JPH0286775A - 新規シクロデキストリングリコシル基転移酵素 - Google Patents
新規シクロデキストリングリコシル基転移酵素Info
- Publication number
- JPH0286775A JPH0286775A JP1203707A JP20370789A JPH0286775A JP H0286775 A JPH0286775 A JP H0286775A JP 1203707 A JP1203707 A JP 1203707A JP 20370789 A JP20370789 A JP 20370789A JP H0286775 A JPH0286775 A JP H0286775A
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- cyclodextrin
- enzyme
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
- C12N9/1074—Cyclomaltodextrin glucanotransferase (2.4.1.19)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は広いｐＨ範囲で良好な活性を示し、その活性を
実質的に失わずに容易に精製でき、その活性の保有に捕
捉因子又は金属を必要とせずに容易に固定化でき、４０
℃で数週間の半減期を有する新規シクロデキストリング
リコシル基転移酵素に関するものである。
実質的に失わずに容易に精製でき、その活性の保有に捕
捉因子又は金属を必要とせずに容易に固定化でき、４０
℃で数週間の半減期を有する新規シクロデキストリング
リコシル基転移酵素に関するものである。
シクロデキストリンはα−Ｄ−グリコピラノース単量体
が１−４結合した環状分子よりなっている。環を形成し
て結合した６−１７−及び８−グルコース単位を含んで
いる。α、β＋７−シクロデキストリンとして一般に知
られているシクロデキストリンは異なった環サイズのシ
クロデキストリンに比較して有用性が大きいため今日で
最も重要なシクロデキストリンである。これらのシクロ
デキストリンの有用なことは多数の型の化合物と包接複
合体又は包接化合物を可逆的に形成する能力を有するこ
とによる。包接複合体はシクロデキストリンのような主
分子が客分子をファンデルワールスの力のような弱い相
互作用によって結合できる内部穴を有する構造によって
生成するものである。その結合は、一般にソリッドコン
プレックスのような明確な配列を与えるに十分な強さの
狭い範囲の力である。しかしこの複合体を主及び客分子
に容易に解離するに十分な弱い力でもある。
が１−４結合した環状分子よりなっている。環を形成し
て結合した６−１７−及び８−グルコース単位を含んで
いる。α、β＋７−シクロデキストリンとして一般に知
られているシクロデキストリンは異なった環サイズのシ
クロデキストリンに比較して有用性が大きいため今日で
最も重要なシクロデキストリンである。これらのシクロ
デキストリンの有用なことは多数の型の化合物と包接複
合体又は包接化合物を可逆的に形成する能力を有するこ
とによる。包接複合体はシクロデキストリンのような主
分子が客分子をファンデルワールスの力のような弱い相
互作用によって結合できる内部穴を有する構造によって
生成するものである。その結合は、一般にソリッドコン
プレックスのような明確な配列を与えるに十分な強さの
狭い範囲の力である。しかしこの複合体を主及び客分子
に容易に解離するに十分な弱い力でもある。
シクロデキストリンは内部穴を持ったドーナツ形分子で
ある。その穴の大きさ及び形状はその環を形成するグリ
コース単位の数により決められる。α−シクロデキスト
リンにおいては大部分のシリンダー状穴は約７オングス
トロームの深さで径は約５オングストロームである。β
−シクロデキストリンにおいては深さは同じであり径は
７オングストロームである。そしてγ−シクロデキスト
リンの穴は７オングストロームの深さに対して９オング
ストロームの径である。シクロデキストリンは穴の縁を
囲んだグルコースの多くの水酸基のために水に溶ける。
ある。その穴の大きさ及び形状はその環を形成するグリ
コース単位の数により決められる。α−シクロデキスト
リンにおいては大部分のシリンダー状穴は約７オングス
トロームの深さで径は約５オングストロームである。β
−シクロデキストリンにおいては深さは同じであり径は
