JPH0532028B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はアデシノンもしくはアデニンとリン源
とからアデノシン三リン酸（ATP）を製造する
方法に関するものである。

［従来の技術］ 従来、酵母を使用してアデノシンもしくはアデ
ニンとリン源とからATPを製造する方法として
糖などをエネルギー源として基質レベルのリン酸
化によるATPの製造法が知られている。

また、メタノールをエネルギー源として特定の
酵母を使用して酸化的リン酸化により、アデノシ
ン―リン酸（AMP）またはアデノシン二リン酸
（AMP）を原料としてATPを生産する方法も既
に報告されている｛Agric.Biol.Chem.第46巻第４
号第1097ページ（1982年）｝。

［従来の技術の問題点］ しかしながらAMPやADPはATPの原料とし
ては高価であり、かつ化学的に不安定な化合物で
あるため工業的には前記従来技術は必ずしも有利
な方法ではない。

そこで本発明者らは工業的に有利なATPの生
産方法の確立を目的に鋭意研究した結果、極めて
特定のメタノール酵母を使用すればよいと言う事
実を見い出した。

［問題を解決するための手段］ すなわち、本発明の上記の目的はハンゼヌラ
（Hansenula）属、トルロプシス（Torulopsis）
属またはピチア（Pichia）属に属しかつメタノー
ルの存在下アデノシンもしくはアデニンとリン酸
源からアデノシン三リン酸を生成する能力を有す
る酵母をメタノールを主炭素源とする培地に培養
して得た菌体もしくは培養物またはそれらの処理
物を、メタノールの存在下アデノシンもしくはア
デニンおよびリン酸源と接触させることによりア
デノシン三リン酸を生成蓄積せしめこれを採取す
ることによつて達成される。特に本発明前記の目
的は前記の菌体処理物がプラスモリシス化処理さ
れたものである時に、より効果的に達成される。
以下本発明の構成、実施例ならびに効果を説明す
る。

本発明に使用されるハンゼヌラ（Hansenula）
属に属する酵母としてはキヤプスレータ
（capsulata IFO 0974）とノンフアーメンタンス
（nonfermentance IFO 1473）などがあり、トル
ロプシス（Torulopsis）属に属する酵母として
はメタノロベツセンス（methanolovescence
ATCC 26176）、ピナス（pinus IFO 1327）、グ
ラブレータ（glabrata IFO 0005）、およびピチ
ア（Pichia）属に属する酵母としては、パストリ
ス（pastoris IFO 0948）、トレハロフイラ
（trehalophila ATCC 22307）等がある。

これらの酵母はメタノール質化能力を持つもの
であり、メタノールを主炭素源とする培地で培養
される。

培地組成としては１〜10容量％のメタノール以
外に窒素源、リン源、マグネシウム源、および微
量要素としてのサイアミン（場合によつては、更
にビチオン）の添加が必要である。培養は好気的
条件下で行ない、対数増殖前記に集菌する。菌体
の分離は公知の分離方法によつて行なわれる。か
くして得られた菌体もしくは培養物はメタノール
をエネルギー源とし、高エネルギーリン酸化合物
を酸化的リン酸化により生成する能力を有するも
のてせあるが、生成物たるATPなどのリン酸化
合物は菌体外に分泌されにくい。従つて、細胞膜
に透過性を持たせるために菌体もしくは培養物を
処理する。その処理法としては従来公知の方法が
使用可能であるが本発明においては、好ましくは
簡単で、かつ最も活性の高いソルビトールによる
原形質分離（プラスモリシス）化処理法を採用す
る。処理後の菌体もしくは培養物はATP生産反
応に供される。

反応原料としてのアデノシンまたはアデニン
は、いかなる方法で製造されたものも使用され得
る。リン源としては正リン酸塩、ピロリン酸塩が
好ましい。

反応はアデノシンまたはアデニン、メタノー
ル、モノリン酸塩および／またはピロリン酸塩、
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（NAD⁺）、Ｄ―ソルビトール、マグネシウム塩、
更に場合によつては還元型グルタチオン（GSH）
および少量のATPの存在下で行なわれる。

反応に使用する各種基質および反応補助因子の
最適濃度は次のとおりである。

(1) アデノシンを基質とした場合 アデノシン 30〜50ｍmol／ メタノール 800〜1200ｍmol／ K₂HPO₄またはNa₂HPO₄ 25〜150ｍmol／ Na₄P₂O₇・10H₂OまたはK₄P₂O₇
50〜110ｍmol／ NAD⁺ １〜15ｍmol／ GSH ０〜15ｍmol／ Ｄ―ソルビトール 200〜800ｍmol／ MgSO₄・7H₂O 30〜90ｍmol／ ATP ０〜10ｍmol／ (2) アデニンを基質とした場合 アデニン ５〜10ｍmol／ メタノール 800〜2500ｍmol／ K₂HPO₄またはNa₂HPO₄ 25〜150ｍmol／ Na₄P₂O₇・10H₂OまたはK₄P₂O₇
50〜110ｍmol／ NAD⁺ １〜５ｍmol／ GSH ０〜５ｍmol／ Ｄ―ソルビトール 200〜800ｍmol／ MgSO₄・7H₂O 10〜80ｍmol／ ATP ０〜10ｍmol／ 本発明においては、上記のように多量のマグネ
シウムの存在下で反応を行なうことによつて反応
が促進される。また、正リン酸のみをリン源とし
て使用する際にはATPの共存が必要である。ピ
ロリン酸をリン源として使用する際はNDA⁺を５
ｍmol／以上添加することが必要である。

