JPH0357746B2 - - Google Patents
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- JPH0357746B2 JPH0357746B2 JP58036306A JP3630683A JPH0357746B2 JP H0357746 B2 JPH0357746 B2 JP H0357746B2 JP 58036306 A JP58036306 A JP 58036306A JP 3630683 A JP3630683 A JP 3630683A JP H0357746 B2 JPH0357746 B2 JP H0357746B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
- C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は耐熱性のロイシン脱水素酵素生産能を
有する新規なエシエリチア・コリに関するもので
ある。 ロイシン脱水素酵素は、臨床検査用酵素とし
て、非常に重要な酵素である。このロイシン脱水
素酵素を生産できる微生物としては、常温菌であ
るバチルス、スフエリカス（Bacillus
sphaericus）のようなバチルス属の細菌が知られ
ている。しかし、これらの菌より得られるロイシ
ン脱水素酵素は、室温の水溶液中で１〜３週間の
うちに活性をほとんど失うのが通例であり、熱安
定性及び長期の安定性に欠けるものであるという
大きな欠点を有している。 それゆえ、ロイシン脱水素酵素を用いる臨床検
査の分析法の利点を最大限に発揮するうえで、熱
に安定で、室温で長時間活性を失わないロイシン
脱水素酵素の出現が熱望されていた。 このため、先に本発明者らの一部がこのような
観点から、熱に安定で、長時間活性を失わない性
質を有するロイシン脱水素酵素を求めて鋭意研究
した結果、好熱性のバチルス属に属する細菌に上
記の性質を有するロイシン脱水素酵素が存在する
ことを見いだし、特許出願し、さらに生化学、
Vol54第634頁（1982年）に発表した。 しかし、この好熱性のバチルス属に属する細菌
は、耐熱性のロイシン脱水素酵素の生産性が低
く、この酵素を効率良く得るには、十分満足する
ものでなかつた。 一方、エシエリチア・（Escherichia）属に属す
る細菌は、本来ロイシン脱水素酵素生産能を全く
有していない。 また、組換DNA遺伝子工学に有用なプラスミ
ド及びそれによつて形質転換された微生物は良く
知られている。例えばサイエンス（Science）198
巻、1056頁（1978年）には、プラスミドPBR322
にラクトースプロモータをつないだプラスミドを
導入した大腸菌内で動物タンパク質が生産される
ことが記載されている。 また、特開昭56−5093号公報には、サーマス属
に属する細菌の遺伝子を有するプラスミド（ベク
ターとしてプラスミドPBR322が用いられてい
る。）を導入することにより形質転換されたエシ
エリチア（Escherichia）属に属する細菌を用い
て耐熱性の酵素を調製することが記載されている
が、耐熱性のロイシン脱水素酵素の遺伝子を有す
るプラスミド及びそれによつて形質転換された微
生物については、全く何も記載されていないし、
またその創製に成功したとの報告もなされていな
い。 そこで、本発明者らは、耐熱性のロイシン脱水
素酵素を効率良く生産しうることのできる微生物
を求めて鋭意研究した結果、耐熱性のロイシン脱
水素酵素の遺伝子を有するプラスミドで形質転換
されたエシエリチア・コリが大量の耐熱性のロイ
シン脱水素酵素を生産することを見いだし、本発
明を完成した。 すなわち、本発明はバチルス・ステアロサーモ
フイルス（Bacillus stearothermophilus）の染
色体DNA由来の耐熱性のロイシン脱水素酵素の
遺伝子を有するプラスミドで形質転換された耐熱
性のロイシン脱水素酵素生産能を有するエシエリ
チア・コリ（Escherichia coli）を要旨とするも
のである。 本発明に用いられるプラスミドを得るには、例
えばバイオケミカ・エト・バイオフイジカ・アク
タ（Biochem.Biophysacta）72，619〜629
（1963）に記載の方法に従い、耐熱性のロイシン
脱水素酵素の遺伝子とベクターとしての役割を有
するDNAとを制限酵素で消化し、次いでリガー
ゼを用いて結合することにより調製することがで
きる。 本発明に用いられる耐熱性ロイシン脱水素酵素
の遺伝子としては、バチルス・ステアロサーモフ
イルス（Bacillus stearothermophilus）の染色
体DNA由来のロイシン脱水素酵素の遺伝子があ
げられる。バチルス・ステアロサーモフイルスの
具体例としては、IFO12550，ATCC7953，7954，
8005，10194，12980，NCA1503などがある。 また、ベクターとしての役割を有するDNAと
しては、例えばプラミスドDNAがあげられ、特
にプラスミドpBR322が好ましい。また制限酵素
としては、例えばSal があげられ、リガーゼ
としては、例えばT4DNAリガーゼがあげられ
