JPH0461638B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物からの３−ヒドロキシブチレー
トポリマーの分離方法に関する。 ポリ（３−ヒドロキシブチレート）は、多くの
微生物、殊に例えばアルカリゲネス
（Alcaligenes）、アチオロ−ジウム
（Athiorhodium）、アゾトバクター
（Azotobacter）、バシルス（Bacillus）、ノカル
ジア（Nocardia）、シユウドモナス
（Pseudomonas）、リゾビウ（Rhizobium）及び
スピリリウム（Spirilliumu）属の細菌によつて、
エネルギー備蓄物質として蓄積される熱可塑性ポ
リエステルであつて、下記式 −CH（CH₃）・CH₂・CO・Ｏ− の繰返し単位からなるものである。 このポリマーは、微生物を、水性培地中でエネ
ルギー及び炭素源としての炭水化物またはメタノ
ールのような適当な基質で培養することによつて
都合よく作られる。基質は、もちろん、微生物に
よつて同化されうるものでなければならない。ポ
リマーの蓄積を促進するには、培養工程の少なく
とも一部分を、微生物の成長のために必須である
けれども該ポリマーの蓄積のためには要求されな
い栄養素の制限条件下で実施するのが好ましい。
適当な培養方法の例は、欧州特許第15669号及び
第46344号明細書に記載されている。 ３−ヒドロキシブチレート単位とその他のヒド
ロキシカルボン酸単位（例えば３−ヒドロキシバ
レレート単位）との両方を含むポリマーも、微生
物により産生されうる。従つて、微生物により産
生された３−ヒドロキシブチレート残基と３−ヒ
ドロキシバレレート残基を含むヘテロポリマーは
ウオーレン（Wallen）等によつて、「エンビロン
メンタル・サイエンス・アンド・テクノロジイ」
第８巻（1974）、第576〜579頁に記載されている。
また、欧州特許第52459号及び第69497号明細書に
記載されているように、種々なコポリマー類が、
特定の基質で微生物を培養することによつて産生
されうる。例えばプロピオン酸を基質とすると、
コポリマー中に３−ヒドロキシバレレート単位が
生じる。 従つて、この明細書において用いる「HBポリ
マー」なる用語は、ホモポリマーであるポリ（３
−ヒドロキシブチレート）のみでなく、上記のよ
うなコポリマー類をも意味するものである（但
し、３−ヒドロキシブチレート残基がポリマー類
をも意味するものである（但し、３−ヒドロキシ
ブチレート残基がポリマーの少なくとも40モル
％、好ましくは少なくとも50モル％をなすものと
する）。 HBポリマーを含む細胞は、そのままで成形用
材料として（例えば米国特許第3107172号明細書
参照）使用できるけれども、普通はポリマーを残
部の細胞物質から分離するのが望ましい。 現在までに提案されてきている分離方法も大多
数においては、HBポリマーが可溶である溶剤に
よつて細胞から重合体を抽出し、次いでその重合
体溶液（以下「シロツプ」と称する）を細胞残渣
から分離することがなされる。普通、そのような
抽出工程は、細胞を抽出溶剤が透過しうるように
なす処理（例えば磨砕、噴霧乾燥）に付した後
に、実施される。典型的溶剤抽出法は、欧州特許
第15123号明細書に記載されている。 細胞残渣からのシロツプの分離は、通常、過
または遠心分離によつてなされるが、約５重量％
以上のポリマーを含むシロツプは非常に粘稠であ
る傾向があり、そのために過や遠心分離工程を
困難にする。HBポリマー以外の分離されるべき
細胞物質（以下「NPCN」と称する）の割合が
多いときには殊にその困難がある。分離されるべ
きNPCMの割合は、もちろん、微生物細胞のHB
ポリマー含量に左右される。 文献には高割合のHBポリマーを含む微生物細
胞の報告もなされてきているが、培養操作の経済
上の考慮から微生物細胞中のHBポリマーの割合
にはしばしば実用上の限度があり、従つてシロツ
プからのNPCMの分離を容易にするに充分なよ
うにシロツプを稀釈するには多量の抽出溶剤の使
用が必要とされる。そのような稀釈シロツプの使
用を必要とされ、大型容器の使用が必要とされ、
そして多量の溶剤回収コストがかかるのみなら
ず、（比較的効率的な溶剤回収操作法を用いた場
合であつても）可成りの溶剤の損失が起こり易
い。従つて、５重量％のシロツプ濃度を使用する
場合、95重量％の溶剤が再使用のために回収され
たとしても、１Kgのポリマーを抽出するために、
１Kgの溶剤が損失される。さらに低濃度のシロツ
プ及び／または低効率の溶剤回収操作を用いれ
ば、溶剤が損失される。さらに低濃度のシロツプ
及び／または低効率の溶剤回収操作を用いれば、
溶剤損失量はさらに多くなる。従つて、そのよう
な抽出法は、抽出処理（含：溶剤回収）コストに
加うるに、可成りの原料コスト（すなわち不回収
溶剤のコスト）がポリマー産生コストに上乗せさ
れることになる。 上記の抽出法においては、HBポリマーは溶剤
中への溶解によつて抽出され、NPCNは不溶解
のまま残こる。しかし若干のNPCM、例えば脂
質も、HBポリマー抽出用溶剤に可溶性であるこ
とがあり、従つてシロツプ中に存在することがあ
る。そこでもしそのように溶解されたNPCM不
純物を含まないHBポリマー製品を得たい場合に
は、HBポリマーが可溶性でない溶剤を用いての
予備抽出工程が、HBポリマー抽出溶剤に可溶な
不純物を除去するためにHBポリマーの抽出前
に、必要とされ、あるいはHBポリマーはシロツ
プから、例えば沈澱により、選択的に分離されな
ければならない。選択分離（例えば沈澱）工程の
採用は、溶剤回収操作をさらに複雑化することが
多い。 ここに我々は、そのような大量の溶剤の損失や
それに伴なう原料コストの増大を引き起こすこと
なくHBポリマーからNPCMの大部分を分離しう
る方法を案出した。 本発明においては、NPCMのほとんどの部分
