JPH0532024B2 - - Google Patents
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- JPH0532024B2 JPH0532024B2 JP59034910A JP3491084A JPH0532024B2 JP H0532024 B2 JPH0532024 B2 JP H0532024B2 JP 59034910 A JP59034910 A JP 59034910A JP 3491084 A JP3491084 A JP 3491084A JP H0532024 B2 JPH0532024 B2 JP H0532024B2
- Authority
- JP
- Japan
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- plasmid
- alanine dehydrogenase
- heat
- dna
- picr301
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
- C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
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- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
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- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は耐熱性のＬ−アラニン脱水素酵素生産
能を有する新規なエシエリチア・コリに関するも
のである。
能を有する新規なエシエリチア・コリに関するも
のである。
Ｌ−アラニン脱水素酵素は、臨床検査や食品分
析のＬ−アラニンの定量やＬ−アラニンの酵素合
成等を利用される非常に重要な酵素である。この
Ｌ−アラニン脱水素酵素を生産できる微生物とし
ては、常温菌であるバチルス・スフエリカス
（Bacillus sphaericus）のようなバチルス属の細
菌が知られている。しかし、これらの菌より得ら
れるＬ−アラニン脱水素酵素は、室温の水溶液中
で１〜３週間のうちに活性をほとんどを失うのが
通例であり、熱安定性及び長期の安定性に欠ける
ものであるという大きな欠点を有している。
析のＬ−アラニンの定量やＬ−アラニンの酵素合
成等を利用される非常に重要な酵素である。この
Ｌ−アラニン脱水素酵素を生産できる微生物とし
ては、常温菌であるバチルス・スフエリカス
（Bacillus sphaericus）のようなバチルス属の細
菌が知られている。しかし、これらの菌より得ら
れるＬ−アラニン脱水素酵素は、室温の水溶液中
で１〜３週間のうちに活性をほとんどを失うのが
通例であり、熱安定性及び長期の安定性に欠ける
ものであるという大きな欠点を有している。
それゆえ、Ｌ−アラニン脱水素酵素を用いる臨
床検査の分析法等の利点を最大限に発揮するうえ
で、熱に安定で、室温で長時間活性を失わないＬ
−アライン脱水素酵素の出現が熱望されていた。
床検査の分析法等の利点を最大限に発揮するうえ
で、熱に安定で、室温で長時間活性を失わないＬ
−アライン脱水素酵素の出現が熱望されていた。
このため、バイオケミカ・エト・バイオフイジ
カ・アクタ（Biochem.Biophys.Acta.）615、34
〜47（1980）には、サーマス（Thermus）属に属
する細菌から熱に安定で、室温で長時間活性を失
わない耐熱性のＬ−アラニン脱水素酵素が得られ
ることが記載されている。
カ・アクタ（Biochem.Biophys.Acta.）615、34
〜47（1980）には、サーマス（Thermus）属に属
する細菌から熱に安定で、室温で長時間活性を失
わない耐熱性のＬ−アラニン脱水素酵素が得られ
ることが記載されている。
しかし、この好熱性のサーマス属に属する細菌
は、耐熱性のＬ−アラニン脱水素酵素の生産性が
低く、この酵素を効率良く得るには、十分満足で
きるものではなかつた。
は、耐熱性のＬ−アラニン脱水素酵素の生産性が
低く、この酵素を効率良く得るには、十分満足で
きるものではなかつた。
一方、エシエリチア（Escherichia）属に属す
る細菌は、本来Ｌ−アラニン脱水素酵素生産能を
全く有していない。
る細菌は、本来Ｌ−アラニン脱水素酵素生産能を
全く有していない。
近年、遺伝子組み換え技術により異種生物の蛋
白質を大腸菌で生産し得るようになつており、ま
た、組換DNA遺伝子工学に有用なプラスミド及
びそれによつて形質転換された微生物は良く知ら
れている。例えば、サイエンス（Science）198
巻、1056頁（1978年）には、プラスミドpBR322
にラクトースプロモーターをつないだプラスミド
を導入した大腸菌内で動物タンパク質が生産され
ることが記載されている。
白質を大腸菌で生産し得るようになつており、ま
た、組換DNA遺伝子工学に有用なプラスミド及
びそれによつて形質転換された微生物は良く知ら
れている。例えば、サイエンス（Science）198
巻、1056頁（1978年）には、プラスミドpBR322
にラクトースプロモーターをつないだプラスミド
を導入した大腸菌内で動物タンパク質が生産され
ることが記載されている。
また、特開昭56−5093号公報には、サーマス属
に属する細菌の遺伝子を有するプラスミド（ベク
ターとしてプラスミドPBR322が用いられてい