７オングストロームである。そしてγ−シクロデキスト
リンの穴は７オングストロームの深さに対して９オング
ストロームの径である。シクロデキストリンは穴の縁を
囲んだグルコースの多くの水酸基のために水に溶ける。
しかしながら、穴それ自体の内部は疎水性である。
そしてこれらの疎水性穴は、もし有機物が正しい形状及
び疎水性の性質を持っていたら水性溶液から有機分子を
抽出する。
び疎水性の性質を持っていたら水性溶液から有機分子を
抽出する。
シクロデキストリンの複合体形成能は種々の用途に役立
つものである。例えば、シクロデキストリンは希望する
風味及び芳香をカプセル化して長時間保存し、製造され
た食品に配合するに用いられる。反対に、シクロデキス
トリンは希望しない風味及び芳香をこれと複合させるこ
とによって食品から除くのに使用することもできる。シ
クロデキストリンはまた食品の酸化、光化学的分解及び
熱分解の保護に用いられる。
つものである。例えば、シクロデキストリンは希望する
風味及び芳香をカプセル化して長時間保存し、製造され
た食品に配合するに用いられる。反対に、シクロデキス
トリンは希望しない風味及び芳香をこれと複合させるこ
とによって食品から除くのに使用することもできる。シ
クロデキストリンはまた食品の酸化、光化学的分解及び
熱分解の保護に用いられる。
これらのそして他の利用は「スターチ（Ｓｔａｒｃｈ）
ＪＪ 、 Ｓ ｚｅｊｔｌｅ、 ３４．３７９−３８５
（１９ｇ２）によりまとめられている。
ＪＪ 、 Ｓ ｚｅｊｔｌｅ、 ３４．３７９−３８５
（１９ｇ２）によりまとめられている。
シクロデキストリンの商業的利用は現在の方法の制約に
よりコストが比較的高いことで妨げられている。シクロ
デキストリンは一般に澱粉から比較的低収率、５０％以
下、しばしば２５〜３５％の範囲で澱粉転換で生成され
る。原料として比較的低固形分のものを使用する必要が
あり、更に生産性を制約し、そしてそれらの分離を更に
煩雑にする希釈されたシクロデキストリンが生産される
。
よりコストが比較的高いことで妨げられている。シクロ
デキストリンは一般に澱粉から比較的低収率、５０％以
下、しばしば２５〜３５％の範囲で澱粉転換で生成され
る。原料として比較的低固形分のものを使用する必要が
あり、更に生産性を制約し、そしてそれらの分離を更に
煩雑にする希釈されたシクロデキストリンが生産される
。
シクロデキストリングリコシル基転移酵素生産物として
知られた微生物の不利なことは我々が優れた微生物を探
索する刺激となった。要求を満足させる微生物の基準は
コストと酵素生産の容易性の実用的観点から決定した。
知られた微生物の不利なことは我々が優れた微生物を探
索する刺激となった。要求を満足させる微生物の基準は
コストと酵素生産の容易性の実用的観点から決定した。
微生物中の特性は簡単な培地で速やかに生育すること、
微生物はまた広いｐＨ範囲、換言すれば、培地条件の変
化にも酵素生産に比較的感受性がない細胞外で酵素を高
水準で生産すること、そしてまた、生産された酵素は容
易に分離しそして精製できることも必要とした。
微生物はまた広いｐＨ範囲、換言すれば、培地条件の変
化にも酵素生産に比較的感受性がない細胞外で酵素を高
水準で生産すること、そしてまた、生産された酵素は容
易に分離しそして精製できることも必要とした。
本研究において、シクロデキストリングリコシル基転移
酵素は数個の基準を満すことを必要とした。酵素は広い
ｐＨ範囲で作用することが望ましく、成程度浅いｐＨ最
適値を現わすことば−層望ましいことである。酵素は容
易に精製されねばならず、そして精製によって活性が実
質的に減少を示してはならない。酵素はまた半減期が４
０℃で数週間、特に固定化した場合は必要である。
酵素は数個の基準を満すことを必要とした。酵素は広い
ｐＨ範囲で作用することが望ましく、成程度浅いｐＨ最
適値を現わすことば−層望ましいことである。酵素は容
易に精製されねばならず、そして精製によって活性が実
質的に減少を示してはならない。酵素はまた半減期が４
０℃で数週間、特に固定化した場合は必要である。
更にそれ以上の基準により、酵素は可溶酵素のみならず
、適宜の担体上に固定化しても使用されることを考える
と、酵素は容易に固定され、そして、その高活性を持続
するためにいかなる補足因子又は金属を必要としないこ
とが必要とされる。
、適宜の担体上に固定化しても使用されることを考える
と、酵素は容易に固定され、そして、その高活性を持続
するためにいかなる補足因子又は金属を必要としないこ