は可溶化され（好ましくは酵素により）、HBポ
リマーを不溶状態で残す。 従つて本発明においては、従来と逆の操作が採
用される。すなわちNPCM（不純物）を溶解され
て、HBポリマーを不溶状態で残す。NPCMの溶
解はいくつかの段階で実施しうるので、次第に向
上する純度のHBポリマー生成物を得ることがで
きる。もちろん、そのような段階が多くなればな
るほど、操作コストは高くなる。HBポリマー生
成物のある種の応用については、他の応用に必要
とされるよりも低い純度の生成物が許容されうる
ので、不純物（NPCM）を段階的に抽出するこ
とによつて、そのような許容しうる、低純度の生
成物を、高純度生成物よりも安価に生産できる。 J.Gen.Microbiology19（1958）第198〜209頁
には、微生物細胞を次亜鉛素酸ナトリウムのアル
カリ性溶液で処理することにより細胞からポリマ
ーを分離することが提案されている。この処理で
はNPCMの可溶化がなされるけれども、それと
同時にHBポリマーの著しい分解が引き起こさ
れ、HBポリマーが多くの応用に対し不適当にさ
れてしまうことを、我々は発見した。 またHBポリマー類についての多くの学術文
献、例えばJ.Bacteriology88（1964年７月）、第
60〜71頁（特に61頁）、では、微生物細胞をリゾ
チーム含有溶液中に懸濁し、懸濁液を超音波に付
し、次いでグリセルロール上に層状とした懸濁液
を遠心分離することにより、HBポリマー顆粒を
細胞砕片から分離することからなる、微生物細胞
からのHBポリマー顆粒の分離法が提案されてい
る。しかし、そのような酵素は比較的高価であり
その操作が大規模運転に向かないばかりでなく、
比較的小割合のNPCMが可溶化されるにすぎな
い。 本発明によれば、HBポリマー含有微生物細胞
の水性懸濁液を少なくとも１種の可溶化剤で消化
することにより該細胞中のNPCMを可溶化させ、
次いでHBポリマーを含む不溶性残留物を懸濁液
から分離することからなる、HBポリマー含有微
生物細胞からのNPCMの除去方法であつて：可
溶化剤として蛋白分解酵素組成物及び／または界
面活性剤を用いる一つまたはそれ以上の段階を消
化工程が含むこと、そして消化工程の前または消
化工程中、及びいずれかの蛋白分解酵素消化の前
に懸濁液を80℃以上の温度に加熱することを特徴
とする上記NPCM除去方法が提供される。 好ましくは、加熱段階及び消化段階は、初期細
胞中のNPCMの少なくとも50重量％を可溶化さ
せ、そして少なくとも70重量％のHBポリマー含
量の不溶性残留物を生じさせるに充分なだけ実施
される。 NPCNは、普通、核酸類、脂質類、燐脂質類、
ヘプチドグリカン、蛋白質物質（グリコ蛋白を含
む）、及び若干の場合には燐多糖類、ならびにそ
の他の炭化物類からなる。蛋白性物質は普通、
NPCMの少なくとも40重量％をなす。 本発明の方法においては、上記のNPCM成分
の少なくともいくつかが可溶化される。これは、
細胞を、可溶化剤によつて１またはそれ以上の段
階で消化することによつてなされる。少なくとも
１つの段階における可溶化剤は酵素組成物である
のが好ましく、そして消化工程は、ペプシン、ト
リプシン、ブロメリン、パパイン、フイシン、レ
ミン、キモトリプシン、及び細菌または真菌の蛋
白分解酵素あるいはそれらの混合物のような、蛋
白分解酵素で懸濁液を処理する少なくとも１つの
段階を含むのが好ましい。適当な酵素組成物は、
「微生物学的」（酵素配合）洗剤粉末に普通使用さ
れているものである。 少なくとも１つの消化段階における可溶化剤は
蛋白分解酵素及び／または界面活性剤（殊にアニ
オン系界面活性剤）である。 消化工程の前もしくは消化工程中、しかしいず
れかの蛋白分解酵素による消化工程の前に、細胞
は80℃以上の温度に付される。そのような加熱工
程は細胞中の核酸類のいくつかの変性及び可溶化
を引き起こす。そのよう加熱工程を省くと、蛋白
分解酵素消化工程後の不溶性残留物の満足すべき
分離ができなくなる。なんとなれば、そのような
予備加熱工程がなされないと、核酸類が細胞から
放出され、細胞が蛋白分解酵素で消化される際に
非常に粘稠な懸濁液を与えるからである。そのよ
うな核酸類は蛋白分解酵素での処理前にデオキシ
リボヌクレアーゼを添加することにより可溶化し
うるであろうが、比較的高価なデオキシリボヌク
レアーゼの高濃度が必要とされる。同様に蛋白分
解酵素での処理後にデオキシリボヌクレアーゼで
処理することは、そのデオキシリボヌクレアーゼ
と粘稠な懸濁液との混合が困難であるので、実用
的でない。 消化工程が蛋白分解酵素での消化処理を含む場
合には、懸濁液を100℃以上加熱するのが好まし
く、殊に水性媒を液体状態に維持するに足る大気
圧以上の圧力の下で120℃以上に加熱し、次いで
その圧力を、（例えば加熱懸濁液を水性媒が蒸発
する圧力に保持した領域中へ押出すことにより、
または懸濁液を単に冷却することにより）低減さ
せるのが好ましい。 核酸類の可溶化及び変性を行なうのに必要とさ
れる熱処理時間は、使用温度により変ることにな
る。従つて、その必要時間は、懸濁液が付される
温度が高いほど、短縮される。少なくとも５分
間、好ましくは少なくとも10分間の加熱が約100
℃の温度において必要とされうるが、さらに高い
温度例えば150℃においては、一層短い加熱時間
を使用することができ、20秒間というような短い
加熱時間を使用できることもある。可溶変剤とし
て界面活性剤を用いるいずれの消化段階も、普通
は、界面活性剤による迅速な可溶化を行なうため
には80℃以上の温度で実施される。 核酸類の変性及び可溶化を行なう加熱工程のた
めには広範囲のPH条件を使用できるけれども、そ
のPH条件はHBポリマーの分解のおそれを最小化
するには中性付近、例えばPH６〜８であるのが好
ましい。 前述の、本発明の好ましい一態様においては、
可溶化の少なくとも一部分は、酵素組成物での細
胞の消化によりなされ、特に、可溶化剤として蛋
白分解酵素組成物を用いる少なくとも１つの消化
段階を採用することによりなされる。 多くの酵素組成物は60℃以上の温度で変性され
る傾向があるので、核酸を変性及び可溶化させる
ための加熱工程は、酵素組成物での処理に先立つ
て実施される。 酵素消化工程を採用する場合に、その消化は当
該酵素が変性される温度よりも低い温度で実施さ
れるべきである。多くの場合に、変性温度は65℃
よりも低いであろうが、若干の酵素については変
性温度がそれよりも高く、従つてそのような酵素
を用いるときには65℃よりも高い消化温度を使用
しうる。その消化温度は80℃以下であるのが好ま
しい。酵素が60℃以上の温度に耐えうる場合を除
いて、消化は60℃以下、特に50〜60℃の温度で実
施するのが好ましい。酵素消化工程を採用する場
合、懸濁液は酵素消化段階で使用される温度より
も高い温度に通常は加熱されるから、普通は酵素
消化に先立つて細胞の冷却が必要とされることに
なる。細胞は、例えば過または遠心分離によつ
て、加熱懸濁液から分離し、次いで別の水性媒に
再懸濁してよく：あるいは加熱懸濁を単に所要の
消化温度にまで冷却し、それに対して酵素消化工
程を行なうこともできる。 酵素消化によつてもたらされる可溶化NPCM
は、所望ならば、追加量のHBポリマー含有微生
物の培養のための基質の一部として再使用し、か
くしてHBポリマー含有微生物の生産における原
料コストの節減を行なうことができる。酵素によ
つて可溶化されたNPCMは培養工程へ再循環さ
せてもよい（但し必要とされうる滅菌処理のよう
な処理の後）。 従つて可溶化は酵素によつてなされるのが好ま
しい。酵素消化後の残る残留物中のNPCMをさ
らに可溶化させることは、可溶化剤として界面活
性剤を用いて実施しうる。 可溶化を、可溶化剤として蛋白分解酵素組成物
及び界面活性剤の両者を用いて実施する場合、消
化はいくつかの段階で実施し、界面活性剤消化段
階を酵素消化段階（単または複数）の後に実施す
るのが好ましい。その理由には二つあり、第１は
酵素組成物が界面活性剤により失活することがあ
ることであり、第２は、微生物懸濁液を作るため
に用いられる培養工程へ可溶化NPCMを再循環
させようとする場合、懸濁液の可溶化部分中に界
面活性剤が存在すると、そのような再使用を妨げ
ることがあることである。 NPCMの充分な可溶化またはそれ以上の可溶
化を達成するには、消化工程は、普通初期細胞の
NPCMの約６〜10重量％を占める燐脂質類を可
溶化するためにホスホリパーゼ酵素を用いての消
化処理段階を含みうる。 酵素消化は、酵素組成物を添加した細胞懸濁液
を所要温度及び6.5〜9.0の範囲のPHに、所要の処
理度を達成するまで、維持することによつて行な
うのが好ましく、この時間は、通常約0.2〜２時
間であろう。 酵素消化はいくつかの段階にわけて実施してよ
く、例えば最初の段階では一つの酵素組成物を用
い、次いで同一または異なる酵素組成物を用いる
一またはそれ以上の処理段階を実施しうる。しか
しながら、１種よりも多くの酵素を使用する場合
には、一つの酵素混合物を用いて単一の段階で細
胞を処理するのが、便宜でありうる。 実際に、我々は、若干の場合には酵素混合物を
用いると相乗効果が得られ、従つて酵素同志が相
互に消化し合わないならば、若干の場合には酵素
混合物を使用すると、酵素を単独でまたは順々に
使用する場合よりもNPCMの高度の可溶化がも
たらされることを、発見した。 酵素、例えば蛋白分解酵素及び／またはホスホ
リパーゼ酵素の必要量は、酵素の種類及び活性に
依存するものであり、典型的には蛋白分解酵素の
量は、初期所細胞中のNPCMの100ｇ当り0.5〜
10Anson単位（AU）、好ましくは１〜6AUを与
えるような量である。 蛋白分解酵素の活性は、変性ヘモグロビンを酵
素で25℃及びPH7.5において10分間消化すること
により測定しうる。1AUは、１ミリ当量のチロ
シンと同じ色をフエノール試薬で呈する量の
TCA可溶生成物を１分当り（初期速度において）
放出させる酵素量である。この分析法の詳細な説
明はノボ・インダストリイス（Novo
Industries）発行のリーフレツトAF4に与えられ
ている。 リゾチウムのようなある種の酵素はペプチドグ
リカンを可溶化させるけれども、我々は、
NPCM中のペプチドグリカンの可溶化をほとん
どまたは全く行われない酵素組成物を、少なくと
も初期の消化段階においても用いるのが望ましい
ことを、発見した。この理由は、もしペプチドグ
リカンが可溶化されると、可溶化された物質から
の不溶性HBポリマー顆粒の分離が一層困難にな
る傾向があるからである。その場合ペプチドグリ
カンがHBポリマー顆粒の集塊体を包み込むある
種の網または袋状物を形成するのではないかと考
えられる。そのような集塊体は水性媒からは、集
塊から解かれた顆粒よりも容易に分離されうる。
ペプチドグリカンの存在は、HBポリマーを含む
不溶性残留物のジアミノピメリン酸含量を測定す
ることにより確認できる。 前述のように、NPCMの可溶化は、可溶化剤
として界面活性剤を使用することによつてもなし
うるものであり、これは好ましくは蛋白分解酵素
消化工程の後に実施する。界面活性剤、例えば硫
酸化またはスルホン酸化脂肪酸（殊に硫酸ドデシ
ルナトリウム塩）のようなアニオン系界面活性剤
を用いての可溶化は、界面活性剤を添加した懸濁
液を80℃以上の温度に加熱することにより実施す
るのが好ましい。界面活性剤の使用量は懸濁液中
に残つているNPCMの10〜20重量％であるのが
好ましい。界面活性剤に対してエチレンジアミン
四酢酸のような錯化剤を添加することは、
NPCMの可溶化を助長する点で有利でありうる。 我々は界面活性剤処理を酵素消化の後に実施す
る若干の場合、殊に酵素消化に先立つ熱処理が特
には苛酷でない場合（例えば温度が100℃を越え
ない場合）には、そのような界面活性剤処理のと
きにエマルジヨンが形成されうること、そしてそ
のようなエマルジヨンからは固型分が極めて分離
され難いこと、を発見した。我々は、そのような
エマルジヨンにカチオン系凝集剤または電解質を
添加してもその分離の助長には余り効果的でない
ことを発見した。しかし、PH２以下までの酸性
化、または珪藻土のような吸収剤鉱物の添加は分
離を助長する。しかし酸性化は、界面活性剤で可
溶化されたNPCMのいく分かの沈澱を生じさせ
ることがある。 消化工程後に残る不溶性残留物は、HBポリマ
ーと共にいく分かの残留未溶解NPCMを含んで
いる。 いずれかの所与の段階におけるNPCMの可溶
化度は、初期細胞と当該段階で得られるHBポリ
マー含有組成物とそれぞれのHBポリマー含量か
ら都合よく計算できる。この計算の目的のために
は、損失がないこと及びHBポリマーは全く可溶
化されなかつたこと、を仮定する。 かくして、初期細胞がP₀重量％のHBポリマー
を含み、当該段階の生成物がP₁重量％のHBポリ
マー含量をもつとすれば、可溶化されたNPCM
の百分率Ｎは下式によつて与えられる。 Ｎ＝〔１−P₀（100−P₁）／P₁（100−P₀）〕×10
0 熱処理及び消化工程は、初期細胞のNPCMの
少なくとも50重量％が可溶化され、かつ残留物が
少なくとも70重量％、好ましくは少なくとも85重
量％のHBポリマーを含む、ように実施するのが
好ましい。 これを達成するのに必要とされる消化の量は、
もちろん微生物細胞の初期HBポリマー含量P₀に
依存することになる。微生物は、HBポリマー含
量P₀が少なくとも50重量％となるような条件下
で培養するのが好ましい。しかし前述のように経
済的な考慮から、細胞のHBポリマー含量P₀は80
重量％以下に限定されうる。 本発明の好ましい一態様においては、酵素及
び／または界面活性剤によるNPCMの可溶化の
後に、残渣を過酸化水素で処理する。蛋白性
NPCMの大部分が蛋白分解酵素で可溶化されて
しまつている場合、過酸化水素による処理は、さ
らに行われる残留NPCMの可溶化に対してほと
んどまたは全く影響を与えず、そしてHBポリマ
ー含有残渣の着色の除去に望ましいものである。
過酸化水素による処理は、HBポリマー含有残渣
を水性培地から（例えば過により）一層容易に
分離できるようにすることにより利点をもたらし
うる。 その他の場合（例えば蛋白性NPCMの一部分
だけを可溶化するのに蛋白分解酵素による消化処
理を用いた場合、及び／または界面活性剤による
消化処理を採用した場合）、過酸化水素処理によ
つて、追加量のNPCMの除去を行ないうる。 HBポリマー含有残渣のNPCMが脂質を含む場
合、例えばホスハリハーゼ酵素を用いての消化を
実施しなかつた場合、脂質を溶解するがHBポリ
マーを溶解しえない溶剤、例えばメタノール、で
そのHBポリマー含有残渣を洗浄することによ
り、脂質を除去できる。そのような溶剤洗浄工程
は、脱臭工程として望ましいことがある。 上記の操作によつて、不溶性の残渣が得られ、
このものは普通少なくとも70重量％、好ましくは
少なくとも85重量％、殊に少なくとも90重量％の
HBポリマーを含む。 前述のようにペプチドグリカンの顕著な可溶化
を行なわないのが好ましい。従つて、好ましい生
成物は少なくとも90重量％のHBポリマー及び少
なくとも１重量％、殊に１〜３重量％のヘプチド
グリカンを含む。好ましくはそのような生成物の
蛋白性物質の含量は６重量％以下である。 若干の場合、消化工程からの生成物は、そのま
ま、例えば成形材料として使用できる。別法とし
て、HBポリマーは、HBポリマーに対する溶剤、
殊に塩化メチレン、クロロホルム、または１，２
−ジクロルエタンのようなハロゲン化炭化水素を
用いての溶剤抽出により抽出できる。NPCMの
残留割合は小さいので、例えば過によるシロツ
プからのNPCMの分離は、直接溶剤抽出法にお
けるよりもはるかに容易であり、従つてさらに濃
厚なシロツプ、例えば５〜15重量％のポリマーを
含むシロツプを採用できる。それ故、抽出溶剤の
必要な割合を削減でき、従つて不完全な溶剤回収
による溶剤損失を低減できる。 実施例 本発明を以下の実施例でさらに説明する。実施
例中におけるすべての％は重量基準で示されてい
る。実施例１〜５、７〜16及び18〜19で使用した
懸濁液は、基質としてグルコースを用い窒素制限
下での連続培養で増殖したアルカリゲネス・オイ
トロフス（Alcalignes eutrophus NCIB寄託第
11599号）の培養液の遠心分離によつて得られた
ものであつた。 実施例 １ この実施例では、約60％の３−ヒドロキシブチ
レートホモポリマー（PHB）含量の細胞を50
ｇ／の濃度で含むいくつかの懸濁液を、100℃
において還流条件下で種々の時間にわたり沸とう
した。次いでそれらの懸濁液を冷却し、トリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン・塩酸塩を緩
衝剤として添加し、50ｍＭの緩衝剤濃度とした。
次いでこれらの緩衝剤処理懸濁液を、初期細胞乾
燥重量に基き１％の蛋白分解酵素組成物を用い
て、55℃及びPH8.2において１時間温置した。こ
こで用いた蛋白分解酵素組成物は、ノボ
（Novo）インダストリイス社から入手した「ア
ルカラーゼ（Alcalase：商標）0.6L」であり、同
社発行のセールス文献では0.6AU／ｇの活性を有
するとされている。この「アルカラーゼ」の量
は、初期細胞中のNPCMの100ｇ当り約1.5AUに
相当する。 結果の消化剤の懸濁液の試料を氷冷水で稀釈
し、次いで20000Gにおいて１〜２分間遠心分離
した。得られた遠心分離ペレツトを水で３回洗浄
し、次いでそれらの蛋白含量を、J.Biol.Chem.
193（1951）265にロウリイ（Lowry）等が発表
した比色分析法に基く方法によつて測定した。結
果を以下に示す。 【表】 アミノ酸分析法による蛋白分析値と比較したと
ころ、比色分析法はアミノ酸分析法で得られた値
の約75％の値を与えることが判つた。 実施例 ２ 熱処理段階の効果は、熱処理後、いずれの酵素
処理もしない前の懸濁液の沈降速度を測定するこ
とによつても評定できる。 使用した水性懸濁液は72％のPHBを含む細胞
を20ｇ／の濃度で含んでいた。この懸濁液をオ
ートクレーブ中で５分間加熱することにより熱処
理し、次いで100rpmにおいてストローブ遠心分
離機で遠心分離した。いろいろな遠心処理時間経
過後に固型分／液体界面の高さを測定した。 【表】 温度が高ければ高いほど、分離が一層容易に行
なわれることが判る。 実施例 ３ 実施例１の操作を繰返えしたが、本例では
PHB含量52％の細胞を50ｇ／含む懸濁液を用
いた。沸とうは10分間行なつた。燐脂質を除去す
るために、「アルカラーゼ」による消化後、懸濁
液を、種々の量のホスホリパーゼ酵素組成物を添
加して、40℃で、PH8.6において１時間温置した。
ホスホリパーゼ酵素組成物は、ノボ・インダスト
リイス社の「レシターゼ（Lecitase）100S」であ
つた。 「レシターゼ」処理の前後の生成物の蛋白含量
を実施例１のように測定し、そして燐脂質を溶剤
抽出しその抽出を酵素法で検定することにより、
残留燐脂質含量を測定した。その酵素による検定
法では、ホスホリパーゼＣ酵素を用いた。これ
は、ホスフアチジルエタノールアミン以外のホス
フアタイド類を比較的遅く加水分解するので、存
在する燐脂質の約50％だけがこの方法で検出され
る。従つて下記の表においては、全燐脂質ではな
くホスフアチジルエタノールアミン含量と表示し
てある。 比較のため、上記の操作を、「アルカラーゼ」
消化を省略して、繰返えした。 【表】 ※ 初期細胞乾燥重量に基く重
量％
※※ 生成物及び初期細胞のPHB
含量から計算
低いホスフアチジルエタノールアミンのレベル
を達成しうるけれども、熱処理と「レシターゼ」
消化とだけでは、比較的多量の「レシターゼ」を
用いた場合であつて、70％以上のポリマーを含む
生成物を与えるに足るNPCMを可溶化しえない
ことが判る。しかし「アルカラーゼ」処理後に
「レシターゼ」処理を行なうと、ポリマー純度の
著しい向上を達成可能とし、「レシターゼ」は少
量の蛋白のみの可溶化に影響を与える。 実施例 ４ 本例では「アルカラーゼ0.6L」蛋白分解酵素の
種々の濃度の比較及び種々の消化時間の比較を行
なう。 実施例１と操作を繰返えした。本例では沸とう
時間を１時間とし、次いで種々の濃度の「アルカ
ラーゼ0.6L」で消化した。各消化処理から一定時
間毎に試料を採取して、比色分析法により蛋白分
析した。生成物の実際の蛋白含量ではなく、「可
溶化された、初期細胞中の蛋白の割合」を下表に
示す。 【表】 【表】 ※ 初期細胞の重量に基く。
実施例 ５ 本例では、界面活性剤による消化の効果を評定
する。 使用した細胞懸濁液は実施例３のものと同一で
あつた。下記の処理を採用した。 Ａ 還流条件下に100℃で１時間沸とう。 Ｂ 細胞乾燥重量に基き10％の硫酸ドデシルナト
リウム塩の添加、次いで還流条件下に100℃で
１時間沸とう。 Ｃ Ｂと同様、但し、５ｍＭの溶液を与えるのに
足るエチレンジアミン四酢酸を添加してから沸
とう。 Ｄ Ａと同様、次いで細胞乾燥重量に基き１％の
「アルカラーゼ0.6L」を添加し、55℃、PH8.2で
１時間消化。 Ｅ Ｄと同様、次いでＢを実施。 Ｆ Ｄと同様、次いでＣを実施。 本実施例では、蛋白含量をアミノ酸分析法で測
定した。ジアミノピメリン酸含量は、残留ペプチ
ドグリカンの濃度の指標を与える。ペプチドグリ
カン含量は、表示したジアミノピメリン酸含量の
ほぼ５倍である。 【表】 上記の種々の処理は著しく低減した蛋白濃度を
与えたけれども、ジアミノピメリン酸含量はペプ
チドグリカンがほとんど可溶化されなかつたこと
を示している、ことが判る。 もう一つの実験では、PHB含量60％の細胞を
50ｇ／濃度で含む懸濁液を上記処理Ｆに付した
ところ、同様な結果を得た。処理Ｆの後に「アル
カラーゼ」または硫酸ドデシルナトリウム塩を用
いてさらに消化しても、生成物の純度の著しい改
善はなかつた。 実施例 ６ この実施例では、グルコースとプロピオン酸と
の混合物を基質として用いた窒素制限下で連続培
養により増殖されたアルカリゲネス・オイトロフ
ス（NCIB寄託第11599号）の培養液を遠心分離
することにより得た、３−ヒドロキシブチレー
ト／３−ヒドロキシバレレート共重合体（10モル
％の３−ヒドロキシバレレート単位を含む）を48
％含む該微生物細胞を50ｇ／の濃度で含む懸濁
液を使用した。 実施例５の処理Ｆを繰返したが、本例では「ア
ルカラーゼ」消化の前の最初の沸とうは１時間で
はなく10分間行なつた。硫酸ドデシルナトリウム
塩による消化後に生成物をいくつかの部分に分割
して、遠心分離してペレツトを得た。 １個のペレツトを、50ｍＭ燐酸塩緩衝液（既に
EDTAが１ｍＭの濃度で添加されていた）に懸
濁させた。ペレツトの重量に基き0.1％の卵白リ
ゾチーム〔シグマ・ケミカルス（Sigma
Chemicals）社製〕を加え、その懸濁液を20℃及
びPH6.5で１時間消化した。 もう１個のペレツトを、１ｍＭのEDTAを添
加した50ｍＭの酢酸塩緩衝液中に懸濁させ、ペレ
ツトの重量に基き0.1％の「ノボチーム
（Novozyme）234」（ノボ・インダストリイス社
製）を加え、その懸濁液を50℃及びPH4.5で１時
間消化した。 もう１個のペレツトを0.1M水酸化ナトリウム
水溶液中で20℃において１時間消化した。このア
ルカリ消化処理を、上記リゾチーム及び「ノボチ
ーム」による消化から得られたそれぞれの生成物
にも適用した。 【表】 ※ アミノ酸分析による。
リゾチームがジアミノピメリン酸含量を著しく
低減させたことが判る。アルカリ処理及び「ノボ
チーム」はジアミノピメリン酸の含量には著しい
効果を示さないけれども、アルカリ処理を単独で
採用した場合またはアルカリ処理をリゾチームの
後に採用した場合にはHBポリマーの純度が向上
した。 実施例 ７−11 これらの実施例では懸濁液は、PHB含量79％
の細胞を90ｇ／の濃度で含むものであつた。 懸濁液をオートクレーブ中で加圧スチームを吹
き込み３分間14℃に加熱することにより加熱処理
した。次いでこの懸濁液を冷却し、遠心分離し
た。 固型残渣の分割部分を水に再懸濁して、固型分
含量50ｇ／の懸濁液（複数）を作つた。これら
の懸濁液に種々の市販酵素組成物を添加して、懸
濁液を、それぞれの酵素組成物供給業者によつて
推奨されるPH値（必要により水酸化ナトリウムの
添加により調節）において50℃で60分間消化し
た。 次いで不活性残渣を遠心分離によつて水性媒体
から分離し、脱イオン水で洗浄した。結果を下表
に示す。 【表】 実施例９及び10の生成物中のNPCMは、残渣
をさらに酵素消化及び／または界面活性剤による
消化に付すことにより、さらに可溶化できた。 実施例11を、実施例９及び10と比較することに
より、蛋白分解酵素の混合物を使用すると、個々
の酵素の同等量を用いた場合よりもすぐれた
NPCM可溶化ができることが判る。 実施例 12 実施例11の生成物を水に再懸濁させた。「ニユ
ウトラーゼ（Neutrase）0.5L」の0.25ｇ／を
「アルカラーゼ0.6L」の0.25ｇ／と組合せたも
のを用いて、上記懸濁液を50℃及びPH7.0におい
て60分間消化した。残渣を遠心分離によつて水性
媒から分離し、脱イオン水で洗浄した。残渣は96
％のPHBを含んでいた。これは84％の総合
NPCM可溶化に相当する。 実施例 13〜16 実施例７〜11の操作を繰返したが、PHB含量
75％の細胞の懸濁液を用い、種々の蛋白分解酵素
組成物を用い、そして消化処理はそれぞれの酵素
組成物供給業者によつて推奨される温度において
PH７で60分間実施した。各例において使用した酵
素組成物の量は初期細胞乾燥重量に基き１％であ
つた。 【表】 ブロメリン・コンセントレート（活性
1295BTU／ｇ；パイナツプルの幹から得られる）
及びパパイン（活性30000PU／mg；パパイヤ果実
から得られる）の両者は、米国インデイアナ州エ
ルハートのマイルス・タカミネから供給されたも
のである。「オールプロテアーゼ（Allprotease）」
及び「ハイ（High）Ｔ」は米国ケンタツキイ州
レキシントンのオール・テク（All−Tech）社か
ら供給されたものである。「オールプロテアーゼ」
は、真菌、細菌及び植物の酵素の混合物である
が、「ハイＴ」はバシラス・リケニホルミス（B.
licheniformis）から得られる。 実施例 17 この実施例で使用した懸濁液は、基質としてメ
タノールを用い窒素制限下での回分式培養により
得られたメスロバクテリウム・オルガノフイルム
（Methlobacterium organophilumu；NCIB寄託
第11483号）の細胞懸濁液であつた。細胞は17％
のPHBを含んでいた。 実施例７〜16の操作を繰返えしたが、本例で
は、0.5％の「アルカラーゼ0.6L」及び0.5％の
「ニユウトラーゼ0.5L」（それぞれ初期細胞乾燥重
量に基く％）の混合物を酵素組成物として使用
し、消化時間60分、PH7.0、温度55℃を用いた。
生成物をさらに複数の消化段階に付した。その際
に同じ条件を用い、各消化毎に新しい酵素を用
い、そして消化段階の間で生成物を遠心分離し、
脱イオン水に再懸濁させた。 結果は下記の通りであつた。 【表】 実施例 18 この実施例で用いた懸濁液は、PHB含量５％
の細胞を100ｇ／の濃度で含んでいた。 500mlの懸濁液を第１の撹拌機付きオートクレ
ーブに仕込んだ。同量の水を第２の撹拌機付きオ
ートクレーブに仕込み、窒素圧下に350℃に加熱
した。第１のオートクレーブは、第２のオートク
レーブ内の圧力を越える圧力まで窒素で加圧し、
次いで第１のオートクレーブの内容物をその超過
窒素圧の力によつて第２のオートクレーブ中へ圧
入した。第２のオートクレーブの併合内容物を２
時間激しく混合した。第２のオートクレーブ中の
併合内容物の温度はほぼ170℃であつたが、加え
られた圧力は液体状態を維持するに足る値であつ
た。次いで第２のオートクレーブの内容物を窒素
圧によつて、大気圧の捕集容器中へ押し出した。 得られた生成物を遠心分離し、遠心分離ペレツ
トを500mlの脱イオン水に再懸濁させ、次いでそ
の懸濁液に0.5ｇの「アルカラーゼ0.6L」を添加
した。懸濁液を55℃及びPH７において30分間保持
した。次いで懸濁液を5000Gにおいて10分間遠心
分離した。遠心分離ペレツトを、次いで500mlの
脱イオン水に再懸濁した。５ｇ、すなわち残留
NPCMの約107％の硫酸ドデシルナトリウム塩を
加え、懸濁液を100℃で１時間加熱した。次いで
懸濁液を5000Gで10分間遠心分離してペレツトを
得て、これを脱イオン水で２回洗浄した（それら
の洗浄の間にペレツトを遠心分離により回収し
た）。最後に乾燥した褐色の生成物（生成物Ａ）
を得た。 上記の操作を繰返えしたが、「アルカラーゼ」
消化段階と「レシターゼ」消化段階を併合して行
ない、消化のために0.5ｇの「アルカラーゼ」及
び0.5ｇの「レシターゼ」の混合物を用いた。 【表】 「アルカラーゼ」消化処理を初期懸濁液に直接
に実施すると（すなわち熱処理工程を省略して実
施すると）、懸濁液は極めて粘稠になり、撹拌す
ることができず、または不溶性部分を分離するた
めの処理もできなかつた。 前記の褐色の生成物Ａの１部を、還流条件下で
10部の塩化メチレンによつて抽出し、得られたシ
ロツプを過した。このシヨツプの高粘度にもか
かわらず、三酢酸セルロースフイルム製造に採用
される如き標準的なシロツプ過法が使用でき
た。その理由は、除去されるべきNPCMの割合
がシロツプの約0.5％にすぎないからであつた。 過後のシロツプはキヤストとしてPHBフイ
ルムを作ることができた。 シロツプの一部を石油エーテルに加えて、HB
ポリマーを沈澱させて微細白色粉末(B)を得た。 生成物Ａ及び粉末Ｂのそれぞれの試料を下記の
方法で溶融押出した： 3.5ｇの試料を、直径２mm、ランド長８mmの円
形オリフイスをもつダイを備えたメルトフローグ
レーダー（英国ウエルウイン、デイブンテスト社
製）のバレルに仕込んだ。バレルは190℃に維持
した。５分間のウオーミング・アツプ時間後に10
Kgの荷重をピストンに掛けた（ピストンの重量
0.16Kg）。メルトフロー時間は、合計２ｇの試料
がダイを介して押出されるに必要な合計時間（上
記５分間のウオーミング・アツプ時間を含む）で
ある。 メルトフロー時間は下記の通りであつた。 生成物Ａ 10.5分 粉末Ｂ 8.0分 比較のために述べると、欧州特許第15123号明
細書い記載される如き噴霧乾燥／液体抽出／溶剤
抽出法によつてアルカリゲネス・オイトロフス細
胞から分離されたPHB試料のメルトフロー時間
は、典型的には８〜10分の範囲である。このこと
は、上記塩化メチレン抽出工程の前または後のい
ずれのポリマーのメルト安定性も、直接溶剤抽出
ルートによつて抽出されたポリマーのそれと同等
であることを、示している。 生成物Ａは、ゲル透過クロマトグラフイで測定
して約1000000の重量平均分子量を有した。 比較のため、本例の出発原料として用いたもの
と同じ懸濁液から、次亜鉛素酸ナトリウム（細胞
乾燥重量に基き15％）を用いて40℃で30分間消化
することによりPHBを抽出した場合には、わず
かに約101000の重量平均分子量の生成物が得られ
た。このことは、過塩素酸塩による消化はポリマ
ーの著しい分解をもたらすことを示している。 実施例 19 この実施例で使用した懸濁液は実施例18で使用
したものと同じであつた。500mlの懸濁液を、そ
の中に浸したスチーム加熱コイルによつて80℃に
加熱し、次いで55℃まで冷却した。実施例18に記
載の「アルカラーゼ」、「レシターゼ」及び硫酸ド
デシルナトリウム塩による処理を順に実施した。 懸濁液は「アルカラーゼ」消化後にわずかに粘
稠になつたが、それでもなお撹拌可能であつた。
しかし「アルカラーゼ」消化及び「レシターゼ消
化」のそれぞれの後の遠心分離段階は、さらに困
難であつた。その理由はフロツクが極めてデリケ
ートであつて、実施例18で得られた堅いペレツト
とは異なりゲル状のペレツトが得られた。しかし
硫酸ドデシルナトリウム塩での処理後には安定な
懸濁液が形成され、このものは遠心分離によつて
容易に分離できた。この懸濁液の沈降特性を調べ
るため、その20ml宛を試験管に入れて、懸濁液の
高さ６cmの垂直カラムを与えた。種々の添加剤を
懸濁液に添加し、種々の時間経過後に固体／液体
界面の高さを観察した。結果を下記の表に示す。 【表】 −＝ 界面なし
電解質（CaCl₂）またはカチオン系凝集剤
（「アクアフロツク；Aquaflock」4051または
4067）は効果を示さないが、珪藻土または多量の
HClの添加はPHを２以下に下げて沈降を生じさせ
うることが判る。 同様な懸濁液のカラムの低い重力加速度(G)にお
ける遠心分離も、未変性懸濁液、及びHClでPH
1.60に酸性化した懸濁液について実施した。 500Gでの種々の遠心分離時間後の界面の高さ
を下表に示す。 【表】 実施例 20 アルカリゲネス・オイトロフス（NICB寄託第
11599号）を水性媒地中で、グルコース及びプロ
ピオン酸の混合物を基質とし窒素条件下に回分培
養し、３−ヒドロキシブチレート（HB）／３−
ヒドロキシバレレート（HV）コポリマー
（HB：HVのモル比＝4.9：１）を71％含む細胞
を21ｇ／の濃度で含む培養液を得た。 培養液を培養器から、135℃に維持した滅菌器
を介して、次いで70℃の冷却器を介して130／
時の流量で貯蔵容器中へ送つた。滅菌器での滞留
時間は約７分であつた。 貯蔵容器中の培養液のPHを８に調節し、次いで
温度が50℃に降下したときに0.2ｇ／の「アル
カラーゼ0.6L」を添加した。その混合物を貯蔵容
器中に１晩放置した。その間に混合物の温度は27
℃に下がつた。次いで混合物を遠心分離した。固
体残渣のHBコポリマー含量は84％であり、これ
はNPCMの53％の可溶化に相当するものである。
この残渣を水に再懸濁して、固型分含量20ｇ／
の懸濁液を作り、次いでこの懸濁液を二つの部分
に分解し、別々に処理した。 Ａ 第１の部分に0.2ｇ／の「アルカラーゼ
0.6L」に添加し、その混合物を55℃でPH８にお
いて１時間消化し、次いで遠心分離した。残渣
のHBコポリマー含量は92％であり、これは
NPCMの79％の可溶化に相当するものであつ
た。 この残渣を次いで水に懸濁して、約260ｇ／
の固型分含量とし、10vol％過酸化水素500
ml／を用いて80℃で２時間消化した。この脱
色した残渣を遠心分離によつて分離し、水洗
し、乾燥した。この残渣のHBコポリマー含量
は92％であつた。これは過酸化水素処理が
NPCMをさらに可溶化しなかつたことを示し
ている。 Ｂ 前記２分割懸濁液の第２の部分に２ｇ／の
硫酸ドデシルナトリウム塩を添加し、その混合
物を１時間沸とう加熱した。次いでこの混合物
を遠心分離し、87％のHBコポリマー含量の残
渣を得た。この数値はNPCMの63％の可溶化
に相当する。 この残渣を二つの部分に分割し、別々に処理し
た。 残渣の第１の部分を水に懸濁して約190ｇ／
の固型分含量の懸濁液とし、10vol％過化水
素を500ml／の量で用いて80℃で２時間消化
処理した。脱色残渣を遠心分離で分離し、水洗
し、乾燥した。この乾燥残渣をHBコポリマー
含量は96％であり、これはNPCMの90％の総
合可溶化に相当するものであつた。 残渣の第２の部分をメタノールで洗浄し、次
いで水洗した後、遠心分離で分離した。この残
渣のHBコポリマー含量は93％であり、これは
NPCMの82％の可溶化に相当するものであつ
た。この湿潤残渣を水に再懸濁して、200ｇ／
の固型分含量とし、10vol％過酸化水素を500
ml／の濃度で用いて80℃において２時間消化
した。得られた脱色スラリーを遠心分離して、
残渣を得て、次いでこれを水で洗浄し、乾燥し
た。この乾燥残渣のHBコポリマー含量は98％
であり、これはNPCMの95％の可溶化に相当
するものであつた。 実施例 21 アルカリゲネス・オイトロフス（NCIB寄託第
11599号）を、グルコース及びプロピオン酸の混
合物を基質として窒素制限下に水性培地中で回分
式培養して、HB／HVコポリマー（HB：HVモ
ル比＝４：１）を75％含む細胞を45ｇ／の濃度
で含む懸濁液を得た。 （この実施例では、酵素及び界面活性剤の量を
初期細胞乾燥重量に基く％を表わす。） 懸濁液をパイプを介して流し、このパイプにス
チームを吹き込んで150℃に加熱した。150℃にお
ける滞留時間は20秒であつた。得られた懸濁液を
70℃に冷却し、その温度において0.5％の「アル
カラーゼ0.6L」及び0.5％の「ニユウトラーゼ
0.5L」の混合物を用いてPH7.5で２時間消化した。 得られた懸濁液を遠心分離によつて濃縮し、次
いで３％の硫酸ドデシルナトリウム塩を添加し、
還流条件下に100℃で２時間沸とうした。 結果の懸濁液を次いで噴霧乾燥した。噴霧乾燥
粉末を還流条件下にメタノールで洗浄し、過
し、乾燥した。上記のいろいろな段階における
HBポリマー含量を次表に示す。 【表】 マー含量から計算。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ３−ヒドロキシブチレートポリマー含有微生
   物細胞の水性懸濁液を少なくとも１種の可溶化剤
   で消化することにより該細胞中の３−ヒドロキシ
   ブチレートポリマー以外の細胞物質を可溶化さ
   せ、次いで３−ヒドロキシブチレートポリマーを
   含む不溶性残留物を懸濁液から分離することから
   なる、３−ヒドロキシブチレートポリマー含有微
   生物細胞からの３−ヒドロキシブチレートポリマ
   ー以外の細胞物の除去方法であつて： () その消化工程が、可溶化剤として蛋白質分
   解酵素組成物を用いる一またはそれ以上の段階
   を含み、そして水性懸濁液をその消化工程の前
   または消化工程中かつその蛋白質分解酵素での
   消化段階の前に100℃以上の温度にまで加熱す
   ること、 () (a)その消化工程が、可溶化剤としてホスホ
   リパーゼを用いる少なくとも一つの段階をも含
   むか、または(b)酵素での消化後に不溶性残留物
   を過酸化水素で処理すること、 を特徴とする上記方法。