る。 本発明で好ましく用いられるプラミスドとして
は、前記した方法でプラミスドpBR322に、バチ
ルス・ステアロサーモフイルスの染色体DNA由
来のロイシン脱水素酵素の遺伝子を導入したプラ
スミドpICR1があげられる。このプラスミド
pICR1を昭和58年２月23日に通産省工業技術院微
生物工業技術研究所に寄託の手続を行つたが、こ
のプラスミドは受託されなかつた。 次にこのプラスミドpICR1の理化学的性質を示
す。 (1) 常温微生物内で耐熱性のロイシン脱水素酵素
を発現させることができる。 (2) 下記制限酵素に対し、次の切断感受性を有す
る。 制限酵素 切断部位数 EcoR ２ Hind １ Pst ２ Sal ４ BamH ２ 制限酵素の名称は、次の菌種から得られる制
限酵素の略称である。 EcoR；エシエリチア・コリ Hind；ヘモフイラス・インフルエンザ Pst ；プロビデンシア・スチユアーテイー Sal ；ストレプトマイセス・アルブス BamH；バチルス・アミロリクエフアシエ
ンス 制限酵素による切断部位数は、過剰の制限酵
素存在下でプラスミドpICR1を消化し、その消
化物をアガロースゲル電気泳動にかけ、分離可
能な断片の数から決定される。 (3) 分子量は約６メガダルトンである。 このプラミスドpICR1を用いてエシエリチア・
コリを形質転換させるには、例えばジヤーナル・
オブ・モレキユラ・バイオロジー（J.Mol.Biol）
53，159〜162（1970）の方法に従つて、０℃付近
の温度で塩化カルシウム処理した上記のエシエリ
チア・コリC600とプラスミドpICR1とを接触さ
せることにより行えばよい。 以上のようにして形質転換されたエシエリチ
ア・コリの例として、プラスミドpICR1が導入さ
れたエシエリチア・コリC600−pICR1株があげ
られる。この菌株は、公知のエシエリチア・コリ
C600〔Nature217，1110〜1114（1968）を参照〕
と、耐熱性のロイシン脱水素酵素生産能及びアン
ピシリン耐性を有する点以外は同じ菌学的性質を
有している。この菌株は、非伝達性を伝達性に変
えることなく、また非病原性を病原性に変えるこ
となく安全性に保持されている。特に、耐熱性の
ロイシン脱水素酵素生産能を有するエシエリチ
ア・コリの報告はなかつた。このことから、エシ
エリチア・コリC600−pICR1株は新菌株である
と考えられるので、昭和58年２月26日に通産省工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託した。その
微生物受託番号は第6937号である。 本発明のエシエリチア・コリを培養するに際し
て用いられる栄養培地の炭素源として、例えばグ
ルコース、シユークロース、フルクトース、澱粉
加水分解物、糖密、亜硫酸パルプ廃液の糖類、酢
酸、乳酸などの有機酸類、さらには使用する細菌
が資化しうるアルコール類、脂肪酸及びグリセリ
ンなどが使用でき、窒素源として、例えば硫酸ア
ンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニ
ウム、アミノ酸、ペプトン、肉エキス、酵母エキ
スなどの無機又は有機物が使用できる。さらに、
無機塩類として、例えばカリウム、ナトリウム、
リン酸、亜鉛、鉄、マグネシウム、マンガン、
銅、カルシウム、コバルナなどの各塩類、必要に
応じて微量金属塩、コーン・ステイープ・リカ
ー，ビタミン類、核酸などを使用してもよく、細
菌の一般的栄養培地が使用できる。 これらの培地を用いて、本発明のエシエリチ
ア・コリを20℃〜45℃、好ましくは35℃〜40℃、
最適には37℃で約10〜20時間、PHを7.0〜7.4、最
適には、7.2で好気的に培養すればよい。 このようにして得られた培養物は、そのまま耐
熱性のロイシン脱水素酵素の酵素源として使用で
きるが、粗酵素抽出液、精製酵素はもちろん分離
生菌体、分離菌体の処理物も酵素源として使用可
能である。次に得られた培養物から本発明におけ
る耐熱性のロイシン脱水素酵素が採取されるが、
培養物、分離生菌体、分離菌体の処理物、粗酵素
抽出液、精製酵素などのあらゆる段階で採取でき
る。その際の精製法としては、通常の酵素精製法
を用いることができる。特に本発明では、耐熱性
のロイシン脱水素酵素を採取するに先立つて、破
砕液を加熱処理すれば、耐熱性を有しない酵素や
蛋白質が熱変性することにより選択的に耐熱性の
ロイシン脱水素酵素が得られるので有利である。
この加熱処理の条件としては、例えば50〜80℃の
温度で５〜30分間処理すればよい。このようにし
て処理した後、分離精製して耐熱性のロイシン脱
水素酵素を得てもよいが、そのまま酵素液として
利用できる。 本発明のエシエリチア・コリは、耐熱性のロイ
シン脱水素酵素を大量に、しかも容易に得ること
ができるので、非常に有用である。 本発明によつて得られる耐熱性のロイシン脱水
素酵素は、生化学、Vol，54、第634頁（1982年）
は記載の耐熱性のロイシン脱水素酵素と同じ理化
学的性質を有する。 次に本発明を実施例により具体的に説明する。 なお、耐熱性のロイシン脱水素酵素の活性は、
アミノ酸、核酸〔Amino Acid and