とが必要とされる。
我々の研究の結果、多くの細菌を含む土壌を分離しシク
ロデキストリングリコシル基転移酵素活性を示す微生物
を分離した。数種を一層精密に試験し、そしてこれらの
うちの３種の微生物が数種の観点において最も優れたシ
クロデキストリングリコシル基転移酵素を生産すること
を見出した。
ロデキストリングリコシル基転移酵素活性を示す微生物
を分離した。数種を一層精密に試験し、そしてこれらの
うちの３種の微生物が数種の観点において最も優れたシ
クロデキストリングリコシル基転移酵素を生産すること
を見出した。
本発明は広いｐＨ範囲で良好な活性を示し、活性を実質
的に失わずに容易に精製でき、その活性の保有に捕捉因
子又は金属を必要とせずに容易に固定化でき、４０℃で
数週間の半減期を有する新規シクロデキストリングリコ
シル基転移酵素である。
的に失わずに容易に精製でき、その活性の保有に捕捉因
子又は金属を必要とせずに容易に固定化でき、４０℃で
数週間の半減期を有する新規シクロデキストリングリコ
シル基転移酵素である。
本発明の一つの態様はＮＲＲＬＢ−１８３７３により生
産される酵素である。そして他の態様はシクロデキスト
リングリコシル基転移酵素がＮＲＲＬＢ１８３７４によ
って生産される。最良の態様は、この酵素がＮＲＲＬＢ
−１８３７５により生産されることである。
産される酵素である。そして他の態様はシクロデキスト
リングリコシル基転移酵素がＮＲＲＬＢ１８３７４によ
って生産される。最良の態様は、この酵素がＮＲＲＬＢ
−１８３７５により生産されることである。
本発明に使用する微生物は１９８８年６月７日にエヌ
アールアールエル（ＮＲＲＬ）に寄託し、バシルス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ） ＳＰ ４３０はＮＲＲＬ Ｂ−１８
３７３、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ） ＳＰ ８６０
はＮＲＲＬ Ｂ−１８３７４、シュードモナス（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ） ＳＰ １７０はＮＲＲＬＢ−１８
３７５として寄託番号を受けている。
アールアールエル（ＮＲＲＬ）に寄託し、バシルス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ） ＳＰ ４３０はＮＲＲＬ Ｂ−１８
３７３、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ） ＳＰ ８６０
はＮＲＲＬ Ｂ−１８３７４、シュードモナス（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ） ＳＰ １７０はＮＲＲＬＢ−１８
３７５として寄託番号を受けている。
本発明は公知のシクロデキストリングリコシル基転移酵
素と数種の重要な点において劇的に区別され、そして相
違する数種のシクロデキストリングリコシル基転移酵素
の発見である。これらの酵素は土壌から分離した３種の
従来未知の細菌により生産される。しかしながら、同−
又は類似の酵素が他の微生物により生産されるであろう
。要するに、本シクロデキストリングリコシル基転移酵
素は公知のシクロデキストリングリコシル基転移酵素に
比し前述のように多くの望ましい特性を有し有用である
。
素と数種の重要な点において劇的に区別され、そして相
違する数種のシクロデキストリングリコシル基転移酵素
の発見である。これらの酵素は土壌から分離した３種の
従来未知の細菌により生産される。しかしながら、同−
又は類似の酵素が他の微生物により生産されるであろう
。要するに、本シクロデキストリングリコシル基転移酵
素は公知のシクロデキストリングリコシル基転移酵素に
比し前述のように多くの望ましい特性を有し有用である
。
以下の記載は本発明に関する微生物からシクロデキスト
リングリコシル基転移酵素の生産の代表的なものである
。１２リツトルの標準培養において、特定菌株の５％接
種材料を加え、のち下記を含む澱粉／塩培養基中で３０
℃で１夜生育する。
リングリコシル基転移酵素の生産の代表的なものである
。１２リツトルの標準培養において、特定菌株の５％接
種材料を加え、のち下記を含む澱粉／塩培養基中で３０
℃で１夜生育する。
４ ｍＭ Ｍｇ ５０４ １０ｍＭ ＮＨ４ＣＱ０
．０３ｍＭ Ｍｎ ５ｏ４０．０６ｍＭ（ＮＨ４）２
ＳＯ４６、８ｍＭ ＮａＣＱ Ｏ，０６ｍＭ
