され、そして第２位置の ＡｌａがＮ−末端に存在することを示した。

組換えＴｍａ　ＤＮＡポリメラーゼを、プラスミドｐＴｍａ１２−３を含有する 種母フラスコは、トリプトン（２０ｇ／ｌ）、酵母エキス（１０ｇ／ｌ）、Ｎａ Ｃ１（１０ｇ／　１　）　、アンピシリン（１００ｍｇ／　１　）およびチアミ ン（１０ｒｎｇ／　１　）を含有した。種母フラスコに寒天プレート（凍結グリ セロール培養物を使用することもできる）からのコロニーを接種した。

種母フラスコを３０°Ｃにおいて０．５〜２．０光学書度（Ａ６．。）に増殖さ せた。発酵槽の中に接種した種母培養物の体積を計算して、細菌の濃度が０．５ ｍｇの乾燥重量／リットルであるようにする。１２．５１ルソトルの増殖培地は 、６０ｍＭのＫＨｚＰＯ４，１６ｍＭのＮａＮＨＪＰＯｎ　、　１０ｍＭのクエ ン酸およびＩＱＩＭのＭｇ５Ｏａを含有した。次の無菌の成分を添加した：２ｇ ／ｌのグルコース、１０ｍｇ／　１のチアミン、２．５ｇ／ｌのカザミノ酸、１ ００ａ＋ｇ／　１のアンピシリン、および１００＋ｎｇ／　］のメチシリン。

必要に応じて、消泡剤としてプロピレングリコールの添加により、発泡を抑制し た。空気の流れを２リットル／分に維持した。発酵槽に前述したように接種し、 そして培養物を３０°Ｃにおいて４．５時間０．７の細胞密度（Ａ、。）に成長 させた。増殖温度を３５°Ｃにシフトして、組換えＴｍａ　ＤＮＡポリメラーゼ の合成を誘導した。温度のシフトはｐＴｍａ１２−３プラスミドのコピーの数を 増加し、そして同時に宿主の中の欠陥のあるプロファージのリソゲンによりコー ドされる温度感受性ｃｌリプレッサーの不活性化により、修飾されたＴｍａ　Ｄ ＮＡポリメラーゼ遺伝子のラムダＰＬプロモーターがコントロールする転写を抑 制解除する。細胞を２１時間の間４の光学密度（Ａ＠、。）に増殖させ、そして 遠心により収穫した。生ずる細胞のペーストを一７０°Ｃで貯蔵した。

組換えＴｍａ　ＤＮＡポリメラーゼを下の実施例６におけるように精製した。簡 単に述べると、細胞を１体積のＴＥ緩衝液（５０ｍＭのトリス−Ｃ１，ｐＨ７， ５および１０ｍＭのＥＤＴＡおよびＩＯＩＭのＤＴＴ）の中で融解し、そしてプ ロテアーゼ阻害剤を添加する（　ＰＭＳＰを２．４ｍＭに、ロイペプチンをＩμ ｇ／ｍｌに、そしてＴＬＣＫを０．２ｍＭに）。細胞をアミニア　（Ａｍｉｃｏ ）フレンチ圧力セル中で２０．０ＯＯｐｓ　ｉにおいて溶解し、そして超音波処 理して粘度を低下させた。超音波処理物をＴＥ緩衝液およびプロテアーゼ阻害剤 を５．５×湿潤重量の細胞塊（分画Ｉ）に希釈し、０．３Ｍの硫酸アンモニウム に調節し、そして急速に７５℃にし、そして７５°Ｃに１５分間維持した。熱処 理した上澄み液を０℃に急速に冷却し、そして大腸菌（Ｕ、　ｃｏｌｉ）細胞の 膜および変性されたタンパク質を２０、０００　Ｘ　ｇの３０分間の遠心後に除 去した。Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼ（分画ＩＩ）を含有する上澄み液を取って 置く。核酸の〉９５％を沈澱させるために必要なボリミン（Ｐｏｌｙｍｉｎ）　 Ｐのレベルを試験沈殿により決定する（通常０．６〜１％Ｗ／Ｖの範囲）。所望 量のボリミン（Ｐｏｌｙｍｉｎ）　Ｐを０℃において３０分間急速に撹拌しなが らゆっくり添加し、そしてこの懸濁液を２０．０００　Ｘ　ｇで３０分間遠心し て、沈澱した核酸を除去する。Ｔｌｌ１ａ　ＤＮＡポリメラーゼを含有する上澄 み液（分画ＩＩＩ）を取って置く。

分画Ｉ１１を５０ｍＭのトリス−Ｃ１，ｐＨ７，５，０，３Ｍの硫酸アンモニウ ム、ｌｏｍＭのＥＤＴＡおよび１ｍＭのＤＴＴの中で平衡化したフェニルセファ ローズのカラムに適用する。カラムを２〜４体積の同一緩衝液で洗浄しく基線に 対してＡ、。）、次いで１〜２力ラム体積の１００ｍＭのＫＣＩを含有するＴＥ 緩衝液で洗浄して大部分の汚染するＥ、　ｃｏｌｔタンパク質を除去する。次い でＴａ＋ａ　ＤＮＡポリメラーゼをカラムから５０ｍＭのトリス−Ｃ１，ｐＨ７ ，５、２Ｍの尿素、２０％（ｗ／ｖ）のエチレングリコール、１０ｍＭのＥＤＴ Ａおよび１ｍＭのＤＴＴを含有する緩衝液で溶出し、そしてＤＮＡポリメラーゼ 活性を含有する遊離をプールする（分画ＩＶ）。

組換えＴｍａ　ＤＮＡポリメラーゼの最後の精製を、ヘパリンセファローズのク ロマトグラフィー（天然またはＮ８７２８４組換えＤＮＡポリメラーゼについて ）、アニオン交換クロマトグラフィー、またはアフィゲルブルーのクロマトグラ フィーを使用して達成する。組換えＴｍａＤＮＡポリメラーゼを２．５×貯蔵緩 衝液の中に透析濾過し、１．５体積の無菌の８０％（Ｗ／Ｖ）のグリセロールと 一緒にし、そして−２０℃において貯蔵する。