NucleicAcid27，84〜88（1973）〕に記載されてい
るロイシン脱水素酵素活性の測定法、すなわちPH
11.3の100μmoleのグリシン−KC1−KOH緩衝液
中で、1.25μmoleのNADと、10μmoleのＬ−ロイ
シンを含む混合液を調製し、その混合液に適当量
の粗酵素抽出液を加えて、最終容量を0.8mlとし、
25℃あるいは55℃における還元型NADの単位時
間あたりの増加を340nmの吸光度の増加として測
定する方法で行つた。 また、実施例及び参考例中の％は、容量％を示
す。 参考例 １ (a) バチルス・ステアロサーモフイルスの染色体
DNAの分離。 バチルス・ステアロサーモフイルス
IFO12550株から、バイオケミカ・エト・バイ
オフイジカ・アクタ（Biochem Biophys
acta）72，619〜629（1963）に記載の方法に準
じ、染色体DNAを分離した。 まず、バチルス・ステアロサーモフイルス
IFO12250株をグリセロール培地（ポリペプト
ン10ｇ／、酵母エキス2.5ｇ／、肉エキス
２ｇ／、グリセロール２ｇ／、塩化ナトリ
ウム５ｇ／、リン酸２カリウム２ｇ／、硫
酸マグネシウム0.1ｇ／、ビオチン4μｇ／、
そしてPH7.21に調製）２で、55℃で12時間振
とう培養した後、遠心分離にて集菌した。 次に12mgのリゾチームを６mlのサリン
（saline）−EDTA溶液（0.15M NaClと0.1M
EDTAを含み、PH8.0に調製。）に溶かし、この
溶液に集菌した菌株を加え、よく攪拌した。こ
れを37℃で約10分間加温し、菌体が溶菌し始め
たら、直ちに凍結した。 この凍結した菌体に50mlのトリス−SDS緩衝
液10mg／mlSDSと0.1M NaClを含むPH9.0に調
製された0.1Mトリス衝衝液。）を加えて攪拌
し、さらに60℃に加温し、完全に溶菌させた。 この溶菌液に56mlの80％フエノールを加え
て、約20分間振とうさせ、フエノール抽出を行
い、夾雑蛋白質を除去した。この抽出された粗
DNA溶液に２倍容量の冷エタノールを加えて
ガラス棒で繊維状の沈澱を巻き取り、70，80，
90％のエタノール各10ml中に順次、数分ずつ浸
漬した後、20mlの希サリン−サイトトレート
（saline−citrate）溶液（0.015M NaCl，０，
0015M Na3−クエン酸に調製。）に溶かし、さ
らに濃saline−citrate溶液（1.5M NaCl，
0.15M Na3−クエン酸に調製。）を２ml加え
て、粗DNA液を調製した。 この粗、DNA液を500μｇ／ml位にうすめ
て、リポヌクレアーゼ〔Ｒ NaseA（シグマ社
製）〕を50μｇ／ml，Ｒ NaseT1（シグマ社製）
を30μｇ／mlになるように加え、37℃で30分間
加温した。冷却後、等量の80％フエノールを加
え、フエノール抽出を行い、抽出DNAをエタ
ノール沈殿にて回収し、さらに上記の希saline
−citrate溶液20mlに溶解させ、さらに上記の
濃saline−citrate溶液を２ml加えることによ
り、染色体DNAの抽出液を調製した。 (b) ベクタープラスミツドpBR322の調製。 プラスミツドpBR322（Batheada Research
Laboratories社製）を導入したエシエリチア・
コリC600株を、２のＬ−培地（ポリペプト
ン10ｇ／、酵母エキス５ｇ／、グリコース
１ｇ／、塩化ナトリウム５ｇ／でPH7.2に
調製。）で対数増殖前期になるまで37℃で通気
培養した後、10mlのクロラムフエニコール溶液
（3.6mg／mlとなるようにエタノールで調製。）
を添加し、さらに37℃で15分間通気培養してプ
ラスミドpBR322を増殖させた。 次に遠心分離にて集菌した菌を80mlのTE−
シユクロース緩衝液200mg／mlシユクロース、
20mM EDTAを含み、PH8.0に調製された
0.05Mトリス緩衝液。）に懸濁し、さらに８ml
のリゾチーム溶液（５mg／mlとなるように上記
TE−シユクロース緩衝液にて調製。）を添加
し、さらに28mlの5M NaCl溶液と４mlの40
mg／mlSDS溶液を加えた。 この混合液を27℃で２時間反応させた後、遠
心分離にて粗プラスミドDNAを分離した。 次に、1/2容量の80％フエノールを加えてフ
エノール処理を行い、夾雑蛋白質を除去した。
この抽出した粗プラスミドを冷イソプロパノー
ルにて沈殿回収し、さらにTE緩衝液（0.14M
MaCl，1mM EDTAを含む、PH7.5に調製され
た20mMトリス緩衝液。）に溶解した。この混
合液に２mgのＲ Naseを添加し、37℃で２時
間反応させ、上記と同様の方法でフエノール処
理にて夾雑RNAを除去した。この抽出された
粗プラスミドを２倍容量のエタノール沈殿にて
回収した。これを、さらに10mlの上記のTE緩
衝液に溶解させ、アガロースゲル濾過にて夾雑
RNAをさらに除去し、得られた粗DNAをエタ
ノール沈殿に再び回収した。 この沈殿を23.1mlの0.02Mトリス緩衝液（PH
8.0に調製。）に溶解し、さらに23.7ｇの塩化セ
シウムと0.6mlのエチジウムブロマイド溶液
（10mg／mlに調製。）を加え、約40時間超遠心す
