JPH05336965A - ヒトプロウロキナーゼ誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 血中半減期が長く、また線溶系因子の活性化
を起こしにくく、かつ優れた血栓溶解能を有するヒトプ
ロウロキナーゼ誘導体を取得する。 【構成】 ヒトプロウロキナーゼのトロンビン切断部位
近傍にアミノ酸置換変異、アミノ酸欠失変異あるいはア
ミノ酸挿入変異を導入した変異部近傍に糖鎖が付加して
おり、かつヒトプロウロキナーゼのエピダーマルグロー
スファクタードメインにアミノ酸置換変異、アミノ酸欠
失変異あるいはアミノ酸挿入変異を導入した新規ヒトプ
ロウロキナーゼ誘導体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明のヒトプロウロキナーゼ誘
導体は、ヒトプロウロキナーゼを不活性型の２本鎖に切
断するプロテアーゼ（トリプシン様プロテアーゼ）に対
して安定であり、このため純粋な形態で容易に精製・採
取できる。このヒトプロウロキナーゼ誘導体は血中半減
期が長く、また血中の線溶系因子の活性化を起こしにく
く、かつ優れた血栓溶解作用を有しているため、脳血
栓、心筋梗塞などの治療薬としての利用が期待される。

【０００２】

【従来技術】ヒトプロウロキナーゼはヒトウロキナーゼ
の不活性型前駆体であり、プラスミンによって活性化さ
れる血栓溶解酵素として知られている。ヒトウロキナー
ゼの１次構造は、ハイネッカーらにより〔Heyneker et
al. ;特開昭59-51300〕明らかにされ、エピダーマルグ
ロースファクタードメイン（epidermal growth factor
domain)(以下、Ｇドメインと略記する）、クリングル
（kringle）ドメイン、プロテアーゼ（protease）ドメ
インの３つのドメインで構成されている。

【０００３】ところで、ボーラス（単回静注）投与に用
いるプラスミノーゲン活性化因子の理想的条件として
は、(a) 投与後の初期血栓溶解活性が高いこと、(b)
血中半減期が長いこと、および(c) 出血という副作用
が少ないこと、すなわち血中のα₂ −プラスミンインヒ
ビターのレベルおよびプラスミノーゲンのレベルを低下
させないことが挙げられるが、これらの条件を実用レベ
ルで満たすプラスミノーゲン活性化因子は得られていな
い。

【０００４】最近では遺伝子工学の応用により、血中半
減期の延長を目的としたヒトプロウロキナーゼ誘導体の
開発が進められている。ヒトウロキナーゼの活性が血中
で消失する原因として、（１）プロウロキナーゼ段階で
のプロテアーゼ（特に、トロンビン）による分解および
失活、（２）ヒトウロキナーゼ特異的な受容体による血
中からの排除、（３）ヒトウロキナーゼと不可逆的に結
合する活性阻害物質による失活、等が知られている。し
たがって、これらの原因を解消することにより血中半減
期を延長したヒトプロウロキナーゼの造成が可能とな
る。

【０００５】本発明者らが既に報告しているヒトプロウ
ロキナーゼ誘導体ＵＫ−Ｓ１（特開平2-227075）はトロ
ンビン切断部位近傍（例えば天然型ヒトプロウロキナー
ゼのＮ末端から１６４番目のアミノ酸）に糖鎖を導入す
ることにより、原因（１）を解消し、血中半減期を延長
させたヒトプロウロキナーゼ誘導体である。さらに、Ｕ
Ｋ−Ｓ１は、天然型ヒトプロウロキナーゼと比べ、全身
線溶系因子の活性化が非常に軽減されている。なお、比
活性については天然型ヒトプロウロキナーゼと同等であ
った。

【０００６】また、ミドリ十字社より報告されたヒトプ
ロウロキナーゼ誘導体ＵＫ−ΔＧ（特開昭63-146789）
は、Ｇドメインの一部を欠失させることによりヒトウロ
キナーゼ特異的な受容体との反応性をなくし〔原因
（２）の解消〕、血中半減期を延長させた誘導体であ
る。このＵＫ−ΔＧの比活性および全身線溶系の活性化
活性が天然型ヒトプロウロキナーゼと比べて改善されて
いるかどうかに関する報告はない。なお、本発明者らが
自ら造成したＵＫ−ΔＧの比活性は、天然型ヒトプロウ
ロキナーゼのものとほぼ同じであった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、天然
型ヒトプロウロキナーゼに改良を加えることにより、ボ
ーラス投与に用いる理想的なプラスミノーゲン活性化因
子の条件である上記条件(a)、(b)、(c)を満たすヒトプロ
ウロキナーゼ誘導体を取得することである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、既に報告
されているヒトプロウロキナーゼ誘導体ＵＫ−Ｓ１およ
びＵＫ−ΔＧのそれぞれに施されている修飾が同時に導
入された新規ヒトプロウロキナーゼ誘導体ＵＫ−ΔＧＳ
１を造成し、その性質を調べた。その結果、本誘導体Ｕ
Ｋ−ΔＧＳ１は、犬を用いた血栓溶解実験系において、
天然型ヒトプロウロキナーゼより血栓溶解活性の優れて
いたヒトプロウロキナーゼ誘導体ＵＫ−Ｓ１よりもさら
に、上記条件 (a)、(b)、(c)のいずれの指標についてもす
ぐれていることが判明し、ボーラス投与可能な理想的な
血栓溶解剤に成り得ることを見出し、本発明を完成する
に至った。

【０００９】以下、本発明を詳細に説明する。本発明
は、ヒトプロウロキナーゼのトロンビン切断部位近傍に
アミノ酸置換変異、アミノ酸欠失変異あるいはアミノ酸
挿入変異を導入した変異部近傍に糖鎖が付加しており、
かつヒトプロウロキナーゼのＧドメインにアミノ酸置換
変異、アミノ酸欠失変異あるいはアミノ酸挿入変異を導
入した新規ヒトプロウロキナーゼ誘導体、該ヒトプロウ
ロキナーゼ誘導体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有
する組換え体プラスミド、該組換え体プラスミドを含有
する微生物細胞または動物細胞、および該微生物細胞ま
たは動物細胞を用いた該ヒトプロウロキナーゼ誘導体の
製造法に関する。

【００１０】本発明者らは目的の性質を持つヒトプロウ
ロキナーゼを得るために、トロンビン切断部位近傍に糖
鎖を導入し、かつＧドメインに修飾を施したヒトプロウ
ロキナーゼ誘導体の一例として、ＵＫ−ΔＧＳ１を造成
した。このＵＫ−ΔＧＳ１はヒトプロウロキナーゼのＮ
末端から１６４番目のアミノ酸（Phe）がAsnに置換さ
れ、該アスパラギン残基に糖鎖が付加しており、かつヒ
トプロウロキナーゼのＮ末端から１０番目のアミノ酸
（Asn）から４５番目のアミノ酸（Asp）までの領域を欠
失したヒトプロウロキナーゼ誘導体である。

【００１１】なお、トロンビン切断部位近傍に糖鎖を導
入し、かつＧドメインに修飾を施した本発明のヒトプロ
ウロキナーゼ誘導体はＵＫ−ΔＧＳ１に限定されるもの
ではなく、組換えＤＮＡ技術によりヒトプロウロキナー
ゼ誘導体をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒトプロウロ
キナーゼのトロンビン切断部位近傍〔天然型ヒトプロウ
ロキナーゼのＮ末端から１４９番目のアミノ酸（グリシ
ン残基）から１６４番目のアミノ酸（フェニールアラニ
ン残基）までの間〕にアミノ酸置換変異、アミノ酸欠失
変異あるいはアミノ酸挿入変異を導入した変異部近傍に
糖鎖を付加し、かつヒトプロウロキナーゼのＧドメイン
〔天然型ヒトプロウロキナーゼのＮ末端から１０番目の
アミノ酸（アスパラギン残基）から４５番目のアミノ酸
（アスパラギン酸残基）までの間〕にアミノ酸置換変
異、アミノ酸欠失変異あるいはアミノ酸挿入変異を導入
することによって得ることができる。

【００１２】糖鎖の付加を可能にするアミノ酸変異とし
てはＮ―グリコシレーション結合部位（アスパラギン残
基―Ｘ残基―スレオニン残基あるいはセリン残基、Ｘ残
基はプロリン以外のアミノ酸）が導入されるようなアミ
ノ酸変異が好ましい。さらに好適にはヒトプロウロキナ
ーゼのＮ末端から１６４番目のアミノ酸（フェニールア
ラニン残基）をアスパラギン残基に置換することによ
り、Ｎ―グリコシレーション結合部位を導入することが
できる。

【００１３】また、Ｇドメイン内の変異としては、ヒト
プロウロキナーゼのＧドメイン内のアミノ酸欠失変異が
好ましい。さらに好適にはヒトプロウロキナーゼのＮ末
端から１０番目のアミノ酸（アスパラギン残基）から４
５番目のアミノ酸（アスパラギン酸残基）までの間を欠
失させることが望ましい。

【００１４】ヒトプロウロキナーゼｃＤＮＡとしては、
ヒトプロウロキナーゼをコードするメッセンジャーＲＮ
Ａから組換えＤＮＡ技術で逆転写して得られるｃＤＮＡ
および染色体ＤＮＡから得られるヒトプロウロキナーゼ
をコードするＤＮＡなどが利用できる。ヒトプロウロキ
ナーゼｃＤＮＡとしては、ヒトプロウロキナーゼをコー
ドしているものであればいかなるものも用いることがで
きるが、具体的にはプラスミドｐＵＫ１あるいはｐＵＫ
１１のヒトプロウロキナーゼｃＤＮＡを用いることがで
きる。ｐＵＫ１、ｐＵＫ１１は、本発明者らによって製
造されたものであり、その製造法は特開平2-227075に記
載されている。

【００１５】ｐＵＫ１とｐＵＫ１１の中のヒトプロウロ
キナーゼｃＤＮＡはともに完全なヒトプロウロキナーゼ
をコードしていないが、それぞれＮ末端の一部を欠くヒ
トプロウロキナーゼおよびＣ末端の一部を欠くヒトプロ
ウロキナーゼをコードしており、それぞれのｃＤＮＡの
塩基配列は配列番号２に示す塩基配列の一部と一致して
いる。なお、ｐＵＫ１を含む大腸菌はEscherichia coli
EUK1 （FERM BP-1463)として、ｐＵＫ１１を含む大腸
菌はEscherichia coli EUK11（FERM BP-1464)として、
工業技術院微生物工業技術研究所（微工研）に昭和６２
年９月３日付で寄託されている。

【００１６】本発明の組換え体プラスミドは、上記ヒト
プロウロキナーゼ誘導体をコードするＤＮＡが宿主細胞
内で該ＤＮＡを発現できる機能を持つ適当なプラスミド
に組み込まれたものである。ヒトプロウロキナーゼ誘導
体をコードするＤＮＡを組み込むプラスミドとしては、
微生物細胞または動物細胞で該ＤＮＡが発現できるもの
なら、いかなるプラスミドも用いることができる。

【００１７】微生物細胞としては大腸菌を用いるのが好
ましい。大腸菌内でヒトプロウロキナーゼ誘導体を発現
させるには、適当なプロモーター、例えば、ｔｒｐ系、
ｌａｃ系のプロモーターの下流に外来ＤＮＡを挿入する
ことができ、しかもシャイン−ダルガーノ配列と開始コ
ドン（ＡＴＧ）の間を適当な距離、例えば６〜１８塩基
に調整したプラスミドを用いることができる。具体的に
好適なプラスミドとしては、本発明者らによって造成さ
れたｐＫＹＰ１０（特開昭58-110600）、ｐＴｒＳ３３
（特開平2-227075）などがあげられる。