ＦｅＳＯ４１４，６ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４ １，６ｍＭ クエン酸塩 Ｉ ｍＭ ＣａＣＱ ２ 培養器を十分な通気を行って３０℃に保持し、そして約
２時間毎に試料の生育、ｐＨ及びシクロデキストラナー
ゼ活性（ＫＩ分析法による）を監視する。シクロデキス
トラナーゼ活性の測定において、活性は培養物自体を「
酵素」として直接使用して決定した。培養の後段（約２
４時間から）で培養液の試料を遠心分離して細胞を除き
、そして試験は培養液の上澄液を用いて行う。
．０３ｍＭ Ｍｎ ５ｏ４０．０６ｍＭ（ＮＨ４）２
ＳＯ４６、８ｍＭ ＮａＣＱ Ｏ，０６ｍＭ
ＦｅＳＯ４１４，６ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４ １，６ｍＭ クエン酸塩 Ｉ ｍＭ ＣａＣＱ ２ 培養器を十分な通気を行って３０℃に保持し、そして約
２時間毎に試料の生育、ｐＨ及びシクロデキストラナー
ゼ活性（ＫＩ分析法による）を監視する。シクロデキス
トラナーゼ活性の測定において、活性は培養物自体を「
酵素」として直接使用して決定した。培養の後段（約２
４時間から）で培養液の試料を遠心分離して細胞を除き
、そして試験は培養液の上澄液を用いて行う。
培養は４時間の間活性のレベルが一定になった時又は減
少が観察された時に終了する。酵素を用いた代表的な培
養において、酵素の精製は下記のようにして行う。酵素
の回収は５０％に近ずく、そして特殊の活性（ｍｇ蛋白
当りの単位）は１２８．０００ （培養液の上澄を０．
２μが適材を通す）から最終の精製酵素である５８０，
０００に増加する。
少が観察された時に終了する。酵素を用いた代表的な培
養において、酵素の精製は下記のようにして行う。酵素
の回収は５０％に近ずく、そして特殊の活性（ｍｇ蛋白
当りの単位）は１２８．０００ （培養液の上澄を０．
２μが適材を通す）から最終の精製酵素である５８０，
０００に増加する。
遊離酵素ＫＩ試験は５ ｍＭ ＣａＣＱ ２及び１００
ｍＭイミダゾールを含む０．２％可溶性澱粉を基質とし
て用いｐＨ７，０でシクロデキストラナーゼに対して行
うａ４０℃で基質の０．３０ｍ Ｌに酵素の１０μＱを
加える。１０分間培養した後反応を０．２ＭＨＣＱ及び
０．５ｍＬの０．０２％Ｉ２及び０．２０％ＫＩを含む
溶液を加えて停止する。背後の対照は０．２ＭＨＣＱの
４．０ｍ Ｌ続いて酵素１０μＱ及びｌ２−ＫＩ混合物
の０．５ｍ Ｌを基質のＯＪｍＬに加えることにより行
われる。ｍＬ当りの活性単位は下記式により決められる
。
ｍＭイミダゾールを含む０．２％可溶性澱粉を基質とし
て用いｐＨ７，０でシクロデキストラナーゼに対して行
うａ４０℃で基質の０．３０ｍ Ｌに酵素の１０μＱを
加える。１０分間培養した後反応を０．２ＭＨＣＱ及び
０．５ｍＬの０．０２％Ｉ２及び０．２０％ＫＩを含む
溶液を加えて停止する。背後の対照は０．２ＭＨＣＱの
４．０ｍ Ｌ続いて酵素１０μＱ及びｌ２−ＫＩ混合物
の０．５ｍ Ｌを基質のＯＪｍＬに加えることにより行
われる。ｍＬ当りの活性単位は下記式により決められる
。
［０，０１ｘ ０Ｄａ１
式中のＯＤａ及びＯＤｓは背景（対照）と試料の７００
＋１メータによる光学密度の比較である。背景と試料の
間の光学密度の差は吸光単位で０．１及び０．４の間で
なければならない。活性表示は１２５０及び５０００、
単位ｍＬ当りの間である。もし、値がこの範囲になかっ
たら、酵素を希釈して後計算の因子にする。
＋１メータによる光学密度の比較である。背景と試料の
間の光学密度の差は吸光単位で０．１及び０．４の間で
なければならない。活性表示は１２５０及び５０００、
単位ｍＬ当りの間である。もし、値がこの範囲になかっ
たら、酵素を希釈して後計算の因子にする。
各菌株により生産されたシクロデキストラナーゼは細胞
外酵素であった。それは最初の遠心分離による菌の除去
により酵素の回収に極めて有効である。細胞を除いた上
澄みを下記の操作を通して４℃に保持する。上澄みを常
時撹拌して硫酸アンモニウム（５０ｇ／Ｌ）を徐々に加
え、次いで不溶性のさらさらした澱粉（５０ｇ／Ｌ）を
加える。この混合物を約１時間ゆるやかに撹拌し、その
間不溶性澱粉をｌ濾過により集めそして空気で乾燥する
。澱粉固型物を後に１０ミリモルに２ＨＰＯ４，３ＭＮ
ａＣＱ及び０．１Ｍマルトースの溶液中に７．５のｐＨ
で懸濁しそして室温で約１時間撹拌する。澱粉からシク
