JPH0518553B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0518553B2 JPH0518553B2 JP59217522A JP21752284A JPH0518553B2 JP H0518553 B2 JPH0518553 B2 JP H0518553B2 JP 59217522 A JP59217522 A JP 59217522A JP 21752284 A JP21752284 A JP 21752284A JP H0518553 B2 JPH0518553 B2 JP H0518553B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- alcohol oxidase
- ethanol
- approx
- methanol
- alcohol
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Description
（産業上の利用分野）
本発明は、保存安定性に優れた新規なアルコー
ルオキシダーゼ及びその製造方法に関するもので
あり、更に詳しくは35℃以上で生育するトルロプ
シス属酵母をアルコール培地で培養して得られる
新規なアルコールオキシダーゼ及びその製造方法
に関するものであり、その目的とするところは、
安価で大量に得られるアルコールを発酵原料とし
て有効利用し、産業上、有益な酵素であるアルコ
ールオキシダーゼ及びその製造方法を提供するこ
とにある。 （従来の技術） アルコールオキシダーゼは下記反応を触媒す
る。 RCH2OH＋O2RCHO＋H2O2 （式中、Ｒは水素又はアルキル基を表す。） そのため、アルコールオキシダーゼは、各種ア
ルデヒドやアルコールの製造、分析に用いられる
ことができる。したがつて、このような酵素は、
省エネルギーが経済性を左右する重要な因子とな
つている化学工業のうち、特にアルデヒドやアル
コールの製造に大変有用であるとともに、他方、
血液中のアルコール測定、酵素電極用の酵素とし
ても、産業上有益である。 一方、メタノール資化性微生物として知られて
いる酵母には、例えばキヤンデイダ（Candida）
属、サツカロマイセス（Saccharomyces）属、
トルロプシス（Torulopsis）属酵母が、アグリ
カルチヤル アンド バイオロジカルケミストリ
ー36巻、13号、2297〜2306頁、1972年
（Agricultural and Biological Chemistry
Vol36No.13 2297〜2306、1972）に記載されてお
り、またクレツケラ−（Kloeckera）属酵母がア
グリカルチヤル アンド バイオロジカルケミス
トリー36巻、１号、68〜75頁、1972年
（Agricultural and Biological Chemistry
Vol36No.１ 68〜75、1972）に、またハンセヌラ
（Hansenula）属酵母（特開昭55−19094号公報参
照）、ピヒア（Pichia）属酵母（特開昭56−26187
号公報参照）、リポマイセス（Lipomyces）属酵
母（特開昭59−135885号公報参照）がそれぞれア
ルコールオキシダーゼを生産することが知られて
いる。 （発明が解決しようとする問題点） 本発明者らは、工業的にアルデヒド、アルコー
ルを生産することを目的に、それら酵母由来のア
ルコールオキシダーゼを比較検討してみると、キ
ヤンデイダ属、クレツケラー属、ハンセヌラ属酵
母由来のアルコールオキシダーゼは、作用適温が
いずれも35℃付近であるため不安定であり、工業
的操業が困難であつた。それゆえ、安定化のため
の処理が必要であることが判明した。この原因
は、それら酵母の培養温度が28℃近辺であること
から、酵素自体の安定性もその近辺に存在するの
で、35℃付近の操業は不安定になることに起因す
る。さらに、顕著な例として、トルロプシス属酵
母においては、培養温度も20℃と著しく低く、そ
のため、酵素は極めて不安定であり、しかも精製
されたアルコールオキシダーゼの報告はなされて
いない。このことが、前記したごとくアルコール
オキシダーゼを工業的に使用するに当たつて大き
な障害となつていたのである。 （問題点を解決するための手段） そこで、本発明者らはかかる問題点を解決し、
室温において長期間活性を失わない性質を有する
アルコールオキシダーゼを求めて鋭意研究した結
果、特定の酵母に上記の性質を有するアルコール
オキシダーゼが存在することを見い出し、しかも
このアルコールオキシダーゼは容易に純粋に精製
し得、かつ従来のアルコールオキシダーゼに比較
し、驚くほどその安定性に優れた新規酵素である
ことを見い出し、本発明を完成した。 すなわち、本発明は以下の性状を有するアルコ
ールオキシダーゼ及び35℃以上で生育可能なトル
ロプシス（Torulopusis）属に属する酵母をアル
コール培地に培養し、培養物から以下の性状を有
するアルコールオキシダーゼを採取することを特
徴とするアルコールオキシダーゼの製造方法であ
