JPH05336983A - リン脂質の生産方法 - Google Patents
リン脂質の生産方法Info
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- JPH05336983A JPH05336983A JP17197592A JP17197592A JPH05336983A JP H05336983 A JPH05336983 A JP H05336983A JP 17197592 A JP17197592 A JP 17197592A JP 17197592 A JP17197592 A JP 17197592A JP H05336983 A JPH05336983 A JP H05336983A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 塩基構造が変換されたリン脂質を製造するに
あたり、ホスホリパーゼＤを生産する微生物の培養液の
存在下に、原料リン脂質と水酸基を有する受容体とを接
触させて反応を行なうことを特徴とするリン脂質の生産
方法。 【効果】 微生物の培養液を直接作用させるので、効率
的且つ経済的にリン脂質を製造できる。
あたり、ホスホリパーゼＤを生産する微生物の培養液の
存在下に、原料リン脂質と水酸基を有する受容体とを接
触させて反応を行なうことを特徴とするリン脂質の生産
方法。 【効果】 微生物の培養液を直接作用させるので、効率
的且つ経済的にリン脂質を製造できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はリン脂質の生産方法に関
し、更に詳しくは、簡便な操作で収率よく塩基構造の変
換されたリン脂質を効率的に生産する方法に関する。リ
ン脂質は、その界面活性や生理作用を生かして、単に乳
化剤として用い得るのみならずリポソームの基材として
薬剤運搬体、人工血液、人工細胞等への応用が近年注目
されており、また、それ自体生理活性、薬理作用を持つ
ものとして、医学、薬学、工学的分野の様々の用途が考
えられている。このような多様な要求に対応するため
に、各々の用途に応じた構造を有するリン脂質を効率的
に製造する方法を開発することは、産業上非常に意義あ
ることである。
し、更に詳しくは、簡便な操作で収率よく塩基構造の変
換されたリン脂質を効率的に生産する方法に関する。リ
ン脂質は、その界面活性や生理作用を生かして、単に乳
化剤として用い得るのみならずリポソームの基材として
薬剤運搬体、人工血液、人工細胞等への応用が近年注目
されており、また、それ自体生理活性、薬理作用を持つ
ものとして、医学、薬学、工学的分野の様々の用途が考
えられている。このような多様な要求に対応するため
に、各々の用途に応じた構造を有するリン脂質を効率的
に製造する方法を開発することは、産業上非常に意義あ
ることである。
【０００２】
【従来の技術】従来、このようなリン脂質を製造する方
法としては、キャベツ由来、膵臓由来、或いは微生物由
来の種々の精製リン脂質分解酵素を直接或いは固定化等
を行って反応させる方法が提案されている（特開昭６３
−４２６９１、同６３−４４８９３、特開平１−１５３
０９０、同２−３５０９３、同２−４９５９３）。
法としては、キャベツ由来、膵臓由来、或いは微生物由
来の種々の精製リン脂質分解酵素を直接或いは固定化等
を行って反応させる方法が提案されている（特開昭６３
−４２６９１、同６３−４４８９３、特開平１−１５３
０９０、同２−３５０９３、同２−４９５９３）。
【０００３】このようなホスホリパーゼＤによるホスフ
ァチジル基転移反応を利用してリン脂質の塩基部分を交
換しようとする場合、一般に水相と有機溶媒相とからな
る２相系で反応が行なわれる。即ち、主として水溶性酵
素、受容体、pH緩衝液、無機塩等を含む水相と、主とし
て親油性である原料リン脂質を含む有機溶媒相とを攪
拌、混合する反応系である。
ァチジル基転移反応を利用してリン脂質の塩基部分を交
換しようとする場合、一般に水相と有機溶媒相とからな
る２相系で反応が行なわれる。即ち、主として水溶性酵
素、受容体、pH緩衝液、無機塩等を含む水相と、主とし
て親油性である原料リン脂質を含む有機溶媒相とを攪
拌、混合する反応系である。
【０００４】しかし乍ら、既に報告されているような精
製酵素を使用する場合、酵素の製造プロセス（分離、精
製プロセス）に要するコストが高くなるため、リン脂質
製造プロセスの工業化に際して酵素コストが割高となる
など経済的に大きな課題となっている。更に、高価なホ
スホリパーゼＤを再利用すべく、固定化酵素による反応
系の構築を考えた場合にも、例えば酵素をセライト等の
担体に固定化する方法は反応物質が担体上の酵素まで拡
散しにくく、特に担体の細孔内に吸着された酵素は反応
には実質的に関与せず、有効に働く酵素が減少する等の
問題がある。また、上記該反応が２相系で行なわれるた
め、酵素の担体への吸着力がかなり強固なものでなけれ
ば、水相への酵素の漏出が懸念される。また、ゲル化剤
などによる包括固定化法は固定化の操作が複雑で、しか
も攪拌律速による反応速度の低下等の不都合な点が多く
工業化を企てる上で改善が望まれている。
製酵素を使用する場合、酵素の製造プロセス（分離、精
製プロセス）に要するコストが高くなるため、リン脂質
製造プロセスの工業化に際して酵素コストが割高となる
など経済的に大きな課題となっている。更に、高価なホ
スホリパーゼＤを再利用すべく、固定化酵素による反応
系の構築を考えた場合にも、例えば酵素をセライト等の
担体に固定化する方法は反応物質が担体上の酵素まで拡
散しにくく、特に担体の細孔内に吸着された酵素は反応
には実質的に関与せず、有効に働く酵素が減少する等の
問題がある。また、上記該反応が２相系で行なわれるた
め、酵素の担体への吸着力がかなり強固なものでなけれ
ば、水相への酵素の漏出が懸念される。また、ゲル化剤
などによる包括固定化法は固定化の操作が複雑で、しか
も攪拌律速による反応速度の低下等の不都合な点が多く
工業化を企てる上で改善が望まれている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明はかかる実情に
鑑み、上記問題点を解決し、工業的、経済的に有利なリ
ン脂質の生産方法を提供するものである。
鑑み、上記問題点を解決し、工業的、経済的に有利なリ
ン脂質の生産方法を提供するものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上述の課
題を解決するべく鋭意検討を重ねた結果、微生物により
生産されるホスホリパーゼＤを含む培養液を直接塩基交
換反応に供することにより、精製した酵素を利用する場
合と比べて工業的、経済的に極めて有利となるのみなら
ず、酵素の安定性も増大することを見いだし、本発明を
完成した。即ち、本発明は、塩基構造が変換されたリン
脂質を製造するにあたり、ホスホリパーゼＤを生産する
微生物の培養液の存在下に、原料リン脂質と水酸基を有
する受容体とを接触させて反応を行なうことを特徴とす
るリン脂質の生産方法を内容とするものである。
題を解決するべく鋭意検討を重ねた結果、微生物により
生産されるホスホリパーゼＤを含む培養液を直接塩基交
換反応に供することにより、精製した酵素を利用する場
合と比べて工業的、経済的に極めて有利となるのみなら
ず、酵素の安定性も増大することを見いだし、本発明を
完成した。即ち、本発明は、塩基構造が変換されたリン
脂質を製造するにあたり、ホスホリパーゼＤを生産する
微生物の培養液の存在下に、原料リン脂質と水酸基を有
する受容体とを接触させて反応を行なうことを特徴とす
るリン脂質の生産方法を内容とするものである。
【０００７】本発明によると、微生物を培養した際の培
養液を直接酵素溶液として用いるため、煩雑な酵素の精
製プロセスを回避することが可能となる。一般的に、直
接酵素を含む培養液を利用した場合、培養液中に存在す
る酵素以外の不純物、例えば培地成分、代謝産物などの
反応生成物への混入が考えられる。特に、食品、医療品
用途の製品を目的とする場合、安全性の点で問題が多い
と考えられる。しかし、本反応は上述の如く２相系で反
応が進行するので、問題となると考えられる物質は水相
に存在し、目的生産物が存在する有機溶媒相には殆ど移
行しないため、危惧されるような問題点を回避すること
が可能となる。更に、反応終了後、有機溶媒相から塩基
構造が変化されたリン脂質のみを容易に回収できるた
め、分離型バイオリアクターとして利用することが可能
になり工業的には極めて好都合である。
養液を直接酵素溶液として用いるため、煩雑な酵素の精
製プロセスを回避することが可能となる。一般的に、直
接酵素を含む培養液を利用した場合、培養液中に存在す
る酵素以外の不純物、例えば培地成分、代謝産物などの
反応生成物への混入が考えられる。特に、食品、医療品
用途の製品を目的とする場合、安全性の点で問題が多い
と考えられる。しかし、本反応は上述の如く２相系で反
応が進行するので、問題となると考えられる物質は水相
に存在し、目的生産物が存在する有機溶媒相には殆ど移
行しないため、危惧されるような問題点を回避すること
が可能となる。更に、反応終了後、有機溶媒相から塩基
構造が変化されたリン脂質のみを容易に回収できるた
め、分離型バイオリアクターとして利用することが可能
になり工業的には極めて好都合である。
【０００８】本発明に用いられる微生物としては、ホス
ホリパーゼＤを生産するものであればいかなる微生物も
利用することができるが、代表的なものとして、リゾプ
ス(Rhizopus)属、アスペルギルス(Aspergillus) 属、ム
コール(Mucor) 属、シュードモナス(Psedomonas)属、キ
ャンディダ(Candida) 属、ペリシリウム(Penicillium)
属、クロモバクテリウム(Chromobacterium) 属、ストレ
プトマイセス（Streptomyces）属、ストレプトバーチシ
リウム（Streptoverticillium ）属、ミクロモノスポラ
（Micromonospora) 属、ノカルディア（Nocardia) 属、
ノカルディオプシス（Nocardiopsis) 属、アクチノマヂ
ューラ（Actinomadura) 属、等に属する微生物を挙げる
ことができる。より具体的には、リゾプス・ジャパニカ
ス（Rhizopus japonicus, IFO 4785)、リゾプス・デレ
マー(Rhizopus delemar, IFO 4730)、アスペルギルス・
ニガー(Aspergillus niger, IFO 4091) 、シュードモナ
ス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens, IFO
12055)、ムコール・ジャバニカス(Mucor javanicus, IF
O 4572) 、キャンディダ・ルゴサ(Candida rugosa, IFO
1152)、ペニシリウム・アルビカンス(Penicillium alb
icans, IFO 6771)、クロモバクテリウム・ビオラセウム
(Chromobacterium violaceum, IFO 12614)、ストレプト
マイセス・メディオシディカス（Streptomyces medioci
dicus, IFO 13202）、ストレプトマイセス・プルニカラ
ー(Streptomyces prunicolor, IFO 13075)、ストレプト
マイセス・アンチバイオティカス(Streptomyces antibi
oticus, IFO 13271)、ストレプトバーチシリウム・ハチ
ジョーエンセ（Streptoverticillium hachijoense, IFO
12782）、ストレプトバーチシリウム・シンナモネウム
(Streptoverticillium cinnamoneum, IFO 12852)、ミク
ロモノスポラ・チャルセア（Micromonospora chalcea,
ATCC 12135) 、ノカルディア・アステロイデス（Nocard
ia asteroides, IFO 3424)、ノカルディオプシス・アト
ラ（Nocardiopsis atra, IFO 14198) 、アクチノマジュ
ーラ・リバノチカ（Actinomadura libanotica, IFO 140
96) 等が挙げられる。これらは単独又は２種以上組み合
わせて用いられ、これらの他にも公知の微生物が適用さ
れる。
ホリパーゼＤを生産するものであればいかなる微生物も
利用することができるが、代表的なものとして、リゾプ
ス(Rhizopus)属、アスペルギルス(Aspergillus) 属、ム
コール(Mucor) 属、シュードモナス(Psedomonas)属、キ
ャンディダ(Candida) 属、ペリシリウム(Penicillium)
属、クロモバクテリウム(Chromobacterium) 属、ストレ
プトマイセス（Streptomyces）属、ストレプトバーチシ
リウム（Streptoverticillium ）属、ミクロモノスポラ
（Micromonospora) 属、ノカルディア（Nocardia) 属、
ノカルディオプシス（Nocardiopsis) 属、アクチノマヂ
ューラ（Actinomadura) 属、等に属する微生物を挙げる
ことができる。より具体的には、リゾプス・ジャパニカ
ス（Rhizopus japonicus, IFO 4785)、リゾプス・デレ
マー(Rhizopus delemar, IFO 4730)、アスペルギルス・
ニガー(Aspergillus niger, IFO 4091) 、シュードモナ
ス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens, IFO
12055)、ムコール・ジャバニカス(Mucor javanicus, IF
O 4572) 、キャンディダ・ルゴサ(Candida rugosa, IFO
1152)、ペニシリウム・アルビカンス(Penicillium alb
icans, IFO 6771)、クロモバクテリウム・ビオラセウム
(Chromobacterium violaceum, IFO 12614)、ストレプト
マイセス・メディオシディカス（Streptomyces medioci
dicus, IFO 13202）、ストレプトマイセス・プルニカラ
ー(Streptomyces prunicolor, IFO 13075)、ストレプト
マイセス・アンチバイオティカス(Streptomyces antibi
oticus, IFO 13271)、ストレプトバーチシリウム・ハチ
ジョーエンセ（Streptoverticillium hachijoense, IFO
12782）、ストレプトバーチシリウム・シンナモネウム
(Streptoverticillium cinnamoneum, IFO 12852)、ミク
ロモノスポラ・チャルセア（Micromonospora chalcea,
ATCC 12135) 、ノカルディア・アステロイデス（Nocard
ia asteroides, IFO 3424)、ノカルディオプシス・アト
ラ（Nocardiopsis atra, IFO 14198) 、アクチノマジュ
ーラ・リバノチカ（Actinomadura libanotica, IFO 140
96) 等が挙げられる。これらは単独又は２種以上組み合
わせて用いられ、これらの他にも公知の微生物が適用さ
れる。
【０００９】上記該微生物を培養して、培養液中にホス
ホリパーゼＤを分泌させるために用いられる培地成分と
しては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用
され得る。炭素源としては同化可能な炭素化合物、例え
ばブドウ糖、ショ糖、乳糖、麦芽糖、澱粉、デキストリ
ン、糖蜜等の糖類、グリセリン、炭化水素類、有機酸、
脂肪酸、油脂、アルコール類等が単独又は２種以上の組
み合わせで使用される。窒素源としては利用可能な窒素
化合物であればよく、無機窒素源、有機窒素源いずれで
も利用可能であり、例えばコーンスチープリカー、大豆
粉、小麦グルテン、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、
麦芽エキス、カゼイン加水分解物、尿素、カザミノ酸、
硝酸態窒素、アンモニウム態窒素等が単独又は２種以上
の組み合わせで使用される。その他、リン酸塩、マグネ
シウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛、
食塩等の塩類が必要に応じて単独又は２種以上の組み合
わせで使用される。
ホリパーゼＤを分泌させるために用いられる培地成分と
しては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用
され得る。炭素源としては同化可能な炭素化合物、例え
ばブドウ糖、ショ糖、乳糖、麦芽糖、澱粉、デキストリ
ン、糖蜜等の糖類、グリセリン、炭化水素類、有機酸、
脂肪酸、油脂、アルコール類等が単独又は２種以上の組
み合わせで使用される。窒素源としては利用可能な窒素
化合物であればよく、無機窒素源、有機窒素源いずれで
も利用可能であり、例えばコーンスチープリカー、大豆
粉、小麦グルテン、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、
麦芽エキス、カゼイン加水分解物、尿素、カザミノ酸、
硝酸態窒素、アンモニウム態窒素等が単独又は２種以上
の組み合わせで使用される。その他、リン酸塩、マグネ
シウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛、
食塩等の塩類が必要に応じて単独又は２種以上の組み合
わせで使用される。
【００１０】上記該微生物の培養方法としては一般に微
生物の培養に用いられる方法が利用される。即ち、回分
培養法、流加培養法、連続培養法等が用いられ、培養温
度は、菌体が生育しホスホリパーゼＤを生産可能な範囲
内で適宜採用し得るが、通常１５〜４０℃が好ましい。
回分培養においては、培養時間は菌体内リン脂質分解酵
素活性が最大となる時点で培養を終了すればよく、通常
は１〜７日程度である。
生物の培養に用いられる方法が利用される。即ち、回分
培養法、流加培養法、連続培養法等が用いられ、培養温
度は、菌体が生育しホスホリパーゼＤを生産可能な範囲
内で適宜採用し得るが、通常１５〜４０℃が好ましい。
回分培養においては、培養時間は菌体内リン脂質分解酵
素活性が最大となる時点で培養を終了すればよく、通常
は１〜７日程度である。
【００１１】得られた培養液は、そのまま反応に用いて
もよいし、静置分離、濾過、或いは遠心分離などの方法
を用いて菌体を分離した後に利用してもよいが、菌体を
除去した後培養液を濃縮し反応に利用するほうが、ホス
ファチジル基とアルコール性水基を有する化合物より新
たなエステルを生成するホスファチジル基転移反応を効
率よく実施する上で好ましい。
もよいし、静置分離、濾過、或いは遠心分離などの方法
を用いて菌体を分離した後に利用してもよいが、菌体を
除去した後培養液を濃縮し反応に利用するほうが、ホス
ファチジル基とアルコール性水基を有する化合物より新
たなエステルを生成するホスファチジル基転移反応を効
率よく実施する上で好ましい。
【００１２】本発明に用いられるホスファチジル基転移
反応の原料リン脂質としては、ホスホリパーゼＤの基質
となり得るものであれば、天然資源から抽出したもの、
又は抽出後精製したもの、或いは合成したものの如何を
問わず使用できる。また、市販のもの、或いは公知の方
法で調整したものを使用してもよい。例えば、大豆レシ
チン、脱脂大豆レシチン、卵黄レシチン、ホスファチジ
ルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファ
チジルセリン、ホスファチジルグリセロール、リゾレシ
チン、ホスファチジン酸等、又はそれらの混合物等が挙
げられる。本発明の効果を最大に発揮するためには、原
料リン脂質として精製したもの、ないしは組成の単純な
ものを用いた方が純粋な反応生成物が得られる面で都合
が良い。また、原料リン脂質の価格及び人手の容易さ、
更には酵素に対する反応性の面から、特にホスファチジ
ルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファ
チジルセリンが工業的に効果が高く好ましい。
反応の原料リン脂質としては、ホスホリパーゼＤの基質
となり得るものであれば、天然資源から抽出したもの、
又は抽出後精製したもの、或いは合成したものの如何を
問わず使用できる。また、市販のもの、或いは公知の方
法で調整したものを使用してもよい。例えば、大豆レシ
チン、脱脂大豆レシチン、卵黄レシチン、ホスファチジ
ルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファ
チジルセリン、ホスファチジルグリセロール、リゾレシ
チン、ホスファチジン酸等、又はそれらの混合物等が挙
げられる。本発明の効果を最大に発揮するためには、原
料リン脂質として精製したもの、ないしは組成の単純な
ものを用いた方が純粋な反応生成物が得られる面で都合
が良い。また、原料リン脂質の価格及び人手の容易さ、
更には酵素に対する反応性の面から、特にホスファチジ
ルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファ
チジルセリンが工業的に効果が高く好ましい。
【００１３】これらのリン脂質の構成脂肪酸としては同
種又は異種であって、炭素数８〜２４の飽和又は不飽和
脂肪酸であり、例えばカプロン酸、カプリル酸、ラウリ
ン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベ
ヘン酸、アラキジン酸、パルミトオレイン酸、オレイン
酸、リノール酸、α−及びγ−リノレイン酸、エルシン
酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキ
サエン酸、テトラコサテトラエン酸等が挙げられる。
種又は異種であって、炭素数８〜２４の飽和又は不飽和
脂肪酸であり、例えばカプロン酸、カプリル酸、ラウリ
ン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベ
ヘン酸、アラキジン酸、パルミトオレイン酸、オレイン