ることにより、プラスミドDNAを分離し、次
にノマルブタノールにより、エチジウムブロマ
イドを除去した。この分離したプラスミドを
0.01MのTE緩衝液（0.1mM EDTAを含むPH
7.5に調製された0.01Mトリス緩衝液。）で透析
することにより、精製プラスミドpBR322を得
た。 (c) プラスミドpICR1の創製。 (a)の方法で得られたバチルス・ステアロサー
モフイルスの染色体DNA5μｇと制限酵素sal
（宝酒造社製）20ユニツトを、7mM MgCl2，
150mM NaCl，0.2mM EDTA，7mM2−メチ
ルカプトエタノール、0.01％BSAを含むPH7.5
に調製した10mMトリス緩衝液100μに入れ、
37℃で2.5時間反応させてDNAを消化させた
後、65℃で５分間加熱し、Salを不性化し、
冷エタノールにて消て消化DNA断片を沈殿回
収した。 次に、(b)の方法で得られたプラスミド
pBR3221μｇに制限酵素Sal３ユニツトを加
え、上記と同様の緩衝液中で37℃で10時間反応
させ、上記と同様の方法で消化プラスミド
DNAを回収した。こうして得られた消化染色
体及びプラスミドのDNAを混合し、T4DNA
リガーゼ（宝酒造社製）を用い、6.6mM
MgCl2，10mM DTT，66μM ATPを含むPH
7.6に調製した66mMトリス緩衝液中で、13℃
で19時間反応させ、消化DNAを再結合するこ
とにより、プラスミドpICR1を得た。 実施例 １ 参考例１で得たプラスミドpICR1を用いてエシ
エリチア・コリの形質転換を行つた。 まず、宿主菌のエシエリチア・コリC600r-m-
株を50mlの上記のＬ−培地に培養し、遠心分離に
て集菌後、50mlの0.1M MgCl2溶液に懸濁し、さ
らに遠心分離を行つて最終的には2.5mlの0.1M
MgCl2溶液に懸濁させた。 このようにして得られたエシエリチア・コリ
C600rm株の懸濁液0.2mlに(c)の方法で得られたプ
ラスミドpICR1を含む混合物を0.1ml加え、０℃
で30分間処理したのち、42℃で２分間処理した。 次にこれに３mlの前記したＬ−培地を加え、37
℃で１時間培養し、さらにアンピシリン（15μ
ｇ／mlに調製。）の入つたＬ−寒天培地（Ｌ−培
地１当り、15ｇの寒天を加えたもの。）で37℃
で培養後、生じたコローニを、さらにテトラサイ
クリン（25μｇ／mlの調製。）の入つたＬ−寒天
培地で培養後、生えてこないコロミーを見出すこ
とにより、プラスミドpIC1の導入されたエシエ
リチア・コリC600−pICR1が得られた。 次にこうして得られたエシエリチア・コリ
C600−pICR1のコロニーより、アンピシリン
（15μｇ／mlに調製。）の入つた上記のグリセロー
ル培地100mlで37℃で16時間、振とう培養を行つ
た。これを遠心分離にて集菌、洗浄後、５mlの
0.01％２−メルカプトエタノールを含み、PH7.4
に調製した0.01Mのリン酸緩衝液に懸濁し、０℃
で５分間の超音波処理にて菌体を破砕し、遠心分
離にて粗酵素抽出液を得た。 このようにして得た粗酵素抽出液の耐熱性のロ
イシン脱水素酵素の活性を測定したところ、
0.201ユニツト／mg・プロテインであつた。これ
はDNA供与菌であるバチルス・ステアロサーモ
フイルスIFO12250株のロイシン脱水素酵素の活
性（0.010ユニツト／mg・プロテイン）よりも10
倍以の活性があつた。 また、このロイシン脱水素酵素を含む粗酵素抽
出液は、２−メルカプトエタノールを0.01％含む
PH7.2の10mMリン酸緩衝液中、70℃で20分間加
熱処理したところ、80％以上の残存活性を有して
いた。 参考例 ２ 実施例１で得たエシエリチア・コリCC600−
pICR1株をアンピシリン（15μｇ／mlに調製。）を
含む前記グリセロール培地100mlにて37℃で15時
間振とう培養した。培養後、遠心分離にて集菌
し、0.01％の２−メルカプトエタノールを含むPH
7.4に調製した0.01Mリン酸緩衝液５mlに懸濁し、
約５分間の超音波処理で菌体を破砕した。 その後、遠心分離にて粗酵素抽出液を得、その
粗酵素抽出液を70℃で30分間熱処理した後、遠心
分離し、その上澄液のロイシン脱水素酵素活性を
測定したところ、0.800ユニツト／mg・プロテイ
ンの活性があり、粗酵素抽出液を70℃で30分間熱
処理することにより、熱処理前に比べて比活性が
約４倍向上した。これは、元のバチルス・ステア
ロサーモフイルスIFO12550のロイシン脱水素酵
素の比活性に比べて、約40倍に相当するものであ
つた。
有する新規なエシエリチア・コリに関するもので
ある。 ロイシン脱水素酵素は、臨床検査用酵素とし
て、非常に重要な酵素である。このロイシン脱水
素酵素を生産できる微生物としては、常温菌であ
るバチルス、スフエリカス（Bacillus
sphaericus）のようなバチルス属の細菌が知られ
ている。しかし、これらの菌より得られるロイシ
ン脱水素酵素は、室温の水溶液中で１〜３週間の
うちに活性をほとんど失うのが通例であり、熱安
定性及び長期の安定性に欠けるものであるという
大きな欠点を有している。 それゆえ、ロイシン脱水素酵素を用いる臨床検