る。 (a) 作用：次の反応を触媒する。 RCH2OH＋O2RCHO＋H2O2 （ただし、Ｒは水素又はアルキル基を表す。） (b) 基質特異性：メタノール及びエタノールに対
するミカエリス定数は、おのおの約６ｍＭ及び
17ｍＭである。 (c) 至適PH：約７〜９ (d) 安定PH：約６〜10 (e) 作用適温の範囲：約25〜40℃ (f) 耐熱性：35℃、15分間の加熱に対して安定で
ある。 (g) 分子量：約３×105、サブユニツトの分子量
は7.5×104。 本発明のアルコールオキシダーゼは、溶液状態
で約30℃で30日間保存することにより、アルコー
ルオキシダーゼの残存活性がもとの活性の約50％
以上の値を保持している性質を有している（以下
この性質を保存安定性という。）この保存安定性
の試験は、PH7.5の100ｍＭリン酸緩衝液でタンパ
ク濃度が0.1mg／mlとなるようにアルコールオキ
シダーゼ溶液を調製し、滅菌処理を施した後、約
30℃で30日間保存することによつて行われる。 次に、本発明のアルコールオキシダーゼの理化
学的性質を示すが、そのアルコールオキシダーゼ
は35℃以上で生育可能なトルロプシス属酵母から
得られたものである。 (1) 作用：次の反応を触媒する。 RCH2OH＋O2RCHO＋H2O2 （ただし、Ｒは水素又はアルキル基を表す。） (2) 基質特異性：メタノール及びエタノールに対
するミカエリス定数（Km値）は、おのおの約６
ｍＭ及び17ｍＭである。 次に、本酵素の各種基質の反応活性の比率
（エタノールの反応活性を100とする）を第１表
に表す。
ルオキシダーゼ及びその製造方法に関するもので
あり、更に詳しくは35℃以上で生育するトルロプ
シス属酵母をアルコール培地で培養して得られる
新規なアルコールオキシダーゼ及びその製造方法
に関するものであり、その目的とするところは、
安価で大量に得られるアルコールを発酵原料とし
て有効利用し、産業上、有益な酵素であるアルコ
ールオキシダーゼ及びその製造方法を提供するこ
とにある。 （従来の技術） アルコールオキシダーゼは下記反応を触媒す
る。 RCH2OH＋O2RCHO＋H2O2 （式中、Ｒは水素又はアルキル基を表す。） そのため、アルコールオキシダーゼは、各種ア
ルデヒドやアルコールの製造、分析に用いられる
ことができる。したがつて、このような酵素は、
省エネルギーが経済性を左右する重要な因子とな
つている化学工業のうち、特にアルデヒドやアル
コールの製造に大変有用であるとともに、他方、
血液中のアルコール測定、酵素電極用の酵素とし
ても、産業上有益である。 一方、メタノール資化性微生物として知られて
いる酵母には、例えばキヤンデイダ（Candida）
属、サツカロマイセス（Saccharomyces）属、
トルロプシス（Torulopsis）属酵母が、アグリ
カルチヤル アンド バイオロジカルケミストリ
ー36巻、13号、2297〜2306頁、1972年
（Agricultural and Biological Chemistry
Vol36No.13 2297〜2306、1972）に記載されてお
り、またクレツケラ−（Kloeckera）属酵母がア
グリカルチヤル アンド バイオロジカルケミス
トリー36巻、１号、68〜75頁、1972年
（Agricultural and Biological Chemistry
Vol36No.１ 68〜75、1972）に、またハンセヌラ
（Hansenula）属酵母（特開昭55−19094号公報参
照）、ピヒア（Pichia）属酵母（特開昭56−26187
号公報参照）、リポマイセス（Lipomyces）属酵
母（特開昭59−135885号公報参照）がそれぞれア
ルコールオキシダーゼを生産することが知られて
いる。 （発明が解決しようとする問題点） 本発明者らは、工業的にアルデヒド、アルコー
ルを生産することを目的に、それら酵母由来のア
ルコールオキシダーゼを比較検討してみると、キ
ヤンデイダ属、クレツケラー属、ハンセヌラ属酵
母由来のアルコールオキシダーゼは、作用適温が
いずれも35℃付近であるため不安定であり、工業
的操業が困難であつた。それゆえ、安定化のため
の処理が必要であることが判明した。この原因
は、それら酵母の培養温度が28℃近辺であること
から、酵素自体の安定性もその近辺に存在するの
で、35℃付近の操業は不安定になることに起因す
る。さらに、顕著な例として、トルロプシス属酵
母においては、培養温度も20℃と著しく低く、そ
のため、酵素は極めて不安定であり、しかも精製
されたアルコールオキシダーゼの報告はなされて
いない。このことが、前記したごとくアルコール
オキシダーゼを工業的に使用するに当たつて大き
な障害となつていたのである。 （問題点を解決するための手段） そこで、本発明者らはかかる問題点を解決し、
室温において長期間活性を失わない性質を有する
アルコールオキシダーゼを求めて鋭意研究した結
果、特定の酵母に上記の性質を有するアルコール
オキシダーゼが存在することを見い出し、しかも
このアルコールオキシダーゼは容易に純粋に精製
し得、かつ従来のアルコールオキシダーゼに比較