る。）を導入することにより形質転換されたエシ
エリチア（Escherichia）属に属する細菌を用い
て耐熱性の酵素を調製することが記載されている
が、耐熱性のＬ−アラニン脱水素酵素の遺伝子を
有するプラスミド及びそれによつて形質転換され
た微生物については、全く何も記載されていない
し、またその創製に成功したとの報告もなされて
いない。
に属する細菌の遺伝子を有するプラスミド（ベク
ターとしてプラスミドPBR322が用いられてい
る。）を導入することにより形質転換されたエシ
エリチア（Escherichia）属に属する細菌を用い
て耐熱性の酵素を調製することが記載されている
が、耐熱性のＬ−アラニン脱水素酵素の遺伝子を
有するプラスミド及びそれによつて形質転換され
た微生物については、全く何も記載されていない
し、またその創製に成功したとの報告もなされて
いない。
そこで、本発明者らは、耐熱性のＬ−アラニン
脱水素酵素を効率良く生産しうることのできる微
生物を求めて鋭意研究した結果、耐熱性のＬ−ア
ラニン脱水素酵素の遺伝子を有するプラスミドで
形質転換されたエシエリチア・コリが大量の耐熱
性のＬ−アラニン脱水素酵素を生産することを見
いだし、本発明を完成した。
脱水素酵素を効率良く生産しうることのできる微
生物を求めて鋭意研究した結果、耐熱性のＬ−ア
ラニン脱水素酵素の遺伝子を有するプラスミドで
形質転換されたエシエリチア・コリが大量の耐熱
性のＬ−アラニン脱水素酵素を生産することを見
いだし、本発明を完成した。
すなわち、本発明は好熱性のバチルス属に属す
る細菌由来の耐熱性のＬ−アラニン脱水素酵素の
遺伝子を有するプラスミドで形質転換された耐熱
性のＬ−アラニン脱水素酵素生産能を有するエシ
エリチア・コリである。
る細菌由来の耐熱性のＬ−アラニン脱水素酵素の
遺伝子を有するプラスミドで形質転換された耐熱
性のＬ−アラニン脱水素酵素生産能を有するエシ
エリチア・コリである。
本発明に用いられるプラスミドを得るには、例
えばバイオケミカ・エト・バイオフイジカ・アク
タ（Biochem.Biophys.Acta.）72、619〜629
（1963）に記載の方法を従い、耐熱性のＬ−アラ
ニン脱水素酵素の遺伝子を含む染色体DNA断片
を取得し、取得した遺伝子とベクターとしての役
割を有するDNAとジヤーナル・オブ・モレキユ
ラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）96、171〜
184（1975）に記載の方法に従い、制限酵素で消化
し、次いでリガーゼを用いて結合することにより
調製することができる。
えばバイオケミカ・エト・バイオフイジカ・アク
タ（Biochem.Biophys.Acta.）72、619〜629
（1963）に記載の方法を従い、耐熱性のＬ−アラ
ニン脱水素酵素の遺伝子を含む染色体DNA断片
を取得し、取得した遺伝子とベクターとしての役
割を有するDNAとジヤーナル・オブ・モレキユ
ラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）96、171〜
184（1975）に記載の方法に従い、制限酵素で消化
し、次いでリガーゼを用いて結合することにより
調製することができる。
本発明に好ましく用いられる耐熱性のＬ−アラ
ニン脱水素酵素の遺伝子としては、好熱性のバチ
ルス属に属する細菌の染色体DNA由来のＬ−ア
ラニン脱水素酵素の遺伝子があげられる。この好
熱性の微生物としては、好熱性のバチルス属に属
する細菌であることが必要である。その中でもＬ
−アラニン脱水素酵素の活性が高いバチルス・ス
テアロサーモフイルス
（Bacillusstearothermophilus）が好ましい。ス
テアロサーモフイルスの具体例としては、
IFO12550、ATCC7953、7954、8005、10149、
12980、NCA1503などがある。
ニン脱水素酵素の遺伝子としては、好熱性のバチ
ルス属に属する細菌の染色体DNA由来のＬ−ア
ラニン脱水素酵素の遺伝子があげられる。この好
熱性の微生物としては、好熱性のバチルス属に属
する細菌であることが必要である。その中でもＬ
−アラニン脱水素酵素の活性が高いバチルス・ス
テアロサーモフイルス
（Bacillusstearothermophilus）が好ましい。ス
テアロサーモフイルスの具体例としては、
IFO12550、ATCC7953、7954、8005、10149、
12980、NCA1503などがある。
また、ベクターとしての役割を有するDNAと
しては、プラスミドDNAが必要であり、リガー
ゼとしては、例えばT4DNAリガーゼがあげられ
る。
しては、プラスミドDNAが必要であり、リガー
ゼとしては、例えばT4DNAリガーゼがあげられ
る。
本発明で用いられるプラスミドとしては、前記
した方法でプラスミドpBR322に、バチルス・ス
テアロサ−モフイルスの染色体DNA由来のＬ−
アラニン脱水素酵素の遺伝子を導入したプラスミ
ドpICR3及びpICR301があげられる。このプラス
ミドpICR3及びpICR301を昭和59年２月14日に通
産省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託の手
続を行つたが、このプラスミドは受託さなかつ
た。
した方法でプラスミドpBR322に、バチルス・ス
テアロサ−モフイルスの染色体DNA由来のＬ−
アラニン脱水素酵素の遺伝子を導入したプラスミ
ドpICR3及びpICR301があげられる。このプラス
ミドpICR3及びpICR301を昭和59年２月14日に通