査の分析法の利点を最大限に発揮するうえで、熱
に安定で、室温で長時間活性を失わないロイシン
脱水素酵素の出現が熱望されていた。 このため、先に本発明者らの一部がこのような
観点から、熱に安定で、長時間活性を失わない性
質を有するロイシン脱水素酵素を求めて鋭意研究
した結果、好熱性のバチルス属に属する細菌に上
記の性質を有するロイシン脱水素酵素が存在する
ことを見いだし、特許出願し、さらに生化学、
Vol54第634頁（1982年）に発表した。 しかし、この好熱性のバチルス属に属する細菌
は、耐熱性のロイシン脱水素酵素の生産性が低
く、この酵素を効率良く得るには、十分満足する
ものでなかつた。 一方、エシエリチア・（Escherichia）属に属す
る細菌は、本来ロイシン脱水素酵素生産能を全く
有していない。 また、組換DNA遺伝子工学に有用なプラスミ
ド及びそれによつて形質転換された微生物は良く
知られている。例えばサイエンス（Science）198
巻、1056頁（1978年）には、プラスミドPBR322
にラクトースプロモータをつないだプラスミドを
導入した大腸菌内で動物タンパク質が生産される
ことが記載されている。 また、特開昭56−5093号公報には、サーマス属
に属する細菌の遺伝子を有するプラスミド（ベク
ターとしてプラスミドPBR322が用いられてい
る。）を導入することにより形質転換されたエシ
エリチア（Escherichia）属に属する細菌を用い
て耐熱性の酵素を調製することが記載されている
が、耐熱性のロイシン脱水素酵素の遺伝子を有す
るプラスミド及びそれによつて形質転換された微
生物については、全く何も記載されていないし、
またその創製に成功したとの報告もなされていな
い。 そこで、本発明者らは、耐熱性のロイシン脱水
素酵素を効率良く生産しうることのできる微生物
を求めて鋭意研究した結果、耐熱性のロイシン脱
水素酵素の遺伝子を有するプラスミドで形質転換
されたエシエリチア・コリが大量の耐熱性のロイ
シン脱水素酵素を生産することを見いだし、本発
明を完成した。 すなわち、本発明はバチルス・ステアロサーモ
フイルス（Bacillus stearothermophilus）の染
色体DNA由来の耐熱性のロイシン脱水素酵素の
遺伝子を有するプラスミドで形質転換された耐熱
性のロイシン脱水素酵素生産能を有するエシエリ
チア・コリ（Escherichia coli）を要旨とするも
のである。 本発明に用いられるプラスミドを得るには、例
えばバイオケミカ・エト・バイオフイジカ・アク
タ（Biochem.Biophysacta）72，619〜629
（1963）に記載の方法に従い、耐熱性のロイシン
脱水素酵素の遺伝子とベクターとしての役割を有
するDNAとを制限酵素で消化し、次いでリガー
ゼを用いて結合することにより調製することがで
きる。 本発明に用いられる耐熱性ロイシン脱水素酵素
の遺伝子としては、バチルス・ステアロサーモフ
イルス（Bacillus stearothermophilus）の染色
体DNA由来のロイシン脱水素酵素の遺伝子があ
げられる。バチルス・ステアロサーモフイルスの
具体例としては、IFO12550，ATCC7953，7954，
8005，10194，12980，NCA1503などがある。 また、ベクターとしての役割を有するDNAと
しては、例えばプラミスドDNAがあげられ、特
にプラスミドpBR322が好ましい。また制限酵素
としては、例えばSal があげられ、リガーゼ
としては、例えばT4DNAリガーゼがあげられ
る。 本発明で好ましく用いられるプラミスドとして
は、前記した方法でプラミスドpBR322に、バチ
ルス・ステアロサーモフイルスの染色体DNA由
来のロイシン脱水素酵素の遺伝子を導入したプラ
スミドpICR1があげられる。このプラスミド
pICR1を昭和58年２月23日に通産省工業技術院微
生物工業技術研究所に寄託の手続を行つたが、こ
のプラスミドは受託されなかつた。 次にこのプラスミドpICR1の理化学的性質を示
す。 (1) 常温微生物内で耐熱性のロイシン脱水素酵素
を発現させることができる。 (2) 下記制限酵素に対し、次の切断感受性を有す
る。 制限酵素 切断部位数 EcoR ２ Hind １ Pst ２ Sal ４ BamH ２ 制限酵素の名称は、次の菌種から得られる制
限酵素の略称である。 EcoR；エシエリチア・コリ Hind；ヘモフイラス・インフルエンザ Pst ；プロビデンシア・スチユアーテイー Sal ；ストレプトマイセス・アルブス BamH；バチルス・アミロリクエフアシエ
ンス 制限酵素による切断部位数は、過剰の制限酵
素存在下でプラスミドpICR1を消化し、その消
化物をアガロースゲル電気泳動にかけ、分離可
能な断片の数から決定される。 (3) 分子量は約６メガダルトンである。 このプラミスドpICR1を用いてエシエリチア・
コリを形質転換させるには、例えばジヤーナル・
オブ・モレキユラ・バイオロジー（J.Mol.Biol）
53，159〜162（1970）の方法に従つて、０℃付近
の温度で塩化カルシウム処理した上記のエシエリ