し、驚くほどその安定性に優れた新規酵素である
ことを見い出し、本発明を完成した。 すなわち、本発明は以下の性状を有するアルコ
ールオキシダーゼ及び35℃以上で生育可能なトル
ロプシス（Torulopusis）属に属する酵母をアル
コール培地に培養し、培養物から以下の性状を有
するアルコールオキシダーゼを採取することを特
徴とするアルコールオキシダーゼの製造方法であ
る。 (a) 作用：次の反応を触媒する。 RCH2OH＋O2RCHO＋H2O2 （ただし、Ｒは水素又はアルキル基を表す。） (b) 基質特異性：メタノール及びエタノールに対
するミカエリス定数は、おのおの約６ｍＭ及び
17ｍＭである。 (c) 至適PH：約７〜９ (d) 安定PH：約６〜10 (e) 作用適温の範囲：約25〜40℃ (f) 耐熱性：35℃、15分間の加熱に対して安定で
ある。 (g) 分子量：約３×105、サブユニツトの分子量
は7.5×104。 本発明のアルコールオキシダーゼは、溶液状態
で約30℃で30日間保存することにより、アルコー
ルオキシダーゼの残存活性がもとの活性の約50％
以上の値を保持している性質を有している（以下
この性質を保存安定性という。）この保存安定性
の試験は、PH7.5の100ｍＭリン酸緩衝液でタンパ
ク濃度が0.1mg／mlとなるようにアルコールオキ
シダーゼ溶液を調製し、滅菌処理を施した後、約
30℃で30日間保存することによつて行われる。 次に、本発明のアルコールオキシダーゼの理化
学的性質を示すが、そのアルコールオキシダーゼ
は35℃以上で生育可能なトルロプシス属酵母から
得られたものである。 (1) 作用：次の反応を触媒する。 RCH2OH＋O2RCHO＋H2O2 （ただし、Ｒは水素又はアルキル基を表す。） (2) 基質特異性：メタノール及びエタノールに対
するミカエリス定数（Km値）は、おのおの約６
ｍＭ及び17ｍＭである。 次に、本酵素の各種基質の反応活性の比率
（エタノールの反応活性を100とする）を第１表
に表す。
【表】
(3) 至適PH：約７〜９（温度30℃）
(4) 安定PH：約６〜10で４℃、24時間の処理でほ
とんど失活が起こらない。 (5) 作用適温の範囲：PH7.5で25℃より40℃まで
の温度の上昇とともに活性は増大する。 (6) 耐熱性：35℃、15分間の加熱に対して安定で
ある。 (7) 分子量：３×105ダルトン、サブユニツトの
分子量は7.5×104ダルトン。 (8) 力価の測定法：PH7.5、100ｍＭのリン酸緩衝
液にエタノール、オルソジアニシジン及びパー
オキシダーゼをそれぞれ１（Ｖ／Ｖ）％、0.01
（Ｗ／Ｖ）％、１ユニツト／mlとなるようにし
て調製した基質溶液0.5mlにアルコールオキシ
ダーゼを加えて、436nｍの吸光度の30℃での
単位時間あたりの増加値より力価を測定し、１
分間あたり１マイクロモルのオルソジアニシジ
ンを酸化せしめる酵素量を求め、この量を酵素
活性の１単位とした。 (9) 単一性：精製標品は、アクリルアミドデイス
ク電気泳動法により陽極側に移動し、単一なバ
ンドを与えた。また、SDS電気泳動法によつて
も単一なバンドを与えた。 本発明のアルコールオキシダーゼを製造するに
は、例えば次のごとき方法を採用することができ
る。すなわち、35℃以上で生育可能なトルロプシ
ス属に属する酵母をアルコール培地に培養し、そ
の培養物から本発明のアルコールオキシダーゼを
採取することによつて得ることができる。 本発明に使用する酵母は、本発明のアルコール
オキシダーゼを産生しうるものであればいかなる
ものでもよく、例えばトルロプシスＲ−14（微工
研菌寄第3114号）、トルロプシスＲ−26（微工研菌
寄第3115号）、トルロプシスＳ−189（微工研菌寄
第3116号）があげられる。 本発明における微生物を培養するに際して用い
られる培地としては、例えば主炭素源としてのア
ルコール、例えばメタノールと、窒素源、無機
物、ビタミン、その他生長促進物質とをそれぞれ
適量に含有する培地ならば、合成培地又は天然培
地いずれでも使用できる。この酵母は、培地中の
メタノール濃度が６重量％でも生育できるが、通
気によるメタノールの蒸発損失を少なくするため
に、培地中のメタノールの初発濃度をできるだけ
低くして、メタノールの消費に合わせてメタノー
ルを添加し、培養液中のメタノールを低濃度に保
つ培養方法をとることが好ましい。 また、窒素源としては、例えばアンモニウム
塩、硝酸塩などの無機窒素化合物、尿素、コーン
ステイープリカー、酵母エキス、ペプトンなどの
有機窒素化合物が用いられる。窒素源として、例
えばアンモニウム塩を使用するときは、アンモニ
ウムイオンが菌体生育のために消費されると培養
液のPHが低下するので、好適なPHを維持するため
アンモニア、カセイカリ、カセイソーダなどを添
加することが望まれる。また、培地中にその他と
してマグネシウム塩、リン酸塩、カリウム塩、カ
ルシウム塩、鉄塩などの無機塩及び必要に応じて
ビタミン類、アミノ酸類などの生育に必須な物質
あるいは生長促進物質を添加することも好まし
い。 培養にあたつては、温度35℃以上、好ましくは