産省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託の手
続を行つたが、このプラスミドは受託さなかつ
た。
次にこのプラスミドpICR3及びpICR301の理化
学的性質を示す。
学的性質を示す。
(1) 常温微生物内で耐熱性のＬ−アラニン脱水素
酵素を発現させることができる。
酵素を発現させることができる。
(2) 下記制限酵素に対し、次の切断感受性を有す
る。
る。
制限酵素 切断部位数
pICR3 pICR301
EcoR ２ ２
Hind ２ １
Sal ４ ３
制限酵素の名称は、次の菌種から得られる制
限酵素の略称である。
限酵素の略称である。
EcoR ；エシエリチア・コリ
Hind ；ヘモフイラス・インフルエンザ
Sal ；ストレプトマイセス・アルブス
制限酵素による切断部位数は、過剰の制限酵
素存在下でプラスミドpICR3及びpICR301を消
化し、その消化物をアガロ−スゲル電気泳動に
かけ、分離可能な断片の数から決定される。
素存在下でプラスミドpICR3及びpICR301を消
化し、その消化物をアガロ−スゲル電気泳動に
かけ、分離可能な断片の数から決定される。
(3) 分子量
プラスミドpICR3は約７メガダルトンであ
り、pICR301は約５メガダルトンである。
り、pICR301は約５メガダルトンである。
(4) プラスミドpICR301は、プラスミドpICR3の
Ｌ−アラニン脱水素酵素遺伝子をそのままに
し、それ以外のものを一部取り除いて小型化し
たプラスミドで、このプラスミドが導入された
エシエリチア・コリC600-pICR301株のＬ−ア
ラニン脱水素酵素活性が、プラスミドpICR3が
導入されたエシエリチア・コリC600pICR3株
の活性よりも約３倍高い値を示す。
Ｌ−アラニン脱水素酵素遺伝子をそのままに
し、それ以外のものを一部取り除いて小型化し
たプラスミドで、このプラスミドが導入された
エシエリチア・コリC600-pICR301株のＬ−ア
ラニン脱水素酵素活性が、プラスミドpICR3が
導入されたエシエリチア・コリC600pICR3株
の活性よりも約３倍高い値を示す。
このプラスミドpICR3及びpICR301を用いてエ
シエリチア・コリを形質転換させるには、例えば
ジヤーナル・オブ・モレキユラ・バイオロジー
（J.Mol.Biol）53、159〜162（1970）の方法に従つ
て、０℃付近の温度で塩化カルシウム処理した上
記のエシエリチア・コリC600とプラスミド
pICR3又はpICR301とを接触させることにより行
えばよい。
シエリチア・コリを形質転換させるには、例えば
ジヤーナル・オブ・モレキユラ・バイオロジー
（J.Mol.Biol）53、159〜162（1970）の方法に従つ
て、０℃付近の温度で塩化カルシウム処理した上
記のエシエリチア・コリC600とプラスミド
pICR3又はpICR301とを接触させることにより行
えばよい。
以上のようにして形質転換されたエシエリチ
ア・コリの例として、プラスミドpICR3又は
pICR301が導入されたエシエリチア・コリC600
−pICR3又はC600−pICR301株があげられる。こ
の菌体は、公知のエシエリチア・コリC600
〔Nature217、1110〜1114（1968）を参照〕と、耐
熱性のＬ−アラニン脱水素酵素生産能及びアンピ
シリン耐性を有する点以外は同じ菌学的性質を有
している。この菌株は、非伝達性を伝達性に変え
ることなく、また非病原性を病原性に変えること
なく安全性が保持されている。従来、耐熱性のＬ
−アラニン脱水素酵素生産能を有するエシエリチ
ア・コリの報告はなかつた。このことから、エシ
エリチア・コリC600−pICR3又はC600−
pICR301株は新菌株であると考えられるので昭和
59年２月14日に通産省工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託した。その微生物受託番号はそれぞ
れ第7447号及び第7448号である。
ア・コリの例として、プラスミドpICR3又は
pICR301が導入されたエシエリチア・コリC600
−pICR3又はC600−pICR301株があげられる。こ
の菌体は、公知のエシエリチア・コリC600
〔Nature217、1110〜1114（1968）を参照〕と、耐
熱性のＬ−アラニン脱水素酵素生産能及びアンピ
シリン耐性を有する点以外は同じ菌学的性質を有
している。この菌株は、非伝達性を伝達性に変え
ることなく、また非病原性を病原性に変えること
なく安全性が保持されている。従来、耐熱性のＬ
−アラニン脱水素酵素生産能を有するエシエリチ
ア・コリの報告はなかつた。このことから、エシ
エリチア・コリC600−pICR3又はC600−
pICR301株は新菌株であると考えられるので昭和
59年２月14日に通産省工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託した。その微生物受託番号はそれぞ
れ第7447号及び第7448号である。
本発明のエシエリチア・コリを培養するに際し
て用いられる栄養培地の炭素源として、例えばグ
ルコース、シユークロース、フルクトース、澱粉
加水分解物、糖密、亜硫酸パルプ廃液の糖類、酢
酸、乳酸などの有機酸類、さらには使用する細菌
が資化しうるアルコール類、脂肪酸及びグリセリ
ンなどが使用でき、窒素源として、例えば硫酸ア
ンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニ
ウム、アミノ酸、ペプトン、肉エキス、酵母エキ
スなどの無機又は有機物が使用できる。さらに、
無機塩類として、例えばカリウム、ナトリウム、
リン酸、亜鉛、鉄、マグネシウム、マンガン、
銅、カルシウム、コバルトなどの各塩類、必要に
応じて微量金属塩、コーン・ステイープ・リカ
ー、ビタミン類、核酸などを使用してもよく、細
菌の一般的栄養培地が使用できる。
て用いられる栄養培地の炭素源として、例えばグ
ルコース、シユークロース、フルクトース、澱粉
加水分解物、糖密、亜硫酸パルプ廃液の糖類、酢
酸、乳酸などの有機酸類、さらには使用する細菌
が資化しうるアルコール類、脂肪酸及びグリセリ
ンなどが使用でき、窒素源として、例えば硫酸ア
ンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニ
ウム、アミノ酸、ペプトン、肉エキス、酵母エキ
スなどの無機又は有機物が使用できる。さらに、
無機塩類として、例えばカリウム、ナトリウム、
リン酸、亜鉛、鉄、マグネシウム、マンガン、
銅、カルシウム、コバルトなどの各塩類、必要に
応じて微量金属塩、コーン・ステイープ・リカ
ー、ビタミン類、核酸などを使用してもよく、細
菌の一般的栄養培地が使用できる。
これらの培地を用いて、本発明のエシエリチ
ア・コリを20℃〜45℃、好ましくは35℃〜40℃、
最適には37℃で約３〜24時間、PHを6.5〜8.0、最
適には7.2で好気的に培養すればよい。
ア・コリを20℃〜45℃、好ましくは35℃〜40℃、
最適には37℃で約３〜24時間、PHを6.5〜8.0、最
適には7.2で好気的に培養すればよい。
このようにして得られた培養物は、そのまま耐
熱性のＬ−アラニン脱水素酵素の酵素源として使
用できるが、粗酵素抽出液、精製酵素はもちろん
分離生菌体、分離菌体の処理物も酵素源として使
用可能である。次に得られた培養物から本発明に
おける耐熱性のＬ−アラニン脱水素酵素が採取さ
れるが、培養物、分離生菌体、分離菌体の処理、
粗酵素抽出液、精製酵素などのあらゆる段階で採
取できる。その際の精製法としては、通常の酵素
精製法を用いることができる。特に本発明では、
耐熱性のＬ−アラニン脱水素酵素を採取するに先
立つて、破砕液を加熱処理すれば、耐熱性を有し
ない酵素や蛋白質が熱変性することにより選択的
に耐熱性のＬ−アラニン脱水素酵素が得られるの
で有利である。この加熱処理の条件としては、例
えば50〜80℃の温度で10〜60分間処理すればよ
い。このようにして処理した後、分離精製して耐
熱性のＬ−アラニン脱水素酵素を得てもよいが、
そのまま酵素液としても利用できる。
熱性のＬ−アラニン脱水素酵素の酵素源として使
用できるが、粗酵素抽出液、精製酵素はもちろん
分離生菌体、分離菌体の処理物も酵素源として使
用可能である。次に得られた培養物から本発明に
おける耐熱性のＬ−アラニン脱水素酵素が採取さ
れるが、培養物、分離生菌体、分離菌体の処理、
粗酵素抽出液、精製酵素などのあらゆる段階で採
取できる。その際の精製法としては、通常の酵素
精製法を用いることができる。特に本発明では、
耐熱性のＬ−アラニン脱水素酵素を採取するに先
立つて、破砕液を加熱処理すれば、耐熱性を有し
ない酵素や蛋白質が熱変性することにより選択的
に耐熱性のＬ−アラニン脱水素酵素が得られるの
で有利である。この加熱処理の条件としては、例
えば50〜80℃の温度で10〜60分間処理すればよ
い。このようにして処理した後、分離精製して耐
熱性のＬ−アラニン脱水素酵素を得てもよいが、
そのまま酵素液としても利用できる。
本発明のエシエリチア・コリは、耐熱性のＬ−
アラニン脱水素酵素を大量に、しかも容易に得る
ことができるので、非常に有用である。
アラニン脱水素酵素を大量に、しかも容易に得る
ことができるので、非常に有用である。
次に本発明を実施例により具体的に説明する。
なお、耐熱性のＬ−アラニン脱水素酵素の活性
は、ヨーロピアン・ジヤーナル・オブ・バイオケ
ミストリー〔Eur.J.Biochem、100、29−30
（1979）〕に記載されているＬ−アラニン脱水素酵
素活性の測定法、すなわちPH11.3の100μmoleの
グリシン−KCl−KOH緩衝液中で、1.25μmoleの
NADと、10μmoleのＬ−アラニンを含む混合液
を調製し、その混合液に適当量の粗酵素抽出液を
加えて、最終容量を0.8mlとし、25℃あるいは55
℃における還元型NADの単位時間あたりの増加
を340nｍの吸光度の増加として測定する方法で
行つた。
は、ヨーロピアン・ジヤーナル・オブ・バイオケ
ミストリー〔Eur.J.Biochem、100、29−30
（1979）〕に記載されているＬ−アラニン脱水素酵
素活性の測定法、すなわちPH11.3の100μmoleの
グリシン−KCl−KOH緩衝液中で、1.25μmoleの
NADと、10μmoleのＬ−アラニンを含む混合液
を調製し、その混合液に適当量の粗酵素抽出液を
加えて、最終容量を0.8mlとし、25℃あるいは55
℃における還元型NADの単位時間あたりの増加
を340nｍの吸光度の増加として測定する方法で
行つた。
また、実施例及び参考例中の％は、容量％を示
す。
す。
参考例 １、２
(a) バチルス・ステアロサ−モフイルスの染色体
DNAの分離。
DNAの分離。
バチルス・ステアロサ−モフイルス
IFO12550株から、バイオケミカ・エト・バイ
オフイジカ・アクタ（Biochem Biophys
Acta）72、619〜629（1963）に記載の方法に準
じ、染色体DNAを分離した。
IFO12550株から、バイオケミカ・エト・バイ