チア・コリC600とプラスミドpICR1とを接触さ
せることにより行えばよい。 以上のようにして形質転換されたエシエリチ
ア・コリの例として、プラスミドpICR1が導入さ
れたエシエリチア・コリC600−pICR1株があげ
られる。この菌株は、公知のエシエリチア・コリ
C600〔Nature217，1110〜1114（1968）を参照〕
と、耐熱性のロイシン脱水素酵素生産能及びアン
ピシリン耐性を有する点以外は同じ菌学的性質を
有している。この菌株は、非伝達性を伝達性に変
えることなく、また非病原性を病原性に変えるこ
となく安全性に保持されている。特に、耐熱性の
ロイシン脱水素酵素生産能を有するエシエリチ
ア・コリの報告はなかつた。このことから、エシ
エリチア・コリC600−pICR1株は新菌株である
と考えられるので、昭和58年２月26日に通産省工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託した。その
微生物受託番号は第6937号である。 本発明のエシエリチア・コリを培養するに際し
て用いられる栄養培地の炭素源として、例えばグ
ルコース、シユークロース、フルクトース、澱粉
加水分解物、糖密、亜硫酸パルプ廃液の糖類、酢
酸、乳酸などの有機酸類、さらには使用する細菌
が資化しうるアルコール類、脂肪酸及びグリセリ
ンなどが使用でき、窒素源として、例えば硫酸ア
ンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニ
ウム、アミノ酸、ペプトン、肉エキス、酵母エキ
スなどの無機又は有機物が使用できる。さらに、
無機塩類として、例えばカリウム、ナトリウム、
リン酸、亜鉛、鉄、マグネシウム、マンガン、
銅、カルシウム、コバルナなどの各塩類、必要に
応じて微量金属塩、コーン・ステイープ・リカ
ー，ビタミン類、核酸などを使用してもよく、細
菌の一般的栄養培地が使用できる。 これらの培地を用いて、本発明のエシエリチ
ア・コリを20℃〜45℃、好ましくは35℃〜40℃、
最適には37℃で約10〜20時間、PHを7.0〜7.4、最
適には、7.2で好気的に培養すればよい。 このようにして得られた培養物は、そのまま耐
熱性のロイシン脱水素酵素の酵素源として使用で
きるが、粗酵素抽出液、精製酵素はもちろん分離
生菌体、分離菌体の処理物も酵素源として使用可
能である。次に得られた培養物から本発明におけ
る耐熱性のロイシン脱水素酵素が採取されるが、
培養物、分離生菌体、分離菌体の処理物、粗酵素
抽出液、精製酵素などのあらゆる段階で採取でき
る。その際の精製法としては、通常の酵素精製法
を用いることができる。特に本発明では、耐熱性
のロイシン脱水素酵素を採取するに先立つて、破
砕液を加熱処理すれば、耐熱性を有しない酵素や
蛋白質が熱変性することにより選択的に耐熱性の
ロイシン脱水素酵素が得られるので有利である。
この加熱処理の条件としては、例えば50〜80℃の
温度で５〜30分間処理すればよい。このようにし
て処理した後、分離精製して耐熱性のロイシン脱
水素酵素を得てもよいが、そのまま酵素液として
利用できる。 本発明のエシエリチア・コリは、耐熱性のロイ
シン脱水素酵素を大量に、しかも容易に得ること
ができるので、非常に有用である。 本発明によつて得られる耐熱性のロイシン脱水
素酵素は、生化学、Vol，54、第634頁（1982年）
は記載の耐熱性のロイシン脱水素酵素と同じ理化
学的性質を有する。 次に本発明を実施例により具体的に説明する。 なお、耐熱性のロイシン脱水素酵素の活性は、
アミノ酸、核酸〔Amino Acid and
NucleicAcid27，84〜88（1973）〕に記載されてい
るロイシン脱水素酵素活性の測定法、すなわちPH
11.3の100μmoleのグリシン−KC1−KOH緩衝液
中で、1.25μmoleのNADと、10μmoleのＬ−ロイ
シンを含む混合液を調製し、その混合液に適当量
の粗酵素抽出液を加えて、最終容量を0.8mlとし、
25℃あるいは55℃における還元型NADの単位時
間あたりの増加を340nmの吸光度の増加として測
定する方法で行つた。 また、実施例及び参考例中の％は、容量％を示
す。 参考例 １ (a) バチルス・ステアロサーモフイルスの染色体
DNAの分離。 バチルス・ステアロサーモフイルス
IFO12550株から、バイオケミカ・エト・バイ
オフイジカ・アクタ（Biochem Biophys
acta）72，619〜629（1963）に記載の方法に準
じ、染色体DNAを分離した。 まず、バチルス・ステアロサーモフイルス
IFO12250株をグリセロール培地（ポリペプト
ン10ｇ／、酵母エキス2.5ｇ／、肉エキス
２ｇ／、グリセロール２ｇ／、塩化ナトリ
ウム５ｇ／、リン酸２カリウム２ｇ／、硫
酸マグネシウム0.1ｇ／、ビオチン4μｇ／、
そしてPH7.21に調製）２で、55℃で12時間振
とう培養した後、遠心分離にて集菌した。 次に12mgのリゾチームを６mlのサリン
（saline）−EDTA溶液（0.15M NaClと0.1M
EDTAを含み、PH8.0に調製。）に溶かし、この
溶液に集菌した菌株を加え、よく攪拌した。こ