ロデキストラナーゼを遊離するに使用するこの溶液の容
積は厳格ではなく望む酵素の最終の濃度により変えるこ
とができる。さらさらした澱粉は０，２μン濾過材を容
易に通し、澄明な溶液になるまで反復して２２渦する段
階で除去される。この溶液は次に５ｍＭグリシンと５ｍ
ＭＣａＣＱ２、ｐＨ７に対して広く透析させ最も多くの
研究に使用される精製された酵素が得られる。
外酵素であった。それは最初の遠心分離による菌の除去
により酵素の回収に極めて有効である。細胞を除いた上
澄みを下記の操作を通して４℃に保持する。上澄みを常
時撹拌して硫酸アンモニウム（５０ｇ／Ｌ）を徐々に加
え、次いで不溶性のさらさらした澱粉（５０ｇ／Ｌ）を
加える。この混合物を約１時間ゆるやかに撹拌し、その
間不溶性澱粉をｌ濾過により集めそして空気で乾燥する
。澱粉固型物を後に１０ミリモルに２ＨＰＯ４，３ＭＮ
ａＣＱ及び０．１Ｍマルトースの溶液中に７．５のｐＨ
で懸濁しそして室温で約１時間撹拌する。澱粉からシク
ロデキストラナーゼを遊離するに使用するこの溶液の容
積は厳格ではなく望む酵素の最終の濃度により変えるこ
とができる。さらさらした澱粉は０，２μン濾過材を容
易に通し、澄明な溶液になるまで反復して２２渦する段
階で除去される。この溶液は次に５ｍＭグリシンと５ｍ
ＭＣａＣＱ２、ｐＨ７に対して広く透析させ最も多くの
研究に使用される精製された酵素が得られる。
「精製されたＪ酵素はその分子量を下記の方法により決
定する前に更に精製される。分析のために−ＰＩ精製さ
れた酵素を得るには、原培地から細胞を除く望ましい方
法はガラス容器中で４℃で細胞を一夜放置しそしてのち
、濁った液浮遊物を０．２μ濾過カセツトを通して濾過
する。
定する前に更に精製される。分析のために−ＰＩ精製さ
れた酵素を得るには、原培地から細胞を除く望ましい方
法はガラス容器中で４℃で細胞を一夜放置しそしてのち
、濁った液浮遊物を０．２μ濾過カセツトを通して濾過
する。
この方法は細胞の混入のない酵素の調製を確保する方法
である。更にその上の濃縮工程はタンジエンシアル模ｌ
濾過ユニットを用いそして１０、０００分子量をｆ濾過
て除く。この方法において約１０．０００ダルトンより
大きな蛋白質のみが原料のｌ／１０の容積に濃縮される
。この濃縮酵素の調製は次のように変形された上述の方
法に従って精製される。加えられる澱粉の量は原培養上
澄み液の容積の基として計算されない。しかし精製のた
めの濃縮酵素溶液の容量の２倍はある。
である。更にその上の濃縮工程はタンジエンシアル模ｌ
濾過ユニットを用いそして１０、０００分子量をｆ濾過
て除く。この方法において約１０．０００ダルトンより
大きな蛋白質のみが原料のｌ／１０の容積に濃縮される
。この濃縮酵素の調製は次のように変形された上述の方
法に従って精製される。加えられる澱粉の量は原培養上
澄み液の容積の基として計算されない。しかし精製のた
めの濃縮酵素溶液の容量の２倍はある。
即ち、１０リツトルの培養液が１リツトルに濃縮される
に対し、さらさらした澱粉の量はｔｏｏ ｇである。更
にその上、この方法は３回繰り返し、各回毎にン戸液に
澱粉のみ加えそして酵素の全部が不溶性澱粉に最後には
結合するようにする。
に対し、さらさらした澱粉の量はｔｏｏ ｇである。更
にその上、この方法は３回繰り返し、各回毎にン戸液に
澱粉のみ加えそして酵素の全部が不溶性澱粉に最後には
結合するようにする。
次に各濾過材上に集まった澱粉固形物を合しそして同じ
マルトース、リン酸塩及び食塩溶液と混合し固定化され
た酵素を遊離する。この加えられる溶液の容量はゆるや
かに撹拌される澱粉のスラリーを形成するに必要な最少
の量である。
マルトース、リン酸塩及び食塩溶液と混合し固定化され
た酵素を遊離する。この加えられる溶液の容量はゆるや
かに撹拌される澱粉のスラリーを形成するに必要な最少
の量である。
続いて、このスラリーのｌ濾過て得られた澱粉固形物に
同様の溶離工程を行いそして、この工程で酵素が僅かか
または溶離しなくなるまで多数回繰り返す。′ｉｐ過さ
れたシクロデキストラーゼ活性の高水準を示す溶液を合
しそして透析しそして分析に使用する。成る場合におい
て、沈殿物が電気泳動により分析用に濃縮される。これ
らの目的のために酵素は凍結乾燥により約１０倍に濃縮
されそして適宜のゲル充填緩衝液中で復元させる。
同様の溶離工程を行いそして、この工程で酵素が僅かか
または溶離しなくなるまで多数回繰り返す。′ｉｐ過さ
れたシクロデキストラーゼ活性の高水準を示す溶液を合