オフイジカ・アクタ（Biochem Biophys
Acta）72、619〜629（1963）に記載の方法に準
じ、染色体DNAを分離した。
まず、バチルス・ステアロサーモフイルス
IFOK2550株をグリセロール培地（ポリペプト
ン10ｇ／、酵母エキス2.5ｇ／、肉エキス
２ｇ／、グリセロール２ｇ／、塩化ナトリ
ウム５ｇ／、リン酸２カリウム２ｇ／、硫
酸マグネシウム0.1ｇ／、ビオチン4μｇ／、
そしてPH7.2に調製）２で、55℃で12時間振
とう培養した後、遠心分離にて集菌した。
IFOK2550株をグリセロール培地（ポリペプト
ン10ｇ／、酵母エキス2.5ｇ／、肉エキス
２ｇ／、グリセロール２ｇ／、塩化ナトリ
ウム５ｇ／、リン酸２カリウム２ｇ／、硫
酸マグネシウム0.1ｇ／、ビオチン4μｇ／、
そしてPH7.2に調製）２で、55℃で12時間振
とう培養した後、遠心分離にて集菌した。
次に12mgのリゾチームを６mlのサリン
（saline）−EDTA溶液（0.15M NaClと0.1M
EDTAを含み、PH8.0に調製。）に溶かし、この
溶液に集菌した菌株を加え、よく撹拌した。こ
れを37℃で約10分間加温し、菌体が溶菌し始め
たところで、直ちに凍結した。
（saline）−EDTA溶液（0.15M NaClと0.1M
EDTAを含み、PH8.0に調製。）に溶かし、この
溶液に集菌した菌株を加え、よく撹拌した。こ
れを37℃で約10分間加温し、菌体が溶菌し始め
たところで、直ちに凍結した。
この凍結した菌体に50mlのトリス−SDS緩衝
液（10mg／mlのSDSと0.1M NaClを含むPH9.0
に調製された0.1Mトリス緩衝液。）を加えて撹
拌し、さらに60℃に加温し、完全に溶菌させ
た。
液（10mg／mlのSDSと0.1M NaClを含むPH9.0
に調製された0.1Mトリス緩衝液。）を加えて撹
拌し、さらに60℃に加温し、完全に溶菌させ
た。
この溶菌液に56mlの80％フエノールを加え
て、約20分間振とうさせ、フエノール抽出を行
い、夾雑蛋白質を除去した。この抽出された粗
DNA溶液に２倍容量の冷エタノールを加えて
ガラス棒で繊維状の沈殿を巻き取り、70、80、
90％のエタノール各10ml中に順次、数分ずつ浸
漬した後、20mlの希サリン−サイトレート
（saline−citrate）溶液（0.015M NaCl、０、
0015M Na3−クエン酸に調製。）に溶かし、さ
らに濃saline−citrate溶液（1.5M NaCl、
0.15M Na3−クエン酸に調製。）を２ml加え
て、粗DNA液を調製した。
て、約20分間振とうさせ、フエノール抽出を行
い、夾雑蛋白質を除去した。この抽出された粗
DNA溶液に２倍容量の冷エタノールを加えて
ガラス棒で繊維状の沈殿を巻き取り、70、80、
90％のエタノール各10ml中に順次、数分ずつ浸
漬した後、20mlの希サリン−サイトレート
（saline−citrate）溶液（0.015M NaCl、０、
0015M Na3−クエン酸に調製。）に溶かし、さ
らに濃saline−citrate溶液（1.5M NaCl、
0.15M Na3−クエン酸に調製。）を２ml加え
て、粗DNA液を調製した。
この粗DNA液を500μｇ／ml位にうすめて、
リボヌクレアーゼ〔Ｒ Nase Ａ（シグマ社
製）〕を50μｇ／mlになるように加え、37℃で
30分間加温した。冷却後、等量の80％フエノー
ルを加え、フエノール抽出を行に、抽出DNA
をエタノール沈殿にて回収し、さらに上記の希
saline−citrate溶液20mlに溶解し、さらに上記
の濃saline−citrate溶液を２ml加えることによ
り、染色体DNAの抽出液を調製した。
リボヌクレアーゼ〔Ｒ Nase Ａ（シグマ社
製）〕を50μｇ／mlになるように加え、37℃で
30分間加温した。冷却後、等量の80％フエノー
ルを加え、フエノール抽出を行に、抽出DNA
をエタノール沈殿にて回収し、さらに上記の希
saline−citrate溶液20mlに溶解し、さらに上記
の濃saline−citrate溶液を２ml加えることによ
り、染色体DNAの抽出液を調製した。
(b) ベクタ−プラスミドpBR322の調製。
プラスミツドpBR322（Bethesda Research
Laboratories社製）を導入したエシエリチア・
コリC600株を、２のＬ−培地（ポリペプト
ン10ｇ／、酵母エキス５ｇ／、グルコース
１ｇ／、塩化ナトリウム５ｇ／を加え、PH
7.2に調製。）で対数増殖前期になるまで37℃で
好気培養した後、10mlのクロラムフエニコール
溶液（3.6mg／mlとなるようにエタノールで調
製。）を添加し、さらに37℃で15分間通気培養
してプラスミドpBR322を増殖させた。
Laboratories社製）を導入したエシエリチア・
コリC600株を、２のＬ−培地（ポリペプト
ン10ｇ／、酵母エキス５ｇ／、グルコース
１ｇ／、塩化ナトリウム５ｇ／を加え、PH
7.2に調製。）で対数増殖前期になるまで37℃で
好気培養した後、10mlのクロラムフエニコール
溶液（3.6mg／mlとなるようにエタノールで調
製。）を添加し、さらに37℃で15分間通気培養
してプラスミドpBR322を増殖させた。
次に遠心分離にて集菌した菌を80mlのTE−
シユクロース緩衝液（20％シユクロース、20ｍ
Ｍ EDTAを含み、PH8.0に調製された0.05M
トリス緩衝液。）に懸濁し、さらに８mlのリゾ
チーム溶液（５mg／mlとなるように上記TE−
シユクロース緩衝液にて調製。）を添加し、さ
らに28mlの5M NaCl溶液と４mlの40mg／mlの
