JPH0532026B2 - - Google Patents
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- JPH0532026B2 JPH0532026B2 JP1203707A JP20370789A JPH0532026B2 JP H0532026 B2 JPH0532026 B2 JP H0532026B2 JP 1203707 A JP1203707 A JP 1203707A JP 20370789 A JP20370789 A JP 20370789A JP H0532026 B2 JPH0532026 B2 JP H0532026B2
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- cyclodextrin
- enzyme
- beta
- range
- starch
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
- C12N9/1074—Cyclomaltodextrin glucanotransferase (2.4.1.19)
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- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は広いPH範囲で良好な活性を示し、その
活性を実質的に失わずに容易に精製でき、その活
性の保有に捕捉因子又は金属を必要とせずに容易
に固定化でき、40℃で数週間の半減期を有する新
規シクロデキストリングリコシル基転移酵素に関
するものである。 〔従来の技術〕 シクロデキストリンはα−Ｄ−グリコピラノー
ス単量体が１−４結合した環状分子よりなつてい
る。環を形成して結合した６−、７−及び８−グ
リコース単位を含んでいる。α，β，γ−シクロ
デキストリンとして一般に知られているシクロデ
キストリンは異なつた環サイズのシクロデキスト
リンに比較して有用性が大きいため今日で最も重
要なシクロデキストリンである。これらのシクロ
デキストリンの有用なことは多数の型の化合物と
包装複合体又は包接化合物を可逆的に形成する能
力を有することによる。包接複合体はシクロデキ
ストリンのような主分子が客分子をフアンデルワ
ールスの力のような弱い相互作用によつて結合で
きる内部穴を有する構造によつて生成するもので
ある。その結合は、一般にソリツドコンプレツク
スのような明確な配列を与えるに充分な強さの狭
い範囲の力である。しかしこの複合体を主及び客
分子に容易に解離するに十分な弱い力でもある。 シクロデキストリンは内部穴を持つたドーナツ
形分子である。その穴の大きさ及び形状はその環
を形成するグリコース単位の数により決められ
る。α−シクロデキストリンにおいては大部分の
シリンダー状穴は約７オングストロームの深さで
径は約５オングストロームである。β−シクロデ
キストリンにおいては深さは同じであり径は７オ
ングストロームである。そしてγ−シクロデキス
トリンの穴は７オングストロームの深さに対して
９オングストロームの径である。シクロデキスト
リンは穴の縁を囲んだグルコースの多くの水酸基
のために水に溶ける。しかしながら、穴それ自体
の内部は疎水性である。そしてこれらの疎水性穴
は、もし有機物が正しい形状及び疎水性の性質を
持つていたら水性溶液から有機分子を抽出する。 シクロデキストリンの複合体形成能は種々の用
途に役立つものである。例えば、シクロデキスト
リンは希望する風味及び芳香をカプセル化して長
時間保存し、製造された食品に配合するに用いら
れる。反対に、シクロデキストリンは希望しない
風味及び芳香をこれと複合させることによつて食
品から除くのに使用することもできる。シクロデ
キストリンはまた食品の酸化、光化学的分解及び
熱分解の保護に用いられる。これらのそして他の
利用は「スターチ（Starch）」J.Szejtle、34、379
−385（1982）によりまとめられている。 〔発明が解決しようとする課題〕 シクロデキストリンの商業的利用は現在の方法
の制約によりコストが比較的高いことで妨げられ
ている。シクロデキストリンは一般に澱粉から比
較的低収率、50％以下、しばしば25〜35％の範囲
で澱粉転換で生成される。原料として比較的低固
形分のものを使用する必要があり、更に生産性を
制約し、そしてそれらの分離を更に煩雑にする希
釈されたシクロデキストリンが生産される。 シクロデキストリングリコシル基転移酵素生産
物として知られた微生物の不利なことは我々が優
れた微生物を探索する刺激となつた。要求を満足
させる微生物の基準はコストと酵素生産の容易性
の実用的観点から決定した。微生物中の特性は簡
単な倍地で速やかに生育すること、微生物はまた
広いPH範囲、換言すれば、倍地条件の変化にも酵
素生産に比較的感受性がない細胞外で酵素を高水
準で生産すること、そしてまた、生産された酵素
は容易に分離しそして精製できることも必要とし
た。 本研究において、シクロデキストリングリコシ
ル基転移酵素は数個の基準を満すことを必要とし
た。酵素は広いPH範囲で作用することが望まし
く、或程度浅いPH最適値を現わすことは一層は望
ましいことである。酵素は容易に精製されねばな
らず、そして精製によつて活性が実質的に減少を
示してはならない。酵素はまた半減期が40℃で数
週間、特に固定化した場合は必要である。 更にそれ以上の基準により、酵素は可溶酵素の
みならず、適宜の担体上に固定化しても使用され
ることを考えると、酵素は容易に固定され、そし
て、その高活性を持続するためにいかなる補足因
子又は金属を必要としないことが必要とされる。 〔課題を解決する手段〕 我々の研究の結果、多くの細菌を含む土壌を分
離しシクロデキストリングリコシル基転移酵素活
性を示す微生物を分離した。数種を一層精密に試
験し、そしてこれらのうちの３種の微生物が数種
の観点において最も優れたシクロデキストリング
リコシル基転移酵素を生産することを見出した。 本発明は広いPH範囲で良好な活性を示し、活性
を実質的に失わずに容易に精製でき、その活性の
保有に捕捉因子又は金属を必要とせずに容易に固
定化でき、40℃で数週間の半減期を有する新規シ
クロデキストリングリコシル基転移酵素である。 本発明の一つの態様はNRRLB−18373により
生産される酵素である。そして他の態様はシクロ
デキストリングリコシル基転移酵素がNRRLB−
18374によつて生産される。最良の態様は、この
酵素がNRRLB−18375により生産されることで
ある。 本発明に使用する微生物は1988年６月７日にエ
ヌ アール アール エル （NRRL）に寄託
し、バシルス（Bacillus）SP430はNRRL Ｂ−
18373、バシルス（Bacillus）SP860はNRRL Ｂ
−18374、シユードモナス（Pseudomonas）
SP170はNRRL Ｂ−18375として寄託番号を受け
ている。 本発明は公知のシクロデキストリングリコシル
基転移酵素と数種の重要な点において劇的に区別
され、そして相違する数種のシクロデキストリン
グリコシル基転移酵素の発見である。これらの酵
素は土壌から分離した３種の従来未知の細菌によ
り生産される。しかしながら、同一又は類似の酵
素が他の微生物により生産されるであろう。要す
るに、本シクロデキストリングリコシル基転移酵
素は公知のシクロデキストリングリコシル基転移
酵素に比し前述のように多くの望ましい特性を有
し有用である。 以下の記載は本発明に関する微生物からシクロ
デキストリングリコシル基転移酵素の生産の代表
的なものである。12リツトルの標準培養におい
て、特定菌株の５％接種材料を加え、のち下記を
含む澱粉／塩培養基中で30℃で１夜生育する。 ４ｍＭ MgSO4 10ｍＭ NH2Cl 0.03ｍＭ MnSO4 0.06ｍＭ （NH4）2SO4 6.8ｍＭ NaCl 0.06ｍＭ FeSO4 5.4ｍＭ KCl １％（ｗ／vol）澱粉、及び0.01％
イースト抽出物 14.6ｍＭ K2HPO4 1.6ｍＭ クエン酸塩 １ｍＭ CaCl2 培養基を十分な通気を行つて30℃に保持し、そ
して約２時間毎に試料の生育、PH及びシクロデキ
ストラナーゼ活性（KI分析法による）を監視す
る。シクロデキストラナーゼ活性の測定におい
て、活性は培養物自体を「酵素」として直接使用
して決定した。培養の後段（約24時間から）で培
養液の試料を遠心分離して細胞を除き、そして試
験は培養液の上澄液を用いて行う。培養は４時間
の間活性のレベルが一定になつた時又は減少が観
察された時に終了する。酵素を用いた代表的な培
養において、酵素の精製は下記のようにして行
う。酵素の回収は50％に近ずく、そして特殊の活
性（mg蛋白当りの単位）は128000（培養液の上澄
を0.2μ過材を通す）から最終の精製酵素である
580000に増加する。 遊離酵素KI試験は５ｍＭ CaCl2及び100ｍＭ
イミダゾールを含む0.2％可溶性澱粉を基質とし
て用いPH7.0でシクロデキストラナーゼに対して
行う。40℃で基質の0.30ｍＬに酵素の10μlを加え
る。10分間培養した後反応を0.2MHCl及び0.5ｍ
Ｌの0.02％I2及び0.02％KIを含む溶液を加えて停
止する。背後の対照は0.2MHClの4.0ｍＬ続いて