しそして透析しそして分析に使用する。成る場合におい
て、沈殿物が電気泳動により分析用に濃縮される。これ
らの目的のために酵素は凍結乾燥により約１０倍に濃縮
されそして適宜のゲル充填緩衝液中で復元させる。
精製した酵素試料の成るものは分子量測定用にポリアク
リルアミドゲル上に装填する前に濃縮により調製される
。精製及び濃縮操作はＢ。
リルアミドゲル上に装填する前に濃縮により調製される
。精製及び濃縮操作はＢ。
シルクランス、ストレイン（Ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、 ５
ｔｒａｉｎｓ）１７０．４３０及び８６０；Ｂ、マセラ
ンス（ｍａｃｅｒａｎｓ）酵素試料で試験したのと同様
である。供給者（アマノ）により提供された粗製遺物及
び供給者により提供されたデータは我々の分析の確認に
使用した。全試料それが濃縮されていてもいなくても、
を装填緩衝液（溶液として加える場合１／１０容）に加
えそしてラエミリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）により記述された
方法（Ｕ、に、 ｌａｅｍｍｌｉ、ネイチ−？−（Ｎａ
ｔｕｒｅ） ２２２． ｐ ６８０．１９７９）に従
って調製した１０％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリ
ルアミドゲル上に装填する。異なった試料、多種の試料
が次々に相互に動くように装填しゲルを通してマイグレ
ーションの正確な比較をする。電気泳動後、ゲルをクマ
シーブルーー染料で着色しそして後、７％酢酸（氷酢酸
）、染料を含まない３０％メタノール中で脱色する。分
子量は酵素試料の動きと分子量標準蛋白との動きを同時
に比較して決定する。
ｔｒａｉｎｓ）１７０．４３０及び８６０；Ｂ、マセラ
ンス（ｍａｃｅｒａｎｓ）酵素試料で試験したのと同様
である。供給者（アマノ）により提供された粗製遺物及
び供給者により提供されたデータは我々の分析の確認に
使用した。全試料それが濃縮されていてもいなくても、
を装填緩衝液（溶液として加える場合１／１０容）に加
えそしてラエミリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）により記述された
方法（Ｕ、に、 ｌａｅｍｍｌｉ、ネイチ−？−（Ｎａ
ｔｕｒｅ） ２２２． ｐ ６８０．１９７９）に従
って調製した１０％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリ
ルアミドゲル上に装填する。異なった試料、多種の試料
が次々に相互に動くように装填しゲルを通してマイグレ
ーションの正確な比較をする。電気泳動後、ゲルをクマ
シーブルーー染料で着色しそして後、７％酢酸（氷酢酸
）、染料を含まない３０％メタノール中で脱色する。分
子量は酵素試料の動きと分子量標準蛋白との動きを同時
に比較して決定する。
等電点を測定するために使用する試料は分子量測定で記
載したようにして調製する。そしてｐＨ３，５〜９．５
の範囲の既製のゲル（ＬＫＢファルマシア）上に装填す
る。ゲルは陽極及び陰極に１Ｍリン酸及び１ＭＮａＯＨ
溶液と共にそれぞれに移動する。初めの電圧は５２０ボ
ルトでありそして終りのそれは、１５２０ボルトであっ
た。同様に、電流は６０ｍＡ乃至６．５ｍＡであった。
載したようにして調製する。そしてｐＨ３，５〜９．５
の範囲の既製のゲル（ＬＫＢファルマシア）上に装填す
る。ゲルは陽極及び陰極に１Ｍリン酸及び１ＭＮａＯＨ
溶液と共にそれぞれに移動する。初めの電圧は５２０ボ
ルトでありそして終りのそれは、１５２０ボルトであっ
た。同様に、電流は６０ｍＡ乃至６．５ｍＡであった。
移動後、ゲルの正確なｐＨを測定しそして３．８乃至８
．１の範囲であった。ゲルは後４％スルホサリチル酸、
１２．５％トリクロロ酢酸及び３０％メタノール中に固
定しそして０．０４％クマシーブルー、１０％酢酸、２
７％エタノール及び０．５％ＣＬＩＳＯ４中で着色する
。
．１の範囲であった。ゲルは後４％スルホサリチル酸、
１２．５％トリクロロ酢酸及び３０％メタノール中に固
定しそして０．０４％クマシーブルー、１０％酢酸、２
７％エタノール及び０．５％ＣＬＩＳＯ４中で着色する
。
本酵素の最適ｐＨの測定のために標準試験溶液［２％マ
ルトリン（ｍａｌｔｒｉｎ） １５０．５ｍＭ ＣａＣ
Ｑ ２］を緩衝ｐＨをクエン酸塩、イミダゾール及びグ
リシンの緩衝剤を用いて２と９の間に変えることを除い