【００１８】また、動物細胞でヒトプロウロキナーゼ誘
導体を発現させるには、適当なプロモーター、例えばＳ
Ｖ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、
Moloney murine leukemia virus （以下、Mo-MuLV と略
記する）のＬＴＲプロモーターなどの下流に外来ＤＮＡ
を挿入することができ、しかも、ポリＡシグナル、スプ
ライシングシグナルなどを有するプラスミドを用いるこ
とが望ましい。具体的に好適なプラスミドとしては、本
発明者らによって造成されたｐＡＧＥ１０３〔水上ら：
ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(J. Biochem.),
101,1307 (1987)〕、ｐＳＥ１ＰＡ１ＳＥ１ｄｈｆｒ１
−９Ａ（以下、ｐＳＰＡＳ１−９Ａと略記する）（特開
平2-227075）などがあげられる。

【００１９】ｐＡＧＥ１０３を含む大腸菌は Escherich
ia coli EAGE 103（FERM BP-1312)として昭和６２年３
月２３日付で微工研に寄託されている。また、ジヒドロ
葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略記する）遺伝子を選
択マーカーとして有するプラスミドとしては、例えば、
ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ〔エス・サブラマニ(S. Subramani)
ら：モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー
（Mol. Cell. Biol.),１，854(1981) 〕などがあげられ
る。

【００２０】各種ヒトプロウロキナーゼ誘導体をコード
するＤＮＡとベクターＤＮＡとの組換えは、制限酵素を
用いて両ＤＮＡを消化後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて
結合する一般的組換えＤＮＡ技法を用いて行うことがで
きる。結合に際しては、制限酵素を用いて消化したＤＮ
Ａ断片の末端を、ＤＮＡポリメラーゼＩ・クレノー断片
〔DNA Pol I Klenow Fragment（以下、クレノー断片と
略記する）（宝酒造社製）〕を用いる埋め込み反応やＴ
４ＤＮＡポリメラーゼを用いる埋め込み反応または削り
込み反応を利用して加工する方法、あるいはＤＮＡリン
カーを用いる方法によっても行うことができる。

【００２１】以下に、ＵＫ−ΔＧＳ１を発現させるため
の組換え体プラスミドであるｐＳＥ１ＵＫΔＧＳ１ＳＥ
ｄ１−５（以下、ｐＳＵＫΔＧＳ１Ｓ−５と略記する）
を造成する例について述べる。第１図に示すようにし
て、ベクタープラスミドｐＡＧＥ１１０（参考例１）
（特開平2-227075）をＨｉｎｄIII とＡｓｐ718で切断
した後、約９kbのＤＮＡ断片を精製する。一方、ＵＫ−
ΔＧ発現プラスミドｐＵＫΔＧ１（参考例４）をＨｉｎ
ｄIII とＰｓｔＩで切断した後、約０.３kbのＤＮＡ断
片を精製する。さらに、ＵＫ−Ｓ１発現プラスミドｐＳ
Ｅ１ＵＫＳ１ＳＥｄ１−５（以下、ｐＳＵＫＳ１Ｓ−５
と略記する）（参考例３）をＰｓｔＩとＡｓｐ718で切
断した後、約０.９kbのＤＮＡ断片を精製する。このよ
うにして得られる３種類のＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガ
−ゼで結合することにより、ヒトプロウロキナーゼのＧ
ドメインの一部を欠失し、かつＮ末端から１６４番目の
アミノ酸（Phe）がアスパラギンに置換された組換え体
プラスミドｐＳＵＫΔＧＳ１Ｓ−５を得ることができ
る。

【００２２】ヒトプロウロキナーゼ誘導体ＵＫ−ΔＧＳ
１のアミノ酸配列および該アミノ酸配列に対応する塩基
配列を配列番号１に示す。また、配列番号２に天然型ヒ
トプロウロキナーゼのアミノ酸配列および該アミノ酸配
列に対応する塩基配列を示す。

【００２３】上記組換え技法における反応の条件は、一
般的に下記のとおりである。ＤＮＡの制限酵素による消
化反応は、通常０.１〜２０μｇのＤＮＡを２〜２００
ｍＭ（好ましくは１０〜４０ｍＭ）のＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ６.０〜９.５好ましくはpH７.０〜８.０）、０〜
２００ｍＭのＮａＣｌ、２〜２０ｍＭ（好ましくは５〜
１０ｍＭ）のＭｇＣｌ₂ を含む溶液に溶かし、制限酵素
０.１〜１００単位（好ましくは１μｇのＤＮＡに対し
て１〜３単位）を用いて、２０〜７０℃（至適温度は用
いる制限酵素により異なる）において、１５分〜２４時
間行う。反応の停止は、通常５５〜７５℃で、５〜３０
分間加熱することによるが、フェノールまたはジエチル
ピロカーボネートなどの試薬により制限酵素を失活させ
る方法も用いることができる。

【００２４】制限酵素消化によって生じたＤＮＡ断片の
精製は、低融点アガロースゲル電気泳動法（以下、ＬＧ
Ｔ法と略記する)〔エル・ウィスランダー(L.Wieslande
r)：アナリティカル・バイオケミストリー(Analytical
Biochemistry),98, 305(1979) 〕の後、アガロースゲル
・凍結融解法（以下、ＡＦＴ法と略記する）あるいは電
気泳動的溶出法を用いることにより行うことができる。

【００２５】ＡＦＴ法とは、ＤＮＡ断片を含むアガロー
スゲル（0.7 〜1.5 ％）のスライスに対して、等量のＴ
Ｅ緩衝液〔 10mM Tris-HCl（pH 7.5) 、１mM EDTA 〕お
よび２倍量のフェノール（ＴＥ緩衝液で飽和したもの）
を加え混合した後、−70℃と65℃での凍結−融解を２回
繰り返し、さらに遠心分離によって生じる上層の水溶液
を分取し、エタノール沈殿によってＤＮＡ断片を回収す
る方法である。また、電気泳動的溶出法とは、ＤＮＡ断
片回収機・マックスイールドAE−3241型（アトー社製）
を用いて、アガロースゲルやポリアクリルアミドゲルか
らＤＮＡ断片を電気泳動によって溶出し、精製する方法
である。

【００２６】ＤＮＡ断片の結合反応は、２〜２００ｍＭ
（好ましくは１０〜４０ｍＭ）のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ６.１〜９.５、好ましくはpH７.０〜８.０）、２〜２
０ｍＭ（好ましくは５〜１０ｍＭ）のＭｇＣｌ₂ 、０.
１〜１０ｍＭ（好ましくは０.５ 〜２.０ｍＭ) のＡＴ
Ｐ、１〜５０ｍＭ（好ましくは５〜１０ｍＭ) のジチオ
スレイトール（以下、ＤＴＴと略記する）を含む反応液
中で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１〜１０００単位を用いて、
１〜３７℃（好ましくは３〜２０℃）で１５分〜７２時
間（好ましくは２〜２０時間）行う。

【００２７】結合反応によって生じた組換え体プラスミ
ドＤＮＡは、必要によりコーエンらの形質転換法〔エス
・エヌ・コーエン(S. N. Cohen) ら：プロシーディング
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス(Proc. Natl. Acad. Sci.)USA，69，2110 (1972)〕あ
るいはハナハンの形質転換法〔Hanahan ：ジャーナル・
オブ・モレキュラー・バイオロジー(J. Mol. Biol.),16
6 , 557 (1983)〕を用いて、大腸菌に導入する。

【００２８】また、結合反応によって生じた組換え体Ｍ
１３ファージＲＦＤＮＡは、必要により公知のトランス
フェクション法〔口野嘉幸ら：蛋白質・核酸・酵素, 2
9, 294 (1984)〕によって、大腸菌ＪＭ１０５株〔ジェ
イ・メシング（J. Messing) ら：ジーン（Gene),33 ,10
3 (1985)〕に導入する。

【００２９】組換え体プラスミドＤＮＡおよび組換え体
Ｍ１３ファージＲＦＤＮＡを有する大腸菌からの該ＤＮ
Ａの単離は、バーンボイムらの方法〔エイチ・シー・バ
ーンボイム（H. C. Birnboim) ら：ヌクレイック・アシ
ッド・リサーチ（Nucleic Acids Res.), 7，1513 (197
9)〕などを用いて行う。組換え体Ｍ１３ファージからの
一本鎖ＤＮＡの単離は、公知の方法〔口野嘉幸ら：蛋白
質・核酸・酵素, 29, 294 (1984)〕に従って行う。

【００３０】本発明で使用するデオキシオリゴヌクレオ
チドは、リン酸アミダイト法による固相合成法〔S. L.
Beaucageら：テトラヘドロン・レターズ(Tetrahedron L
ett.),22 ,1859 (1981) 、および L. J. BcBrieら：同2
4，245 (1983) 〕に従い、３８０Ａ・ＤＮＡ合成機〔ア
プライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社
製〕を用いて合成することができる。合成されたデオキ
シオリゴヌクレオチドを他のＤＮＡ断片と結合させるに
は、約２０pmolのデオキシオリゴヌクレオチドを２０ｍ
ｌのＴ４キナーゼ緩衝液〔50mM Tris-HCl (pH 7.6)、10
mM MgCl₂、５mMDTT、0.1mM EDTA、0.5mM ATP 〕に溶解
し、５単位のＴ４ＤＮＡキナーゼ（宝酒造社製）を加え
ることにより、５’末端をリン酸化する。ハイブリダイ
ゼーション用のプローブとして用いる場合には、上記の
Ｔ４キナーゼ緩衝液中の０.５ｍＭ ＡＴＰの代わりに２
０〜５０μCiの５’−〔γ−３２Ｐ〕ＡＴＰ〔 3000 Ci
／mmol、アマーシャム(Amersham)社製〕を用いて、その
５’末端を放射能標識する。

【００３１】プラスミドＤＮＡの構造解析については、
プラスミドＤＮＡを１〜１０種類の制限酵素で消化後、
アガロースゲル電気泳動あるいはポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により切断部位を調べる。さらにＤＮＡの塩
基配列を決定する必要があるときはＭ13ファージを用い
たディデオキシ・シークエンス（dideoxy sequence)法
によって決定する。

【００３２】本発明のヒトプロウロキナーゼ誘導体ポリ
ペプチドは該ポリペプチドを発現できる宿主細胞なら、
いかなる微生物細胞あるいは動物細胞によっても製造す
ることができる。以下に、動物細胞を宿主として該ヒト
プロウロキナーゼ誘導体ポリペプチドを生産する方法に
ついて述べる。

【００３３】ヒトプロウロキナーゼ誘導体ポリペプチド
を発現させる際の宿主としては、該ポリペプチドを発現
できるものならいかなる動物細胞も用いることができ
る。具体的に好適な動物細胞としては、ｄｈｆｒが欠損
したＣＨＯ細胞〔ジー・ウルラウブ＆エル・エー・チェ
イシン(G. Urlaub & L. A. Chasin) :プロシーディング
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス（Proc. Natl. Acad. Sci.）USA , 77, 4216(198
0)〕、Ｎａｍａｌｗａ細胞（ATCC CRL1432）などがあげ
られる。

【００３４】以下に、ヒトプロウロキナーゼ誘導体ＵＫ
−ΔＧＳ１を発現しうるプラスミドとしてｐＳＵＫΔＧ
Ｓ１Ｓ−５、宿主としてｄｈｆｒが欠損したＣＨＯ細胞
を用いて該ヒトプロウロキナーゼ誘導体ポリペプチドを
製造する例を述べる。