上に記載したように、完全なＴｍａ遺伝子のコード配列を含有する発現プラスミ ドは、開始コドンにおける翻訳の開始から生ずる全長のポリメラーゼ、あるいは 位置１４０におけるメチオニンのコドンに存在する翻訳開始部から生ずる短縮さ れたポリメラーゼを発現した。

翻訳開始部位として作用することができる第３メチオニンコドンは、Ｔｍａ遺伝 子のコード配列の位置２８４に存在する。天然Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼのア ミノ酸１−２８３を欠如するＤＮＡポリメラーゼを発現するプラスミドを、Ｔｏ ＋ａのコード配列の対応する領域を欠失することによって構成した。

プラスミドｐＴｆｆｌａ１２−１をＢｓｐＨ１（ヌクレオチド位置８４８）およ びＢｉｎｄＩＩＩ　（ヌクレオチド位置２６２９）で消化した。１７８１ｂｐの 断片をアガロースゲル精製により単離した。ＤＮＡからアガロースを分離するた めに、所望の断片を含有するゲルのスライスをコスタ−（Ｃｏｓｔａｒ）スピン ネックスフイルターユニットの中で一２０°Ｃにおいて凍結した。

室温において融解後、ユニットをマイクロフージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）の中で 回転した。ＤＮＡを含有するフィルターをスピード・バク（Ｓｐｏｏｄ　Ｖａｃ ）濃縮装置で濃縮し、そしてＤＮＡをエタノールで沈澱させた。

単離した断片をＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＴｍａ１２−１の中 にクローニングした。Ｎｃｏ　Ｅの消化物はＢｓｐＨ１による消化物と同一の粘 着末端の配列を残すので、１７８１塩基対の断片はＮｅｏ　ＩおよびＨｉｎｄｌ ｌｌで消化することによってプラスミドｐＴａ＋ａ１２−１から切除した全長の 断片と同一の粘着末端を有する。単離した断片と消化したプラスミドとの結合は 断片のスイットを生じ、そしてｐＴｍａ１４と表示するプラスミドをつくるため に使用した。

プラスミドｐＴｍａ１５は同一の単離した断片をｐＴｍａ１３の中にクローニン グすることによって構成した。ｐＴｍａ１４と同様に、ｐＴａ＋ａ１５は天然Ｔ ｍａ　ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸１−２８３を欠如するポリメラーゼの発現 を推進する：翻訳は天然コード配列の位置２８４のメチオニンのｐＴＩＵａ１４ およびｐＴｍａ１５の両者の発現プラスミドは、約７０ｋＤａの分子量の生物学 的に活性な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを高いレベルで発現した；プラスミドｐ Ｔｍａ１５はＴ４ＤＮＡリガーゼより高いレベルでポリメラーゼを発現した。大 腸菌（Ｂ、　ｃｏｌｉ）　Ｐｏ１ｒのクレノー断片との類似性、例えば、３’− ５’エキソヌクレアーゼ活性のために必須の３つのすべてのドメインにおけるア ミノ酸配列のモチーフの保存性、アミノ末端からエキソヌクレアーゼ活性のため に必須の第１ドメインまでの距離、および発現されたタンパク質の長さ、に基づ いて、Ｔｍａポリメラーゼの短縮された形態（ＭＥＴ２８４）は３’−５’エキ ソヌクレアーゼおよびブルーフ−リーディング（ｐｒｏｏｆ−ｒｅａｄｉｎｇ） 活性を有するが、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠如する。

しかしながら３’−５’エキソヌクレアーゼ活性についての初期のＳＤＳ活性の ゲルアッセイおよび溶液アッセイは、プラスミドｐＴｍａ１５を収容する大腸菌 （Ｅ、　ｃｏｌｉ）宿主細胞により発現されたポリメラーゼのブルーフ−リーデ ィング活性の有意の弱化を示唆した。

ＭＥＴ２８４Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼを、プラスミドｐＴｍａ１５を含有す る大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）菌株ＤＧ１１６から精製した。１０リツトルの発酵の 種母フラスコは、トリプトン（２０ｇ／　１　）　、酵母エキス（１０ｇ／ｌ） 、グルコース（１０ｇ／ｌ）、アンピシリン（５０ｍｇ／　１　）およびチアミ ン（１０ｍｇ／　１　）を含有した。種母フラスコに寒天プレート（凍結グリセ ロール培養物を使用することができる）からのコロニーを接種した。種母フラス コを３０℃において０．５〜２．０光学書度（Ａｓｓｓ）に増殖させた。発酵槽 中に接種した種母培養物の体積を計算して、細菌濃度が０．５ｍｇ乾燥重量／リ ットルであるようにする。ｌＯリットルの増殖培地は、２５ｍＭのＫＨｔＰＯ４ ，１１００ＩのＮａＮＨＪＰＯ４，４１１１Ｍのクエン酸ナトリウム、　０．３ ｍＭのＦｅＣ１ｇ、　０．０４ｍＭのＺｎＣ１＊、　０．０３ｍＭのＣｏＣ１ｔ 。

０゜０３ｍＭのＣｕＣ１ｔおよび１ｍＭのＨ，ＢＯ３を含有した。次の無菌の成 分を添加した：４ｍＭのＭｇＳＯ４，２０ｇ／　１のグルコース、２０ｍｇ／　 １のチアミン、および５０ｍｇ／　１のアンピシリン。ｐＨをＮａＯＨで６．８ に調節し、そして発酵の間ＮＨ４ＯＨの添加によりコントロールした。グルコー スをＮＨ，ＯＨの添加と組み合わせてｉ続的に添加した。必要に応じて、消泡剤 としてプロピレングリコールの添加により、発泡を抑制した。