35〜38℃とし、PHを2.5〜8.0、好ましくは3.0〜
6.0とし、好気的培養を行うのがよい。 なお、一般にメタノール資化性酵母の増殖可能
温度は、30〜33℃であるが、本酵母はより高温
（35℃以上）で、良好な培養ができるので、培養
時に発生する熱を除去する費用が少なくてすみ、
本発明の方法の実用上の価値は高い。 また、培養方法は回分培養、連続培養のいずれ
の方法を行つてもよい。 培養液から酵母菌体を採取するには、例えば濾
過、遠心分離などを行えばよい。もし、必要なら
ば洗滌をほどこすこともできる。 次に、得られた培養物から本発明のアルコール
オキシダーゼが採取されるが、培養物、分離生菌
体、分離菌体の処理物、粗製酵素、精製酵素など
のあらゆる段階で採取できる。精製法としては、
通常の酵素精製法を用いることができる。すなわ
ち、遠心分離などにより菌体を得た後、菌体をマ
ントンゴーリン、ダイノミル、フレンチプレス、
超音波処理などにより細胞破砕後、遠心分離によ
り細胞片を除去し、細胞抽出液を得、これに硫酸
ストレプトマイシン又は硫酸プロタミン処理を行
い、さらには硫酸アンモニウム沈澱、アセトン沈
澱、加熱処理などを行い、精製するためにDEAE
−セルロースカラムなどのイオン交換クロマトグ
ラフイー、ヒドロキシアパタイトカラムなどの吸
着クロマトグラフイー、フエニルセフアロース
CL−4B（商品名、フアルマシア社製）のような
疎水製性クロマトグラフイー、架橋デキストラン
あるいは架橋ポリアクリルアミドなどのゲル濾過
クロマトグラフイーを組合せて行うことができ
る。このようにして、本発明のアルコールオキシ
ダーゼを単離、精製することができる。 次に、本発明を実施例により具体的に説明す
る。 実施例１、比較例１ （NH4）2SO42ｇ、KH2PO40.5ｇ、MgSO4・
7H2O0.5ｇ、NaCl0.05ｇ、酵母エキス0.1ｇ、ビ
オチン10μｇ、チアミン塩酸塩400μｇ、水１、
PH4.5からなる培地100mlを、500ml容マイヤーフ
ラスコに入れ、１Kg／cm2、10分間殺菌後、メタノ
ールを１（Ｖ／Ｖ）％となるように添加し、これ
にトルロプシスＲ−14（微工研菌寄 第3114号。）
を接種し、培養温度35℃で振盤培養を行つた。36
時間培養後、培養液を遠心分離機にかけ、菌体を
分離したところ、２あたり30ｇの湿菌体が得ら
れた。 この菌体３ｇをPH7.5の25ｍＭリン酸緩衝液20
mlに懸濁し、超音波発生装置にて30分間処理し、
細胞を破壊した後、遠心分離してアルコールオキ
シダーゼ活性を有する粗酵素液を得た。 この粗酵素液をあらかじめ上記緩衝液で平衡化
したDEAE−セルロースカラムに通じ、塩化カリ
ウムを上記緩衝液に加えた溶液で溶出せしめる
と、塩化カリウム濃度0.15Mの近くに目的のアル
コールオキシダーゼが溶出した。この画分を集
め、濃縮後、15％飽和相当の硫酸アンモニウムを
加え、あらかじめ上記リン酸緩衝液を15％飽和相
当の硫酸アンモニウムを加えた溶液で平衡化した
フエニル・セフアロースカラムに通じ、水により
塩濃度を減少させることによつてアルコールオキ
シダーゼを溶出させた。 このようにして得たアルコールオキシダーゼは
アクリルアミドデイスク電気泳動で単一なバンド
を与え、さらにセフアクリルＳ−300ゲルクロマ
トグラフイーにおいても、分子量約300000のとこ
ろに単一のピークを与えた。 その収量は約７mgで、酵素１mgあたり約40単位
の力価を示した。 次に、このようにして得たアルコールオキシダ
ーゼと、比較のためキヤンデイダＮ−16（微工研
菌寄 第425号。）をアグリカルチヤル アンド
バイオロジカルケミストリー36巻、13号、2297〜
2306頁、1972年（Agricultural and Biological
Chemistry Vol36No.13 2297〜2307、1972）に記
載の手法により培養し、かつ同文献記載の手法に
より精製して得たアルコールオキシダーゼとの保
存安定性を調べた（比較例１）。 保存安定性の試験は100ｍＭ、PH7.5のリン酸緩
衝液10mlに、それぞれ１mgのアルコールオキシダ
ーゼを溶解し、メンブランフイルターにより滅菌
後、30℃に保ち、活性の経時変化を測定した。 その結果を第１図に示す。図中の曲線Ａが実施
例１、曲線Ｂが比較例１である。この結果からあ
きらかなように、キヤンデイダＮ−16から得られ
たアルコールオキシダーゼは、30℃で２日間保存
することによりほぼ完全にその活性を不可逆的に
失うのに対し、本発明のアルコールオキシダーゼ
は30日経過した時点でも約60％の活性が保持され
ていた。 このように、本発明のアルコールオキシダーゼ
は驚くほど安定であり、これを長期間保存するこ
とができる性質を有している。この性質は、いま
までのアルコールオキシダーゼにはないものであ
る。 実施例 ２ （NH4）2SO410ｇ、KH2PO42.5ｇ、MgSO4・
7H2O2.5ｇ、NaCl0.25ｇ、FeSO4・7H2O0.01ｇ、
酵母エキス0.1ｇ、ビオチン10μｇ、チアミン塩酸
塩400μｇ、水１、PH4.5からなる培地15を30