【００３５】組換え体プラスミドｐＳＵＫΔＧＳ１Ｓ−
５を例えばリン酸カルシウム法〔グラハム＆ファン・デ
ル・エブ（Graham & Van der Eb)：ヴィロロジー (Viro
logy),52, 546(1978) 〕もしくはエレクトロポーレーシ
ョン法〔ニューマン（Neumann)ら：エンボ・ジャーナル
(EMBO J.) , 1,841(1982)〕によりｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ
株に導入する。ｐＳＵＫΔＧＳ１Ｓ−５を有する形質転
換株は例えばＭＥＭα（選択培地）〔透析ウシ胎児血清
（以下、ＦＣＳと略記する）を含むＭＥＭα培地（リボ
核酸およびデオキシリボ核酸不含有；ギブコ・オリエン
タル社製）〕により選択することができる。さらに形質
転換株の中からメソトレキセート（以下、ＭＴＸと略記
する）を用いて該生理活性ポリペプチド遺伝子が増幅さ
れた形質転換株を得ることもできる。得られた形質転換
株を培地に培養することにより培養物中にヒトプロウロ
キナーゼ誘導体ポリペプチドを生成させることができ
る。

【００３６】培地としては、各種血清（例えばウシ胎児
血清）を加えたハムＦ１０培地、ハムＦ１２培地〔以
上、フローラボ（Flow Laboratories）社製〕、ダルベ
ッコＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−1640培地（以上、日水製薬
社製）、ＭＥＭα培地およびこれらの混合培地が用いら
れる。培地には必要により、グルタミン０.５〜５mM、
抗生物質〔ペニシリン（25Ｕ／ml）、ストレプトマイシ
ン（25ug／ml）、Ｇ４１８（0.3 mg／ml）など〕、重曹
（0.01％）などを適量加えてもよい。

【００３７】培養には、種々の培養ビン、ディッシュ、
ローラーボトル、スピンナーフラスコ、ジャーファーメ
ンターなどを用いることができる。通常、種細胞密度５
×１０⁴ 〜１×１０⁶ 細胞／mlとし、３０〜４０℃、２
〜１０日間培養を行うと、各細胞密度に応じ、本発明物
質が主に細胞外に分泌される。

【００３８】培養物から細胞を遠心除去し、遠心後の上
清からヒトプロウロキナーゼ誘導体ポリペプチドを分離
精製する。得られたヒトプロウロキナーゼ誘導体ポリペ
プチドのプラスミノーゲン活性化活性は、フィブリン平
板法〔Granelli-PipernoとReich : ジャーナル・オブ・
エクスペリメンタル・メディシン( J.Exp.Med.),148, 2
23 (1978)〕あるいはＳ−２４４４人工基質分解法によ
って定量することができる。以上、新規ヒトプロウロキ
ナーゼ誘導体ＵＫ−ΔＧＳ１の製造法について記載した
が、その他のヒトプロウロキナーゼ誘導体の場合も同様
に製造することができる。

【００３９】また、大腸菌による本ヒトプロウロキナー
ゼ誘導体の生産も可能である。大腸菌で生産した場合、
生産されたポリペプチドには糖鎖は付加していないが、
生産後、Ｎ−グリコシレーション結合部位に人工的に化
学反応によって糖鎖を付加することができる。このよう
にして造成された糖鎖導入型ヒトプロウロキナーゼ誘導
体についても動物細胞で生産したものと同等の効果が期
待できる。

【００４０】以下に本発明の実施例を示す。

【００４１】

【実施例】

実施例１ ＵＫ−ΔＧＳ１発現プラスミドｐＳＵＫΔＧ
Ｓ１Ｓ−５の造成 参考例１で得られたベクタープラスミドｐＡＧＥ１１０
約２μｇを３０μｌのＹ−０緩衝液〔10mM Tris-HCl(pH
7.5)、7mM MgCl₂、および6mM 2-メルカプトエタノール
を含む緩衝液〕に溶かし、１０単位のＡｓｐ718を加
え、３７℃で２時間消化反応を行った。続いて１.５μ
ｌの２Ｍ ＮａＣｌと１０単位のＨｉｎｄIII を加え、
さらに３７℃で１時間消化反応を行った。６５℃、１０
分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約９kbのＤＮＡ断片
を精製した。

【００４２】また、参考例３で得られたＵＫ−Ｓ１発現
プラスミドｐＳＵＫＳ１Ｓ−５ 約２μｇを３０μｌの
Ｙ−０緩衝液に溶かし、１０単位のＡｓｐ718を加え、
３７℃で２時間消化反応を行った。続いて１.５μｌの
２Ｍ ＮａＣｌと１０単位のＰｓｔＩを加え、さらに３
７℃で１時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱
処理後、ＡＦＴ法を用いて約０.９kbのＤＮＡ断片を精
製した。

【００４３】一方、参考例４で得られたＵＫ−ΔＧ発現
プラスミドｐＵＫΔＧ１ 約２μｇを３０μｌのＹ−１
００緩衝液〔10mM Tris-HCl(pH7.5)、100mM NaCl、7mM
MgCl₂、および6mM 2-メルカプトエタノールを含む緩衝
液〕に溶かし、１０単位のＨｉｎｄIIIと１０単位のＰ
ｓｔＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。６５
℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約０.３kb
のＤＮＡ断片を精製した。

【００４４】このようにして得られたｐＡＧＥ１１０由
来のＡｓｐ718−ＨｉｎｄIII断片（約９kb）約０.０２
μｇ、ｐＳＵＫＳ１Ｓ−５由来のＡｓｐ718−ＰｓｔＩ
断片（約０.９kb）約０.２μｇ、およびｐＵＫΔＧ１由
来のＨｉｎｄIII−ＰｓｔＩ断片（約０.３kb）約０.２
μｇを２０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液〔20mM Tris-HCl
(pH7.6)、10mM MgCl₂、10mM DTTおよび1mM ATPを含む緩
衝液〕に溶かし、１００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝
酒造社製）を加え、４℃で１８時間結合反応を行った。

【００４５】得られた組換え体プラスミドの混合物を用
いて、大腸菌ＭＭ２９４株を形質転換し、アンピシリン
（以下、Ａｐと略記する）耐性株を得た。この形質転換
株からプラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素消化による
構造解析を行ったところ、ｐＳＵＫΔＧＳ１Ｓ−５と称
するこのプラスミドＤＮＡは目的の構造を有することが
確認された（第１図参照）。

【００４６】実施例２ ＵＫ−ΔＧＳ１発現プラスミド
ｐＭｏ１ＵＫΔＧＳ１ＳＥｄ１−５（ｐＭＵＫΔＧＳ１
Ｓ−５）の造成 参考例５で得られたベクタープラスミドｐＡＧＥ１４７
約２μｇを３０μｌのＹ−１００緩衝液に溶解し、１０
単位のＨｉｎｄIIIと１０単位のＸｈｏＩを加えて３７
℃で２時間消化反応を行った。該反応液からＡＦＴ法を
用いて、約０.６３kbのＤＮＡ断片を回収した。一方、
実施例１で得られたｐＳＵＫΔＧＳ１Ｓ−５プラスミド
ＤＮＡ約２μｇを３０μｌのＹ−１００緩衝液に溶解
し、１０単位のＨｉｎｄIIIと１０単位のＸｈｏＩを加
えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液からＡ
ＦＴ法を用いて約１０kbのＤＮＡ断片を回収した。

【００４７】上記で得た、ｐＡＧＥ１４７由来のＨｉｎ
ｄIII−ＸｈｏＩ断片（約０.６３kb）約０.０５μgおよ
びｐＳＵＫΔＧＳ１Ｓ−５由来のＨｉｎｄIII−Ｘｈｏ
Ｉ断片（約１０kb）約０.２μgをＴ４リガーゼ緩衝液３
０μlに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１００単位を加
え、１２℃で１６時間結合反応を行った。該反応液を用
いて大腸菌ＨＢ１０１株をコーエンらの方法によって形
質転換し、Ａｐ耐性株を得た。この形質転換株から公知
の方法に従ってプラスミドを単離した。得られたプラス
ミドｐＭｏ１ＵＫΔＧＳ１ＳＥｄ１−５（以下、ｐＭＵ
ＫΔＧＳ１Ｓ−５と略記する）の構造は制限酵素消化に
より確認した（第２図参照）。

【００４８】実施例３ ヒトプロウロキナーゼ誘導体及
び天然型ヒトプロウロキナーゼの動物細胞による生産： （１）ｐＳＵＫΔＧＳ１Ｓ−５を保有するＣＨＯ細胞に
よるＵＫ−ΔＧＳ１ポリペプチドの生産：実施例１で得
られたｐＳＵＫΔＧＳ１Ｓ−５のｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ株
への導入は既述のエレクトロポーレーション法に準じて
行った。すなわち、ＣＨＯ細胞を４×１０⁷ 細胞／ｍｌ
になるように島津緩衝液〔0.25M マンニトール、0.1mM
CaCl₂、0.1mM MgCl₂、0.2mM Tris-HCl (pH7.2〜7.4)〕
に懸濁し、ＳＳＨ−Ｃ１３チェンバー（島津製作所製）
に４０μｌ分注した。これに、ｐＳＵＫΔＧＳ１Ｓ−５
ＤＮＡ（１μｇ／ｍｌ）４μｌを加えてよく混合し
た。細胞融合装置ＳＳＨ−１（島津製作所製）を用いて
電圧２.０ｋＶ／ｃｍ、パルス幅１００μｓｅｃ、パル
ス回数３回の条件で遺伝子導入を行った。

【００４９】１０分間静置させてＤＮＡを細胞に取り込
ませた後、ＭＥＭα（非選択培地）〔ＦＣＳ 1/10 量お
よび7.5％ NaHCO₃溶液(Flow Laboratories社製) 1/50量
を加えたＭＥＭα培地（リボ核酸およびデオキシリボ核
酸含有；ギブコ・オリエンタル社製）〕１０ｍｌに添加
し、３７℃、ＣＯ₂ インキュベーターにて１日間培養
（培養には直径１０ｃｍのディッシュを使用した：ＬＵ
Ｘ社製，以下、培養にはＬＵＸ社のディッシュを用い
た）した。細胞をＰＢＳ〔NaCl 8 g/l 、KCl 0.2 g/l、
Na₂HPO₄（無水) 1.15 g/l、KH₂PO₄ 0.2 g/lを含むリン
酸緩衝液〕で洗浄し、Ｇ４１８（ギブコ・オリエンタル
社製）を０.３ｍｇ／ｍｌになるように加えたＭＥＭα
（選択培地）１０ｍｌを加えて３７℃、ＣＯ₂ インキュ
ベーターにて約１０日間培養した。

【００５０】ＰＢＳで細胞を洗浄した後、０.０５％ト
リプシン、０.２％ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢
酸）を含む溶液３ｍｌを加え、余分な溶液を除いた。３
７℃で５分間インキュベートした後、１０ｍｌのＭＥＭ
α（選択培地）を加えて懸濁した細胞を直径１０ｃｍの
ディッシュに移し（このようにトリプシンを用いて細胞
をディッシュからはがす操作を以下、トリプシン処理と
いう）、３７℃、ＣＯ₂ インキュベーターにて３〜７日
間培養した。

【００５１】さらに出現してきたコロニーをトリプシン
処理によりディッシュからはがした後、５０ｎＭのＭＴ
Ｘを含む１０ｍｌのＭＥＭα（選択培地）に懸濁し、１
０ｃｍディッシュ中で培養した。出現してきたＭＴＸ耐
性の各コロニーを２４穴マイクロタイタープレートの各
ウェルに蒔き（この操作を単コロニー分離という）、コ
ンフルエントになるまで培養した。５０ｎＭ ＭＴＸを
含むＭＥＭα（選択培地）１ｍｌに培地交換し、該クロ
ーンを１日間培養した後、培養液中のＵＫ−ΔＧＳ１の
活性をフィブリン平板法を用いて調べた。その結果、ク
ローンNo.4-10の活性が最も高く、そのＵＫ−ΔＧＳ１
の生産量は２μｇ／日であった。