溶解した酸素の濃度を４０％に維持した。

発酵槽に前述したように接種し、そして培養物を３０℃において０．５〜１．０ Ｘ１０”の細胞密度（１５の光学密度［Ａ１．。］）に増殖させた。

増殖温度を３８℃にシフトして、ＭＥＴ２８４のＴｍａ　ＤＮＡポリメラーゼの 合成を誘導した。温度のシフトはｐＴｍａ１５のプラスミドのコピーの数を増加 し、そして同時に宿主中の欠陥のあるプロファージのリソゲンによりコードされ る温度感受性ｃｌリプレッサーの不活性化により、修飾されたＴｍａ　ＤＮＡポ リメラーゼ遺伝子のラムダＰＬプロモーターがコントロールする転写を抑制解除 する。

細胞を６時間の間５７（Ａｓｓ。）に増殖させ、そして遠心により収穫した。細 胞塊（約９５ｇ／ｌ）を５０ｄのトリス−ＣＩ、ｐＨ７，６，２０ｍＭのＥＤＴ Ａおよび２０％（Ｗ／Ｖ）のグリセロールを含有する等しい体積の緩衝液の中に 再懸濁させた。この懸濁液を液体窒素の中にゆっくり滴下して懸濁液を「ピース 」または小さいペレットとして凍結した。

凍結した細胞を一７０℃で貯蔵した。

２００ｇの凍結したビーズ（１００ｇの湿潤重量の細胞を含有する）に、１００ ｍ１のＩ　ＸＴＥ　（５０ｍＭのトリス−Ｃ１，ｐＨ７，５，１０ｍＭの）！Ｄ ＴＡ）を添加し、そしてＤＴＴを０．３ｍＭに、ＰＭＳＦを２．４ｍＭに、ロイ ペプチンをｌμｇ／ｍｌに、モしてＴＬＣＫ　（プロテアーゼ阻害剤）を０．２ ｍＭに添加した。試料を氷上で融解し、そして低速のブレンターの中で均一に再 懸濁した。細胞懸濁液を細胞をアミンコ（Ａｍｉｎｃｏ）フレンチ圧力セルの中 で２０．０００ｐｓｊにおいて溶解した。粘度を減少するために、溶解した細胞 の試料を各３分間５０％の使用サイクルおよび７０％のアウトプットで４回超音 波処理した。超音波処理物をＩＩＩＩＭのＤＴＴ、　２．４ｍＭのＰＭＳＦ、１ 　ｕ　ｇ／ｍｌのロイペプチンおよび０．２ｍＭのＴＩ、Ｃに（分画Ｉ）を含有 するＩＸＴＥで５５０ｍ１に調節した。硫酸アンモニウムを０．３Ｍに添加した 後、粗製のリゼイトを沸騰する水の中で急速に７５℃にし、モして７５°Ｃの水 に１５分間移して大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）宿主のタンパク質を変性および不活 性化した。熱処理した試料を急速に０℃にし、そして氷上で２０分間インキュベ ーションした。５°Ｃにおいて２０．０００×Ｇで遠心することによって沈澱し たタンパク質および細胞膜を除去し、そして上澄み液（分画口）を取って置いた 。

熱処理した上澄み液（分画ＩＩ）をポリエチレンイミン（ＰＥＩ）で処理して、 ＤＮＡおよびＲＮＡの除去した。ボリミン（Ｐｏｌｙｍｉｎ）　Ｐ　（３４，９ ６ｍ１の１０％［ｗ／ｖｌ　、　ｐＨ７，５）を急速に撹拌しながら、４３７ｍ １の分画ＩＩに０℃において添加した。０°Ｃにおいて３０分後、試料を２０． ０００　ＸＧで３０分間遠心した。上澄み液（分画ＩＩＩ）を、５０ｍＭのトリ ス−ＣＩ。

ｐＨ７，５，０，３Ｍの硫酸アンモニウム、１０ｍＭのＥＤＴＡおよび１ｍＭの ＤＴＴの中で平衡化した。１００ｍ１のフェニルセファローズのカラム（３，２ Ｘ１２、５ｃｍ）に、８０ｍ１／時で適用した。このカラムを約２００ｍ１の同 一緩衝液で洗浄しく基線に対してＡｓｓ。）、次いで１５０ｍ１の５０ｍＭのト リス−ＣＩ、ｐＨ７，５，１１００ＯＩのＫＣＩ、１０ｍＭのＥＤＴＡおよび１ ｍＭのＤＴＴで洗浄した。次いでＭＥＴ２８４のＴｍａ　ＤＮＡポリメラーゼを カラムから５０ｍＭのトリス−Ｃ１，ｐＨ７，５，２Ｍの尿素、２０％（ｗ／ｖ ）のエチレングリコール、１０ｍＭのＥＤＴＡおよび１ｍＭのＤＴＴを含有する 緩衝液で溶離し、そしてＤＮＡポリメラーゼ活性を含有する分画をプールした（ 分画ＩＶ）。

分画Ｖｌを５０ｍＭのトリス−Ｃ１，ｐＨ７，５，１ｍＭ（７）ＥＤＴＡおよび １ｍＭのＤＴＴの中で５０ｍＭのＫＣＩに等しい導電性に調節した。この試料を 、同一緩衝液の中で平衡化した１５ｍ１のヘパリン−セファローズのカラムに適 用（９ｍｌ／時で）した。このカラムを同一緩衝液で約１４ｍ１／時（３，５力 ラム体積）で洗浄し、そして同一緩衝液中の１５０ｍ１（７）０．０５〜０．５ ＭのＫＣＩで溶離した。ＤＮＡポリメラーゼ活性は０．１１〜０．２２ＭのＫＣ Ｉの間で溶離された。ｐＴｍａ１５でエンコードされた修飾Ｔｍａ　ＤＮＡポリ メラーゼを含有する分画をプールし、濃縮し、そして２．５×貯蔵緩衝液（５０ ｍＭノドリス−ＣＩ、ｐＨ８，０，２５０ｍＭ）ＫＣＩ、　０．２５ｍＭノＥＤ ＴＡ。