SDS溶液を加えた。
シユクロース緩衝液（20％シユクロース、20ｍ
Ｍ EDTAを含み、PH8.0に調製された0.05M
トリス緩衝液。）に懸濁し、さらに８mlのリゾ
チーム溶液（５mg／mlとなるように上記TE−
シユクロース緩衝液にて調製。）を添加し、さ
らに28mlの5M NaCl溶液と４mlの40mg／mlの
SDS溶液を加えた。
この混合液を37℃で２時間反応させ、さらに
０℃で約15時間保つた後、遠心分離にて粗プラ
スミドDNAを分離した。
０℃で約15時間保つた後、遠心分離にて粗プラ
スミドDNAを分離した。
次に、1/2容量の80％フエノールを加えてフ
エノール処理を行い、夾雑蛋白質を除去した。
この抽出した粗プラスミドを冷イソプロパノー
ルにて沈殿回収し、さらにTE緩衝液（0.14M
MaCl、１ｍＭ EDTAを含む、PH7.5に調製さ
れた20ｍＭトリス緩衝液。）に溶解した。この
混合液に２mgのＲ Nase Ａを添加し、37℃で
２時間反応させ、上記と同様の方法でフエノー
ル処理にて夾雑RNAを除去した。この抽出さ
れた粗プラスミドを２倍容量のエタノール沈殿
にて回収した。これを、さらに10mlの上記の
TE緩衝液に溶解し、アガロースゲル濾過にて
夾雑RNAをさらに除去し、得られた粗DNAを
エタノール沈殿にて再び回収した。
エノール処理を行い、夾雑蛋白質を除去した。
この抽出した粗プラスミドを冷イソプロパノー
ルにて沈殿回収し、さらにTE緩衝液（0.14M
MaCl、１ｍＭ EDTAを含む、PH7.5に調製さ
れた20ｍＭトリス緩衝液。）に溶解した。この
混合液に２mgのＲ Nase Ａを添加し、37℃で
２時間反応させ、上記と同様の方法でフエノー
ル処理にて夾雑RNAを除去した。この抽出さ
れた粗プラスミドを２倍容量のエタノール沈殿
にて回収した。これを、さらに10mlの上記の
TE緩衝液に溶解し、アガロースゲル濾過にて
夾雑RNAをさらに除去し、得られた粗DNAを
エタノール沈殿にて再び回収した。
この沈殿を23.1mlの0.02Mトリス緩衝液（PH
8.0に調製。）に溶解し、さらに23.7ｇの塩化セ
シウムと0.6mlのエチジウムブロマイド溶液
（10mg／mlに調製。）を加え、約40時間超遠心す
ることにより、プラスミドDNAを分離し、次
にノルマルブタノールにより、エチジウムブロ
マイドを除去した。この分離したプラスミドを
0.01MのTE緩衝液（0.1mM EDTAを含むPH
7.5に調製された0.01Mトリス緩衝液。）で透析
することにより、精製プラスミドpBR322を得
た。
8.0に調製。）に溶解し、さらに23.7ｇの塩化セ
シウムと0.6mlのエチジウムブロマイド溶液
（10mg／mlに調製。）を加え、約40時間超遠心す
ることにより、プラスミドDNAを分離し、次
にノルマルブタノールにより、エチジウムブロ
マイドを除去した。この分離したプラスミドを
0.01MのTE緩衝液（0.1mM EDTAを含むPH
7.5に調製された0.01Mトリス緩衝液。）で透析
することにより、精製プラスミドpBR322を得
た。
(c) プラスミドpICR3の創製（参考例１）。
(a)の方法で得られたバチルス・ステアロサー
モフイルスの染色体DNA5μｇと制限酵素Sal
（宝酒造社製）20ユニツトを、７ｍＭ
MgCl2、150ｍＭ NaCl、0.2ｍＭ EDTA、
７ｍＭ ２−メルカプトエタノール、0.1mg／
mlBSAを含むPH7.5に調製した10ｍＭトリス緩
衝液100μに入れ、37℃で2.5時間反応させて
DNAを消化させた後、65℃で５分間加熱し、
Salを不活性化し、冷エタノールにて消化
DNA断片を沈殿回収した。
モフイルスの染色体DNA5μｇと制限酵素Sal
（宝酒造社製）20ユニツトを、７ｍＭ
MgCl2、150ｍＭ NaCl、0.2ｍＭ EDTA、
７ｍＭ ２−メルカプトエタノール、0.1mg／
mlBSAを含むPH7.5に調製した10ｍＭトリス緩
衝液100μに入れ、37℃で2.5時間反応させて
DNAを消化させた後、65℃で５分間加熱し、
Salを不活性化し、冷エタノールにて消化
DNA断片を沈殿回収した。
次に、(b)の方法で得られたプラスミド
pBR322 1μｇに制限酵素Sal３ユニツトを加
え、上記と同様の緩衝液中で37℃で10時間反応
させ、上記と同様の方法で消化プラスミド
DNAを回収した。こうして得られた消化染色
体及びプラスミドのDNAを混合し、T4DNA
リガーゼ（宝酒造社製）を用い、6.6ｍＭ
MgCl2、10ｍＭ DTT、66μM ATP を含む
PH7.6に調製した66ｍＭトリス緩衝液中で、13
℃で19時間反応させ、消化DNAを再結合する
ことにより、プラスミドpICR3を得た。
pBR322 1μｇに制限酵素Sal３ユニツトを加
え、上記と同様の緩衝液中で37℃で10時間反応
させ、上記と同様の方法で消化プラスミド
DNAを回収した。こうして得られた消化染色
体及びプラスミドのDNAを混合し、T4DNA
リガーゼ（宝酒造社製）を用い、6.6ｍＭ
MgCl2、10ｍＭ DTT、66μM ATP を含む
PH7.6に調製した66ｍＭトリス緩衝液中で、13
℃で19時間反応させ、消化DNAを再結合する
ことにより、プラスミドpICR3を得た。
(d) プラスミドpICR301創製（参考例２）。
(c)の方法にて創製されたプラスミドpICR3の
1μｇを制限酵素Hind３ユニツトを加え、７
ｍＭのMgCl2および60ｍＭのNaClを含むPH7.5
に調製した10ｍＭトリス緩衝液10μに入れ、
37℃で10時間反応させたのち、(c)と同様の方法