容ジヤーフアーメンターに入れ、１Kg／cm2で20
分間殺菌し、これにメタノールを0.5（Ｖ／Ｖ）％
となるように添加した。この培地に同様組成培地
で、あらかじめマイヤーフラスコにて36時間培養
しておいたトルプロシスＲ−14（微工研菌寄第
3114号。）の培養液を２容量％植菌し、35℃で通
気培養を行つた。PHはアンモニア水を用いて自動
的に4.5になるように維持し、培養液中のメタノ
ール濃度は0.2〜0.5（Ｖ／Ｖ）％となるように逐
次添加しながら培養した。培養45時間後にメタノ
ールの添加量は15（Ｖ／Ｖ）％に達したので、培
養を停止し、遠心分離により集菌したところ、１
あたり450ｇの湿菌体が得られた。 この菌体450ｇをPH7.5の25ｍＭリン酸緩衝液３
に懸濁し、ダイノミルにて細胞を破壊した後、
遠心分離してアルコールオキシダーゼ活性を有す
る粗酵素液を得た。 この粗酵素液に15％飽和相当の硫酸アンモニウ
ムを加え、あらかじめ上記リン酸緩衝液に15％飽
和相当の硫酸アモニウムを加えた溶液で平衡化し
たフエニル・セフアロースカラムに通じ、水によ
り塩濃度を減少させることによつてアルコールオ
キシダーゼを溶出させた。次に、この画分を集
め、濃縮後、上記リン酸緩衝液に透析し、あらか
じめ上記リン酸緩衝液で平衡化したDEAE−セフ
アセルカラムに通じ、塩化カリウムを上記リン酸
緩衝液に加えた溶液に溶出せしめると、塩化カリ
ウム濃度0.15M近くに目的のアルコールオキシダ
ーゼが溶出した。 このようにして得たアルコールオキシダーゼ
は、実施例１と同様にアクリルアミドデイスク電
気泳動で単一なバンドを与え、さらにセフアクリ
ルＳ−300ゲルクロマトグラフイーにおいても、
分子量約300000のところに単一のピークを与え
た。 また、このアルコールオキシダーゼを実施例１
と同様な保存安定性の試験を行つたところ、実施
例１と同様の保存安定性の結果が得られた。 （発明の効果） 本発明のアルコールオキシダーゼは、極めて優
れた保存安定性を有している。この優れた性能を
利用してアルコールをアルデヒドに変換させる系
に適用させることができる。すなわち、アルコー
ルオキシダーゼを包括法により固定し、30℃にお
いて連続的にアルコールをアルデヒドに変換させ
るものである。その結果、従来のアルコールオキ
シダーゼでは２〜３日でその触媒能力を完全に失
つていたものが、本発明のアルコールオキシダー
ゼを用いると、30日後においても初期の60％の能
力を維持し、新たに40％のアルコールオキシダー
ゼを加えることにより、初期と同程度の能力を持
つようになり、この操作を繰り返すことにより、
半永続的にアルコールをアルデヒドに変換させる
ことが可能である。 また、本発明のアルコールオキシダーゼは、驚
くべきことにその基質特異性が広いうえに、さら
に顕著な特色を持つている。すなわち、従来の酵
母由来のアルコールオキシダーゼがメタノール及
びエタノールに同時程度反応するのに対し、本発
明のアルコールオキシダーゼはエタノールに強く
反応するが、メタノールにはエタノールの約35％
の反応性しか示さない。この性質は、エタノール
の混在しているエタノール溶液のエタノール濃度
を酵素法で測定する時、正誤差を小さくすること
ができ、エタノールの測定法として、このアルコ
ールオキシダーゼを用いれば、正確にエタノール
測定ができることを意味し、工業的なアルコー
ル、アルデヒドの製造に加えて分析面でも産業上
有益である。
とんど失活が起こらない。 (5) 作用適温の範囲：PH7.5で25℃より40℃まで
の温度の上昇とともに活性は増大する。 (6) 耐熱性：35℃、15分間の加熱に対して安定で
ある。 (7) 分子量：３×105ダルトン、サブユニツトの
分子量は7.5×104ダルトン。 (8) 力価の測定法：PH7.5、100ｍＭのリン酸緩衝
液にエタノール、オルソジアニシジン及びパー
オキシダーゼをそれぞれ１（Ｖ／Ｖ）％、0.01
（Ｗ／Ｖ）％、１ユニツト／mlとなるようにし
て調製した基質溶液0.5mlにアルコールオキシ
ダーゼを加えて、436nｍの吸光度の30℃での
単位時間あたりの増加値より力価を測定し、１
分間あたり１マイクロモルのオルソジアニシジ
ンを酸化せしめる酵素量を求め、この量を酵素
活性の１単位とした。 (9) 単一性：精製標品は、アクリルアミドデイス
ク電気泳動法により陽極側に移動し、単一なバ
ンドを与えた。また、SDS電気泳動法によつて
も単一なバンドを与えた。 本発明のアルコールオキシダーゼを製造するに
は、例えば次のごとき方法を採用することができ
る。すなわち、35℃以上で生育可能なトルロプシ
ス属に属する酵母をアルコール培地に培養し、そ
の培養物から本発明のアルコールオキシダーゼを
採取することによつて得ることができる。 本発明に使用する酵母は、本発明のアルコール
オキシダーゼを産生しうるものであればいかなる
ものでもよく、例えばトルロプシスＲ−14（微工
研菌寄第3114号）、トルロプシスＲ−26（微工研菌
寄第3115号）、トルロプシスＳ−189（微工研菌寄
第3116号）があげられる。 本発明における微生物を培養するに際して用い