２、５ｍＭのＤＴＴおよび０．５％のツイーン２０）に対して透析濾過し、引き 続いて１６５体積の無菌の８０％（Ｗ／Ｖ）のグリセロールを混合し、そして− ２０°Ｃにおいて貯蔵した。必要に応じて、ヘパリンセファローズ溶出のＤＮＡ ポリメラーゼまたはフェニルセファローズ溶出のＤＮＡポリメラーゼを透析する か、あるいは５０ｍＭのトリス−ＣＩ、　ｐＨ７，５゜１ｍＭ（７）　ＤＴＴ、 １ｍＭノＥＤＴＡおよび０．２％のツイーン２ｏノ中テ５０ｍＭノＫＣ１に等し い導電性に調節し、そして同一の緩衝液の中で平衡化したアフィゲルブルーカラ ムに適用（］ｌ１１ｇのタンパク質／＋ｎｌの樹脂）することができる。このカ ラムを３〜５力ラム体積の同一緩衝液で洗浄し、そしてｌＯカラム体積の同一緩 衝液中のＫＣＩの勾配（０，０５〜０．８Ｍ）で溶出した。ＤＮＡポリメラーゼ 活性（０，２５〜０．４ＭのＫＣＩの間で溶出する）を含有する分画をプールし 、濃縮し、透析濾過し、そして上のように貯蔵した。

種々のＤＮＡポリメラーゼの相対的耐熱性を比較した。９７．５°Ｃにおいて、 天然ＤＮＡ　Ｔｍａポリメラーゼの半減期は天然または組換えＴａｑＤＮＡ　（ すなわち、ＡｍｐｌｉＴａｑ’　）ポリメラーゼの半減期の２倍より大きい。驚 くべきことには、ＭＥＴ２８４Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼの９７．５℃におけ る半減期は天然Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼの半減期より３倍長い。

１０ｍＭのトリス−ＣＩ、ｐＨ８，３および１．５ｍＭのＭｇＣ１！（Ｔａｑま たは天然Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼについて）または３ｍＭのＭｇＣ１＊（Ｍ ＥＴ２８４Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼについて）　、５０１１１ＭのＫＣＩ（ Ｔａｑ、天然ＴｍａおよびＭＥＴ２８４Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼについて） またはＫＣＩ不含（ＭＥＴ２８４Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼ）、０．５μＭの 各ブライｖ　−ＰＣＲＯＩおよびＰＣＲＯ２，１ｎｇノラムダ鋳ＷＤＮＡ、　２ ００μＭｃ７）各ｄＮＴＰ　（ｄＣＴＰを除外する）、および４単位の各酵素を 含有するＰＣＲ管を９７．５℃において大きい水浴中で０〜６０分間インキュベ ーションした。試料を経時的に抜き出し、０℃において貯蔵し、そして５μｌを 残留活性についての標準の活性のアッセイにおいて７５℃において１０分間測定 した。

Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼは９７．５°Ｃにおいて約１０分の半減期を有した が、天然Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼは９７．５℃において約２１〜２２分間の 半減期を有した。驚くべきことには、Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼのＭＥＴ２８ ４の形態は、Ｔａｑまたは天然Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼのいずれより有意に 長い半減期（５０〜５５分）を存した。ＭＥＴ２８４Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラー ゼの改良された耐熱性は、ＰＣＨにおける、とくにＧ＋Ｃに富んだ標的が増幅困 難である場合に用途を見いだすであろう。なぜなら、標的およびＰＣＲ生成物の 配列の完全な変性に要求される鎖単離の温度は酵素の不活性化に導くからである 。

５０μｍの１０ｍＭのトリス−Ｃ１，ｐ）１８．３　、　３ｍＭのＭｇＣ１ｚ、 　２０ＭＭの各ｃｌＮＴＰ、０．５＊ｇのバクテリオファージラムダのＤＮＡ、 ０．５μＭのブライ７−　ＰＣＲＯＩ、４単位のＭＥＴ２８４Ｔｍａ　ＤＮＡポ リメラーゼおよび０．５ｍＭのプライマーＰＣＲＯ２またはＰＬＩＯを含有する ＰＣＲ管を、１分間の９６℃のＴ（変性）および２分間の６０℃のＴ（アニーリ ング−伸長）を使用して２５サイクルをサイクルした。ラムダＤＮＡ鋳型、デオ キシヌクレオチドのストック溶液、並びにプライマーＰＣＲＯＩおよびＰＣＲＯ ２は、ＰＥＣｌ　Ｇｅｎｅ　Ａｍｐ”キットの一部分であった。プライマーＰＬ ＩＯは配列：（配列番号：　４５）　５’−ＧＧＣＧＴＡＣＣＴＴＴＧＴＣＴＣ ＡＣＧＧＧＣＡＡＣ−３’を有し、そしてバクテリオファージラムダのヌクレオ チド８１０６−８１３０に対して相補的である。

プライマーＰＣＲＯＩおよびＰＣＲＱ２は、ラムダからの５００１１ρの生成物 を増幅する。プライマー対ＰＣＲＯＩおよびＰＬＩＯはラムダからのｌｋｂの生 成物を増幅する。それぞれのプライマーの組を使用して増幅した後、５μｌのア リコートをアガロースゲルの電気泳動にかけ、そして特定の意図する生成物のバ ンドを臭化エチジウムの染色で可視化した。豊富なレベルの生成物が両者のプラ イマーの組で発生し、ＭＥＴ２８４Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼは意図する標的 配列を首尾よく増幅したことを示す。

上に記載したように、完全なＴｍａ　ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のコード配列を 含有するプラスミドで形質転換された宿主細胞は、短縮された形態（ＭＥＴ１４ ０）のＴｍａポリメラーゼを単独または全長のポリメラーゼと一緒に発現する。