にて消化DNAを回収し、T4DNAリガーゼに
て再結合させたことにより、プラスミド
pICR301を得た。
1μｇを制限酵素Hind３ユニツトを加え、７
ｍＭのMgCl2および60ｍＭのNaClを含むPH7.5
に調製した10ｍＭトリス緩衝液10μに入れ、
37℃で10時間反応させたのち、(c)と同様の方法
にて消化DNAを回収し、T4DNAリガーゼに
て再結合させたことにより、プラスミド
pICR301を得た。
実施例 １、２
参考例１で得たプラスミドpICR3（実施例１）
及びpICR301（実施例２）を用いてエシエリチ
ア・コリの形質転換を行つた。
及びpICR301（実施例２）を用いてエシエリチ
ア・コリの形質転換を行つた。
まず、宿主菌のエシエリチア・コリC600r-m-
株を50mlの上記のＬ−倍地にて培養し、遠心分離
にて集菌後、50mlの0.1M MgCl2溶液に懸濁し、
さらに遠心分離を行つて最終的には2.5mlの0.1M
MgCl2溶液に懸濁させた。
株を50mlの上記のＬ−倍地にて培養し、遠心分離
にて集菌後、50mlの0.1M MgCl2溶液に懸濁し、
さらに遠心分離を行つて最終的には2.5mlの0.1M
MgCl2溶液に懸濁させた。
このようにして得られたエシエリチア・コリ
C600r-m-株の懸濁液0.2mlに(c)又は(d)の方法で得
られたプラスミドpICR3又はpICR301を含む混合
物を0.1ml加え、０℃で30分間処理したのち、42
℃で２分間処理した。
C600r-m-株の懸濁液0.2mlに(c)又は(d)の方法で得
られたプラスミドpICR3又はpICR301を含む混合
物を0.1ml加え、０℃で30分間処理したのち、42
℃で２分間処理した。
次にこれに３mlの前記したＬ−培地を加え、37
℃で１時間培養し、さらにアンピシリン（15μ
ｇ／mlに調製。）の入つたＬ−寒天培地（Ｌ−培
地１当り、15ｇの寒天を加えたもの。）で37℃
で培養後、生じたコロニーを、さらにテトラサイ
クリン（25μｇ／mlに調製。）の入つたＬ−寒天
培地で培養後、生えてこないコロニ−をProc
Natl.Acad.Sci.USA、72、2274−2278（1975）に
記載の方法に従い、濾紙上に分離し、NBT（ニト
ロブル−テトラゾリウム）及びPMS（フエナジン
メソサルフエート）を含む反応液にて反応させる
ことにより、Ｌ−アラニン脱水素酵素活性を有す
るコロニーを見出すことにより、プラスミド
pICR3又はpICR301の導入されたエシエリチア・
コリC600−pICR3又はpICR301が得られた。
℃で１時間培養し、さらにアンピシリン（15μ
ｇ／mlに調製。）の入つたＬ−寒天培地（Ｌ−培
地１当り、15ｇの寒天を加えたもの。）で37℃
で培養後、生じたコロニーを、さらにテトラサイ
クリン（25μｇ／mlに調製。）の入つたＬ−寒天
培地で培養後、生えてこないコロニ−をProc
Natl.Acad.Sci.USA、72、2274−2278（1975）に
記載の方法に従い、濾紙上に分離し、NBT（ニト
ロブル−テトラゾリウム）及びPMS（フエナジン
メソサルフエート）を含む反応液にて反応させる
ことにより、Ｌ−アラニン脱水素酵素活性を有す
るコロニーを見出すことにより、プラスミド
pICR3又はpICR301の導入されたエシエリチア・
コリC600−pICR3又はpICR301が得られた。
次にこうして得られたエシエリチア・コリ
C600−pICR3又はpICR301のコロニーより、アン
ピシリン（15μｇ／mlに調製。）の入つた上記の
グリセロール培地100mlで37℃で16時間、振とう
培養を行つた。これを遠心分離にて集菌、洗浄
後、５mlの0.01％２−メルカプトエタノールを含
み、PH7.4に調製した0.01Mのリン酸緩衝液に懸
濁し、０℃で５分間の超音波処理にて菌体を破砕
し、遠心分離にて粗酵素抽出液を得た。
C600−pICR3又はpICR301のコロニーより、アン
ピシリン（15μｇ／mlに調製。）の入つた上記の
グリセロール培地100mlで37℃で16時間、振とう
培養を行つた。これを遠心分離にて集菌、洗浄
後、５mlの0.01％２−メルカプトエタノールを含
み、PH7.4に調製した0.01Mのリン酸緩衝液に懸
濁し、０℃で５分間の超音波処理にて菌体を破砕
し、遠心分離にて粗酵素抽出液を得た。
このようにして得た粗酵素抽出液の耐熱性のＬ
−アラニン脱水素酵素の活性を測定したところ、
エシエリチア・コリC600pICR3株では、0.8ユニ
ツト／mgプロテインで、エシエリチア・コリ
C600-pICR301株では、2.4ユニツト／mg・プロテ
インであつた。これはDNA供与菌であるバチル
ス・ステアロサーモフイルスIFO12550株のＬ−
アラニン脱水素酵素の活性（0.070ユニツト／
mg・プロテイン）よりもそれぞれ10倍ないし30倍
以上の値であつた。
−アラニン脱水素酵素の活性を測定したところ、
エシエリチア・コリC600pICR3株では、0.8ユニ
ツト／mgプロテインで、エシエリチア・コリ
C600-pICR301株では、2.4ユニツト／mg・プロテ
インであつた。これはDNA供与菌であるバチル
ス・ステアロサーモフイルスIFO12550株のＬ−
アラニン脱水素酵素の活性（0.070ユニツト／
mg・プロテイン）よりもそれぞれ10倍ないし30倍
以上の値であつた。
また、このＬ−アラニン脱水素酵素を含む粗酵
素抽出液は、２−メルカプトエタノールを0.1
mg／ml含むPH7.2の10ｍＭリン酸緩衝液中、70℃
で60分間加熱処理したところ、80％以上の残存活