られる培地としては、例えば主炭素源としてのア
ルコール、例えばメタノールと、窒素源、無機
物、ビタミン、その他生長促進物質とをそれぞれ
適量に含有する培地ならば、合成培地又は天然培
地いずれでも使用できる。この酵母は、培地中の
メタノール濃度が６重量％でも生育できるが、通
気によるメタノールの蒸発損失を少なくするため
に、培地中のメタノールの初発濃度をできるだけ
低くして、メタノールの消費に合わせてメタノー
ルを添加し、培養液中のメタノールを低濃度に保
つ培養方法をとることが好ましい。 また、窒素源としては、例えばアンモニウム
塩、硝酸塩などの無機窒素化合物、尿素、コーン
ステイープリカー、酵母エキス、ペプトンなどの
有機窒素化合物が用いられる。窒素源として、例
えばアンモニウム塩を使用するときは、アンモニ
ウムイオンが菌体生育のために消費されると培養
液のPHが低下するので、好適なPHを維持するため
アンモニア、カセイカリ、カセイソーダなどを添
加することが望まれる。また、培地中にその他と
してマグネシウム塩、リン酸塩、カリウム塩、カ
ルシウム塩、鉄塩などの無機塩及び必要に応じて
ビタミン類、アミノ酸類などの生育に必須な物質
あるいは生長促進物質を添加することも好まし
い。 培養にあたつては、温度35℃以上、好ましくは
35〜38℃とし、PHを2.5〜8.0、好ましくは3.0〜
6.0とし、好気的培養を行うのがよい。 なお、一般にメタノール資化性酵母の増殖可能
温度は、30〜33℃であるが、本酵母はより高温
（35℃以上）で、良好な培養ができるので、培養
時に発生する熱を除去する費用が少なくてすみ、
本発明の方法の実用上の価値は高い。 また、培養方法は回分培養、連続培養のいずれ
の方法を行つてもよい。 培養液から酵母菌体を採取するには、例えば濾
過、遠心分離などを行えばよい。もし、必要なら
ば洗滌をほどこすこともできる。 次に、得られた培養物から本発明のアルコール
オキシダーゼが採取されるが、培養物、分離生菌
体、分離菌体の処理物、粗製酵素、精製酵素など
のあらゆる段階で採取できる。精製法としては、
通常の酵素精製法を用いることができる。すなわ
ち、遠心分離などにより菌体を得た後、菌体をマ
ントンゴーリン、ダイノミル、フレンチプレス、
超音波処理などにより細胞破砕後、遠心分離によ
り細胞片を除去し、細胞抽出液を得、これに硫酸
ストレプトマイシン又は硫酸プロタミン処理を行
い、さらには硫酸アンモニウム沈澱、アセトン沈
澱、加熱処理などを行い、精製するためにDEAE
−セルロースカラムなどのイオン交換クロマトグ
ラフイー、ヒドロキシアパタイトカラムなどの吸
着クロマトグラフイー、フエニルセフアロース
CL−4B（商品名、フアルマシア社製）のような
疎水製性クロマトグラフイー、架橋デキストラン
あるいは架橋ポリアクリルアミドなどのゲル濾過
クロマトグラフイーを組合せて行うことができ
る。このようにして、本発明のアルコールオキシ
ダーゼを単離、精製することができる。 次に、本発明を実施例により具体的に説明す
る。 実施例１、比較例１ （NH4）2SO42ｇ、KH2PO40.5ｇ、MgSO4・
7H2O0.5ｇ、NaCl0.05ｇ、酵母エキス0.1ｇ、ビ
オチン10μｇ、チアミン塩酸塩400μｇ、水１、
PH4.5からなる培地100mlを、500ml容マイヤーフ
ラスコに入れ、１Kg／cm2、10分間殺菌後、メタノ
ールを１（Ｖ／Ｖ）％となるように添加し、これ
にトルロプシスＲ−14（微工研菌寄 第3114号。）
を接種し、培養温度35℃で振盤培養を行つた。36
時間培養後、培養液を遠心分離機にかけ、菌体を
分離したところ、２あたり30ｇの湿菌体が得ら
れた。 この菌体３ｇをPH7.5の25ｍＭリン酸緩衝液20
mlに懸濁し、超音波発生装置にて30分間処理し、
細胞を破壊した後、遠心分離してアルコールオキ
シダーゼ活性を有する粗酵素液を得た。 この粗酵素液をあらかじめ上記緩衝液で平衡化
したDEAE−セルロースカラムに通じ、塩化カリ
ウムを上記緩衝液に加えた溶液で溶出せしめる
と、塩化カリウム濃度0.15Mの近くに目的のアル
コールオキシダーゼが溶出した。この画分を集
め、濃縮後、15％飽和相当の硫酸アンモニウムを
加え、あらかじめ上記リン酸緩衝液を15％飽和相
当の硫酸アンモニウムを加えた溶液で平衡化した
フエニル・セフアロースカラムに通じ、水により
塩濃度を減少させることによつてアルコールオキ
シダーゼを溶出させた。 このようにして得たアルコールオキシダーゼは
アクリルアミドデイスク電気泳動で単一なバンド
を与え、さらにセフアクリルＳ−300ゲルクロマ
トグラフイーにおいても、分子量約300000のとこ
ろに単一のピークを与えた。 その収量は約７mgで、酵素１mgあたり約40単位
の力価を示した。 次に、このようにして得たアルコールオキシダ
ーゼと、比較のためキヤンデイダＮ−16（微工研
菌寄 第425号。）をアグリカルチヤル アンド
バイオロジカルケミストリー36巻、13号、2297〜
2306頁、1972年（Agricultural and Biological
Chemistry Vol36No.13 2297〜2307、1972）に記