【００５２】さらに５００ｎＭ ＭＴＸを含むＭＥＭα
（選択培地）１０ｍｌに培地交換し、このクローンを上
記と同様の手順で培養して５００ｎＭ ＭＴＸ耐性株を
得た。これら５００ｎＭ ＭＴＸ耐性株のうち、最も生
産性の高かったクローンNo.4-10-28のＵＫ−ΔＧＳ１生
産量は１０μｇ／１０⁶ 細胞・日であった。このクロー
ンを５００ｎＭ ＭＴＸを含む１００ｍｌのＭＥＭα
（選択培地) 中でファルコン（Falcon) 3027型ローラー
・ボトルを用いて、コンフルエントになるまで培養した
後、１０IU/mlアプロチニン（ベーリンガー・マンハイ
ム社製）を含む無血清ＭＥＭα（選択培地）で３日間培
養した。得られた２０リットルの培養液を実施例４で用
いた。

【００５３】（２）ｐＭＵＫΔＧＳ１Ｓ−５を保有する
Namalwa細胞によるＵＫ−ΔＧＳ１ポリペプチドの生
産：実施例２で得られたｐＭＵＫΔＧＳ１Ｓ−５のNama
lwa細胞への導入は既述のエレクトロポーレーション法
に準じて行った。すなわち、細胞を４×１０⁷ 細胞／ｍ
ｌになるようにＫ−ＰＢＳ緩衝液（137mM KCl、0.27mM
NaCl、0.81mM Na₂HPO₄、0.15mM KH₂PO₄、4mM MgCl₂ ）
に懸濁し、ＳＳＨ−Ｃ１３チェンバーに４０μｌ分注し
た。これに、ｐＭＵＫΔＧＳ１Ｓ−５ ＤＮＡ（１μｇ
／μｌ）４μｌを加えてよく混合した。細胞融合装置Ｓ
ＳＨ−１を用いて電圧３.０ｋＶ／ｃｍ、パルス幅１０
０μｓｅｃ、パルス回数２回の条件で遺伝子導入を行っ
た。

【００５４】１０分間静置させてＤＮＡを細胞に取り込
ませた後、ＩＴＰＳＧＦ培地〔7.5％ NaHCO₃溶液 1/40
量、200mM Ｌーグルタミン溶液（ギブコ・オリエンタル
社製）を３％、ペニシリン・ストレプトマイシン溶液
（5000units/ml ペニシリン−5000μｇ/ml ストレプト
マイシン）（ギブコ・オリエンタル社製）を0.5％、N-2
-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルフォン
酸（ＨＥＰＥＳ）（10mM）、インシュリン（3μｇ／m
l）、トランスフェリン（5μｇ／ml）、ピルビン酸ナト
リウム（5mM）、亜セレン酸ナトリウム（125nM）、ガラ
クトース（1mg/ml）、プルロニックＦ６８（0.1％w/v）
を含むＲＰＭＩ1640培地（日水製薬社製）〕で希釈し、
生細胞数を測定した。このときの染色にはエリスロシン
Ｂを用いた。

【００５５】生細胞数が５×１０⁴ 細胞／ｍｌになるよ
うにＩＴＰＳＧＦ培地で希釈し、２００μｌずつ９６穴
マイクロタイター・プレートに分注した。３７℃、ＣＯ
₂ インキュベーターにて１日間培養後、Ｇ４１８を０.
５ｍｇ／ｍｌなるように加え、１０〜１４日間培養し
た。該培養液にＦＣＳを１０％、Ｇ４１８を０.３ｍｇ
／ｍｌ、７.５％ ＮａＨＣＯ₃ を1/40量、２００ｍＭ
Ｌ−グルタミン溶液を３％、ペニシリン・ストレプトマ
イシン溶液を０.５％含むＲＰＭＩ1640培地を５０μｌ
加えてさらに培養し、コンフルエントになった時点で培
養液中のＵＫ−ΔＧＳ１活性をフィブリン平板法によっ
て測定した。

【００５６】活性の認められたものについては５０ｎＭ
ＭＴＸを含むＩＴＰＳＧＦ培地２００ｍｌに培地交換
し培養を行った。出現してきたＭＴＸ耐性株をコンフル
エントになるまで培養した。５０ｎＭ ＭＴＸを含むＩ
ＴＰＳＧＦ培地２００μｌに培地交換し、１日間培養し
た後、培養液中のＵＫ−ΔＧＳ１の活性をフィブリン平
板法を用いて調べた。

【００５７】その結果、クローンNo.50-5の活性が最も
高く、そのＵＫ−ΔＧＳ１の生産量は１０μｇ／１０⁶
細胞・日であった。この培養上清をＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動にかけたところ、その分子量はＵ
Ｋ−ΔＧよりも増大しており、ＣＨＯ細胞で生産したＵ
Ｋ−ΔＧＳ１と同じ分子量であった。このことから、Na
malwa細胞で生産したＵＫ−ΔＧＳ１にも糖鎖が付加し
ていることが確認された。このようにNamalwa細胞でも
ＣＨＯ細胞と同様にＵＫ−ΔＧＳ１が分泌生産できるこ
とが確認された。

【００５８】（３）ｐＳＥ１ＵＫΔＧ１−３ｄ（ｐＳＵ
ＫΔＧ−３ｄ）を保有するＣＨＯ細胞によるＵＫ−ΔＧ
ポリペプチドの生産：参考例６で得られたｐＳＥ１ＵＫ
ΔＧ１−３ｄ（以下、ｐＳＵＫΔＧ−３ｄと略記する）
のｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ株への導入は既述のリン酸カルシ
ウム法に準じて行った。すなわち、ＭＥＭα（非選択培
地）５ｍｌに１×１０⁵ 細胞／ｍｌになるようにＣＨＯ
細胞を接種し、３７℃、ＣＯ₂ インキュベーターにて１
日間培養した。一方、ｐＳＵＫΔＧ−３ｄ ＤＮＡ １０
μｇを溶解した４５０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７.５）溶液に２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１.５ｍ
ＭＮａ₂ＨＰＯ₄、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.１）を
含む溶液５００μｌを混合した。さらに５０μｌの２.
５Ｍ ＣａＣｌ₂ 溶液を加えて、室温で５分間静置し
た。

【００５９】上述のｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞株を新しい
ＭＥＭα（非選択培地）に培地交換し、１時間培養した
後、上記のＤＮＡ溶液全量を加え、８時間培養した。Ｐ
ＢＳで細胞を洗浄し、５ｍｌのＭＥＭα（非選択培地）
を加えて１６時間培養した。細胞をＰＢＳで洗浄後トリ
プシン処理を行った。０.３ｍｇ／ｍｌ Ｇ−４１８を含
むＭＥＭα（選択培地）１０ｍｌに細胞をよく懸濁し、
直径１０ｃｍのディッシュを用い、３７℃、ＣＯ₂ イン
キュベーターにて５日間培養した。続いてＰＢＳで細胞
を洗浄し、ＭＥＭα（選択培地）１０ｍｌを加えて５日
間培養した。同様の手順で、さらに５日間培養した。Ｐ
ＢＳで細胞を洗浄した後、トリプシン処理し、５ｍｌの
ＭＥＭα（選択培地）に細胞を懸濁し、直径６ｃｍのデ
ィッシュを用い、３７℃、ＣＯ₂ インキュベーターにて
３〜７日間培養した。

【００６０】出現してきたコロニーをトリプシン処理し
た後、５０ｎＭのＭＴＸを含む１０ｍｌのＭＥＭα（選
択培地）を用いて細胞濃度５×１０⁴ 細胞／ｍｌになる
ように直径１０ｃｍのディッシュ１枚に植え込んだ。５
日おきに上記培地を用いて培地の交換を計３回行った。
出現してきたＭＴＸ耐性のコロニーを単コロニー分離
し、各々直径６ｃｍのディッシュを用い、コンフルエン
トになるまで培養した。５０ｎＭ ＭＴＸを含む５ｍｌ
のＭＥＭα（選択培地）に培地交換し、１日間培養した
後、培養液中のＵＫ−ΔＧ活性をフィブリン平板法を用
いて調べた。その結果、クローンNo.10-8の活性が最も
高く、そのＵＫ−ΔＧの生産量は１０μｇ／１０⁶ 細胞
・日であった。

【００６１】このクローンを、５０ｎＭ ＭＴＸを含む
１００ｍｌのＭＥＭα（選択培地）中でファルコン3027
型ローラー・ボトルを用いてコンフルエントになるまで
培養した。ついで１０IU／mlアプロチニンを含む無血清
ＭＥＭα（選択培地）で３日間培養した。この様にして
得られた４００ｍｌの培養液を実施例４で用いた。

【００６２】（４）ｐＳＥ１ＵＫ１ＳＥｄ１−３を保有
する動物細胞による天然型ヒトプロウロキナーゼポリペ
プチドの生産：上述のリン酸カルシウム法を用いて組換
え体プラスミドｐＳＥ１ＵＫ１ＳＥｄ１−３〔宮地 宏
昌ら：サイトテクノロジー（Cytotechnology），3 ，13
3 （1990）〕（以下、ｐＳＵＫＳ−３と略記する）をｄ
ｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞株に導入し、天然型ヒトプロウロ
キナーゼを生産する細胞株を得た。この中でクローンN
o.５の活性が最も高く、その天然型ヒトプロウロキナー
ゼの生産量は３μｇ／１０⁶ 細胞・日であった。

【００６３】このクローンを、５０ｎＭ ＭＴＸを含む
１００ｍｌのＭＥＭα（選択培地）中でファルコン3027
型ローラー・ボトルを用いてコンフルエントになるまで
培養し、１０IU／mlアプロチニンを含む無血清ＭＥＭα
（選択培地）を用い、３日間培養した。この様にして得
られた２０リットルの培養液を実施例４で用いた。

【００６４】実施例４ 天然型ヒトプロウロキナーゼ及
び各種ヒトプロウロキナーゼ誘導体の動物細胞培養液か
らの精製：実施例３で得た天然型ヒトプロウロキナーゼ
あるいはヒトプロウロキナーゼ誘導体を含有する無血清
培養液５リットルを０.０１％（重量／容量、以下同
様）Ｔｗｅｅｎ８０、０.０５％ ＮａＮ₃ および１００
ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７.
５）で平衡化した１００ｍｌの抗ウロキナーゼ（以下、
ＵＫと略記する）モノクローナル抗体カラムに通した。
なお、抗ＵＫモノクローナル抗体は、低分子型ＵＫ（日
本ケミカルリサーチ社製）を抗原としてミルスタインら
の方法〔C.Milstein：ネイチャー（Nature），256 , 49
5 (1975)〕に従い取得した。また、抗ＵＫモノクローナ
ル抗体カラムはファルマシア ＣＮＢｒ−活性化セファ
ロース(Sepharose）４Ｂ〔ファルマシア（Pharmacia )
社製〕に抗ＵＫモノクローナル抗体を結合させることに
より調製した。

【００６５】まず、カラム平衡時に使用した緩衝液を３
ベッド体積分だけ流した。次に、０.０１％ Ｔｗｅｅｎ
８０、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび２００ｍＭ アルギニ
ンを含むリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ４.０）を用い
て溶出し、溶出液は直ちにリン酸でｐＨ７.５に調整
し、ＵＫ緩衝液〔0.01％ Tween 80、100mM NaClおよび2
00mM アルギニンを含むリン酸緩衝液（pH7.5 ）〕に４
℃、１日間透析した。これを最終精製標品とし、以下の
実験に使用した。

【００６６】この最終精製標品は１本鎖であり、蛋白質
として９５％以上の純度であることをＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動で確認した。また、ヒトプロウ
ロキナーゼ誘導体ＵＫ−ΔＧＳ１は新たなＮ−グリコシ
レーション結合部位（−Asn¹⁶⁴-Thr¹⁶⁵-Thr¹⁶⁶−）を持
っているが、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
の結果、その分子量はＵＫ−ΔＧよりも増大しており、
特にプラスミンにより２本鎖に切断した場合、Ｎ末端側
断片の分子量はＵＫ−ΔＧと同じであるが、糖鎖付加が
可能なアミノ酸置換を導入したＣ末端側断片の分子量は
増加していることが確認された。これによってＵＫ−Δ
ＧＳ１には目的通り糖鎖が付加していることが確認され
た。

【００６７】実施例５ 天然型ヒトプロウロキナーゼと
ヒトプロウロキナーゼ誘導体のin vitroにおける比活性
の比較：実施例４で得られた天然型ヒトプロウロキナー
ゼまたはヒトプロウロキナーゼ誘導体を含む最終精製標
品の濃度は、逆相ＨＰＬＣカラム（ＴＳＫｇｅｌ ＯＤ
Ｓ−１２０Ｔ 東ソー社製）を用いて、各最終精製標品
のピーク面積を、ローリー法〔ローリー（Lowry）ら：
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.
Biol. Chem.), 193 ,265 (1951) 〕によって濃度の決定
された天然型ヒトプロウロキナーゼのピーク面積と比較
することにより求めた。

【００６８】活性はＳ−２４４４人工基質分解法、及び
フィブリン平板法によって測定した。Ｓ−２４４４人工基質分解法 サンプルはＵＫ緩衝液で約５μｇ／ｍｌに調整したもの
を使用した。スタンダードはヒト・ウロキナーゼ（２本
鎖型、尿由来、日本ケミカルリサーチ社製）をＵＫ緩衝
液で５００ IU/mlに調整したものを使用した。次に、Ｔ
ＮＴ緩衝液〔0.05M Tris-HCl (pH7.4)、0.038M NaCl、
0.01％ Tween80〕で２倍ずつ１０段階希釈したサンプル
およびスタンダードを５０μｌずつ９６穴マイクロタイ
タープレートに分注した。さらにＴＮＴ緩衝液で２０ｐ
Ｍに調整したプラスミン（ベーリンガー・マンハイム社
製）を５０μｌずつ加え、３７℃、３０分間加温した。
次に、ＴＮＴ緩衝液で１.２ｍＭに調整した合成発色基
質Ｓ−２４４４（第一化学薬品社製）５０μｌを加え、
３７℃、９０分間加温した。得られた各溶液の４０５ｎ
ｍの吸光度を測定し、活性を求めた。

【００６９】フィブリン平板法 フィブリン・プレートの作成 ５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７.０）５ｍｌにウシ・ト
ロンビン（シグマ社製）１,０００Ｕを溶解後、０.４５
μｍのメンブレン・フィルターで滅菌濾過し、トロンビ
ン溶液を得た。次に、滅菌した５０ｍＭ リン酸緩衝液
（ｐＨ７.０）１００ｍｌにウシ・フィブリノーゲン
（ナカライテスク社製）１ｇを３０分攪拌・溶解し、滅
菌したガラスウールで不溶物を除去し、フィブリノーゲ
ン溶液を得た。次に、５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７.
０）１００ｍｌに、寒天（シグマ社製）２ｇを加え、
１.５気圧、１２０℃、２０分で滅菌後、６０℃に保温
し、２％寒天溶液を得た。１０ｃｍディッシュ１枚に、
トロンビン溶液０.２５ｍｌ、フィブリノーゲン溶液５
ｍｌ、寒天溶液５ｍｌをそれぞれ加え混ぜた後、寒天を
固めてフィブリン・プレートを得た。

【００７０】フィブリン平板法による活性測定 スタンダードとして、ヒト・ウロキナーゼ（２本鎖型、
尿由来、日本ケミカルリサーチ社製）をＵＫ緩衝液に溶
解し、それぞれ１、１０、１００、１,０００、１０,０
００IU／mｌに調整したものを使用した。

【００７１】サンプルは、まずＵＫ緩衝液を用いて０.
２５μｇ／ｍｌに調整した。この溶液９０μｌに、プラ
スミン処理をするサンプルについてはＵＫ緩衝液を用い
て１００ｎＭに調整したプラスミン１０μｌを添加し、
プラスミン処理を施さないサンプルについてはプラスミ
ンの代わりにＵＫ緩衝液１０μｌを添加した。これらサ
ンプルは３７℃で１時間加温後、氷冷し、以下の反応に
供した。

【００７２】フィブリン・プレートに直径２ｍｍの穴を
スタンダードとサンプルの数だけ開け、その穴にスタン
ダード、および上で調製したサンプルをそれぞれ５μｌ
ずつ入れた。３７℃で２４時間インキュベートした後、
生じたハロー（溶解斑）の直径を測定し、スタンダード
による検量線（活性とハローの直径との関係）をもと
に、各サンプルの活性を求めた。それぞれの結果を第１
表に示す。

【００７３】

【表１】

【００７４】これらの結果より、ヒトプロウロキナーゼ
誘導体ＵＫ−ΔＧＳ１はin vitroではプラスミンで活性
化しなければフィブリン平板法で活性が検出されないこ
とがわかった。このことはＵＫ−ΔＧＳ１がプラスミン
で活性化されにくいこと、即ち２本鎖になりにくいこと
を示唆している。このような結果は天然型ヒトプロウロ
キナーゼ、ヒトプロウロキナーゼ誘導体ＵＫ−Ｓ１およ
びＵＫ−ΔＧの性質からは予想できないものであり、糖
鎖導入とＧドメインの欠失を同時に導入することにより
予期できなかった新しい性質が付与できたことを示す。

【００７５】実施例６ 犬を用いた血栓溶解能、線溶系
因子の血中濃度および血中半減期の測定；血栓溶解能の
測定は以下のようにして行った。体重６.０〜１１.７ｋ
ｇの雌雄雑犬を３０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタール・
ナトリウムの静脈内投与によって麻酔した後、直ちに室
内空気（room air）による人工呼吸を施した。薬物投与
用のカニューレを大腿静脈に、採血用のカニューレを大
腿動脈に挿入した後、反対側の大腿動脈を長さ約５ｃｍ
に渡って露出させた。露出部の最も上流側に電磁血流計
（ＭＦＶ３１００、日本光電社製）を装着した。血流計
からの信号は、生体電気用アンプ（ＡＢ−６２１Ｇ、日
本光電社製）を通し、熱ペン式レコーダ−（ＷＳ−６８
１Ｇ、日本光電社製）に記録した。

【００７６】大腿動脈血栓は長さ約１０ｍｍ、直径約３
ｍｍの銅製のコイルを剥離部の血管に挿入することによ
って作製した。血管の両端で血流を一時止め、血管の一
部を切開して銅コイルを挿入した。切開部は、内側をシ
リコンでコートしたテフロンチューブで継ぎ、血液が滞
りなく流れるように補修した。ヒトプロウロキナーゼ誘
導体を投与した後３０、６０、１２０分の各時点で銅コ
イルを取り出して重量を測定し、挿入前の重量と比較す
ることによって血栓重量の経時的変化を測定した（第３
図参照）。結果から、ＵＫ−ΔＧＳ１はヒトプロウロキ
ナーゼ誘導体ＵＫ−Ｓ１より血栓溶解能、特に初期血栓
溶解能に優れていることが示された。

【００７７】同時に副作用の指標として、線溶系因子の
血中濃度変化を調べた。線溶系因子としてα₂ −プラス
ミンインヒビター〔α₂ −Plasmin Inhibitor （以下、
α₂ＰＩと略記する）〕およびプラスミノーゲンを測定
した。測定方法を以下に示す。薬物を投与する直前、投
与後１５、３０、６０、１２０分の各時点において、大
腿動脈より採血した。採血した血液は１／１０容の３.
８％クエン酸ナトリウム、１／４０容のＰＰＡＣＫ〔 D
-Phe−L-Pro−L-Arg−Chioromethyl Ketone 、Lot#9860
06, カルビオ（CALBIO CHEM）社製〕（最終濃度１２.５
mＭ）を添加し、直ちに遠心し−２０℃で保存した。血
漿中のα₂ ＰＩ、およびプラスミノーゲンの測定は、そ
れぞれα₂ ＰＩオートカラー三共（三共製薬社製）、お
よびＰＬＧオートカラー三共（三共製薬社製）を用い
て、オリンパスオートアナライザーＡＵ５１０（オリン
パス光学社製）で行った（第４、５図参照）。

【００７８】第４、５図に示した結果から、ヒトプロウ
ロキナーゼ誘導体ＵＫ−ΔＧＳ１は、線溶系因子の活性
化はほとんど誘起せず、天然型ヒトプロウロキナーゼよ
り副作用の軽減されたＵＫ−Ｓ１よりもさらに副作用の
ない血栓溶解剤であることが確認された。

【００７９】さらに同時に、ヒトウロキナーゼに対する
抗体を用いたサンドイッチ型の酵素免疫測定法により、
各プラスミノーゲン活性化因子の血漿中濃度の測定を行
い、第６図に示す結果を得た。これよりヒトプロウロキ
ナーゼ誘導体ＵＫ−ΔＧＳ１の血中半減期は天然型ヒト
プロウロキナーゼよりも血中半減期が延長しているＵＫ
−Ｓ１と同等であることが示された。ボーラス投与が可
能なことから、血中半減期については十分有効であると
考えられる。

【００８０】参考例１ ベクタープラスミドｐＡＧＥ１
１０の造成 ｐＡＧＥ１０７〔宮地 宏昌ら：サイトテクノロジー
（Cytotechnology），3，133 （1990）〕プラスミドＤ
ＮＡ約２μｇを４０μｌのＹ−０緩衝液に溶かし、１０
単位のＫｐｎＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行っ
た。続いて１.５μｌの２Ｍ ＮａＣｌと１０単位のＸ
ｈｏＩを加え、さらに３７℃で１時間消化反応を行っ
た。６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約
０.４kbのＤＮＡ断片を精製した。

【００８１】また、ｐＳＵＫＳ−３プラスミドＤＮＡ約
３μｇを３０μｌのＹ−１００緩衝液に溶かし、１２単
位のＨｉｎｄIIIを加え、３７℃で２時間消化反応を行
った。６５℃、１０分間の熱処理後、フェノール抽出お
よびクロロホルム抽出を行った。エタノール沈澱によっ
てＤＮＡ断片を回収し、４０μｌのポリメラーゼ緩衝液
〔50mM Tris-HCl(pH7.8)、7mM MgCl₂、6mM 2-メルカプ
トエタノール、0.25mMdATP 、0.25mM dCTP 、0.25mM dG
TP 、および0.25mM dTTP を含む緩衝液〕に溶かし、６
単位のクレノー断片を加え、１５℃で１時間反応させ、
ＨｉｎｄIII突出末端を平坦末端に変えた。反応をフェ
ノール抽出によって止め、クロロホルム抽出を行った
後、エタノール沈澱によってＤＮＡ断片を回収した。

【００８２】得られた直鎖状ｐＳＵＫＳ−３プラスミド
ＤＮＡ約３μｇを３０μｌのＹ−０緩衝液に溶かし、１
５単位のＫｐｎＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行
った。続いて１.５μｌの２Ｍ ＮａＣｌと１２単位の
ＸｈｏＩを加え、さらに３７℃で１時間消化反応を行っ
た。６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約
２.０kbのＤＮＡ断片と約６.７kbのＤＮＡ断片を精製し
た。

【００８３】このようにして得られたｐＡＧＥ１０７由
来のＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ断片（約０.４kb）約０.１μ
ｇ、ｐＳＵＫＳ−３由来のＨｉｎｄIII−ＫｐｎＩ断片
（約２.０kb）約０.２μｇとＨｉｎｄIII−ＸｈｏＩ断
片（約６.７kb）約０.２μｇを２０μｌのＴ４リガーゼ
緩衝液に溶かし、１００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加
え、４℃で１８時間結合反応を行った。

【００８４】得られた組換え体プラスミドの混合物を用
いて、大腸菌ＭＭ２９４株を形質転換し、Ａｐ耐性株を
得た。この形質転換株からプラスミドＤＮＡを単離し、
制限酵素消化による構造解析を行ったところ、ｐＡＧＥ
１１０と称するこのプラスミドＤＮＡは目的の構造を有
することが確認された（第７図参照）。

【００８５】参考例２ ｐＳＵＫＳ−５の造成 ｐＳＵＫＳ−３プラスミドＤＮＡ約２μｇを３０μｌの
Ｙ−０緩衝液に溶かし、１０単位のＫｐｎＩを加え、３
７℃で２時間消化反応を行った。続いて１.５μｌの２
Ｍ ＮａＣｌと１０単位のＸｈｏＩを加え、さらに３７
℃で１時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱処
理後、ＡＦＴ法を用いて約８.８kbのＤＮＡ断片を精製
した。

【００８６】また、ｐＳＵＫＳ−３プラスミドＤＮＡ約
３μｇを３０μｌのＹ−１００緩衝液に溶かし、１２単
位のＢａｍＨＩと１２単位のＸｈｏＩを加え、３７℃で
２時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱処理
後、ＡＦＴ法を用いて約１.７kbのＤＮＡ断片を精製し
た。一方、配列番号３および配列番号４で示される第８
図記載の２種の合成ＤＮＡを３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を
用いて合成した。得られた合成ＤＮＡ２５pmolずつを１
０μｌのＴ４キナーゼ緩衝液に溶解し、５単位のＴ４Ｄ
ＮＡキナーゼを加え、３７℃で３０分間反応させること
により、５’末端をリン酸化した。

【００８７】このようにして得られたｐＳＵＫＳ−３由
来のＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ断片（約８.８kb）約０.１μｇ
とＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片（約１.７kb）約０.２μ
ｇ、および５’リン酸化された２種の合成ＤＮＡ（１pm
olずつ）を２０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶かし、３
００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、４℃で１８時間
結合反応を行った。

【００８８】得られた組換え体プラスミドの混合物を用
いて、大腸菌ＭＭ２９４株を形質転換し、Ａｐ耐性株を
得た。この形質転換株からプラスミドＤＮＡを単離し、
制限酵素消化による構造解析およびＭ１３ディデオキシ
・シークエンス法による塩基配列決定を行い、目的の構
造を有しているプラスミドＤＮＡをｐＳＵＫＳ−５とし
た（第８図参照）。

【００８９】参考例３ ＵＫ−Ｓ１発現プラスミドｐＳ
ＵＫＳ１Ｓ−５の造成 本発明者らによって造成されたｐＳＥ１ＵＫＳ１ＳＥｄ
１−３（以下、ｐＳＵＫＳ１Ｓ−３と略記する）（特開
平2-227075）プラスミドＤＮＡ約２μｇを３０μｌのＹ
−０緩衝液に溶かし、１０単位のＫｐｎＩを加え、３７
℃で２時間消化反応を行った。続いて１.５μｌの２Ｍ
ＮａＣｌと１０単位のＸｈｏＩを加え、さらに３７℃
で１時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱処理
後、ＡＦＴ法を用いて約１０.１kbのＤＮＡ断片を精製
した。

【００９０】また、ｐＳＵＫＳ１Ｓ−３プラスミドＤＮ
Ａ約３μｇを３０μｌのＹ−１００緩衝液に溶かし、１
２単位のＢａｍＨＩと１２単位のＸｈｏＩを加え、３７
℃で２時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱処
理後、ＡＦＴ法を用いて約１.７kbのＤＮＡ断片を精製
した。一方、参考例２で得られたｐＳＵＫＳ−５プラス
ミドＤＮＡ約４μｇを３０μｌのＹ−０緩衝液に溶か
し、１５単位のＫｐｎＩを加え、３７℃で２時間消化反
応を行った。続いて１.５μｌの２Ｍ ＮａＣｌと１２
単位のＢａｍＨＩを加え、さらに３７℃で１時間消化反
応を行った。６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を
用いて約０.０５kbのＤＮＡ断片を精製した。

【００９１】このようにして得られたｐＳＵＫＳ１Ｓ−
３由来のＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ断片（約１０.１kb）約０.
０２μｇとＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片（約１.７kb）約
０.２μｇ、およびｐＳＵＫＳ−５由来のＫｐｎＩ−Ｂ
ａｍＨＩ断片（約０.０５kb）約０.３μｇを２０μｌの
Ｔ４リガーゼ緩衝液に溶かし、１００単位のＴ４ＤＮＡ
リガーゼを加え、４℃で１８時間結合反応を行った。

【００９２】得られた組換え体プラスミドの混合物を用
いて、大腸菌ＭＭ２９４株を形質転換し、Ａｐ耐性株を
得た。この形質転換株からプラスミドＤＮＡを単離し、
制限酵素消化による構造解析を行ったところ、ｐＳＵＫ
Ｓ１Ｓ−５と称するこのプラスミドＤＮＡは目的の構造
を有することが確認された（第９図参照）。

【００９３】参考例４ ＵＫ−ΔＧ発現プラスミドｐＵ
ＫΔＧ１の造成 本発明者らによって造成された、ｐＵＫＢ１０１プラス
ミドＤＮＡ（特開平2-227075）約２μｇを３０μｌのＹ
−１００緩衝液に溶かし、１６単位のＳｍａＩと１０単
位のＨｉｎｄIII を加え、３７℃で２時間消化反応を行
った。６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて
約４.０kbのＤＮＡ断片を精製した。さらに本発明者ら
によって造成されたｐＵＫＦｐｒｏ（特開平2-227075）
プラスミドＤＮＡ約２μｇを３０μｌのＹ−１００緩衝
液に溶かし、１６単位のＴａｑＩと１０単位のＨｉｎｄ
IIIを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。６５
℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約０.３kb
のＤＮＡ断片を精製した。

【００９４】一方、配列番号５および配列番号６で示さ
れる第１０図記載の２種の合成ＤＮＡを３８０Ａ・ＤＮ
Ａ合成機を用いて合成した。得られた合成ＤＮＡ２５pm
olずつを１０μｌのＴ４キナーゼ緩衝液に溶解し、５単
位のＴ４ＤＮＡキナーゼを加え、３７℃で３０分間反応
させることにより、５’末端をリン酸化した。このよう
にして得られたｐＵＫＢ１０１由来のＳｍａＩ−Ｈｉｎ
ｄIII断片（約４.０kb）約０.１μｇ、ｐＵＫＦｐｒｏ
由来のＴａｑＩ−ＨｉｎｄIII断片（約０.３kb）約０.
１μｇ、および５’リン酸化された２種の合成ＤＮＡ
（１pmolずつ）を２０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶か
し、３００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、４℃で１
８時間結合反応を行った。

【００９５】得られた組換え体プラスミドの混合物を用
いて、大腸菌ＭＭ２９４株を形質転換し、Ａｐ耐性株を
得た。この形質転換株からプラスミドＤＮＡを単離し、
制限酵素消化による構造解析を行ったところ、ｐＵＫΔ
Ｇ１と称するこのプラスミドＤＮＡは目的の構造を有す
ることが確認された（第１０図参照）。

【００９６】参考例５ ベクタープラスミドｐＡＧＥ１
４７の造成 ｐＰＭＯＬ１プラスミドＤＮＡ（特開平1-63394）２μ
ｇをＹ−０緩衝液３０μｌに溶解し、２０単位のＳｍａ
Ｉを加え、３０℃で３時間消化反応を行った。その後、
ＮａＣｌを５０ｍＭになるように添加し、２０単位のＣ
ｌａＩを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。該反
応液からＡＦＴ法を用いて、約０.６KbのＤＮＡ断片を
回収した。

【００９７】一方、下記２種の合成ＤＮＡを３８０Ａ・
ＤＮＡ合成機を用いて合成した。 ５’-TCGAGGACC- ３’ ３’-CCTGGGC- ５’ 得られた合成ＤＮＡ２５pmolずつをＴ４キナーゼ緩衝液
１０μｌに溶解し、５単位のＴ４ＤＮＡキナーゼを加
え、３７℃で３０分間反応させることにより５’末端を
リン酸化した。

【００９８】上記で得た、ｐＰＭＯＬ１由来のＣｌａＩ
−ＳｍａＩ断片（約０.６kb）約０.０５μｇ、５’リン
酸化された２種の合成ＤＮＡ（１pmolずつ）およびＨｉ
ｎｄIIIリンカー(5'-pCAAGCTTG-3'; 宝酒造社製)（１pm
ol）をＴ４リガーゼ緩衝液３０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼ２００単位を加え、１２℃で１６時間結合反
応を行った。エタノール沈澱により該ＤＮＡ断片を回収
した後、２０μｌのＹ−１００緩衝液に溶解し、１０単
位のＨｉｎｄIIIおよび１０単位のＸｈｏＩを加えて３
７℃で２時間消化反応を行った。反応をフェノール−ク
ロロホルム抽出により停止させ、エタノール沈澱により
約０.６３kbのＤＮＡ断片を回収した。

【００９９】一方、ｐＡＧＥ１０７プラスミドＤＮＡ１
μｇを３０μｌのＹ−１００緩衝液に溶解し、１０単位
のＨｉｎｄIIIと１０単位のＸｈｏＩを加えて３７℃で
２時間消化反応を行った。該反応液からＡＦＴ法を用い
て約６.０kbのＤＮＡ断片を回収した。上記で得たｐＡ
ＧＥ１０７由来のＨｉｎｄIII−ＸｈｏＩ断片（約６.０
kb）約０.３μｇおよびｐＰＭＯＬ１由来のＨｉｎｄIII
−ＸｈｏＩ断片（約０.６３kb)約０.０１μｇをＴ４リ
ガーゼ緩衝液２０μｌに溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２
００単位を加え、１２℃で１６時間結合反応を行った。

【０１００】該反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株をコ
ーエンらの方法によって形質転換し、Ａｐ耐性株を得
た。この形質転換株から公知の方法に従ってプラスミド
を単離した。得られたプラスミドの構造は制限酵素消化
により確認した。このプラスミドをｐＡＧＥ１４７と呼
ぶ（第１１図参照）。

【０１０１】参考例６ ＵＫ−ΔＧ発現プラスミドｐＳ
ＵＫΔＧ−３ｄの造成 参考例４で得られたｐＵＫΔＧ１プラスミドＤＮＡ約２
μｇを３０μｌのＹ−１００緩衝液に溶かし、１０単位
のＢｇｌIIと１０単位のＨｉｎｄIIIを加え、３７℃で
２時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱処理
後、ＡＦＴ法を用いて約０.４kbのＤＮＡ断片を精製し
た。

【０１０２】また、参考例８で得られたｐＳＥ１ＵＫｐ
ｒｏ１ｄｈｆｒ１−３Ａ（以下、ｐＳＵＫ−３ｄと略記
する）プラスミドＤＮＡ約２μｇを３０μｌのＹ−０緩
衝液に溶かし、１０単位のＫｐｎＩを加え、３７℃で２
時間消化反応を行った。続いて１.５μｌの２Ｍ Ｎａ
Ｃｌと１０単位のＢｇｌIIを加え、さらに３７℃で１時
間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱処理後、Ａ
ＦＴ法を用いて約１kbのＤＮＡ断片を精製した。

【０１０３】一方、ｐＳＵＫ−３ｄプラスミドＤＮＡ約
２μｇを３０μｌのＹ−０緩衝液に溶かし、１５単位の
ＫｐｎＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。続
いて１.５μｌの２Ｍ ＮａＣｌと１２単位のＨｉｎｄI
II を加え、さらに３７℃で１時間消化反応を行った。
６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約９.
２kbのＤＮＡ断片を精製した。

【０１０４】このようにして得られたｐＵＫΔＧ１由来
のＢｇｌII−ＨｉｎｄIII断片（約０.４kb）約０.２μ
ｇ、ｐＳＵＫ−３ｄ由来のＫｐｎＩ−ＢｇｌII断片（約
１kb）約０.２μｇとＫｐｎＩ−ＨｉｎｄIII断片（約
９.２kb）約０.０２μｇを２０μｌのＴ４リガーゼ緩衝
液に溶かし、１００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、
４℃で１８時間結合反応を行った。

【０１０５】得られた組換え体プラスミドの混合物を用
いて、大腸菌ＭＭ２９４株を形質転換し、Ａｐ耐性株を
得た。この形質転換株からプラスミドＤＮＡを単離し、
制限酵素消化による構造解析を行ったところ、ｐＳＵＫ
ΔＧ−３ｄと称するこのプラスミドＤＮＡは目的の構造
を有することが確認された（第１２図参照）。

【０１０６】参考例７ ｐＳＥ１ｄｈｆｒ１Ａ−Ｋの造
成 ｐＳＥ１ｄｈｆｒ１Ａ〔宮地 宏昌ら：サイトテクノロ
ジー（Cytotechnology），4 ，173 （1990）〕プラスミ
ドＤＮＡ約２μｇを４０μｌのＹ−５０緩衝液〔10mM T
ris-HCl(pH7.5)、50mM NaCl、7mM MgCl₂、および6mM 2-
メルカプトエタノールを含む緩衝液〕に溶かし、１０単
位のＨｉｎｄIIIを加え、３７℃で２時間消化反応を行
った。６５℃、１０分間の熱処理後、フェノール抽出お
よびクロロホルム抽出を行った。エタノール沈澱によっ
てＤＮＡ断片を回収し、４０μｌのポリメラーゼ緩衝液
に溶かし、６単位のクレノー断片を加え、１５℃で１時
間反応させ、ＨｉｎｄIII突出末端を平坦末端に変え
た。反応をフェノール抽出によって止め、クロロホルム
抽出を行った後、エタノール沈澱によってＤＮＡ断片を
回収した。

【０１０７】一方、２０pmolのＫｐｎＩリンカー（ＧＧ
ＧＴＡＣＣＣ：宝酒造社製）を参考例４で述べた方法と
同様にして５’末端をリン酸化した。このようにして得
られたｐＳＥ１ｄｈｆｒ１Ａ由来の約７kbのＤＮＡ断片
約０.１μｇおよび１pmolの５’リン酸化されたＫｐｎ
Ｉリンカーを２０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶かし、
１００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、４℃で１８時
間結合反応を行った。

【０１０８】得られた組換え体プラスミドの混合物を用
いて、大腸菌ＭＭ２９４株を形質転換し、Ａｐ耐性株を
得た。この形質転換株からプラスミドＤＮＡを単離し、
制限酵素消化による構造解析を行ったところ、ｐＳＥ１
ｄｈｆｒ１Ａ−Ｋと称するこのプラスミドＤＮＡは目的
の構造を有することが確認された（第１３図参照）。

【０１０９】参考例８ ｐＳＵＫ−３ｄの造成 上述のｐＡＧＥ１０７プラスミドＤＮＡ約２μｇを３０
μｌのＹ−１００緩衝液に溶かし、１０単位のＸｈｏＩ
と１０単位のＨｉｎｄIIIを加え、３７℃で２時間消化
反応を行った。６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法
を用いて約０.４kbのＤＮＡ断片を精製した。また、宮
地らによって造成されたｐＵＣ１９ＵＫｄ３プラスミド
ＤＮＡ（特開平2-257891）約２μｇを３０μｌのＹ−０
緩衝液に溶かし、１０単位のＫｐｎＩを加え、３７℃で
２時間消化反応を行った。続いて１.５μｌの２Ｍ Ｎ
ａＣｌと１０単位のＨｉｎｄIIIを加え、さらに３７℃
で１時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱処理
後、ＡＦＴ法を用いて約１.４kbのＤＮＡ断片を精製し
た。

【０１１０】一方、参考例７で得られたｐＳＥ１ｄｈｆ
ｒ１Ａ−ＫプラスミドＤＮＡ約２μｇを３０μｌのＹ−
０緩衝液に溶かし、１５単位のＫｐｎＩを加え、３７℃
で２時間消化反応を行った。続いて１.５μｌの２Ｍ
ＮａＣｌと１２単位のＸｈｏＩを加え、さらに３７℃で
１時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱処理
後、ＡＦＴ法を用いて約６.７kbのＤＮＡ断片を精製し
た。

【０１１１】このようにして得られたｐＡＧＥ１０７由
来のＸｈｏＩ−ＨｉｎｄIII断片（約０.４kb）約０.１
μｇ、ｐＵＣ１９ＵＫｄ３由来のＫｐｎＩ−ＨｉｎｄII
I断片（約１.４kb）約０.２μｇ、およびｐＳＥ１ｄｈ
ｆｒ１Ａ−Ｋ由来のＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ断片（約６.７k
b）約０.０２μｇを２０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶
かし、１００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、４℃で
１８時間結合反応を行った。

【０１１２】得られた組換え体プラスミドの混合物を用
いて、大腸菌ＭＭ２９４株を形質転換し、Ａｐ耐性株を
得た。この形質転換株からプラスミドＤＮＡを単離し、
制限酵素消化による構造解析を行ったところ、ｐＳＵＫ
−３ｄと称するこのプラスミドＤＮＡは目的の構造を有
することが確認された（第１４図参照）。

【０１１３】

【発明の効果】本発明におけるヒトプロウロキナーゼ誘
導体は、天然型ヒトプロウロキナーゼに比べて血中半減
期が長く、また血栓溶解能も優れている。さらに副作用
の指標となる全身線溶系因子の活性化はほとんど誘起せ
ず、ボーラス投与における理想的な血栓溶解剤であるこ
とが示された。このため本発明は血栓塞栓性疾患の治療
において、より安全でより効果的な治療を可能とし、医
療分野への大きな貢献が期待できる。

【０１１４】

【配列表】配列番号：1 配列の長さ：1188 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ヒト 株名 ：デトロイト５６２細胞株 配列 ATG AGA GCC CTG CTG GCG CGC CTG CTT CTC TGC GTC CTG GTC GTG AGC 48 Met Arg Ala Leu Leu Ala Arg Leu Leu Leu Cys Val Leu Val Val Ser -20 -15 -10 -5 GAC TCC AAA GGC AGC AAT GAA CTT CAT CAA GTT CCA TCG AAG TCA AAG 96 Asp Ser Lys Gly Ser Asn Glu Leu His Gln Val Pro Ser Lys Ser Lys 1 5 10 ACA TGT TAT GAG GGG AAT GGT CAC TTT TAC CGA GGA AAG GCC AGC ACT 144 Thr Cys Tyr Glu Gly Asn Gly His Phe Tyr Arg Gly Lys Ala Ser Thr 15 20 25 GAC ACC ATG GGC CGG CCC TGC CTG CCC TGG AAC TCT GCC ACT GTC CTT 192 Asp Thr Met Gly Arg Pro Cys Leu Pro Trp Asn Ser Ala Thr Val Leu 30 35 40 CAG CAA ACG TAC CAT GCC CAC AGA TCT GAT GCT CTT CAG CTG GGC CTG 240 Gln Gln Thr Tyr His Ala His Arg Ser Asp Ala Leu Gln Leu Gly Leu 45 50 55 60 GGG AAA CAT AAT TAC TGC AGG AAC CCA GAC AAC CGG AGG CGA CCC TGG 288 Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Arg Arg Arg Pro Trp 65 70 75 TGC TAT GTG CAG GTG GGC CTA AAG CCG CTT GTC CAA GAG TGC ATG GTG 336 Cys Tyr Val Gln Val Gly Leu Lys Pro Leu Val Gln Glu Cys Met Val 80 85 90 CAT GAC TGC GCA GAT GGA AAA AAG CCC TCC TCT CCT CCA GAA GAA TTA 384 His Asp Cys Ala Asp Gly Lys Lys Pro Ser Ser Pro Pro Glu Glu Leu 95 100 105 AAA TTT CAG TGT GGC CAA AAG ACT CTG AGG CCC CGC TTT AAG ATT ATT 432 Lys Phe Gln Cys Gly Gln Lys Thr Leu Arg Pro Arg Phe Lys Ile Ile 110 115 120 GGG GGA GAA AAC ACC ACC ATC GAG AAC CAG CCC TGG TTT GCG GCC ATC 480 Gly Gly Glu Asn Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp Phe Ala Ala Ile 125 130 135 140 TAC AGG AGG CAC CGG GGG GGC TCT GTC ACC TAC GTG TGT GGA GGC AGC 528 Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val Cys Gly Gly Ser 145 150 155 CTC ATC AGC CCT TGC TGG GTG ATC AGC GCC ACA CAC TGC TTC ATT GAT 576 Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser Ala Thr His Cys Phe Ile Asp 160 165 170 TAC CCA AAG AAG GAG GAC TAC ATC GTC TAC CTG GGT CGC TCA AGG CTT 624 Tyr Pro Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Val Tyr Leu Gly Arg Ser Arg Leu 175 180 185 AAC TCC AAC ACG CAA GGG GAG ATG AAG TTT GAG GTG GAA AAC CTC ATC 672 Asn Ser Asn Thr Gln Gly Glu Met Lys Phe Glu Val Glu Asn Leu Ile 190 195 200 CTA CAC AAG GAC TAC AGC GCT GAC ACG CTT GCT CAC CAC AAT GAC ATT 720 Leu His Lys Asp Tyr Ser Ala Asp Thr Leu Ala His His Asn Asp Ile 205 210 215 220 GCC TTG CTG AAG ATC CGT TCC AAG GAG GGC AGG TGT GCG CAG CCA TCC 768 Ala Leu Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu Gly Arg Cys Ala Gln Pro Ser 225 230 235 CGG ACT ATA CAG ACC ATC TGC CTG CCC TCG ATG TAT AAC GAT CCC CAG 816 Arg Thr Ile Gln Thr Ile Cys Leu Pro Ser Met Tyr Asn Asp Pro Gln 240 245 250 TTT GGC ACA AGC TGT GAG ATC ACT GGC TTT GGA AAA GAG AAT TCT ACC 864 Phe Gly Thr Ser Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys Glu Asn Ser Thr 255 260 265 GAC TAT CTC TAT CCG GAG CAG CTG AAA ATG ACT GTT GTG AAG CTG ATT 912 Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gln Leu Lys Met Thr Val Val Lys Leu Ile 270 275 280 TCC CAC CGG GAG TGT CAG CAG CCC CAC TAC TAC GGC TCT GAA GTC ACC 960 Ser His Arg Glu Cys Gln Gln Pro His Tyr Tyr Gly Ser Glu Val Thr 285 290 295 300 ACC AAA ATG CTG TGT GCT GCT GAC CCA CAG TGG AAA ACA GAT TCC TGC 1008 Thr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Gln Trp Lys Thr Asp Ser Cys 305 310 315 CAG GGA GAC TCA GGG GGA CCC CTC GTC TGT TCC CTC CAA GGC CGC ATG 1056 Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Ser Leu Gln Gly Arg Met 320 325 330 ACT TTG ACT GGA ATT GTG AGC TGG GGC CGT GGA TGT GCC CTG AAG GAC 1104 Thr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys Ala Leu Lys Asp 335 340 345 AAG CCA GGC GTC TAC ACG AGA GTC TCA CAC TTC TTA CCC TGG ATC CGC 1152 Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His Phe Leu Pro Trp Ile Arg 350 355 360 AGT CAC ACC AAG GAA GAG AAT GGC CTG GCC CTC TGA 1188 Ser His Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Ala Leu *** 365 370 375

【０１１５】配列番号：2 配列の長さ：1296 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ヒト 株名 ：デトロイト５６２細胞株 配列 ATG AGA GCC CTG CTG GCG CGC CTG CTT CTC TGC GTC CTG GTC GTG AGC 48 Met Arg Ala Leu Leu Ala Arg Leu Leu Leu Cys Val Leu Val Val Ser -20 -15 -10 -5 GAC TCC AAA GGC AGC AAT GAA CTT CAT CAA GTT CCA TCG AAC TGT GAC 96 Asp Ser Lys Gly Ser Asn Glu Leu His Gln Val Pro Ser Asn Cys Asp 1 5 10 TGT CTA AAT GGA GGA ACA TGT GTG TCC AAC AAG TAC TTC TCC AAC ATT 144 Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Val Ser Asn Lys Tyr Phe Ser Asn Ile 15 20 25 CAC TGG TGC AAC TGC CCA AAG AAA TTC GGA GGG CAG CAC TGT GAA ATA 192 His Trp Cys Asn Cys Pro Lys Lys Phe Gly Gly Gln His Cys Glu Ile 30 35 40 GAT AAG TCA AAA ACC TGC TAT GAG GGG AAT GGT CAC TTT TAC CGA GGA 240 Asp Lys Ser Lys Thr Cys Tyr Glu Gly Asn Gly His Phe Tyr Arg Gly 45 50 55 60 AAG GCC AGC ACT GAC ACC ATG GGC CGG CCC TGC CTG CCC TGG AAC TCT 288 Lys Ala Ser Thr Asp Thr Met Gly Arg Pro Cys Leu Pro Trp Asn Ser 65 70 75 GCC ACT GTC CTT CAG CAA ACG TAC CAT GCC CAC AGA TCT GAT GCT CTT 336 Ala Thr Val Leu Gln Gln Thr Tyr His Ala His Arg Ser Asp Ala Leu 80 85 90 CAG CTG GGC CTG GGG AAA CAT AAT TAC TGC AGG AAC CCA GAC AAC CGG 384 Gln Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Arg 95 100 105 AGG CGA CCC TGG TGC TAT GTG CAG GTG GGC CTA AAG CCG CTT GTC CAA 432 Arg Arg Pro Trp Cys Tyr Val Gln Val Gly Leu Lys Pro Leu Val Gln 110 115 120 GAG TGC ATG GTG CAT GAC TGC GCA GAT GGA AAA AAG CCC TCC TCT CCT 480 Glu Cys Met Val His Asp Cys Ala Asp Gly Lys Lys Pro Ser Ser Pro 125 130 135 140 CCA GAA GAA TTA AAA TTT CAG TGT GGC CAA AAG ACT CTG AGG CCC CGC 528 Pro Glu Glu Leu Lys Phe Gln Cys Gly Gln Lys Thr Leu Arg Pro Arg 145 150 155 TTT AAG ATT ATT GGG GGA GAA TTC ACC ACC ATC GAG AAC CAG CCC TGG 576 Phe Lys Ile Ile Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp 160 165 170 TTT GCG GCC ATC TAC AGG AGG CAC CGG GGG GGC TCT GTC ACC TAC GTG 624 Phe Ala Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val 175 180 185 TGT GGA GGC AGC CTC ATC AGC CCT TGC TGG GTG ATC AGC GCC ACA CAC 672 Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser Ala Thr His 190 195 200 TGC TTC ATT GAT TAC CCA AAG AAG GAG GAC TAC ATC GTC TAC CTG GGT 720 Cys Phe Ile Asp Tyr Pro Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Val Tyr Leu Gly 205 210 215 220 CGC TCA AGG CTT AAC TCC AAC ACG CAA GGG GAG ATG AAG TTT GAG GTG 768 Arg Ser Arg Leu Asn Ser Asn Thr Gln Gly Glu Met Lys Phe Glu Val 225 230 235 GAA AAC CTC ATC CTA CAC AAG GAC TAC AGC GCT GAC ACG CTT GCT CAC 816 Glu Asn Leu Ile Leu His Lys Asp Tyr Ser Ala Asp Thr Leu Ala His 240 245 250 CAC AAT GAC ATT GCC TTG CTG AAG ATC CGT TCC AAG GAG GGC AGG TGT 864 His Asn Asp Ile Ala Leu Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu Gly Arg Cys 255 260 265 GCG CAG CCA TCC CGG ACT ATA CAG ACC ATC TGC CTG CCC TCG ATG TAT 912 Ala Gln Pro Ser Arg Thr Ile Gln Thr Ile Cys Leu Pro Ser Met Tyr 270 275 280 AAC GAT CCC CAG TTT GGC ACA AGC TGT GAG ATC ACT GGC TTT GGA AAA 960 Asn Asp Pro Gln Phe Gly Thr Ser Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys 285 290 295 300 GAG AAT TCT ACC GAC TAT CTC TAT CCG GAG CAG CTG AAA ATG ACT GTT 1008 Glu Asn Ser Thr Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gln Leu Lys Met Thr Val 305 310 315 GTG AAG CTG ATT TCC CAC CGG GAG TGT CAG CAG CCC CAC TAC TAC GGC 1056 Val Lys Leu Ile Ser His Arg Glu Cys Gln Gln Pro His Tyr Tyr Gly 320 325 330 TCT GAA GTC ACC ACC AAA ATG CTG TGT GCT GCT GAC CCA CAG TGG AAA 1104 Ser Glu Val Thr Thr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Gln Trp Lys 335 340 345 ACA GAT TCC TGC CAG GGA GAC TCA GGG GGA CCC CTC GTC TGT TCC CTC 1152 Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Ser Leu 350 355 360 CAA GGC CGC ATG ACT TTG ACT GGA ATT GTG AGC TGG GGC CGT GGA TGT 1200 Gln Gly Arg Met Thr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys 365 370 375 380 GCC CTG AAG GAC AAG CCA GGC GTC TAC ACG AGA GTC TCA CAC TTC TTA 1248 Ala Leu Lys Asp Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His Phe Leu 385 390 395 CCC TGG ATC CGC AGT CAC ACC AAG GAA GAG AAT GGC CTG GCC CTC TGA 1296 Pro Trp Ile Arg Ser His Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Ala Leu *** 400 405 410

【０１１６】配列番号：3 配列の長さ：49 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GATCCGCAGT CACACCAAGG AAGAGAATGG CCTGGCCCTC TAGAGGTAC 49

【０１１７】配列番号：4 配列の長さ：41 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CTCTAGAGGG CCAGGCCATT CTCTTCCTTG GTGTGACTGC G 41

【０１１８】配列番号：5 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CGAAGTCAAA GACATGTTAT GAG 23

【０１１９】配列番号：6 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CTCATAACAT GTCTTTGACT T 21

【０１２０】

【図面の簡単な説明】

【図１】第１図はプラスミドｐＳＵＫΔＧＳ１Ｓ−５の
造成工程を示す。

【図２】第２図はプラスミドｐＭＵＫΔＧＳ１Ｓ−５の
造成工程を示す。

【図３】第３図はボーラス投与における各プラスミノー
ゲン活性化因子の血栓溶解能を示す。

【図４】第４図はボーラス投与における各プラスミノー
ゲン活性化因子投与後のα₂ −プラスミンインヒビター
（α₂ ＰＩ）の血中濃度変化を示す。

【図５】第５図はボーラス投与における各プラスミノー
ゲン活性化因子投与後のプラスミノーゲンの血中濃度変
化を示す。

【図６】第６図はボーラス投与における各プラスミノー
ゲン活性化因子の血中濃度変化を示す。

【図７】第７図はプラスミドｐＡＧＥ１１０の造成工程
を示す。

【図８】第８図はプラスミドｐＳＵＫＳ−５の造成工程
を示す。

【図９】第９図はプラスミドｐＳＵＫＳ１Ｓ−５の造成
工程を示す。

【図１０】第１０図はプラスミドｐＵＫΔＧ１の造成工
程を示す。

【図１１】第１１図はプラスミドｐＡＧＥ１４７の造成
工程を示す。

【図１２】第１２図はプラスミドｐＳＵＫΔＧ−３ｄの
造成工程を示す。

【図１３】第１３図はプラスミドｐＳＥ１ｄｈｆｒ１Ａ
−Ｋの造成工程を示す。

【図１４】第１４図はプラスミドｐＳＵＫ−３ｄの造成
工程を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 久保 和博 静岡県田方郡修善寺町柏久保532の６ (72)発明者 桑原 隆 静岡県沼津市寿町18の33 ルミナス21 Ｂ −103

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトプロウロキナーゼのトロンビン切断
   部位近傍〔天然型ヒトプロウロキナーゼのＮ末端から１
   ４９番目のアミノ酸（グリシン残基）から１６４番目の
   アミノ酸（フェニールアラニン残基）までの間〕にアミ
   ノ酸置換変異、アミノ酸欠失変異あるいはアミノ酸挿入
   変異を導入した変異部近傍に糖鎖が付加しており、かつ
   ヒトプロウロキナーゼのエピダーマルグロースファクタ
   ードメイン〔天然型ヒトプロウロキナーゼのＮ末端から
   １０番目のアミノ酸（アスパラギン残基）から４５番目
   のアミノ酸（アスパラギン酸残基）までの間〕にアミノ
   酸置換変異、アミノ酸欠失変異あるいはアミノ酸挿入変
   異を導入した新規ヒトプロウロキナーゼ誘導体。
2. 【請求項２】 トロンビン切断部位近傍の変異部がＮ─
   グリコシレーション結合部位（アスパラギン残基─Ｘ残
   基─スレオニン残基あるいはセリン残基、Ｘ残基はプロ
   リン以外のアミノ酸）を有するものであることを特徴と
   する請求項１記載の新規ヒトプロウロキナーゼ誘導体。
3. 【請求項３】 トロンビン切断部位近傍の変異がヒトプ
   ロウロキナーゼのＮ末端から１６４番目のアミノ酸（フ
   ェニールアラニン残基）がアスパラギン残基に置換され
   たものであることを特徴とする請求項１記載の新規ヒト
   プロウロキナーゼ誘導体。
4. 【請求項４】 ヒトプロウロキナーゼのエピダーマルグ
   ロースファクタードメイン内のアミノ酸欠失変異がヒト
   プロウロキナーゼのＮ末端から１０番目のアミノ酸（ア
   スパラギン残基）から４５番目のアミノ酸（アスパラギ
   ン酸残基）までの領域を欠失させたものであることを特
   徴とする請求項１記載の新規ヒトプロウロキナーゼ誘導
   体。
5. 【請求項５】 請求項１から４のいずれかに記載のヒト
   プロウロキナーゼ誘導体のポリペプチド部分のアミノ酸
   配列をコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）。
6. 【請求項６】 請求項５記載のＤＮＡを組み込んでなる
   組換え体プラスミド。
7. 【請求項７】 組換え体プラスミドがｐＳＥ１ＵＫΔＧ
   Ｓ１ＳＥｄ１−５である請求項６記載の組換え体プラス
   ミド。
8. 【請求項８】 請求項６または７記載の組換え体プラス
   ミドを含有する微生物細胞または動物細胞。
9. 【請求項９】 請求項８記載の微生物細胞または動物細
   胞を培地に培養し、培養物中に変異ヒトプロウロキナー
   ゼを蓄積させ、該培養物からヒトプロウロキナーゼ誘導
   体を採取することからなるヒトプロウロキナーゼ誘導体
   の製造法。