性を有していた。
素抽出液は、２−メルカプトエタノールを0.1
mg／ml含むPH7.2の10ｍＭリン酸緩衝液中、70℃
で60分間加熱処理したところ、80％以上の残存活
性を有していた。
参考例 ３
実施例１で得たエシエリチア・コリC600−
pICR301株をアンピシリン（15μｇ／mlに調製。）
を含む前記グリセロール培地100mlにて37℃で15
時間振とう培養した。培養後、遠心分離にて集菌
し、0.01％の２−メルチカプトエタノールを含む
PH7.4に調製した0.01Mリン酸緩衝液５mlに懸濁
し、約５分間の超音波処理で菌体を破砕した。
pICR301株をアンピシリン（15μｇ／mlに調製。）
を含む前記グリセロール培地100mlにて37℃で15
時間振とう培養した。培養後、遠心分離にて集菌
し、0.01％の２−メルチカプトエタノールを含む
PH7.4に調製した0.01Mリン酸緩衝液５mlに懸濁
し、約５分間の超音波処理で菌体を破砕した。
その後、遠心分離にて粗酵素抽出液を得、その
粗酵素抽出液を70℃で30分間熱処理した後、遠心
分離し、その上澄液のＬ−アラニン脱水素酵素活
性を測定したところ、12.0ユニツト／mg・プロテ
インの活性があり、粗酵素抽出液を70℃で30分間
熱処理することにより、熱処理前に比べて比活性
が約５倍向上した。これは、元のバチルス・ステ
アロサ−モフイルスIFO12550株のＬ−アラニン
脱水粗酵素の粗酵素液の比活性に比べて、約150
倍に相当するものであつた。
粗酵素抽出液を70℃で30分間熱処理した後、遠心
分離し、その上澄液のＬ−アラニン脱水素酵素活
性を測定したところ、12.0ユニツト／mg・プロテ
インの活性があり、粗酵素抽出液を70℃で30分間
熱処理することにより、熱処理前に比べて比活性
が約５倍向上した。これは、元のバチルス・ステ
アロサ−モフイルスIFO12550株のＬ−アラニン
脱水粗酵素の粗酵素液の比活性に比べて、約150
倍に相当するものであつた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 好熱性のバチルス属に属する細菌由来の耐熱
性のＬ−アラニン脱水素酵素の遺伝子を有するプ
ラスミドで形質転換された耐熱性のＬ−アラニン
脱水素酵素生産能を有するエシエリチア・コリ
（Escherichia coli）。 ２ 好熱性のバチルス属に属する細菌由来の耐熱
性のＬ−アラニン脱水素酵素の遺伝子が、好熱性
のバチルス属に属する細菌の染色体DNA由来の
Ｌ−アラニン脱水素酵素の遺伝子である特許請求
の範囲第１項記載のエシエリチア・コリ。 ３ 好熱性のバチルス属に属する細菌が、バチル
ス・ステアロサーモフイルス（Bacillus
stearothermophilus）である特許請求の範囲第１
項記載のエシエリチア・コリ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59034910A JPS60180580A (ja) | 1984-02-24 | 1984-02-24 | エシエリチア・コリ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59034910A JPS60180580A (ja) | 1984-02-24 | 1984-02-24 | エシエリチア・コリ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60180580A JPS60180580A (ja) | 1985-09-14 |
| JPH0532024B2 true JPH0532024B2 (ja) | 1993-05-14 |
Family
ID=12427354
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59034910A Granted JPS60180580A (ja) | 1984-02-24 | 1984-02-24 | エシエリチア・コリ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60180580A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2672845B2 (ja) * | 1988-09-27 | 1997-11-05 | 旭化成工業株式会社 | Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼの製造法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS565093A (en) * | 1979-06-22 | 1981-01-20 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | Preparation of heat-resistant enzyme |
| JPS5955186A (ja) * | 1982-09-21 | 1984-03-30 | Amano Pharmaceut Co Ltd | 耐熱性酵素の取得法 |
-
1984
- 1984-02-24 JP JP59034910A patent/JPS60180580A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60180580A (ja) | 1985-09-14 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |