JPH05336982A

JPH05336982A - ポリヒドロキシ有機酸エステルの分離・精製法

Info

Publication number: JPH05336982A
Application number: JP4353197A
Authority: JP
Inventors: Koichi Mochida; 晃一持田; Yoshikazu Kondo; 義和近藤; Masao Matsui; 雅男松井; Kunio Ichihashi; 邦夫市橋
Original assignee: Kanebo Ltd
Current assignee: Kanebo Ltd
Priority date: 1992-06-11
Filing date: 1992-12-11
Publication date: 1993-12-21

Abstract

(57)【要約】【構成】ポリヒドロキシ有機酸エステル蓄積菌体から
ポリヒドロキシ有機酸エステルを分離・精製する方法で
あって、菌体懸濁液へ溶菌酵素を添加して細胞壁を溶解
する工程ののち、細胞質中に存在する顆粒皮膜で覆われ
た粒径0.1 μｍ以上のポリヒドロキシ有機酸エステル顆
粒について、これを分離回収して集める工程と、しかる
のちに蛋白分解酵素処理によって顆粒皮膜を除去する工
程とからなることを特徴とするポリヒドロキシ有機酸エ
ステルの分離・精製法である。【効果】本発明の分離・精製法により、ＰＨＡ蓄積菌
から、安全に効率よく、純度の高いＰＨＡを分離・精製
することが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、菌体内に蓄積されたポ
リヒドロキシ有機酸エステル（以下、ＰＨＡという）を
分離・精製する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＰＨＡは、細菌のエネルギー貯蔵物質と
して菌体内に蓄積される高分子であることが知られてい
る。ＰＨＡは自然分解性を有するポリマーであることか
ら、環境保護の問題が注目される昨今、大いにその利
用、応用が期待されている。しかしながら、その分離・
精製が問題であった。

【０００３】従来、菌体内ＰＨＡの分離・精製は、クロ
ロホルム、ジクロルエタンなどといった塩素系有機溶媒
を用いて行なわれていた（たとえば、特開昭61-35790号
公報参照）。しかし、抽出に必要とされる溶剤量がきわ
めて大量であるばかりでなく、抽出した溶液の粘度も非
常に大きく該溶液からのポリマーの分離・精製が困難で
ある。さらに、毒性および環境に対する影響に鑑みれ
ば、このような有機溶媒を多量に用いる方法は好ましく
ない。実際に、これらの有機溶媒の使用は漸次、法的に
規制される方向である。

【０００４】また、塩素系以外の有機溶媒であるジオキ
サンを用いた方法もあるが（特開昭63-198991 号公報参
照）、ポリマーの溶解性の点で、ジオキサン溶液の温度
を80度以上という高温にしなければならず、作業性の点
やＰＨＡが分解・劣化するなど実用性に欠けるものであ
る。

【０００５】有機溶媒を用いない方法としては、特開昭
60-145097 号公報に記載の方法があげられる。これは、
ＰＨＡ含有菌体を蛋白分解酵素および／または界面活性
剤で可溶化したのちにＰＨＡを含む不溶性残留物を分離
する方法である。このような方法では、蛋白分解酵素お
よび／または界面活性剤により非選択的に細胞膜や蛋白
質が可溶化されＰＨＡ含有液の粘度が著しく高くなる。
そのため、溶液からのＰＨＡ顆粒の分離・回収操作が困
難になり、不純物除去のための濾過、遠心分離などの分
離・回収操作も不可能となる。また、分離・精製操作中
にＰＨＡが細胞質および蛋白質酵素加水分解物と混在
し、安定な懸濁液となるため、遠心分離によってＰＨＡ
を集めるためには凝集剤を添加してフロックを形成させ
なくてはならない。これにより凝集剤添加という工程が
増えるだけでなく、フロック中にはＰＨＡ以外の成分が
含まれることになるため、製造コストの面でもＰＨＡの
純度の面でも不都合である。

【０００６】特開昭63-226291 号公報には、菌体をスフ
ェロプラストへ変換し、音波振動処理によってこれらを
破砕し、そして遠心分離したのちに形成される最上層
（ＰＨＡ）を分離する方法が記載されている。この方法
では、音波振動処理によりＰＨＡ含有液の粘度はやはり
著しく上昇する。また、浮上したＰＨＡを分離するた
め、ＰＨＡと同比重である不純物を除去することができ
ない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明はかかる実情に
鑑み、これまでのような有害な有機溶剤を用いず、かつ
ＰＨＡ含有液の大幅な粘度アップを抑え、また凝集剤の
添加のような余分の工程も不要な純度の高いＰＨＡの分
離・精製法を提供することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明はＰＨＡ蓄積菌体
からＰＨＡを分離・精製する方法であって、菌体懸濁液
へ溶菌酵素を添加して細胞壁を溶解する工程ののち、細
胞質中に存在する顆粒皮膜で覆われた粒径0.1 μｍ以上
のＰＨＡ顆粒について、これを分離回収して集める工程
と、しかるのちに蛋白分解酵素処理によって顆粒皮膜を
除去する工程とからなることを特徴とするＰＨＡの分離
・精製法に関する。

【０００９】

【実施例】本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意検
討を重ねた結果、溶菌酵素を用いることによりＰＨＡ顆
粒膜を損なうことなく細胞壁のみを溶解することで、Ｐ
ＨＡを顆粒として他の細胞成分より容易に分離しうるこ
と、さらにＰＨＡ顆粒から容易に膜成分を除去しうるこ
とを見出し、本発明を完成した。

【００１０】つぎに本発明のＰＨＡ分離・精製法につい
て説明する。

【００１１】本発明において用いられるＰＨＡ蓄積菌体
は、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属、アル
カリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属またはバチル
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物、その他ＰＨ
Ａを菌体内に蓄積する微生物であればいずれの菌体でも
よい。ここで、ＰＨＡとは、以下の式(I) で示される、
菌体内に蓄積されるポリマーまたはコポリマーである。式(I) ：

【００１２】

【化１】（式中、ｍおよびｎは整数を表わす）そのようなＰＨＡ
としては、たとえば下記の式(II)で示されるポリ-3- ヒ
ドロキシ酪酸エステル（以下、ＰＨＢという）よりなる
ポリマーまたはＰＨＢよりなるポリマーが主成分となる
ポリマーがあげられる。式(II)：

【００１３】

【化２】（式中、ｎは前記と同じ）そのばあいは、他の成分とし
て、炭素数５以上の有機酸エステル成分も含まれてもよ
い。さらに、3-ヒドロキシ酪酸エステル、3-ヒドロキシ
吉草酸エステルよりなるポリマーがあげられる。

【００１４】このようなＰＨＡを菌体内に蓄積する微生
物では、ＰＨＡは顆粒として顆粒膜に包まれて菌体内に
存在する。ＰＨＡ顆粒膜は、ＰＨＡ合成酵素およびＰＨ
Ａ分解酵素などの蛋白質と微量のリン脂質からなるもの
で、菌体内でＰＨＡを細胞質から隔離し、顆粒を安定な
形状に保つ働きをしている。

【００１５】菌体中のＰＨＡ顆粒の粒径は0.1 μｍ以上
であればよい。粒径が0.1 μｍ未満のばあいには分離・
回収が格段に困難になりかつ0.1 μｍ以下の分率が相対
的に少なく、0.1 μｍ以下のＰＨＡ顆粒を除外したとし
ても実用上は問題ない。分離操作を行なう前に、検鏡に
より0.1 μｍ以上であることを確認する。微生物体内に
蓄積するＰＨＡ顆粒の大きさは、上述のように0.1 μｍ
以上が好ましく、0.1μｍ未満の顆粒は分離精製過程に
おいて排除される可能性がある。

【００１６】また、菌体中のＰＨＡ蓄積量も限定されな
いが、本発明の方法は菌体中のＰＨＡ蓄積量が高いばあ
いにとくに有効であり、好ましくは80重量％以上であ
る。

【００１７】本発明において用いられる溶菌酵素は、細
胞壁を消化するが、顆粒膜を消化しないものならば何で
もよい。そのような酵素としては、たとえばリゾチーム
があげられる。

【００１８】まず、前記菌体を懸濁した水性溶液に、溶
菌酵素を0.1 〜0.5 mg／ml添加して室温、約ｐＨ６〜8.
5 にて10〜60分程度消化を行なう。

【００１９】溶菌酵素処理によりえられたＰＨＡ顆粒を
含有する液から、ＰＨＡ顆粒を分離回収する。ＰＨＡ顆
粒の分離は、遠心分離、濾過、電気泳動などによって行
なうことができる。工業的規模で行なうばあいには、遠
心分離または濾過が好ましい。

【００２０】遠心分離によってＰＨＡ顆粒を分離するば
あいには、遠心分離は約9,000 〜12,000Ｇ（Ｇ：重力加
速度）で２〜15分間程度行なうのが好ましいが、ＰＨＡ
顆粒の形状および大きさなどにより適宜決定されるべき
である。

【００２１】濾過によってＰＨＡ顆粒を分離するばあい
には、通常使用される精密濾過膜や限外濾過膜を使用で
きる。たとえば、ポリエチレンやポリプロピレン、ポリ
テトラフルオロエチレン、ポリカーボネートなどのフィ
ルム、メンブレンに特定の孔を形成させたものがあげら
れる。該濾過膜の孔の大きさは、通常少なくとも0.05μ
ｍ以上である。遠心分離と濾過とを組み合わせることに
よっても効率的、あるいは高精度で達成できる。

【００２２】そのようにして分離されたＰＨＡ顆粒を蛋
白分解酵素処理することにより、ＰＨＡ顆粒膜を溶解除
去する。すなわち、ＰＨＡ顆粒をｐＨ６〜８の10〜100
μＭトリス- ＨＣｌ緩衝液またはリン酸緩衝液中に再懸
濁し、蛋白分解酵素を100 〜1000μg ／ml添加して30〜
40℃にて30〜60分間反応させることにより行なう。

【００２３】用いられる蛋白分解酵素はとくに限定され
ないが、たとえばプロナーゼ、ナガーゼ、ビオプラー
ゼ、パパイン、トリプシンなどがあげられる。

【００２４】蛋白分解酵素処理後、再び遠心などにより
ＰＨＡを分離する。必要に応じて反応後に水で洗浄を行
なう。

【００２５】ＰＨＡ顆粒膜の溶解除去は、前記のように
顆粒を分散した溶液から行なうことも可能であるが、Ｐ
ＨＡ顆粒を直接溶融、成形したのちに行なうこともでき
る。成形条件としては、ＰＨＡの分解温度以下にて行な
うことが必須である。好ましくは、分解点以下にて圧力
をかけて焼結体を形成することが好ましい。成形後に処
理することにより、処理中に顆粒が壊れずにＰＨＡが回
収しやすいなどの工業的メリットがある。また、蛋白分
解酵素処理が容易に行なわれるように、成型はフィル
ム、シート、集積体または糸状などのようにできるだけ
表面積が大きくなるような形に行なう。そうすることに
より、溶解処理面積増大にともなう処理時間の低減が図
られる。このように成形されたＰＨＡ顆粒をそのまま、
または細断して蛋白分解酵素を溶解した緩衝液に加え、
前記と同様にして反応せしめ、蛋白質を溶解除去する。

【００２６】または、菌体を溶菌酵素処理したのち、前
記のように蛋白分解酵素処理を先に行なってから、前記
の分離操作によりＰＨＡを分離することも可能である。
蛋白分解酵素処理を適切に行なうことによりＰＨＡ顆粒
は膜が溶解されたのちも顆粒状を保ち、その後につづく
分離操作は容易に行なうことができる。

【００２７】なお、本発明の分離・精製法においては必
要に応じて、溶菌処理の際に核酸分解処理を行なっても
よい。核酸分解処理は、たとえば小ウシのパンクレアス
由来デオキシリボヌクレアーゼＩ（400 〜600 Ｕ／mg）
などの核酸分解酵素を加えることにより行なわれる。