酸、リノール酸、α−及びγ−リノレイン酸、エルシン
酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキ
サエン酸、テトラコサテトラエン酸等が挙げられる。
【００１４】本発明における受容体としては、コリン、
エタノールアミン、セリン、Ｎーメチルエタノールアミ
ン、Ｎ，Ｎージメチルエタノールアミン等の含窒素アル
コール類やイノシトール、グリセロール、グルコース、
フラクトース等のポリオール、単糖類等、カルニチン、
アスコルビン酸等の水酸基を有するビタミン類等を挙げ
ることができる。これらは単独又は２種以上組み合わせ
て用いられる。
エタノールアミン、セリン、Ｎーメチルエタノールアミ
ン、Ｎ，Ｎージメチルエタノールアミン等の含窒素アル
コール類やイノシトール、グリセロール、グルコース、
フラクトース等のポリオール、単糖類等、カルニチン、
アスコルビン酸等の水酸基を有するビタミン類等を挙げ
ることができる。これらは単独又は２種以上組み合わせ
て用いられる。
【００１５】反応は、原料リン脂質を溶解又は懸濁する
有機溶媒の存在下で行うことが好ましく、微生物酵素を
失活させることの少ない溶媒系であればいずれも使用で
きる。例えば石油エーテル、ジエチルエーテル、メチル
エチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、クロロホル
ム、ジクロロメタン、四塩化炭素、ジクロロエタン、ｎ
−オクタン、イソオクタン、酢酸エチル、ジオキサン、
ベンゼン等の溶媒、又はこれらの混合溶媒系等が挙げら
れる。ただし、前述の如くアルコール類は目的反応の基
質となるため、基質として添加する以外に用いることは
あまり好ましくない。
有機溶媒の存在下で行うことが好ましく、微生物酵素を
失活させることの少ない溶媒系であればいずれも使用で
きる。例えば石油エーテル、ジエチルエーテル、メチル
エチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、クロロホル
ム、ジクロロメタン、四塩化炭素、ジクロロエタン、ｎ
−オクタン、イソオクタン、酢酸エチル、ジオキサン、
ベンゼン等の溶媒、又はこれらの混合溶媒系等が挙げら
れる。ただし、前述の如くアルコール類は目的反応の基
質となるため、基質として添加する以外に用いることは
あまり好ましくない。
【００１６】反応温度は、用いる微生物の生産するホス
ホリパーゼＤの至適温度付近が好ましく、通常２０〜６
０℃の範囲である。ただし、用いる溶媒が低沸点のもの
である場合等はこの限りではない。反応時間については
回分法の場合は概ね０．５〜４０時間、半回分法や連続
法においても、この反応条件に見合った反応時間を設定
することにより、目的とする反応を行わせることができ
る。また反応様式としては、容器に入れた有機溶媒相と
水相とを懸濁し接触反応させればよく、回転撹拌や超音
波による撹拌方式、カラム中において水相と有機溶媒相
を向流に流して接触させる方式、カラム中に酵素を含む
水相を保持しておいて、油滴状に導入した有機溶媒相を
自然浮上させながら反応を行なう方式等のあらゆる形式
の反応様式が適用可能である。
ホリパーゼＤの至適温度付近が好ましく、通常２０〜６
０℃の範囲である。ただし、用いる溶媒が低沸点のもの
である場合等はこの限りではない。反応時間については
回分法の場合は概ね０．５〜４０時間、半回分法や連続
法においても、この反応条件に見合った反応時間を設定
することにより、目的とする反応を行わせることができ
る。また反応様式としては、容器に入れた有機溶媒相と
水相とを懸濁し接触反応させればよく、回転撹拌や超音
波による撹拌方式、カラム中において水相と有機溶媒相
を向流に流して接触させる方式、カラム中に酵素を含む
水相を保持しておいて、油滴状に導入した有機溶媒相を
自然浮上させながら反応を行なう方式等のあらゆる形式
の反応様式が適用可能である。
【００１７】
【発明の効果】叙上のごとく、微生物の培養液を原料リ
ン脂質と水酸基を有する受容体に直接作用させることに
より、充分な反応速度が得られるとともに、反応終了後
有機溶媒相から塩基構造が変換されたリン脂質を容易に
回収することが可能になる。また、精製した酵素を使用
する場合と比べて安価な上に酵素の安定性が増すため経
済的にも有利になり、効率的に塩基構造が変換されたリ
ン脂質を製造することが可能となる。更に本発明によれ
ば、例えば近年、ドラッグデリバリーシステムにおける
リポソームの基材として工業的生産が望まれている高純
度のリン脂質を生産するにあたり、ホスファチジル基転
移反応を利用して効率的且つ経済的に所望のリン脂質を
高収率で得ることが可能となる。
ン脂質と水酸基を有する受容体に直接作用させることに
より、充分な反応速度が得られるとともに、反応終了後
有機溶媒相から塩基構造が変換されたリン脂質を容易に
回収することが可能になる。また、精製した酵素を使用
する場合と比べて安価な上に酵素の安定性が増すため経
済的にも有利になり、効率的に塩基構造が変換されたリ
ン脂質を製造することが可能となる。更に本発明によれ
ば、例えば近年、ドラッグデリバリーシステムにおける
リポソームの基材として工業的生産が望まれている高純
度のリン脂質を生産するにあたり、ホスファチジル基転
移反応を利用して効率的且つ経済的に所望のリン脂質を
高収率で得ることが可能となる。
【００１８】
【実施例】次に実施例を用いて本発明を更に詳しく説明
するが、本発明はもとよりかかる実施例のみに限定され
るものではない。以下の記載において、「％」は特に断
らない限り「重量％」を意味する。尚、リン脂質の分析
は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて行なっ
た。固定相には、シリカゲルにアミノプロピル基を化学
結合させたカラムを、また移動相溶媒としてはアセトニ
トリル：メタノール：１０mMリン酸二水素アンモニウム
＝６１２：２８９：１００の混合溶媒系をそれぞれ用
い、２０５nmにおける吸収を測定することにより定量を
行なった。ホスホリパーゼＤの加水分解活性は、ホスフ
ァチジルコリンがホスホリパーゼＤにより加水分解され
る際に遊離してくるコリンの量を酵素法を用いることに
より測定を行なった。酵素活性の定義として、３７℃、
pH８．０における反応で、１分間あたり１μmol のコリ
ンを遊離する酵素量を１ユニット（Unit）と定義した。
するが、本発明はもとよりかかる実施例のみに限定され
るものではない。以下の記載において、「％」は特に断
らない限り「重量％」を意味する。尚、リン脂質の分析
は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて行なっ
た。固定相には、シリカゲルにアミノプロピル基を化学
結合させたカラムを、また移動相溶媒としてはアセトニ
トリル：メタノール：１０mMリン酸二水素アンモニウム
＝６１２：２８９：１００の混合溶媒系をそれぞれ用
い、２０５nmにおける吸収を測定することにより定量を
行なった。ホスホリパーゼＤの加水分解活性は、ホスフ
ァチジルコリンがホスホリパーゼＤにより加水分解され
る際に遊離してくるコリンの量を酵素法を用いることに
より測定を行なった。酵素活性の定義として、３７℃、
pH８．０における反応で、１分間あたり１μmol のコリ
ンを遊離する酵素量を１ユニット（Unit）と定義した。
【００１９】実施例１ ストレプトバーチシリウム・シナモネウム IFO 12363
を、グルコース１％、肉エキス０．７５％、ポリペプト
ン０．７５％、NaCl０．３％、MgSO4 ０．１％を含む培
地（pH７．２）で、温度３０℃、５日間振盪培養した。
得られた培養液は３０００rpm で１０分間遠心分離を行
なうことにより菌体を除去した後塩基交換反応に供し
た。こうして得られた培養液の３７℃、pH８．０におけ
るＰＬ−Ｄ加水分解活性は培養液１リットルあたり１１
２０ユニットであった。密栓したサンプル瓶に、ホスフ
ァチジルコリン（旭化成製）７０mg、ジエチルエーテル
３２ml、１Ｍモノエタノールアミン−HCl バッファー
（pH８．０）１５．５ml、上記の如く調製した培養上清
０．５ml（ＰＬ−Ｄ加水分解活性で０．５６ユニット相
当）を加え、３０℃にて５時間反応を行なった。分析の
結果、５時間反応後の反応液組成は、ホスファチジルコ
リン０．２％、ホスファチジルエタノールアミン９９．
８％、ホスファチジン酸０％であった。ＰＬ−Ｄを生産
する微生物の培養液を用いた場合もホスファチジル基転
移反応を効率的に行なうことができることが確認され
た。
を、グルコース１％、肉エキス０．７５％、ポリペプト
ン０．７５％、NaCl０．３％、MgSO4 ０．１％を含む培
地（pH７．２）で、温度３０℃、５日間振盪培養した。
得られた培養液は３０００rpm で１０分間遠心分離を行
なうことにより菌体を除去した後塩基交換反応に供し
た。こうして得られた培養液の３７℃、pH８．０におけ
るＰＬ−Ｄ加水分解活性は培養液１リットルあたり１１
２０ユニットであった。密栓したサンプル瓶に、ホスフ
ァチジルコリン（旭化成製）７０mg、ジエチルエーテル
３２ml、１Ｍモノエタノールアミン−HCl バッファー
（pH８．０）１５．５ml、上記の如く調製した培養上清
０．５ml（ＰＬ−Ｄ加水分解活性で０．５６ユニット相
当）を加え、３０℃にて５時間反応を行なった。分析の
結果、５時間反応後の反応液組成は、ホスファチジルコ
リン０．２％、ホスファチジルエタノールアミン９９．
８％、ホスファチジン酸０％であった。ＰＬ−Ｄを生産
する微生物の培養液を用いた場合もホスファチジル基転
移反応を効率的に行なうことができることが確認され
た。
【００２０】実施例２ 実施例１で使用した微生物の代わりに、ストレプトマイ
セス・プルニカラー IFO 13075、ミクロモノスポラ・チ
ャルセア IFO 12135、ノカルディア・アステロイデス I
FO 3424 、ノカルディオプシス・アトラ IFO 14198、ア
クチノマジューラ・リバノチカ IFO 14096、リゾプス・
デレマー IFO 4730 、アスペルギルス・ニガー IFO 409
1 、シュードモナス・フルオレッセンス IFO 12055、ム
コール・ジャバニカス IFO 4572 、キャンディダ・ルゴ
サ IFO 1152 、ペニシリウム・アルビカンス IFO 6771
、クロモバクテリウム・ビオラセウム IFO 12614を使
用した以外は、実施例１と全く同様に行なった。表１に
各微生物を培養した際の培養上清を用いて、実施例１と
同様にＰＣからＰＥの塩基交換反応を行なった場合の５
時間後の反応液組成の分析結果を示した。
セス・プルニカラー IFO 13075、ミクロモノスポラ・チ
ャルセア IFO 12135、ノカルディア・アステロイデス I
FO 3424 、ノカルディオプシス・アトラ IFO 14198、ア
クチノマジューラ・リバノチカ IFO 14096、リゾプス・
デレマー IFO 4730 、アスペルギルス・ニガー IFO 409
1 、シュードモナス・フルオレッセンス IFO 12055、ム
コール・ジャバニカス IFO 4572 、キャンディダ・ルゴ
サ IFO 1152 、ペニシリウム・アルビカンス IFO 6771
、クロモバクテリウム・ビオラセウム IFO 12614を使
用した以外は、実施例１と全く同様に行なった。表１に
各微生物を培養した際の培養上清を用いて、実施例１と
同様にＰＣからＰＥの塩基交換反応を行なった場合の５
時間後の反応液組成の分析結果を示した。
【００２１】
【表１】 ＰＣ：ホスファチジルコリン ＰＥ：ホスファチジルエタノールアミン ＰＡ：ホスファチジン酸
【００２２】実施例３ 塩基交換反応の際の受容体として、エタノールアミンの
代わりにセリンを１．６８ｇ加え、バッファーとして
０．１Ｍクエン酸−クエン酸ナトリウムバッファー（pH
８．０）を１５．５ml加えた以外は実施例１と全く同様
に行なった。結果を表２に示す。
代わりにセリンを１．６８ｇ加え、バッファーとして
０．１Ｍクエン酸−クエン酸ナトリウムバッファー（pH
８．０）を１５．５ml加えた以外は実施例１と全く同様
に行なった。結果を表２に示す。
【００２３】実施例４ 塩基交換反応の際の受容体として、エタノールアミンの
代わりにグリセロールを１．４７ｇ加えた以外は実施例
３と全く同様に行なった。結果を表２に示す。
代わりにグリセロールを１．４７ｇ加えた以外は実施例
３と全く同様に行なった。結果を表２に示す。
【００２４】実施例５ 塩基交換反応の際の受容体として、エタノールアミンの
代わりにイノシトールを２．８８ｇ加えた以外は実施例
３と全く同様に行なった。結果を表２に示す。
代わりにイノシトールを２．８８ｇ加えた以外は実施例
３と全く同様に行なった。結果を表２に示す。
【００２５】実施例６ 塩基交換反応の際の受容体として、エタノールアミンの
代わりにアスコルビン酸を２．８２ｇ加えた以外は実施
例３と全く同様に行なった。結果を表２に示す。
代わりにアスコルビン酸を２．８２ｇ加えた以外は実施
例３と全く同様に行なった。結果を表２に示す。
【００２６】実施例７ 塩基交換反応の際の受容体として、エタノールアミンの
代わりにカルニチンを２．５９ｇ加えた以外は実施例３
と全く同様に行なった。結果を表２に示す。
代わりにカルニチンを２．５９ｇ加えた以外は実施例３
と全く同様に行なった。結果を表２に示す。
【００２７】
【表２】 ＰＣ：ホスファチジルコリン ＰＡ：ホスファチジン酸 ＰＸ：ホスファチジルセリン（実施例３） ホスファチジルグリセロール（実施例４） ホスファチジルイノシトール（実施例５） ホスファチジルアスコルビン酸（実施例６） ホスファチジルカルニチン（実施例７）
【００２８】実施例８ 実施例１と全く同様の反応条件でＰＣからＰＥへの塩基
交換反応を繰り返し実施した。３０℃で５時間１回目の
反応を行なった後、遠心分離（１０００rpm 、２min ）
により水相と有機溶媒相とを分離した。２相に分かれた
反応液から有機溶媒相を除去した後、新たに調製した有
機溶媒相を加えて次の反応を実施した。この様な繰り返
し反応を３０回繰り返した。各回の反応においてそのＰ
Ｅ生成の初速度を測定し、１回目の反応の初速度を１０
０％として繰り返し反応における初速度の推移を図１に
示す。
交換反応を繰り返し実施した。３０℃で５時間１回目の
反応を行なった後、遠心分離（１０００rpm 、２min ）
により水相と有機溶媒相とを分離した。２相に分かれた
反応液から有機溶媒相を除去した後、新たに調製した有
機溶媒相を加えて次の反応を実施した。この様な繰り返
し反応を３０回繰り返した。各回の反応においてそのＰ
Ｅ生成の初速度を測定し、１回目の反応の初速度を１０
０％として繰り返し反応における初速度の推移を図１に
示す。
【００２９】比較例１ 比較例として、培養液を用いる代わりに市販のＰＬ−Ｄ
酵素（東洋醸造製、Streptomyces sp., ３７℃、pH８．
０における加水分解活性で０．０５ユニット相当）を用
いた以外は実施例８と全く同様に行なった。結果を図１
に併記する。図１から明かなように、ＰＬ−Ｄを生産す
る微生物の培養液をリン脂質の塩基交換反応に直接利用
することは、市販のＰＬ−Ｄ酵素を用いる場合と比べ酵
素の安定性が増大するため、繰り返し塩基交換反応を安
定して行なうことが可能である。
酵素（東洋醸造製、Streptomyces sp., ３７℃、pH８．
０における加水分解活性で０．０５ユニット相当）を用
いた以外は実施例８と全く同様に行なった。結果を図１
に併記する。図１から明かなように、ＰＬ−Ｄを生産す
る微生物の培養液をリン脂質の塩基交換反応に直接利用
することは、市販のＰＬ−Ｄ酵素を用いる場合と比べ酵
素の安定性が増大するため、繰り返し塩基交換反応を安
定して行なうことが可能である。
【図１】実施例８と比較例１において、繰り返し反応に
おける初速度の推移を示すグラフである。
おける初速度の推移を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:39） (Ｃ１２Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:785） (Ｃ１２Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:80） (Ｃ１２Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:48） (Ｃ１２Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:30） (Ｃ１２Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:365）
Claims (2)