載の手法により培養し、かつ同文献記載の手法に
より精製して得たアルコールオキシダーゼとの保
存安定性を調べた（比較例１）。 保存安定性の試験は100ｍＭ、PH7.5のリン酸緩
衝液10mlに、それぞれ１mgのアルコールオキシダ
ーゼを溶解し、メンブランフイルターにより滅菌
後、30℃に保ち、活性の経時変化を測定した。 その結果を第１図に示す。図中の曲線Ａが実施
例１、曲線Ｂが比較例１である。この結果からあ
きらかなように、キヤンデイダＮ−16から得られ
たアルコールオキシダーゼは、30℃で２日間保存
することによりほぼ完全にその活性を不可逆的に
失うのに対し、本発明のアルコールオキシダーゼ
は30日経過した時点でも約60％の活性が保持され
ていた。 このように、本発明のアルコールオキシダーゼ
は驚くほど安定であり、これを長期間保存するこ
とができる性質を有している。この性質は、いま
までのアルコールオキシダーゼにはないものであ
る。 実施例 ２ （NH4）2SO410ｇ、KH2PO42.5ｇ、MgSO4・
7H2O2.5ｇ、NaCl0.25ｇ、FeSO4・7H2O0.01ｇ、
酵母エキス0.1ｇ、ビオチン10μｇ、チアミン塩酸
塩400μｇ、水１、PH4.5からなる培地15を30
容ジヤーフアーメンターに入れ、１Kg／cm2で20
分間殺菌し、これにメタノールを0.5（Ｖ／Ｖ）％
となるように添加した。この培地に同様組成培地
で、あらかじめマイヤーフラスコにて36時間培養
しておいたトルプロシスＲ−14（微工研菌寄第
3114号。）の培養液を２容量％植菌し、35℃で通
気培養を行つた。PHはアンモニア水を用いて自動
的に4.5になるように維持し、培養液中のメタノ
ール濃度は0.2〜0.5（Ｖ／Ｖ）％となるように逐
次添加しながら培養した。培養45時間後にメタノ
ールの添加量は15（Ｖ／Ｖ）％に達したので、培
養を停止し、遠心分離により集菌したところ、１
あたり450ｇの湿菌体が得られた。 この菌体450ｇをPH7.5の25ｍＭリン酸緩衝液３
に懸濁し、ダイノミルにて細胞を破壊した後、
遠心分離してアルコールオキシダーゼ活性を有す
る粗酵素液を得た。 この粗酵素液に15％飽和相当の硫酸アンモニウ
ムを加え、あらかじめ上記リン酸緩衝液に15％飽
和相当の硫酸アモニウムを加えた溶液で平衡化し
たフエニル・セフアロースカラムに通じ、水によ
り塩濃度を減少させることによつてアルコールオ
キシダーゼを溶出させた。次に、この画分を集
め、濃縮後、上記リン酸緩衝液に透析し、あらか
じめ上記リン酸緩衝液で平衡化したDEAE−セフ
アセルカラムに通じ、塩化カリウムを上記リン酸
緩衝液に加えた溶液に溶出せしめると、塩化カリ
ウム濃度0.15M近くに目的のアルコールオキシダ
ーゼが溶出した。 このようにして得たアルコールオキシダーゼ
は、実施例１と同様にアクリルアミドデイスク電
気泳動で単一なバンドを与え、さらにセフアクリ
ルＳ−300ゲルクロマトグラフイーにおいても、
分子量約300000のところに単一のピークを与え
た。 また、このアルコールオキシダーゼを実施例１
と同様な保存安定性の試験を行つたところ、実施
例１と同様の保存安定性の結果が得られた。 （発明の効果） 本発明のアルコールオキシダーゼは、極めて優
れた保存安定性を有している。この優れた性能を
利用してアルコールをアルデヒドに変換させる系
に適用させることができる。すなわち、アルコー
ルオキシダーゼを包括法により固定し、30℃にお
いて連続的にアルコールをアルデヒドに変換させ
るものである。その結果、従来のアルコールオキ
シダーゼでは２〜３日でその触媒能力を完全に失
つていたものが、本発明のアルコールオキシダー
ゼを用いると、30日後においても初期の60％の能
力を維持し、新たに40％のアルコールオキシダー
ゼを加えることにより、初期と同程度の能力を持
つようになり、この操作を繰り返すことにより、
半永続的にアルコールをアルデヒドに変換させる
ことが可能である。 また、本発明のアルコールオキシダーゼは、驚
くべきことにその基質特異性が広いうえに、さら
に顕著な特色を持つている。すなわち、従来の酵
母由来のアルコールオキシダーゼがメタノール及
びエタノールに同時程度反応するのに対し、本発
明のアルコールオキシダーゼはエタノールに強く
反応するが、メタノールにはエタノールの約35％
の反応性しか示さない。この性質は、エタノール
の混在しているエタノール溶液のエタノール濃度
を酵素法で測定する時、正誤差を小さくすること
ができ、エタノールの測定法として、このアルコ
ールオキシダーゼを用いれば、正確にエタノール
測定ができることを意味し、工業的なアルコー
ル、アルデヒドの製造に加えて分析面でも産業上
有益である。
第１図は、本発明のアルコールオキシダーゼ
（曲線Ａ）及びキヤンデイダから得られたアルコ
ールオキシダーゼ（曲線Ｂ）を30℃で保存し、活
性の経時変化（残存活性）を示す図である。
（曲線Ａ）及びキヤンデイダから得られたアルコ
ールオキシダーゼ（曲線Ｂ）を30℃で保存し、活