て使用する。精製された酵素を基質の１モルに加えそし
て４０℃で３時間培養する。試料を密封容器（前もって
蒸発により水分を除く）中で２分間沸騰し、そして冷却
する。アルファアミラーゼの過剰量を加えそして試料を
６０℃で３０〜６０分培養し基質中の未反応澱粉を分解
する。
ルトリン（ｍａｌｔｒｉｎ） １５０．５ｍＭ ＣａＣ
Ｑ ２］を緩衝ｐＨをクエン酸塩、イミダゾール及びグ
リシンの緩衝剤を用いて２と９の間に変えることを除い
て使用する。精製された酵素を基質の１モルに加えそし
て４０℃で３時間培養する。試料を密封容器（前もって
蒸発により水分を除く）中で２分間沸騰し、そして冷却
する。アルファアミラーゼの過剰量を加えそして試料を
６０℃で３０〜６０分培養し基質中の未反応澱粉を分解
する。
試料は後、アルファ、ベーター及びガンマ−シクロデキ
ストリンのその材料の標準品と比較によってｉす定する
ためのＨＰＬＣによる分析に用いるまで冷凍保存する。
ストリンのその材料の標準品と比較によってｉす定する
ためのＨＰＬＣによる分析に用いるまで冷凍保存する。
ベーターシクロデキストリンへの最高コンバージョンは
２％マルトリン＋５０．５ ｍＭ Ｃａｃ Ｑ ２゜５
ｍＭイミダゾールのｐＨ７の基質及び１０％（Ｖ／Ｖ）
エタノールを用い４０℃で精製酵素試料を使用して、各
酵素についで決めた。
２％マルトリン＋５０．５ ｍＭ Ｃａｃ Ｑ ２゜５
ｍＭイミダゾールのｐＨ７の基質及び１０％（Ｖ／Ｖ）
エタノールを用い４０℃で精製酵素試料を使用して、各
酵素についで決めた。
本酵素の重要なそして区別される電点な特性の幾つかを
表１に摘要する。シクロデキストリングリコシル基転移
酵素の少くとも二つの原型があるこ、とは既に知られて
いる。転移反応の少くとも始期の相で、そのうちの一つ
は主にアルファ生成体でありそして他は主にビータ−生
成体である。Ｈ，ペングー（Ｂｅｒ＋ｄｅｒ）、アドバ
ンスインバイオテクノロジカルプロセス（Ａｄｖａｎｃ
ｅ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏ
ｃｅｓｓ） ６ ＡｌａｎＲｏＬｉｓｓ、 Ｉｎｃ、
、 １９８６．３７頁。Ｂ、マセランス（ｍａｃｅｒ
ａｎｓ）及びＮＲＲＬ Ｂ−１８３７５からの酵素は第
１の級であり、一方、Ｂ、サーキュランス（Ｃｉｒｃｕ
ｔａｎｓ）、ＮＲＲＬ Ｂ−１８３７５及びＢ−１８３
７４からの酵素は第２の種類であると見ることができる
。酵素の分子量は６５又は７３キロダルトンの何れかで
ある。
表１に摘要する。シクロデキストリングリコシル基転移
酵素の少くとも二つの原型があるこ、とは既に知られて
いる。転移反応の少くとも始期の相で、そのうちの一つ
は主にアルファ生成体でありそして他は主にビータ−生
成体である。Ｈ，ペングー（Ｂｅｒ＋ｄｅｒ）、アドバ
ンスインバイオテクノロジカルプロセス（Ａｄｖａｎｃ
ｅ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏ
ｃｅｓｓ） ６ ＡｌａｎＲｏＬｉｓｓ、 Ｉｎｃ、
、 １９８６．３７頁。Ｂ、マセランス（ｍａｃｅｒ
ａｎｓ）及びＮＲＲＬ Ｂ−１８３７５からの酵素は第
１の級であり、一方、Ｂ、サーキュランス（Ｃｉｒｃｕ
ｔａｎｓ）、ＮＲＲＬ Ｂ−１８３７５及びＢ−１８３
７４からの酵素は第２の種類であると見ることができる
。酵素の分子量は６５又は７３キロダルトンの何れかで
ある。
そして等電点は前者は略々８．５を示すに拘らず後者は
それぞれ異なった本質的に異なる等電点を有する。
それぞれ異なった本質的に異なる等電点を有する。
［以下余白］
Claims (1)
- １、１）ＮＲＲＬＢ−１８３７３により生産されそして
更に分子量７３キロダルトン、等電点６．８、約７．８
のｐＨ、４０℃で最高の酵素活性を現わし、その酵素活
性の約９０％を約６．４乃至約９．０のｐＨ範囲で保有
し、そして７５％を約５．２５乃至約９のｐＨ範囲で保
有し、約２．５：９：１の割合のアルファ、ベーター、
ガンマ−シクロデキストリン混合物を生産し、そして標
準条件下で２２．５％のベーターシクロデキストリンの
最高コンバージヨンを示す特性を有するシクロデキスト
リングリコシル基転移酵素；２）ＮＲＲＬＢ−１８３７
４により生産されそして更に分子量７３キロダルトン、
等電点７．８、約７．２のｐＨ、４０℃で最高の酵素活
性を現わし、その酵素活性の約９０％を約５．７５乃至
約７．７のｐＨ範囲で保有し、そして７５％を約４．８
乃至約８．２のｐＨ範囲で保有し、約３：１２：１の割