変異を行って、発現されるポリメラーゼの形態をコントロールすることができる 。ポリメラーゼのＭＥＴ１４０の独占的な発現を増強するために、１３９までの アミノ酸に相当するコード領域を発現ベクターから欠失した。このようなに欠失 を構成するプロトコルは実施例６に記載されている構成に類似する：短縮された 遺伝子断片を切り出し、次いで全長の断片が切除されているベクターの中に挿入 する。しかしながら、短縮された断片は、制限消化物から精製するよりむしろＰ ＣＲ増幅生成物として得られる。この方法は有用な場合に新しい上流制限部位（ または他の配列）の組込みを可能とする。

位置１４０におけるメチオニンのコドンまでの領域を欠失するために、５ｐｈｒ 部位をｐＴｍａ１２−１およびｐＴｆｌｌａ１３中にＰＣＲを使用して導入した 。

位置１４０のメチオニンのコドンのちょうど上流に５ｐｈｒ部位を導入するよう に、前方プライマー（ＦＬ６３）を設計した。位置６２４にＸｂａ　ｒを含むよ うに、逆プライマー（ＦＬ６９）を選択した。Ｓｍａ　Ｉで線状化したプラスミ ドｐＴＩｎａ１２−１をＰＣＲ鋳型として使用して、２２５ｂｐのＰＣＲ生成物 を生成した。

消化の前に、ＰＣＲ生成物をＰＣＲ反応混合物中の５０Ｍｇ、”ｍｔのプライマ ー対に＋　０．５％（７）　ＳＤＳおよび５　ＤＩＭ（７）　ＥＤＴＡ　テ処理 した。３７℃において３０分間インキュベーションした後、プロテイナーゼＫを ６８°Ｃで１０分間加熱不活性化した。この手順は、引き続く制限消化を阻害し うる生成物に結合したＴａｑポリメラーゼを排除した。緩衝液をＴＥ緩衝液に交 換し、そして過剰のＰＣＲプライマーをセントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）１ ００マイクロコンセントレータ−で除去した。

増幅された断片を５ｐｈｌで消化し、次いでクレノーで処理して、５ｐｈｌ切断 した末端に平滑末端をつくり、そして最後にＸｂａＩで消化した。

生ずる断片を、Ｎｃｏ　Ｉで消化したプラスミドｐＴｍａ１３　（ｐＴｍａｌ２ −１が適当であったであろう）と結合し、クレノーで修復し、次いでＸｂａ　Ｉ で消化した。この連結は、最初のＮｃｏ１部位（コード配列の第１メチオニンか ら上流）と導入された５ｐｈｌ部位（位置１４０におけるメチオニンコード配列 から上流）との間の領域が除去されたインフレームのコード配列を生じた。生ず る発現ベクターをｐＴｍａｌ６と表示した。

この実施例において使用したプライマーを下および配列のリストの節に記載する 。

プライマー　配列番号：　配列 ＦＬ６３　配列番号：　３０　５’　ＧＡＴＡＡＡＧＧＣＡＴＧＣＴＴＣＡＧＣ ＴＴＧＴＧＡＡＣＧＦＬ６９　配列番号：　３１　５’　ＴＧＴＡＣＴＴＣＴＣ ＴＡＧＡＡＧＣＴＧＡＡＣＡＧＣＡＧＴｍａ　ＤＮＡポリメラーゼのＭＥＴ１４ ０の形態の少い発現は、位置１４０のメチオニンのコドンから上流のリポソーム 結合部位（ＲＢＳ）を排除することによって達成することができる。オリゴヌク レオチド部位特異的変異誘発により排除した。遺伝コードの冗長性の利点を利用 して、コドンの第３位置を変化して核酸配列を変更し、これにより、コードされ たタンパク質のアミノ酸配列を変化しないで、ＲＢＳを排除することができる。

修飾された配列を含有する変異原プライマー（ＦＬ６４）を合成し、そしてリン 酸化した。−重鎖ｐＴｍａ０９　（Ｎｅａｒ部位を育する全長クローン）を、ス トラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から商業的に入手可能な、ヘルパーファ ージＲ４８０で同時感染することによって調製した。−重鎖ｐＴｍａ０９および ｐＢｓ１３＋のＰｖｕ［消化からの大きい断片の［ギャップド二重鎖（ｇａｐｐ ｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ）」を、２つのプラスミドを混合し、２分間沸騰加熱しモし て６５°Ｃに５分間冷却することによって作った。

次いで、リン酸化したプライマーと「ギャップドニ重鎮」とを、混合、２分間の ８０℃への加熱および引き続く室温へのゆっくりした冷却によりアニーリングし た。残留するギャップをクレノーを使用する伸長により満たし、そして断片をＴ ４ＤＮＡリガーゼにより連結した。

再反応を標準的塩類中２００ｍＭの各ｄＮＴＰおよび４０ｍＭのＡＴＰの中で３ ７℃において３０分間実施した。

生ずる環状断片をＤＧＩＯＩに、ニトロセルロースフィルター上でプレート形質 転換により形質転換した。二重反復実験のファルタ−をつくり、そして正しいプ ラスミドの存在をγ５ａｐ−リン酸化プローブ（ＦＬ６５）でブロービングする ことによって検出した。生ずるベクターをｐＴｍａｌ９と表示した。

ｐＴｍａｌ９からのＰＢＳを含まない部分を、Ｎｃｏｌ／Ｘｂａ［断片のスイッ チによりｐＴｍａｌ２−１中にクローニングした。プラスミド１９をＮｅｏ　Ｉ およびＸｂａ　Ｉで消化し、モして６２０ｂｐの断片を、上の実施例７における ように、電気泳動により精製した。ｐＴａ＋ａ１２−１をＮｃｏＬ　Ｘｂａｌお よびＸｃｍｌで消化した。Ｘｃｍ　ｒによる切断は、引き続く連結工程のために ＰＢＳ＋断片を不活性化し、これは「粘着」末端の連結に適当な条件下に実施さ れる（希いリガーゼおよび４０ａ＋ＭのＡＴＰ）。最後に、発現のために、連結 生成物をＤＧ１１６宿主細胞の中に形質転換し、モしてＩ）Ｔｍａ１９−ＰＢＳ と表示する。