性の経時変化（残存活性）を示す図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 以下の性状を有するアルコールオキシダー
ゼ。 (a) 作用：次の反応を触媒する。 RCH2OH＋O2RCHO＋H2O2 （ただし、Ｒは水素又はアルキル基を表す。） (b) 基質特異性：メタノール及びエタノールに対
するミカエリス定数は、おのおの約６ｍＭ及び
17ｍＭである。 (c) 至適PH：約７〜９ (d) 安定PH：約６〜10 (e) 作用適温の範囲：約25〜40℃ (f) 耐熱性：35℃、15分間の加熱に対して安定で
ある。 (g) 分子量：約３×105、サブユニツトの分子量
は7.5×104。 ２ 35℃以上で生育可能なトルロプシス
（Torulopusis）属に属する酵母をアルコール培
地に培養し、培養物から以下の性状を有するアル
コールオキシダーゼを採取することを特徴とする
アルコールオキシダーゼの製造方法。 (a) 作用：次の反応を触媒する。 RCH2OH＋O2RCHO＋H2O2 （ただし、Ｒは水素又はアルキル基を表す。） (b) 基質特異性：メタノール及びエタノールに対
するミカエリス定数は、おのおの約６ｍＭ及び
17ｍＭである。 (c) 至適PH：約７〜９ (d) 安定PH：約６〜10 (e) 作用適温の範囲：約25〜40℃ (f) 耐熱性：35℃、15分間の加熱に対して安定で
ある。 (g) 分子量：約３×105、サブユニツトの分子量
は7.5×104。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59217522A JPS6196986A (ja) | 1984-10-17 | 1984-10-17 | アルコ−ルオキシダ−ゼ及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59217522A JPS6196986A (ja) | 1984-10-17 | 1984-10-17 | アルコ−ルオキシダ−ゼ及びその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6196986A JPS6196986A (ja) | 1986-05-15 |
| JPH0518553B2 true JPH0518553B2 (ja) | 1993-03-12 |
Family
ID=16705559
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59217522A Granted JPS6196986A (ja) | 1984-10-17 | 1984-10-17 | アルコ−ルオキシダ−ゼ及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6196986A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8409477B2 (en) | 2007-09-27 | 2013-04-02 | Mitsubishi Materials Corporation | ZnO vapor deposition material, process for producing the same, and ZnO film |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2786679B2 (ja) * | 1989-07-24 | 1998-08-13 | 旭化成工業株式会社 | 新規なω位カルボキシアルコール酸化酵素 |
| US5206148A (en) * | 1989-07-24 | 1993-04-27 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Method for assaying aliphatic alcohol, aliphatic aldehyde or ω-carboxylic acid derivatives thereof |
| CN113403291A (zh) * | 2021-06-22 | 2021-09-17 | 华侨大学 | 一种醛醇氧化酶二聚体及其制备方法 |
-
1984
- 1984-10-17 JP JP59217522A patent/JPS6196986A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8409477B2 (en) | 2007-09-27 | 2013-04-02 | Mitsubishi Materials Corporation | ZnO vapor deposition material, process for producing the same, and ZnO film |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6196986A (ja) | 1986-05-15 |
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