合のアルファ、ベーター、ガンマーシクロデキストリン
混合物を生産し、そして標準条件下で２３％のベーター
シクロデキストリンの最高コンバージヨンを示す特性を
有するシクロデキストリングリコシル基転移酵素；３）
ＮＲＲＬＢ−１８３７５により生産されそして更に分子
量６５キロダルトン、等電点８．５、約６．５のｐＨ、
４０℃で最高の酵素活性を現わし、その酵素活性の約９
０％が約５．５乃至７．６のｐＨ範囲で保有し、そして
７５％を約４．６乃至約８．３のｐＨ範囲で保有し、約
１：１．５：＜１の割合のアルファ、ベーター、ガンマ
−シクロデキストリン混合物を生産し、そして標準条件
下で１７％のベーターシクロデキストリン最高コンバー
ジヨンを示す特性を有するシクロデキストリングリコシ
ル基転移酵素よりなる群から選択されたシクロデキスト
リングリコシル基転移酵素。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US22864788A | 1988-08-05 | 1988-08-05 | |
| US228647 | 1988-08-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0286775A true JPH0286775A (ja) | 1990-03-27 |
| JPH0532026B2 JPH0532026B2 (ja) | 1993-05-14 |
Family
ID=22858056
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1203707A Granted JPH0286775A (ja) | 1988-08-05 | 1989-08-05 | 新規シクロデキストリングリコシル基転移酵素 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0356048A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0286775A (ja) |
| FI (1) | FI893708L (ja) |
| HU (1) | HUT53933A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5874261A (en) * | 1988-09-02 | 1999-02-23 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Method for the purification of glycosyltransferases |
| HU216881B (hu) * | 1990-04-16 | 1999-09-28 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Eljárás és berendezés szaharidkészítmények glikozil transzferáz által katalizált előállítása |
-
1989
- 1989-08-03 EP EP19890307938 patent/EP0356048A3/en not_active Withdrawn
- 1989-08-04 HU HU893977A patent/HUT53933A/hu unknown
- 1989-08-04 FI FI893708A patent/FI893708L/fi not_active Application Discontinuation
- 1989-08-05 JP JP1203707A patent/JPH0286775A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUT53933A (en) | 1990-12-28 |
| FI893708A7 (fi) | 1990-02-06 |
| FI893708L (fi) | 1990-02-06 |
| EP0356048A2 (en) | 1990-02-28 |
| JPH0532026B2 (ja) | 1993-05-14 |
| EP0356048A3 (en) | 1990-11-14 |
| FI893708A0 (fi) | 1989-08-04 |
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