れを37℃で約10分間加温し、菌体が溶菌し始め
たら、直ちに凍結した。 この凍結した菌体に50mlのトリス−SDS緩衝
液10mg／mlSDSと0.1M NaClを含むPH9.0に調
製された0.1Mトリス衝衝液。）を加えて攪拌
し、さらに60℃に加温し、完全に溶菌させた。 この溶菌液に56mlの80％フエノールを加え
て、約20分間振とうさせ、フエノール抽出を行
い、夾雑蛋白質を除去した。この抽出された粗
DNA溶液に２倍容量の冷エタノールを加えて
ガラス棒で繊維状の沈澱を巻き取り、70，80，
90％のエタノール各10ml中に順次、数分ずつ浸
漬した後、20mlの希サリン−サイトトレート
（saline−citrate）溶液（0.015M NaCl，０，
0015M Na3−クエン酸に調製。）に溶かし、さ
らに濃saline−citrate溶液（1.5M NaCl，
0.15M Na3−クエン酸に調製。）を２ml加え
て、粗DNA液を調製した。 この粗、DNA液を500μｇ／ml位にうすめ
て、リポヌクレアーゼ〔Ｒ NaseA（シグマ社
製）〕を50μｇ／ml，Ｒ NaseT1（シグマ社製）
を30μｇ／mlになるように加え、37℃で30分間
加温した。冷却後、等量の80％フエノールを加
え、フエノール抽出を行い、抽出DNAをエタ
ノール沈殿にて回収し、さらに上記の希saline
−citrate溶液20mlに溶解させ、さらに上記の
濃saline−citrate溶液を２ml加えることによ
り、染色体DNAの抽出液を調製した。 (b) ベクタープラスミツドpBR322の調製。 プラスミツドpBR322（Batheada Research
Laboratories社製）を導入したエシエリチア・
コリC600株を、２のＬ−培地（ポリペプト
ン10ｇ／、酵母エキス５ｇ／、グリコース
１ｇ／、塩化ナトリウム５ｇ／でPH7.2に
調製。）で対数増殖前期になるまで37℃で通気
培養した後、10mlのクロラムフエニコール溶液
（3.6mg／mlとなるようにエタノールで調製。）
を添加し、さらに37℃で15分間通気培養してプ
ラスミドpBR322を増殖させた。 次に遠心分離にて集菌した菌を80mlのTE−
シユクロース緩衝液200mg／mlシユクロース、
20mM EDTAを含み、PH8.0に調製された
0.05Mトリス緩衝液。）に懸濁し、さらに８ml
のリゾチーム溶液（５mg／mlとなるように上記
TE−シユクロース緩衝液にて調製。）を添加
し、さらに28mlの5M NaCl溶液と４mlの40
mg／mlSDS溶液を加えた。 この混合液を27℃で２時間反応させた後、遠
心分離にて粗プラスミドDNAを分離した。 次に、1/2容量の80％フエノールを加えてフ
エノール処理を行い、夾雑蛋白質を除去した。
この抽出した粗プラスミドを冷イソプロパノー
ルにて沈殿回収し、さらにTE緩衝液（0.14M
MaCl，1mM EDTAを含む、PH7.5に調製され
た20mMトリス緩衝液。）に溶解した。この混
合液に２mgのＲ Naseを添加し、37℃で２時
間反応させ、上記と同様の方法でフエノール処
理にて夾雑RNAを除去した。この抽出された
粗プラスミドを２倍容量のエタノール沈殿にて
回収した。これを、さらに10mlの上記のTE緩
衝液に溶解させ、アガロースゲル濾過にて夾雑
RNAをさらに除去し、得られた粗DNAをエタ
ノール沈殿に再び回収した。 この沈殿を23.1mlの0.02Mトリス緩衝液（PH
8.0に調製。）に溶解し、さらに23.7ｇの塩化セ
シウムと0.6mlのエチジウムブロマイド溶液
（10mg／mlに調製。）を加え、約40時間超遠心す
ることにより、プラスミドDNAを分離し、次
にノマルブタノールにより、エチジウムブロマ
イドを除去した。この分離したプラスミドを
0.01MのTE緩衝液（0.1mM EDTAを含むPH
7.5に調製された0.01Mトリス緩衝液。）で透析
することにより、精製プラスミドpBR322を得
た。 (c) プラスミドpICR1の創製。 (a)の方法で得られたバチルス・ステアロサー
モフイルスの染色体DNA5μｇと制限酵素sal
（宝酒造社製）20ユニツトを、7mM MgCl2，
150mM NaCl，0.2mM EDTA，7mM2−メチ
ルカプトエタノール、0.01％BSAを含むPH7.5
に調製した10mMトリス緩衝液100μに入れ、
37℃で2.5時間反応させてDNAを消化させた
後、65℃で５分間加熱し、Salを不性化し、
冷エタノールにて消て消化DNA断片を沈殿回
収した。 次に、(b)の方法で得られたプラスミド
pBR3221μｇに制限酵素Sal３ユニツトを加
え、上記と同様の緩衝液中で37℃で10時間反応
させ、上記と同様の方法で消化プラスミド
DNAを回収した。こうして得られた消化染色
体及びプラスミドのDNAを混合し、T4DNA
リガーゼ（宝酒造社製）を用い、6.6mM
MgCl2，10mM DTT，66μM ATPを含むPH
7.6に調製した66mMトリス緩衝液中で、13℃
で19時間反応させ、消化DNAを再結合するこ
とにより、プラスミドpICR1を得た。 実施例 １ 参考例１で得たプラスミドpICR1を用いてエシ