- 【請求項１】 塩基構造が変換されたリン脂質を製造す
るにあたり、ホスホリパーゼＤを生産する微生物の培養
液の存在下に、原料リン脂質と水酸基を有する受容体と
を接触させて反応を行なうことを特徴とするリン脂質の
生産方法。 - 【請求項２】 微生物がリゾプス属、アスペルギルス
属、シュードモナス属、ムコール属、キャンディダ属、
ペニシリウム属、クロモバクテリウム属、ストレプトマ
イセス属、ストレプトバーチシリウム属、ミクロモノス
ポラ属、ノカルディア属、ノカルディオプシス属及びア
クチノマヂューラ属から選択される少なくとも１種であ
る請求項１記載の生産方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17197592A JPH05336983A (ja) | 1992-06-04 | 1992-06-04 | リン脂質の生産方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17197592A JPH05336983A (ja) | 1992-06-04 | 1992-06-04 | リン脂質の生産方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05336983A true JPH05336983A (ja) | 1993-12-21 |
Family
ID=15933216
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17197592A Withdrawn JPH05336983A (ja) | 1992-06-04 | 1992-06-04 | リン脂質の生産方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05336983A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997017460A1 (en) * | 1995-11-08 | 1997-05-15 | Kabushiki Kaisha Yakult Honsha | Process for producing phosphatidylserines having polybasic unsaturated fatty acid as side chain |
| EP0776976A2 (en) | 1995-12-08 | 1997-06-04 | ITALFARMACO SUD S.p.A. | A process for the industrial preparation of phosphatidylserine |
| JP2006211974A (ja) * | 2005-02-04 | 2006-08-17 | Yakult Honsha Co Ltd | ストレプトマイセス属細菌の培養方法及びこれを利用する有用物質の製造方法 |
| CN107723282A (zh) * | 2017-11-27 | 2018-02-23 | 盐城工学院 | 一种磷脂酶d的生产工艺以及磷脂酶d制品 |
-
1992
- 1992-06-04 JP JP17197592A patent/JPH05336983A/ja not_active Withdrawn
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997017460A1 (en) * | 1995-11-08 | 1997-05-15 | Kabushiki Kaisha Yakult Honsha | Process for producing phosphatidylserines having polybasic unsaturated fatty acid as side chain |
| US5965413A (en) * | 1995-11-08 | 1999-10-12 | Kabushiki Kaisha Yakult Honsha | Process for producing phosphatidylserines having long chain unsaturated fatty acid as side chain |
| CN1103818C (zh) * | 1995-11-08 | 2003-03-26 | 株式会社雅库路特本社 | 在侧链上具有多元不饱和脂肪酸的磷酯酰丝氨酸的制造方法 |
| EP0776976A2 (en) | 1995-12-08 | 1997-06-04 | ITALFARMACO SUD S.p.A. | A process for the industrial preparation of phosphatidylserine |
| EP0776976B2 (en) † | 1995-12-08 | 2014-07-30 | CHEMI S.p.A. | A process for the industrial preparation of phosphatidylserine |
| JP2006211974A (ja) * | 2005-02-04 | 2006-08-17 | Yakult Honsha Co Ltd | ストレプトマイセス属細菌の培養方法及びこれを利用する有用物質の製造方法 |
| CN107723282A (zh) * | 2017-11-27 | 2018-02-23 | 盐城工学院 | 一种磷脂酶d的生产工艺以及磷脂酶d制品 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 19990831 |