この実施例において使用したオリゴヌクレオチド配列を下記および配列表の節に 記載する。

オリゴ　配列ＮＯ：　鳳烈 ＦＬ６４　配列番号：　３２　５’　ＣＴＧＡＡＧＣＡＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＡ ＣＣＧＧＴＴＡＣＴＡＴＡＡＴＡＴ ＦＬ６５　配列番号：　３２　５’　ＴＡＧＴＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＡＡＡＧ実 施例９ 切頭Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼＭＥＴ　ＡＳＰ２１の発現Ｔｍａ　ＤＮＡポリ メラーゼ遺伝子のコード配列の位置２１におけるアスパラギン酸のコドン付近に おいて翻訳を開始するために、このコドンの前にメチオニンのコドンを導入し、 そし工最初のＮｃｏ１部位からこの導入されたメチオニンのコドンまでの領域を 欠失させる。欠失の方法は、前述の同一の下流プライマー（ＦＬ６９）　、およ び５７０ｂｐの生成物を生ずるためにＮｃｏＩ部位およびメチオニンのコドン組 込むように設計した上流プライマー（ＦＬ６６）を使用する手順を包含する。

増幅された生成物をセントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）　−１００マイクロコ ンセントレータ−で濃縮して、過剰のプライマーおよび緩衝液を排除した。生成 物をスピード・バク（Ｓｐｅｅｄ　Ｖａｃ）濃縮装置で濃縮し、次いで消化混合 物の中に再懸濁させる。増幅した生成物をＮｅｏ　ＩおよびＸｂａ　［で消化す る。同様に、ｐＴｍａｌ２−１．　ｐＴｍａｌ３またはｐＴｍａｌ、９−ＲＢＳ を同じ２つの制限酵素で消化し、そして増幅断片の消化物と消化した発現ベクタ ーとを連結した。生ずる構成体は、天然Ｔｍａコード配列の開始コドンから上流 のＮｅｏ　１部位から、天然Ｔｍａコード配列の位置２１のアスパラギン酸のコ ドンから上流に導入された新しいメチオニンのコドンまでの欠失を有する。

同様に、翻訳の開始が天然Ｔｍａコード配列の位置７４のグルタミンのコドンＧ １ｕ７４において開始するように、欠失の変異体をつくることができる。メチオ ニンのコドンおよびＮｃｏ　１部位をＧ１ｕ７４の前に導入するように上流プラ イマー（ＦＬ６７）を設計する。使用する下流プライマーおよびクローニングの プロトコルは、ＭＥＴ　ＡＳＰ２１構成体について前述した通りである。

この実施例において使用した上流プライマーの配列を下記および配列表の節に記 載する。

オリゴ　配列番号：　配列 ＦＬ６６　配列番号：　３４　５’　ＣＴＡＴＧＣＣＡＴＧＧＡＴＡＧＡＴＣＧ ＣＴＴＴＣＴＡＣＴＴＣＣＦＬ６７　配列番号：　３５　５’　ＣＡＡＧＣＣＣ ＡＴＧＧＡＡＡＣＴＴＡＣＡＡＧＧＣＴＣＡＡＡＧＡ発現の効率は、発現ベクタ ー中のプロモーターおよび／またはリポソーム結合部位（ＲＢＳ）を変化するこ とによって変更することができる。Ｔ７遺伝子１０のプロモーターおよびＲＢＳ を使用して、発現ベクターｐＴｍａ１７からのＴｍａ　ＤＮＡポリメラーゼの発 現を推進し、モしてＴ７遺伝子１０のプロモーターおよび遺伝子ＮのＲＢＳを使 用して、発現ベクターｐＴｍａ１８からのＴｍａ　ＤＮＡポリメラーゼの発現を 推進した。

これらのベクターの構成は、ｐＴ［ｌ１ａ１２−１中に存在するユニーク制限部 位：プロモーターから上流のＡｍｒ部位、ＲＢＳから下流のＮｃｏ■部位、およ びプライマーとＲＢＳとの間のＢｓｐ８１部位を利用した。存在するプロモータ ーを、前の実施例に記載する技術に類似する技術を使用″して、ｐＴｍａｌ２− １から切除しそして合成Ｔ７遺伝子ＩＯプロモーターと置換した。

２つのオーバーラッピングする合成オリゴヌクレオチドから合成インサートをつ くった。ｐＴｍａ７（Ｔ　７遺伝子ｌＯのＲＢＳをもつ）をつくるために、等し い比率のＦＲ４１４およびＦＲ４１６を混合し、加熱沸騰させ、そして室温にゆ っくり冷却した。ハイブリダイゼーションしたオリゴヌクレオチドをクレノーで 伸長して、全長の二本鎖のインサートをつ（った。次いで伸長した断片をＡｆｌ ＴＩおよびＮｃｏ　Ｉで消化し、適当な「粘着」末端を残した。インサートをＡ ｆｌｌｌおよびＮｃｏｌで消化したプラスミドｐＴｍａ１２−１中にクローニン グした。ＤＧ１１６宿主細胞を生ずるプラスミドにより形質転換し、そして形質 転換体を所望のプラスミドについてスクリーニングした。

同一手順をｐＴｍａ１８　（遺伝子ＮのＲＢＳをもつ）の作製において使用した が、ただしＦＲ４１４およびＦＲ４１８を使用し、そして伸長した断片をＡｆｌ ｌｌおよびＢｓｐＥｌで消化した。このＤＮＡ断片を、ＡｐＨ！およびＢｓｐＥ Ｉで消化したプラスミドρ細ａ１２−１中のＰＬプロモーターと置換した。

プラスミドｐＴＩｎａ１７およびｐＴｍａ１８を使用して、誘発可能なＴ７ＤＮ Ａポリメラーゼ遺伝子を含有するように修飾された大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）宿 主細胞を形質転換する。

これらのベクターの構成において使用したオリゴヌクレオチドを下記および配列 表の節に記載する。

ＦＲ４１４配列番号：　３６　５’　ＴＣＡＧＣＴＴＡＡＧＡＣＴＴＣＧＡＡＡ ＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴ ＣＣＣＴＣＦＲ４１６配列番号：　３７　５’　ＴＣＧＡＣＣＡＴＧＧＧＴＡＴ ＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣＡＡＡＡＴＴＡＴＴＴＣＴＡＧＡ ＧＧＧＡＡＡＣＣＧＴＴＧＦＲ４１８配列番号：　３８　５’　ＴＣＡＧＴＣＣ ＧＧＡＴＡＡＡＣＡＡＡＡＴＴＡＴＴＴＣＴＡＧＡＧＧＧＡＡＡＣＣＧＴＴＧ 前述したように、タンパク質のためのコード配列の開始部位のちょうど上流に短 いコード配列をカップリングすることによって、翻訳カップリングはタンパク質 の発現の効率を増加することができる。

上流のコード配列の翻訳の停止は、下流のコード配列のための開始部位に密接に 近接してリポソームの残す。上流のコード配列は、所望のタンパク質のためのコ ード配列の開始に対して下流にリポソームを動かす機能のみをする。

翻訳的にカップリングしたＴｍａの発現ベクターを構成し、そしてこの発現ベク ターはＴｍａコード領域の上流に位置する大腸菌（Ｅ。

ｃｏｌｉ）のＴｒｐＥの最後の６コドンに対してインフレームで融合したＴ７バ クテリオフアージの主要キャプシドタンパク質（遺伝子１０）の最初のｌＯコド ンおよび翻訳開始シグナルを有した。ＴｒｐＥのためのＴＧＡ（停止）コドンと Ｔｍａ遺伝子のためのＡＴＧ（ｌｊＪ！始）コドンとをｒカップリング」して、 配列ＴＧＡＴＧを形成する。短いコード配列の翻訳とＴｍａコード配列の翻訳と の間に、１塩基のフレーム−シフトが要求される。

下記の実施例において、Ｔ７遺伝子１０−大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　ＴｒｐＥ ／ＴｒｌｌＤ融合生成物を含有する断片（ＴｒｐＥからの最後の６コドンおよび ＴＧＡ停止コドンならびにＴｒｐＤからのオーバーラツプするＡＴＧ開始コドン ）は、前辺て存在するプラスミドから転移された。当業者は認識するように、翻 訳的にカップリングした発現ベクターの構成において使用したＴ７遺伝子１〇− 大腸菌（旦、　ｃｏｌｉ）　ＴｒｐＥ／ＴｒｐＤ融合生成物は合成オリゴヌクレ オチドとして構成することができる。挿入された断片のための配列を下記および 配列表の節に記載する。

Ｔ７遺伝子１〇−大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　ＴｒｐＥ／ＴｒｐＤ融合生成物を 、プラスミドｐｓＹｃ１８６８からプライマーＦＬ４８およびＦＬ４９を使用し て増幅した。ブライ７−ＦＬ５１およびＦＬ５３では、ｐＴｍａ０８　（Ｎｄｅ １部位を含有する全長クローン）中のＴｍａ　Ｐａ１ｌ遺伝子の５′末端を、Ａ ＴＧ開始コドンからＡＴＧ開始コドンの下流のＭｒｏ１部位まで増幅した。オー バーラッピング領域を残し、こうして本質的に実施例ＩＯに記載するようにして ２つの増幅された生成物をアニーリングしそして伸長することができるようにプ ライマーＦＬ５１およびＦＬ４９を設計した。２つの増幅生成物を混合し、９５ ℃に加熱し、室温にゆっくり冷却し、そしてＴａｑポリメラーゼで伸長した。

伸長されたインサートをプライマーＦＬ４８およびＦＬ５３で増幅し、次いでＸ ｍａ　ＩおよびＭｒｏｌで消化した。プラスミドｐＴｍａ　１２−１をＭｒｏ　 ｌで消化し、そして仔つシ腸アルカリ性ホスファターゼで処理して再連結を防止 した。消化したｐＴｆｆ１８１２−１をインサートと連結した。生ずる構成体で ＤＧ１１６宿主細胞を形質転換し、そして形質転換体を所望のプラスミドＤＮＡ についてスクリーニングした。生ずるベクターをｐＴｍａ２０と表示した。

オリゴヌクレオチドブライマーおよびＴ７遺伝子１０−大腸菌（旦。

記および配列表の節に記載する。

プライマー　配列番号：　配列 ＦＬ４８　配列番号：　３９　５’　ＴＣＣＧＧＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧ ＡＴＡＴＡＣＦＬ４９　配列番号：　４０　５’　ＡＡＴＡＧＴＣＴＡＧＣＣＡ ＴＣＡＧＡＡＡＧＴＣＴＣＣＧＴＧＣ ＦＬ５１　配列番号：　４１　５’　ＡＧＡＣＴＴＴＣＴＧＡＴＧＧＣＴＡＧＡ ＣＴＡＴＴＴＣＴ ＦＬ５３　配列番号：　４２　５’　ＣＴＧＡＡＴＣＡＧＧＡＧＡＣＣＣＧＧＧ ＧＴＣＴＴＴＧＴＣ 遺伝子１０のインサート ５’　ＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＣＴＡＧＣＡＴＧ ＡＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＡＡＡＴＧＣＡＴＧＣＡＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＴＣ ＴＧＡＴＧ実施例１２ コドンの使用のパターンは、サーモタガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔａｇａｍａ ｒｉｔｉｍａ）と大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）との間で異なるｏ　Ｔｍａコード配 列において、アルギニンはｒ　ＡＧＡＪコドンにより最も頻繁にコードされるが 、このコドンは大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）宿主細胞の中で低い頻度で使用される 。対応するｒＡｒｇＵＪ　ｔＲＮＡは大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）において低い濃 度で現れる。宿主細胞中のＡｒｇｔＲＮＡの低い濃度はＴｍａポリメラーゼ遺伝 子の翻訳効率を制限することがある。大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）宿主内のＴｍａ コード配列の翻訳効率は、ｒＡｒｇＵＪ　ｔＲＮＡのための遺伝子を含有する第 ２発現ベクターを使用して、ｔ　ＲＮＡ遺伝子の多数のコピーを宿主細胞中にク ローニングすることによって、このｔＲＮＡ種の濃度を増加することにより改良 することができる。

ＡｒｇｔＲＮＡ遺伝子を、ブライｖ　−ＤＧ２４８およびＤＣ２８５を使用して 、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。増幅生成物を５ ａｉｌおよびＢｓｐＨ１で消化し、そして次にＡｒｇＵ断片を消化したベクター と連結した。ＤＧＩＯＩ細胞を形質転換し、そして連結したベクターをｐＡＲＧ ｏｌと表示した。Ｒ１後に、ＤＧｌ１６宿主細胞をｐＡＲＧＯｌおよびｐＴｍａ １２−１により同時形質転換した。

この実施例において使用したオリゴヌクレオチドのプライマーを下記および配列 表の節に記載する。

プライマー　配列番号：　配列 ＤＧ２８４　配列番号：　４３　５’　ＣＧＧＧＧＡＴＣＣＡＡＡＡＧＣＣＡＴ ＴＧＡＣＴＣＡＧＡＡＧＧ ＤＧ２８５　配列番号：　４４　５’　ＧＧＧＧＧＴＣＧＡＣＧＣＡＴＧＣＧＡ ＧＧＡＡＡＡＴＡＡＣＧ 国際調査報告 国際調査報告 ＵＳ　９１０５７５３ Ｓ＾　５１０３５ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，Ｓ　識別記号　庁内整理番号（Ｃ１２Ｎ　９／１２ Ｃ１２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｎ　１５１５４ Ｃ１２Ｒ１：０１） （７２）発明者　ストッフエル、スサンヌアメリカ合衆国、カリフォルニア　９ ４５３０゜エル　セリット、ガルビン　ドライブ Ｉ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ユーバクテリウムのサーモタガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔａｇａｍａｒｉ ｔｉｍａ）に由来し、ヌクレオシド三リン酸の結合による、核酸鋳型鎖に対して 相補的である核酸鎖の形成を触媒する、精製された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ Ｉ酵素。 ２．約９７キロダルトン〜１０３キロダルトンの分子量を有する、請求項１に記 載の酵素。 ３．逆転写酵素活性を有する、請求項１に記載の酵素。 ４．３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有する、請求項１に記載の酵素。 ５．自然の形態である、請求項１に記載の酵素。 ６．自然の形態である、請求項２に記載の酵素。 ７．組み換え体の形態である、請求項１に記載の酵素。 ８．組み換え体の形態である、請求項２に記載の酵素。 ９．逆転写酵素活性および３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有する、請求項 ２に記載の酵素。 １０．自然の形態である、請求項９に記載の酵素。 １１．組み換え体の形態である、請求項９に記載の酵素。 １２．工程； （ａ）サーモタガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔａｇａｍａｒｉｔｉｍａ）の細胞 から粗細胞抽出物を調製し、 （ｂ）サーモタガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔａｇａｍａｒｉｔｉｍａ）のＤＮ Ａポリメラーゼが前記抽出物中のすべての核酸から解離するように、前記抽出物 のイオン強度を調節し、 （ｃ）前記抽出物を疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけ、（ｄ）前記抽出 物をＤＮＡ結合性タンパク質アフィニティークロマトグラフィーにかけ、 （ｅ）前記抽出物をヌクレオチド結合性タンパク質のアフィニティークロマトグ ラフィーにかけ、そして（ｆ）前記抽出物をアニオン交換クロマトグラフィー、 カチオン交換クロマトグラフィーおよびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ ーから選択されるクロマトグラフィーにかける、ことを含んでなる、サーモタガ ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔａｇａｍａｒｉｔｉｍａ）の細胞からサーモタガ・ マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔａｇａｍａｒｉｔｉｍａ）ＤＮＡポリメラーゼを精製 する方法。 １３．サーモタガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔａｇａｍａｒｉｔｉｍａ）ＤＮＡ ポリメラーゼＩ活性をコードする組み換えＤＮＡ配列。 １４．アミノ末端からカルボキシ末端への配列番号：Ｉのアミノ酸配列： 【配列があります】 をコードする、請求項１３に記載のＤＮＡ配列。 １５．配列番号：１のＤＮＡ配列： 【配列があります】である、請求項１４に記載のＤＮＡ配列。 １６．請求項１３に記載のＤＮＡ配列を含んでなる組み換えＤＮＡベクタ１７． 請求項１６に記載のベクターで形質転換された組み換え宿主細胞。 １８．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項１７に記載の組み換え宿主細胞。 １９．約８６キロダルトンの分子量を有し、組み換え体の形態である、請求項１ に記載の酵素。 ２０．約７０キロダルトンの分子量を有し、組み換え体の形態である、請求項１ に記載の酵素。 ２１．配列番号：１のアミノ酸番号１４０〜８９３をコードする、請求項１３に 記載のＤＮＡ配列。 ２２．配列番号：１のヌクレオシド番号４１８〜２６８２である、請求項２１に 記載のＤＮＡ配列。 ２３．配列番号：１のアミノ酸番号２８４〜８９３をコードする、ＤＮＡ配列。 ２４．配列番号：１のヌクレオシド番号８５０〜２６８２である、請求項２３に 記載のＤＮＡ配列。