反応の最適温度は20〜30℃、最適PHは７〜９で
ある。

また、反応は不断の酸素供給が必要であり、例
えば開放下、振盪条件下で行なう。

かくして、メタノールの酸化系、ヌクレオチド
のサルベージ経路、酸化的リン酸化系の共同作用
によるアデノシンもしくはアデニンとリン源から
のATP生産が進行する。

反応終了後の反応液中にはATPが蓄積し、他
に少量のAMP、ADPおよび反応時間が短い場合
には未反応基質のアデノシンもしくはアデニンが
共存する。

反応液中に蓄積したATPは、イオン交換樹脂、
吸着樹脂、活性炭等を使用する方法、高速液体ク
ロマトグラフを使用する方法等種々の方法によつ
てAMP、ADP、ATP、アデノシン、アデニン、
NAD＋を分離し、ATPを単独で採取することが
できる。以下本発明法を実施例をもつて説明す
る。

［実施例］ 実施例 １ ｛培養｝ NH₄Cl 0.4wt％、KH₂PO₄ 0.1wt％、K₂HPO₄
0.1wt％、MgSO₄・7H₂O 0.05％wt％および酵母
エキス0.2wt％からなるPH6.0の培地を試験管に５
ミリリツトル取り、これを殺菌しメタノールを２
容量％になるように添加した。これにメタノール
酵母を一白金耳移植した。そして温度28℃にて48
時間往復振盪培養（種母培養）を行なつた。

次に前記の培養で得た種母培養液と同じ組成の
培養液を容量２リツトルの振盪フラスコに500ミ
リリツトル取り、殺菌してメタノールを２容量％
になるように添加し、更に種母培養液５ミリリツ
トルを添加し、温度28℃で24〜48時間往復振盪培
養を行なつた。培養後、培養液を遠心分離し、酵
母を分離した。

｛プラスモリシス化処理｝ 分離酵母80ｇ／（乾燥重量換算）を蒸溜水に
分散せしめ、45分間37℃でかつ静止状態で放置し
た。しかる後に、４モル／リツトルのＤ―ソルビ
トール水溶液を加え、最終濃度1.5モル／リツト
ルのＤ―ソルビトール濃度とし、10分間37℃で静
止状態で放置した。

｛反応｝ プラスモリシス化処理酵母（ハンゼヌラ キャ
ブスレータ IFO 0974）液200μ（乾燥菌体換
算重量10mg、Ｄ―ソルビトール300μmol含有）と
アデノシン20μmol（またはアデニン5μmol）、
K₂HPO₄100μmol、NAD＋0.5μmol、メタノール
500μmol、MgSO₄・7H₂O40μmol、ATP1.5μmol
を総量0.5mlとし、10ml容三角フラスコ中で25℃
で20時間反応を往復振盪にて行なつた。その結
果、反応液中には16ｍmol／（４ｍmol／）
のATPがアデノシン（アデニン）から生成した。
これらの値はATP蓄積濃度から初期添加濃度を
差し引いたものである。分析は酸素法および高速
液体クロマトグラフにより行なつた。

実施例 ２ 実施例１と全く同様にしてハンデヌラ ノンフ
アーメンタンス（IFO 1473）を用い、培養、菌
体処理および反応を行なつたところ、反応液中に
４ｍmol／（２ｍmol／）のATPがアデノシ
ン（アデニン）から生成した。

実施例 ３ 実施例１と全く同様にしてトルロプシス メタ
ノロベツセンス（ATCC 26176）を用い、培養、
菌体処理および反応を行なつたところ、反応液中
に10ｍmol／（２ｍmol／）のATPがアデノ
シン（アデニン）から生成した。

実施例 ４ 実施例１と全く同様にしてトルロプシス ピチ
ス（IFO 1327）を用い、培養、菌体処理および
反応を行なつたところ、反応液中に３ｍmol／
（1.2ｍmol／）のATPがアデノシン（アデニ
ン）から生成した。

実施例 ５ 実施例１と全く同様にしてピチア パストリス
（IFO 0948）を用い、培養、菌体処理および反応
を行なつたところ、反応液中に６ｍmol／（３
ｍmol／）のATPがアデノシン（アデニン）
から生成した。

実施例 ６ 実施例１と全く同様にしてピチア トレハロフ
イラ（IFO 1683）を用い、培養、菌体処理およ
び反応を行なつたところ、反応液中に２ｍmol／
（1.2ｍmol／）のATPがアデノシン（アデ
ニン）から生成した。

［発明の効果］ 本発明法は特定のメタノール資化性酵母を使用
しており、従来これらの酵母による上記方法での
ATP生産は報告されていない。従つて、本発明
はATPの工業的な製法として全く新規なもので
ある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ハンゼヌラ（Hansenula）属、トルロプシス
   （Torulopsis）属またはピチア（Pichia）属に属
   しかつメタノールの存在下アデノシンもしくはア
   デニンとリン酸源からアデノシン三リン酸を生成
   する能力を有する酵母をメタノールを主炭素源と
   する培地に培養して得た菌体もしくは培養物また
   はそれらの処理物を、メタノールの存在下アデノ
   シンもしくはアデニンおよびリン酸源と接触させ
   ることによりアデノシン三リン酸を生成蓄積せし
   めこれを採取することを特徴とするアデノシン三
   リン酸の製法。 ２ 処理物がプラスモリシス化処理された物であ
   る特許請求の範囲第１項記載のアデノシン三リン
   酸の製法。