【００２８】また、本発明の分離・精製法においては必
要に応じて、溶菌処理後に超音波処理および10ＫＨｚ程
度の可聴音波を使用した音波処理を行なうこともでき
る。このばあいの超音波処理および10ＫＨｚ程度の可聴
音波を使用した音波処理条件としては、ＰＨＡ顆粒自体
が分解しない程度の処理を行なう。また、必要に応じて
ＰＨＡ分散液を冷却する。菌の種類により、処理条件は
当然変わってくるが、10ＫＨｚ以上1000ＫＨｚ程度の音
波あるいは超音波を使用する。これらの周波数は微生物
の種類によっても変えることは任意である。強度は、通
常0.05Ｗ／cm²以上好ましくは、0.1 〜50Ｗ／cm²、さ
らに好ましくは１〜30Ｗ／cm²程度である。ただし、菌
体の超音波処理に通常用いられる超音波強度（１Ｗ／cm
²程度）よりかなり強い強度（10〜30Ｗ／cm²程度）の
超音波を用いて処理しても、菌体中のＰＨＡ顆粒は破壊
されない。一方、その他の菌体成分は速やかに微細化さ
れる（本発明の方法にしたがってリゾチームで処理され
たのちのロドバクターキャプスレイタスのばあい、20
ＫＨｚ、20Ｗ／cm²、５分の超音波処理により菌体は微
細化された）。したがって、超音波の強度が強いほど処
理が短時間で済み、効率的である。

【００２９】以上のような方法により精製されたＰＨＡ
がえられる。

【００３０】つぎに本発明のＰＨＡの分離・精製法を実
施例に基づいて説明するが、本発明はもとよりかかる実
施例のみに限定されるものではない。実施例１ロドバクターキャプスレイタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔ
ｅｒｃａｐｓｕｌａｔｕｓＡＴＣＣ 11166）（グル
コースを炭素源としたときに主としてＰＨＢからなるＰ
ＨＡを蓄積することが知られる）をグルコースを炭素源
として培養したＰＨＡ蓄積菌体（菌体１個あたり粒径0.
4 〜0.6 μｍの顆粒が２〜３個入っているのが観察され
た）５ｇ（湿菌，乾燥菌体１ｇに相当）をｐＨ7.0 、50
ｍＭリン酸緩衝液30mlに懸濁し、リゾチーム（塩化リゾ
チーム（精製）卵白由来、ナカライテスク社製）50mg、
１ＭＣａＣｌ₂ 0.5ml 、デオキシリボヌクレアーゼ
（シグマ製、タイプＩ）を0.5mg 加えて撹拌し、室温で
30分間反応させた。ついで、氷冷下超音波処理を20ＫＨ
ｚ、10分間行なった。つぎに遠心分離を10,000Ｇで30分
間行なってＰＨＡ粒子画分を集めた。再度、ＰＨＡ画分
をｐＨ8.0 、50ｍＭリン酸緩衝液へ懸濁し遠心分離して
ＰＨＡ画分を集めて精製を繰返し、粗ＰＨＡ（純度75
％）0.52ｇをえた。粗ＰＨＡを150 ℃で溶融し厚さ50μ
ｍのフィルムに成形した。このフィルムを約１×１mmに
砕断し、ｐＨ7.0 、50ｍＭリン酸緩衝液に浸漬し、プロ
ナーゼ20mgを加え、80℃、６時間反応させた。反応後フ
ィルムを水洗し乾燥した（0.8 ｇ）。実施例２実施例１でえたロドバクターキャプスレイタス（Ｒ．
ｃａｐｓｕｌａｔｕｓＡＴＣＣ 11166）の凍結乾燥菌体
100mg （ＰＨＡ含有量80％）を50ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ8.0 ）100ml へ懸濁し、５分間ゆるやかに撹拌し
た。検鏡の結果、菌体内ＰＨＡ顆粒の直径は0.4 〜0.8
μｍで１または２個が１菌体内に存在するのがわかっ
た。ついで１ＭＭｇＣｌ₂ １ml、リゾチーム（塩化
リゾチーム（精製）卵白由来、ナカライテスク社製）50
mg、ＤＮＡアーゼ（シグマ製、タイプＩ）１mgおよび0.
1 ＭＥＤＴＡナトリウム２mlを加えて撹拌して溶かし
た。30分間撹拌後、容器を砕氷中へ移し、10ＫＨｚで２
分間処理した。遠心管へ移し、5000Ｇ20分の条件で遠心
分離し、上清をすて、50ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.
0 ）10mlを加えて粗ＰＨＡ懸濁液をえた。同条件で遠心
分離して上清をすてたのち、0.01％トリプシンを含む同
トリス塩酸緩衝液３mlを加えて、30℃、10分間撹拌して
ＰＨＡ顆粒膜蛋白質を溶解した。これを5000Ｇで10分間
遠心分離して上清をすて、沈降したＰＨＡへ同緩衝液10
mlを加えて撹拌後5000Ｇ、10分間の条件で遠心分離し
た。上清をすて沈降したＰＨＡを凍結乾燥した。収量は
75mgであった。実施例３実施例１により製造したＰＨＡの性状を確認するため
に、熱分析（ＤＳＣ）、分子量分布測定（ＧＰＣ）およ
び核磁気共鳴スペクトルの測定（ＮＭＲ）を行なった。

【００３１】以下にその条件と結果を示す。（１）ＧＰＣ（検液）試料約30mgにｍ−クレゾールを10ml加え40℃
にて完全に溶解したのち、ＣＨＣｌ₃で50mlにメスアッ
プし、0.45μのメンプランフィルターで濾過したものを
検液とした。

【００３２】（測定条件）ポンプ：ＣＣＰＤ（東ソー）カラム：ＧＭＨＸＬ（東ソー）溶離液：ｍ−クレゾール／ＣＨＣｌ₃（１：４）流量：1.0 ml／min 温度：40°（恒温槽ＣＯ−８０１１東ソー）Ｄｅｔ．：Ｒ１−８０１０（東ソー）注入量：50μｌ（分子量較正曲線）標準ポリスチレンより作成し、分子
量は標準ポリスチレン分子量の換算値表わす。

【００３３】（データ）分子量分布曲線を図１に示す。

【００３４】（結果）データより実施例１のＰＨＡの
Ｍｗは180 万、Ｍｎは80万であることがわかった。Ｍｗ
／Ｍｎは2.25であった。（２）ＤＳＣ測定結果を図２に示す。

【００３５】この結果から、実施例１のＰＨＡのＴｍは
165.2 ℃であることがわかった。（３）ＮＭＲ磁場を300MHzとして、溶媒は重水素化クロロホルムを用
いてＮＭＲを行なった。

【００３６】実施例１でえられたＰＨＡについての¹Ｈ
−ＮＭＲの測定結果を図３に、¹³Ｃ−ＮＭＲの測定結果
を図４に示した。

【００３７】ＮＭＲの結果より、実施例１でえたＰＨＡ
はヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）、ヒドロキシ吉草酸（ＰＨ
Ｖ）単位を含むことおよびその比が約95：５であること
がわかった。実施例４実施例１でえたＰＨＡをクロロホルムに溶解しガラス板
上にキャスト、風乾しフィルム成型した。このフィルム
を当研究所庭（防府市鐘紡町４番１号）に埋めて強度、
伸度、形態的な経時変化を観察した。結果を表１に示す
が、約60日で完全に強度を失うまでに分解することがわ
かる。また、図５から図８に、それぞれ埋める前、埋め
た後８日、30日および60日間経過後のフィルムの状態の
電子顕微鏡写真を示す。

【００３８】

【表１】

【００３９】

【発明の効果】本発明の分離・精製法により、ＰＨＡ蓄
積菌から、安全に効率よく、純度の高いＰＨＡを分離・
精製することが可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１でえられたポリマーの分子量分布曲線
である。

【図２】実施例１でえられたポリマーの熱分析の測定結
果を表わすグラフである。

【図３】実施例１でえられたポリマーの¹Ｈ−ＮＭＲの
スペクトル分析の結果を表わすチャートである。

【図４】実施例１でえられたポリマーの¹³Ｃ−ＮＭＲス
ペクトル分析の結果を表わすチャートである。

【図５】実施例４の埋める前のフィルムの電子顕微鏡写
真（50倍）である。

【図６】実施例４の埋めた後８日間経過後のフィルムの
電子顕微鏡写真（50倍）である。

【図７】実施例４の埋めた後30日間経過後のフィルムの
電子顕微鏡写真（30倍）である。

【図８】実施例４の埋めた後60日間経過後のフィルムの
電子顕微鏡写真（30倍）である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ポリヒドロキシ有機酸エステル蓄積菌体
からポリヒドロキシ有機酸エステルを分離・精製する方
法であって、菌体懸濁液へ溶菌酵素を添加して細胞壁を
溶解する工程ののち、細胞質中に存在する顆粒皮膜で覆
われた粒径0.1 μｍ以上のポリヒドロキシ有機酸エステ
ル顆粒について、これを分離回収して集める工程と、し
かるのちに蛋白分解酵素処理によって顆粒皮膜を除去す
る工程とからなることを特徴とするポリヒドロキシ有機
酸エステルの分離・精製法。