酵素10μl及びI2−KI混合物の0.5ｍＬを基質の0.3
ｍＬに加えることにより行われる。ｍＬ当りの活
性単位は下記式により決められる。 活性（単位／ｍＬ）＝ODB−ODS／〔0.01×ODB〕×100 式中のODB及びODSは背景（対照）と試料の
700＋１メータによる光学密度の比較である。背
景と試料の間の光学密度の差は吸光単位で0.1及
び0.4の間でなければならない。活性表示は1250
及び5000、単位ｍＬ当りの間である。もし、値が
この範囲になかつたら、酵素を希釈して後計算の
因子にする。 各菌株により生産されたシクコデキストラナー
ゼは細胞外酵素であつた。それは最初の遠心分離
による菌の除去により酵素の回収に極めて有効で
ある。細胞を除いた上澄みを下記の操作を通して
４℃に保持する。上澄みを常時撹拌して硫酸アン
モニウム（50ｇ／Ｌ）を徐々に加え、次いで不溶
性のさらさらした澱粉（50ｇ／Ｌ）を加える。こ
の混合物を約１時間ゆるやかに撹拌し、その間不
溶性澱粉を過により集めそして空気で乾燥す
る。澱粉固型物を後に10ミリモルK2HPO4、3M
NaCl及び0.1Mマルトースの溶液中に7.5のPHの懸
濁しそして室温で約１時間攪拌する。澱粉からシ
クロデキストラナーゼを遊離するに使用するこの
溶液の容積は厳格ではなく望む酵素の最終の濃度
により変えることができる。さらさらした澱粉は
0.2μ過材を容易に通し、澄明な溶液になるまで
反復して過する段階で除去される。この溶液は
次に５ｍＭグリシンと５ｍＭ CaCl2、PH７に対
して広く透析させ最も多くの研究に使用される精
製された酵素が得られる。 「精製された」酵素はその分子量を下記の方法
により決定する前に更に精製される。分析のため
に一層精製された酵素を得るには、原培地から細
胞を除く望ましい方法はガラス容器中で４℃で細
胞を一夜放置しそしてのち、濁つた液浮遊物を
0.2μ過カセツトを通して過する。この方法は
細胞の混入のない酵素の調製を確保する方法であ
る。更にその上の濃縮工程はタンジエンシアル膜
過ユニツトを用いそして10000分子量を過で
除く。この方法において約10000ダルトンより大
きな蛋白質のみが原料の１／10の容積に濃縮され
る。この濃縮酵素の調製は次のように変形された
上述の方法に従つて精製される。加えられる澱粉
の量は原培養上澄み液の容積の基として計算され
ない。しかし精製のための濃縮酵素溶液の容量の
２倍はある。即ち、10リツトルの培養液が１リツ
トルに濃縮されるに対し、さらさらした澱粉の量
は100ｇである。更にその上、この方法は３回繰
り返し、各回毎に液に澱粉のみ加えそして酵素
の全部が不溶性澱粉に最後には結合するようにす
る。次に各過材上に集まつた澱粉固形物を合し
そして同じマルトース、リン酸塩及び食塩溶液と
混合し固定形化された酵素を遊離する。この加え
られる溶液の容量はゆるやかに攪拌される澱粉の
スラリーを形成するに必要な最少の量である。続
いて、このスラリーの過で得られた澱粉固形物
に同様の溶離工程を行いそして、この工程で酵素
が僅かかまたは溶離しなくなるまで多数回繰り返
す。過されたシクロデキストラーゼ活性の高水
準を示す溶液を合しそして透析しそして分析に使
用する。或る場合において、沈殿物が電気泳動に
より分析用に濃縮される。これらの目的のために
酵素は凍結乾燥により約10倍に濃縮されそして適
宜のゲル充填緩衝液中で復元させる。 精製した酵素試料の或るものは分子量測定用に
ポリアクリルアミドゲル上に装填する前に濃縮に
より調製される。精製及び濃縮操作はB.シルク
ランス、ストレイン（Circulans、strains）170、
430及び860；B.マセランス（macerans）酵素試
料で試験したのと同様である。供給者（アマノ）
により提供された粗製造物及び供給者により提供
されたデータは我々の分析の確認に使用した。全
試料それが濃縮されていてもいなくても、を装填
緩衝液（溶液として加える場合１／10容）に加え
そしてラエミリ（Laemmli）により記述された
方法（U.K.Laemmli、ネイチヤー（Nature）
222、p680、1979）に従つて調製した10％ドデシ
ル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル上に装
填する。異なつた試料、多種の試料が次々に相互
に動くように装填しゲルを通してマイグレーシヨ
ンの正確な比較をする。電気泳動後、ゲルをクマ
シーブルー一染料で着色しそして後、７％酢酸
（氷酢酸）、染料を含まない30％メタノール中で脱
色する。分子量は酵素試料の動きと分子量標準蛋
白との動きを同時に比較して決定する。 等電点を測定するために使用する試料は分子量
測定で記載したようにして調製する。そしてPH
3.5〜9.5の範囲の既製のゲル（LKBフアルマシ
ア）上に装填する。ゲルは陽極及び陰極に1Mリ
ン酸及び1M NaOH溶液と共にそれぞれに移動
する。初めの電圧は520ボルトでありそして終り
のそれは、1520ボルトであつた。同様に、電流は
60ｍＡ乃至6.5ｍＡであつた。移動後、ゲルの正
確なPHを測定しそして3.8乃至8.1の範囲であつ
た。ゲルは後４％スルホサリチル酸、12.5％トリ
クロロ酢酸及び30％メタノール中に固定しそして
0.04％クマシーブルー、10％酢酸、27％エタノー
ル及び0.5％CuSO4中で着色する。 本酵素の最適PHの測定のために標準試験溶液
〔２％マルトリン（maltrin）150、５ｍＭ
CaCl2〕を緩衝PHをクエン酸塩、イミダゾール及
びグリシンの緩衝剤を用いて２と９の間に変える
ことを除いて使用する。精製された酵素を基質の
１モルに加えそして40℃で３時間培養する。試料
を密封容器（前もつて蒸発により水分を除く）中
で２分間沸騰し、そして冷却する。アルフアアミ
ラーゼの過剰量を加えそして試料を60℃で30〜60
分培養し基質中の未反応澱粉を分解する。試料は
後、アルフア、ベーター及びガンマーシクロデキ
ストリンのその材料の標準品と比較によつて測定
するためのHPLCによる分析に用いるまで冷凍保
存する。 ベーターシクロデキストリンへの最高コンバー
ジヨンは２％マルトリン150、５ｍＭ Cacl2、５
ｍＭイミダゾールのPH７の基質及び10％（ｖ／
ｖ）エタノールを用い40℃で精製酵素試料を使用
して、各酵素について決めた。 本酵素の重要なそして区別される劇点な特性の
幾つかを表１に摘要する。シクロデキストリング
リコシル基転移酵素の少くとも二つの原型がある
ことは既に知られている。転移反応の少くとも始
期の相で、そのうちの一つは主にアルフア生成体
でありそして他は主にビーター生成体である。
H.ベンダー（Bender）、アドバンス イン バイ
オテクノロジカル プロセス（Advance in
Biotechnological Process）６ Alan R.Liss、
Inc.、1986、37頁。B.マセランス（macerans）
及びNRRL Ｂ−18375からの酵素は第１の級で
あり、一方、B.サーキユランス（Circulans）、
NRRL Ｂ−18375及びＢ−18374からの酵素は第
２の種類であると見ることができる。酵素の分子
量は65又は73キロダルトンの何れかである。そし
て等電点は前者は略々8.5を示すに拘らず後者は
それぞれ異なつた本質的に異なる等電点を有す
る。 【表】
活性を実質的に失わずに容易に精製でき、その活
性の保有に捕捉因子又は金属を必要とせずに容易
に固定化でき、40℃で数週間の半減期を有する新
規シクロデキストリングリコシル基転移酵素に関
するものである。 〔従来の技術〕 シクロデキストリンはα−Ｄ−グリコピラノー
ス単量体が１−４結合した環状分子よりなつてい
る。環を形成して結合した６−、７−及び８−グ
リコース単位を含んでいる。α，β，γ−シクロ
デキストリンとして一般に知られているシクロデ
キストリンは異なつた環サイズのシクロデキスト
リンに比較して有用性が大きいため今日で最も重
要なシクロデキストリンである。これらのシクロ
デキストリンの有用なことは多数の型の化合物と
包装複合体又は包接化合物を可逆的に形成する能
力を有することによる。包接複合体はシクロデキ
ストリンのような主分子が客分子をフアンデルワ
ールスの力のような弱い相互作用によつて結合で
きる内部穴を有する構造によつて生成するもので
ある。その結合は、一般にソリツドコンプレツク
スのような明確な配列を与えるに充分な強さの狭
い範囲の力である。しかしこの複合体を主及び客
分子に容易に解離するに十分な弱い力でもある。 シクロデキストリンは内部穴を持つたドーナツ
形分子である。その穴の大きさ及び形状はその環
を形成するグリコース単位の数により決められ
る。α−シクロデキストリンにおいては大部分の
シリンダー状穴は約７オングストロームの深さで
径は約５オングストロームである。β−シクロデ
キストリンにおいては深さは同じであり径は７オ
ングストロームである。そしてγ−シクロデキス
トリンの穴は７オングストロームの深さに対して
９オングストロームの径である。シクロデキスト
リンは穴の縁を囲んだグルコースの多くの水酸基
のために水に溶ける。しかしながら、穴それ自体
の内部は疎水性である。そしてこれらの疎水性穴
は、もし有機物が正しい形状及び疎水性の性質を
持つていたら水性溶液から有機分子を抽出する。 シクロデキストリンの複合体形成能は種々の用
途に役立つものである。例えば、シクロデキスト
リンは希望する風味及び芳香をカプセル化して長
時間保存し、製造された食品に配合するに用いら
れる。反対に、シクロデキストリンは希望しない
風味及び芳香をこれと複合させることによつて食
品から除くのに使用することもできる。シクロデ
キストリンはまた食品の酸化、光化学的分解及び
熱分解の保護に用いられる。これらのそして他の
利用は「スターチ（Starch）」J.Szejtle、34、379
−385（1982）によりまとめられている。 〔発明が解決しようとする課題〕 シクロデキストリンの商業的利用は現在の方法
の制約によりコストが比較的高いことで妨げられ
ている。シクロデキストリンは一般に澱粉から比
較的低収率、50％以下、しばしば25〜35％の範囲
で澱粉転換で生成される。原料として比較的低固
形分のものを使用する必要があり、更に生産性を
制約し、そしてそれらの分離を更に煩雑にする希
釈されたシクロデキストリンが生産される。 シクロデキストリングリコシル基転移酵素生産
物として知られた微生物の不利なことは我々が優
れた微生物を探索する刺激となつた。要求を満足
させる微生物の基準はコストと酵素生産の容易性
の実用的観点から決定した。微生物中の特性は簡
単な倍地で速やかに生育すること、微生物はまた
広いPH範囲、換言すれば、倍地条件の変化にも酵
素生産に比較的感受性がない細胞外で酵素を高水
準で生産すること、そしてまた、生産された酵素
は容易に分離しそして精製できることも必要とし
た。 本研究において、シクロデキストリングリコシ
ル基転移酵素は数個の基準を満すことを必要とし
た。酵素は広いPH範囲で作用することが望まし
く、或程度浅いPH最適値を現わすことは一層は望
ましいことである。酵素は容易に精製されねばな
らず、そして精製によつて活性が実質的に減少を
示してはならない。酵素はまた半減期が40℃で数
週間、特に固定化した場合は必要である。 更にそれ以上の基準により、酵素は可溶酵素の
みならず、適宜の担体上に固定化しても使用され
ることを考えると、酵素は容易に固定され、そし
て、その高活性を持続するためにいかなる補足因
子又は金属を必要としないことが必要とされる。 〔課題を解決する手段〕 我々の研究の結果、多くの細菌を含む土壌を分
離しシクロデキストリングリコシル基転移酵素活
性を示す微生物を分離した。数種を一層精密に試
験し、そしてこれらのうちの３種の微生物が数種
の観点において最も優れたシクロデキストリング
リコシル基転移酵素を生産することを見出した。 本発明は広いPH範囲で良好な活性を示し、活性
を実質的に失わずに容易に精製でき、その活性の
保有に捕捉因子又は金属を必要とせずに容易に固
定化でき、40℃で数週間の半減期を有する新規シ
クロデキストリングリコシル基転移酵素である。 本発明の一つの態様はNRRLB−18373により
生産される酵素である。そして他の態様はシクロ
デキストリングリコシル基転移酵素がNRRLB−
18374によつて生産される。最良の態様は、この
酵素がNRRLB−18375により生産されることで
ある。 本発明に使用する微生物は1988年６月７日にエ
ヌ アール アール エル （NRRL）に寄託
し、バシルス（Bacillus）SP430はNRRL Ｂ−
18373、バシルス（Bacillus）SP860はNRRL Ｂ
−18374、シユードモナス（Pseudomonas）
SP170はNRRL Ｂ−18375として寄託番号を受け
ている。 本発明は公知のシクロデキストリングリコシル
基転移酵素と数種の重要な点において劇的に区別
され、そして相違する数種のシクロデキストリン
グリコシル基転移酵素の発見である。これらの酵
素は土壌から分離した３種の従来未知の細菌によ
り生産される。しかしながら、同一又は類似の酵
素が他の微生物により生産されるであろう。要す
るに、本シクロデキストリングリコシル基転移酵
素は公知のシクロデキストリングリコシル基転移
酵素に比し前述のように多くの望ましい特性を有
し有用である。 以下の記載は本発明に関する微生物からシクロ
デキストリングリコシル基転移酵素の生産の代表
的なものである。12リツトルの標準培養におい
て、特定菌株の５％接種材料を加え、のち下記を
含む澱粉／塩培養基中で30℃で１夜生育する。 ４ｍＭ MgSO4 10ｍＭ NH2Cl 0.03ｍＭ MnSO4 0.06ｍＭ （NH4）2SO4 6.8ｍＭ NaCl 0.06ｍＭ FeSO4 5.4ｍＭ KCl １％（ｗ／vol）澱粉、及び0.01％
イースト抽出物 14.6ｍＭ K2HPO4 1.6ｍＭ クエン酸塩 １ｍＭ CaCl2 培養基を十分な通気を行つて30℃に保持し、そ
して約２時間毎に試料の生育、PH及びシクロデキ
ストラナーゼ活性（KI分析法による）を監視す
る。シクロデキストラナーゼ活性の測定におい
て、活性は培養物自体を「酵素」として直接使用
して決定した。培養の後段（約24時間から）で培
養液の試料を遠心分離して細胞を除き、そして試
験は培養液の上澄液を用いて行う。培養は４時間
の間活性のレベルが一定になつた時又は減少が観
察された時に終了する。酵素を用いた代表的な培
養において、酵素の精製は下記のようにして行
う。酵素の回収は50％に近ずく、そして特殊の活
性（mg蛋白当りの単位）は128000（培養液の上澄
を0.2μ過材を通す）から最終の精製酵素である
580000に増加する。 遊離酵素KI試験は５ｍＭ CaCl2及び100ｍＭ
イミダゾールを含む0.2％可溶性澱粉を基質とし
て用いPH7.0でシクロデキストラナーゼに対して
行う。40℃で基質の0.30ｍＬに酵素の10μlを加え
る。10分間培養した後反応を0.2MHCl及び0.5ｍ
Ｌの0.02％I2及び0.02％KIを含む溶液を加えて停
止する。背後の対照は0.2MHClの4.0ｍＬ続いて
酵素10μl及びI2−KI混合物の0.5ｍＬを基質の0.3
ｍＬに加えることにより行われる。ｍＬ当りの活
性単位は下記式により決められる。 活性（単位／ｍＬ）＝ODB−ODS／〔0.01×ODB〕×100 式中のODB及びODSは背景（対照）と試料の
700＋１メータによる光学密度の比較である。背
景と試料の間の光学密度の差は吸光単位で0.1及
び0.4の間でなければならない。活性表示は1250
及び5000、単位ｍＬ当りの間である。もし、値が
この範囲になかつたら、酵素を希釈して後計算の
因子にする。 各菌株により生産されたシクコデキストラナー
ゼは細胞外酵素であつた。それは最初の遠心分離
による菌の除去により酵素の回収に極めて有効で
ある。細胞を除いた上澄みを下記の操作を通して
４℃に保持する。上澄みを常時撹拌して硫酸アン
モニウム（50ｇ／Ｌ）を徐々に加え、次いで不溶
性のさらさらした澱粉（50ｇ／Ｌ）を加える。こ
の混合物を約１時間ゆるやかに撹拌し、その間不
溶性澱粉を過により集めそして空気で乾燥す
る。澱粉固型物を後に10ミリモルK2HPO4、3M
NaCl及び0.1Mマルトースの溶液中に7.5のPHの懸
濁しそして室温で約１時間攪拌する。澱粉からシ
クロデキストラナーゼを遊離するに使用するこの
溶液の容積は厳格ではなく望む酵素の最終の濃度
により変えることができる。さらさらした澱粉は
0.2μ過材を容易に通し、澄明な溶液になるまで
反復して過する段階で除去される。この溶液は
次に５ｍＭグリシンと５ｍＭ CaCl2、PH７に対
して広く透析させ最も多くの研究に使用される精
製された酵素が得られる。 「精製された」酵素はその分子量を下記の方法
により決定する前に更に精製される。分析のため
に一層精製された酵素を得るには、原培地から細
胞を除く望ましい方法はガラス容器中で４℃で細
胞を一夜放置しそしてのち、濁つた液浮遊物を
0.2μ過カセツトを通して過する。この方法は
細胞の混入のない酵素の調製を確保する方法であ
る。更にその上の濃縮工程はタンジエンシアル膜
過ユニツトを用いそして10000分子量を過で
除く。この方法において約10000ダルトンより大
きな蛋白質のみが原料の１／10の容積に濃縮され
る。この濃縮酵素の調製は次のように変形された
上述の方法に従つて精製される。加えられる澱粉
の量は原培養上澄み液の容積の基として計算され
ない。しかし精製のための濃縮酵素溶液の容量の
２倍はある。即ち、10リツトルの培養液が１リツ
トルに濃縮されるに対し、さらさらした澱粉の量
は100ｇである。更にその上、この方法は３回繰
り返し、各回毎に液に澱粉のみ加えそして酵素
の全部が不溶性澱粉に最後には結合するようにす
る。次に各過材上に集まつた澱粉固形物を合し
そして同じマルトース、リン酸塩及び食塩溶液と
混合し固定形化された酵素を遊離する。この加え
られる溶液の容量はゆるやかに攪拌される澱粉の
スラリーを形成するに必要な最少の量である。続
いて、このスラリーの過で得られた澱粉固形物
に同様の溶離工程を行いそして、この工程で酵素
が僅かかまたは溶離しなくなるまで多数回繰り返
す。過されたシクロデキストラーゼ活性の高水
準を示す溶液を合しそして透析しそして分析に使
用する。或る場合において、沈殿物が電気泳動に
より分析用に濃縮される。これらの目的のために
酵素は凍結乾燥により約10倍に濃縮されそして適
宜のゲル充填緩衝液中で復元させる。 精製した酵素試料の或るものは分子量測定用に
ポリアクリルアミドゲル上に装填する前に濃縮に
より調製される。精製及び濃縮操作はB.シルク
ランス、ストレイン（Circulans、strains）170、
430及び860；B.マセランス（macerans）酵素試
料で試験したのと同様である。供給者（アマノ）
により提供された粗製造物及び供給者により提供
されたデータは我々の分析の確認に使用した。全
試料それが濃縮されていてもいなくても、を装填
緩衝液（溶液として加える場合１／10容）に加え
そしてラエミリ（Laemmli）により記述された
方法（U.K.Laemmli、ネイチヤー（Nature）
222、p680、1979）に従つて調製した10％ドデシ
ル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル上に装
填する。異なつた試料、多種の試料が次々に相互
に動くように装填しゲルを通してマイグレーシヨ
ンの正確な比較をする。電気泳動後、ゲルをクマ
シーブルー一染料で着色しそして後、７％酢酸
（氷酢酸）、染料を含まない30％メタノール中で脱
色する。分子量は酵素試料の動きと分子量標準蛋
白との動きを同時に比較して決定する。 等電点を測定するために使用する試料は分子量
測定で記載したようにして調製する。そしてPH
3.5〜9.5の範囲の既製のゲル（LKBフアルマシ
ア）上に装填する。ゲルは陽極及び陰極に1Mリ
ン酸及び1M NaOH溶液と共にそれぞれに移動
する。初めの電圧は520ボルトでありそして終り
のそれは、1520ボルトであつた。同様に、電流は
60ｍＡ乃至6.5ｍＡであつた。移動後、ゲルの正
確なPHを測定しそして3.8乃至8.1の範囲であつ
た。ゲルは後４％スルホサリチル酸、12.5％トリ
クロロ酢酸及び30％メタノール中に固定しそして
0.04％クマシーブルー、10％酢酸、27％エタノー
ル及び0.5％CuSO4中で着色する。 本酵素の最適PHの測定のために標準試験溶液
〔２％マルトリン（maltrin）150、５ｍＭ
CaCl2〕を緩衝PHをクエン酸塩、イミダゾール及
びグリシンの緩衝剤を用いて２と９の間に変える
ことを除いて使用する。精製された酵素を基質の
１モルに加えそして40℃で３時間培養する。試料
を密封容器（前もつて蒸発により水分を除く）中
で２分間沸騰し、そして冷却する。アルフアアミ
ラーゼの過剰量を加えそして試料を60℃で30〜60
分培養し基質中の未反応澱粉を分解する。試料は
後、アルフア、ベーター及びガンマーシクロデキ
ストリンのその材料の標準品と比較によつて測定
するためのHPLCによる分析に用いるまで冷凍保
存する。 ベーターシクロデキストリンへの最高コンバー
ジヨンは２％マルトリン150、５ｍＭ Cacl2、５
ｍＭイミダゾールのPH７の基質及び10％（ｖ／
ｖ）エタノールを用い40℃で精製酵素試料を使用
して、各酵素について決めた。 本酵素の重要なそして区別される劇点な特性の
幾つかを表１に摘要する。シクロデキストリング
リコシル基転移酵素の少くとも二つの原型がある
ことは既に知られている。転移反応の少くとも始
期の相で、そのうちの一つは主にアルフア生成体
でありそして他は主にビーター生成体である。
H.ベンダー（Bender）、アドバンス イン バイ
オテクノロジカル プロセス（Advance in
Biotechnological Process）６ Alan R.Liss、
Inc.、1986、37頁。B.マセランス（macerans）
及びNRRL Ｂ−18375からの酵素は第１の級で
あり、一方、B.サーキユランス（Circulans）、
NRRL Ｂ−18375及びＢ−18374からの酵素は第
２の種類であると見ることができる。酵素の分子
量は65又は73キロダルトンの何れかである。そし
て等電点は前者は略々8.5を示すに拘らず後者は
それぞれ異なつた本質的に異なる等電点を有す
る。 【表】
Claims (1)
- １ (1)NRRLB−18373により生産されそして更
に分子量73キロダルトン、等電点6.8、約7.8の
PH、40℃で最高の酵素活性を現わし、その酵素活
性の約90％を約6.4乃至約9.0のPH範囲で保有し、
そして75％を約5.25乃至約９のPH範囲で保有し、
約2.5：９：１の割合のアルフア、ベーター、ガ
ンマーシクロデキストリン混合物を生産し、そし
て標準条件下で22.5％のベーターシクロデキスト
リンの最高コンバージヨンを示す特性を有するシ
クロデキストリングリコシル基転移酵素；(2)
NRRLB−18374により生産されそして更に分子
量73キロダルトン、等電点7.8、約7.2のPH、40℃
で最高の酵素活性を現わし、その酵素活性の約90
％を約5.75乃至約7.7のPH範囲で保有し、そして
75％を約4.8乃至約8.2のPH範囲で保有し、約３：
12：１の割合のアルフア、ベーター、ガンマーシ
クロデキストリン混合物を生産し、そして標準条
件下で23％のベーターシクロデキストリンの最高
コンバージヨンを示す特性を有するシクロデキス
トリングリコシル基転移酵素；(3)NRRLB−
18375により生産されそして更に分子量65キロダ
ルトン、等電点8.5、約6.5のPH、40℃で最高の酵
素活性を現わし、その酵素活性の約90％が約5.5
乃至7.6のPH範囲で保有し、そして75％を約4.6乃
至約8.3のPH範囲で保有し、約１：1.5：＜１の割
合のアルフア、ベーター、ガンマーシクロデキス
トリン混合物を生産し、そして標準条件下で17％
のベーターシクロデキストリン最高コンバージヨ
ンを示す特性を有するシクロデキストリングリコ
シル基転移酵素よりなる群から選択されたシクロ
デキストリングリコシル基転移酵素。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US22864788A | 1988-08-05 | 1988-08-05 | |
| US228647 | 1988-08-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0286775A JPH0286775A (ja) | 1990-03-27 |
| JPH0532026B2 true JPH0532026B2 (ja) | 1993-05-14 |
Family
ID=22858056
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1203707A Granted JPH0286775A (ja) | 1988-08-05 | 1989-08-05 | 新規シクロデキストリングリコシル基転移酵素 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0356048A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0286775A (ja) |
| FI (1) | FI893708L (ja) |
| HU (1) | HUT53933A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5874261A (en) * | 1988-09-02 | 1999-02-23 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Method for the purification of glycosyltransferases |
| HU216881B (hu) * | 1990-04-16 | 1999-09-28 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Eljárás és berendezés szaharidkészítmények glikozil transzferáz által katalizált előállítása |
-
1989
- 1989-08-03 EP EP19890307938 patent/EP0356048A3/en not_active Withdrawn
- 1989-08-04 HU HU893977A patent/HUT53933A/hu unknown
- 1989-08-04 FI FI893708A patent/FI893708L/fi not_active Application Discontinuation
- 1989-08-05 JP JP1203707A patent/JPH0286775A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUT53933A (en) | 1990-12-28 |
| FI893708A7 (fi) | 1990-02-06 |
| JPH0286775A (ja) | 1990-03-27 |
| FI893708L (fi) | 1990-02-06 |
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| EP0356048A3 (en) | 1990-11-14 |
| FI893708A0 (fi) | 1989-08-04 |
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