エリチア・コリの形質転換を行つた。 まず、宿主菌のエシエリチア・コリC600r-m-
株を50mlの上記のＬ−培地に培養し、遠心分離に
て集菌後、50mlの0.1M MgCl2溶液に懸濁し、さ
らに遠心分離を行つて最終的には2.5mlの0.1M
MgCl2溶液に懸濁させた。 このようにして得られたエシエリチア・コリ
C600rm株の懸濁液0.2mlに(c)の方法で得られたプ
ラスミドpICR1を含む混合物を0.1ml加え、０℃
で30分間処理したのち、42℃で２分間処理した。 次にこれに３mlの前記したＬ−培地を加え、37
℃で１時間培養し、さらにアンピシリン（15μ
ｇ／mlに調製。）の入つたＬ−寒天培地（Ｌ−培
地１当り、15ｇの寒天を加えたもの。）で37℃
で培養後、生じたコローニを、さらにテトラサイ
クリン（25μｇ／mlの調製。）の入つたＬ−寒天
培地で培養後、生えてこないコロミーを見出すこ
とにより、プラスミドpIC1の導入されたエシエ
リチア・コリC600−pICR1が得られた。 次にこうして得られたエシエリチア・コリ
C600−pICR1のコロニーより、アンピシリン
（15μｇ／mlに調製。）の入つた上記のグリセロー
ル培地100mlで37℃で16時間、振とう培養を行つ
た。これを遠心分離にて集菌、洗浄後、５mlの
0.01％２−メルカプトエタノールを含み、PH7.4
に調製した0.01Mのリン酸緩衝液に懸濁し、０℃
で５分間の超音波処理にて菌体を破砕し、遠心分
離にて粗酵素抽出液を得た。 このようにして得た粗酵素抽出液の耐熱性のロ
イシン脱水素酵素の活性を測定したところ、
0.201ユニツト／mg・プロテインであつた。これ
はDNA供与菌であるバチルス・ステアロサーモ
フイルスIFO12250株のロイシン脱水素酵素の活
性（0.010ユニツト／mg・プロテイン）よりも10
倍以の活性があつた。 また、このロイシン脱水素酵素を含む粗酵素抽
出液は、２−メルカプトエタノールを0.01％含む
PH7.2の10mMリン酸緩衝液中、70℃で20分間加
熱処理したところ、80％以上の残存活性を有して
いた。 参考例 ２ 実施例１で得たエシエリチア・コリCC600−
pICR1株をアンピシリン（15μｇ／mlに調製。）を
含む前記グリセロール培地100mlにて37℃で15時
間振とう培養した。培養後、遠心分離にて集菌
し、0.01％の２−メルカプトエタノールを含むPH
7.4に調製した0.01Mリン酸緩衝液５mlに懸濁し、
約５分間の超音波処理で菌体を破砕した。 その後、遠心分離にて粗酵素抽出液を得、その
粗酵素抽出液を70℃で30分間熱処理した後、遠心
分離し、その上澄液のロイシン脱水素酵素活性を
測定したところ、0.800ユニツト／mg・プロテイ
ンの活性があり、粗酵素抽出液を70℃で30分間熱
処理することにより、熱処理前に比べて比活性が
約４倍向上した。これは、元のバチルス・ステア
ロサーモフイルスIFO12550のロイシン脱水素酵
素の比活性に比べて、約40倍に相当するものであ
つた。
Claims (1)
- １ バチルス・ステアロサーモフイルス
（Bacillus stearothermophilus）の染色体DNA
由来の耐熱性のロイシン脱水素酵素の遺伝子を有
するプラスミドで形質転換された耐熱性のロイシ
ン脱水素酵素生産能を有するエシエリチア・コリ
（Escherichia coli）。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58036306A JPS59159775A (ja) | 1983-03-04 | 1983-03-04 | エシエリチア・コリ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58036306A JPS59159775A (ja) | 1983-03-04 | 1983-03-04 | エシエリチア・コリ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59159775A JPS59159775A (ja) | 1984-09-10 |
| JPH0357746B2 true JPH0357746B2 (ja) | 1991-09-03 |
Family
ID=12466147
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58036306A Granted JPS59159775A (ja) | 1983-03-04 | 1983-03-04 | エシエリチア・コリ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59159775A (ja) |
-
1983
- 1983-03-04 JP JP58036306A patent/JPS59159775A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS59159775A (ja) | 1984-09-10 |
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