JPH0534000B2 - - Google Patents
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- JPH0534000B2 JPH0534000B2 JP14440884A JP14440884A JPH0534000B2 JP H0534000 B2 JPH0534000 B2 JP H0534000B2 JP 14440884 A JP14440884 A JP 14440884A JP 14440884 A JP14440884 A JP 14440884A JP H0534000 B2 JPH0534000 B2 JP H0534000B2
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- Japan
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- dehydrogenase
- reaction
- electron
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
「産業上の利用分野」
本発明は、生体液中の成分の測定に用いる新規
な検査試薬に関する。すなわち主に、生体液の臨
床検査に利用されるものである。
な検査試薬に関する。すなわち主に、生体液の臨
床検査に利用されるものである。
「従来の技術」
生体液中の成分の測定方法が、繁雑な抽出、濃
縮、分離操作を必要とするもの、或いは特異性の
低い化学反応によるものから、簡便でしかも特異
性の高い正確な測定が可能となる酵素法へと推移
して久しい。これらの測定方法は、主に次の二種
類の酵素系のいずれかを利用する場合が殆どであ
る。すなわち、目的とする成分を脱水素酵素を介
して水素（電子）量として測定するもの、他方
は、酸化酵素を介して過酸化水素量として測定す
るものである。とりわけ、前者の脱水素酵素を用
いた方法は、利用可能な酵素が豊富なため、古く
から多用されており、測定は、酵素反応に共役し
た補酵素の還元量或いは電子伝達体を介して電子
受容体を変化させその変化量を探知することから
行われる。本発明は、この脱水素酵素、電子伝達
体、及び電子受容体を利用した測定方法のための
新規な試薬成分に関するものである。
縮、分離操作を必要とするもの、或いは特異性の
低い化学反応によるものから、簡便でしかも特異
性の高い正確な測定が可能となる酵素法へと推移
して久しい。これらの測定方法は、主に次の二種
類の酵素系のいずれかを利用する場合が殆どであ
る。すなわち、目的とする成分を脱水素酵素を介
して水素（電子）量として測定するもの、他方
は、酸化酵素を介して過酸化水素量として測定す
るものである。とりわけ、前者の脱水素酵素を用
いた方法は、利用可能な酵素が豊富なため、古く
から多用されており、測定は、酵素反応に共役し
た補酵素の還元量或いは電子伝達体を介して電子
受容体を変化させその変化量を探知することから
行われる。本発明は、この脱水素酵素、電子伝達
体、及び電子受容体を利用した測定方法のための
新規な試薬成分に関するものである。
この電子伝達体を介する反応では、脱水素酵素
の作用により、成分１分子当たり２個の電子が放
出され、電子伝達体を介して電子受容体が還元さ
れる。従つて、電子受容体の変化量を監視するこ
とによつて、検出系が成立することになる。この
検出系は電子の流れを直接電極系へ導いて生じた
電流を電気的に計測する場合や電子受容体の還元
によつて光吸収特性に変化を生じさせ、その変化
量を分光光学的に測定する場合が多い。直接電気
的変化量をみる前者においては電子受容体として
電池の一方の電極をなすもの、例えば白金又は適
当に処理された炭素などが用いられ、この電極は
第２の電極例えば銀／塩化銀、フエリシアン化物
中の白金などに接続され、塩橋等がこの二電極間
を接続する。勿論これらの電極の形態については
種々である。他方、後者の光吸収特性に変化を生
じる電子受容体には、例えば２，４−ジクロロフ
エノールインドフエノールや種々のテトラゾリウ
ム塩などがあるが、これらを用いた場合には、そ
の還元量を分光光学的に測定することができる。
これらは、しばしば可視領域における色の変化を
伴なう。実際に病院等での生体液中の成分の分析
には、もつぱらこの簡便な吸光度分析が利用され
ている。中でも電子受容体にテトラゾリウム塩を
用いて、この還元反応により生成するホルマザン
量をインデイケーターとする場合が一般的であ
る。
の作用により、成分１分子当たり２個の電子が放
出され、電子伝達体を介して電子受容体が還元さ
れる。従つて、電子受容体の変化量を監視するこ
とによつて、検出系が成立することになる。この
検出系は電子の流れを直接電極系へ導いて生じた
電流を電気的に計測する場合や電子受容体の還元
によつて光吸収特性に変化を生じさせ、その変化
量を分光光学的に測定する場合が多い。直接電気
的変化量をみる前者においては電子受容体として
電池の一方の電極をなすもの、例えば白金又は適
当に処理された炭素などが用いられ、この電極は
第２の電極例えば銀／塩化銀、フエリシアン化物
中の白金などに接続され、塩橋等がこの二電極間
を接続する。勿論これらの電極の形態については
種々である。他方、後者の光吸収特性に変化を生
じる電子受容体には、例えば２，４−ジクロロフ
エノールインドフエノールや種々のテトラゾリウ
ム塩などがあるが、これらを用いた場合には、そ
の還元量を分光光学的に測定することができる。
これらは、しばしば可視領域における色の変化を
伴なう。実際に病院等での生体液中の成分の分析
には、もつぱらこの簡便な吸光度分析が利用され
ている。中でも電子受容体にテトラゾリウム塩を
用いて、この還元反応により生成するホルマザン
量をインデイケーターとする場合が一般的であ
る。
「発明が解決しようとする問題点」
ホルマザンの発色反応は、組織切片中の目的成
分の染色や電気泳動像の染色など難溶性という性
質がメリツトとなる反面、試験管や比色時に用い
るキユベツト、チユーブ類に著しく吸着するた
め、自動分析機など高価な機材での使用は敬遠さ
れており、その利用度はかなり低い。さらに水溶
性のインデイケーターの場合には一定のモル吸光
係数を示すものに対してホルマザンは難溶性なた
めに、反応溶媒の脂溶性の程度によつてモル吸光
係数が変動するという欠点を持つ。（又モル吸光
係数は、最大でも約２万である。）従つて生体液
中に比較的、高濃度に含有される成分、或いは他
の方法が適用できない成分に限られることにな
る。さらに、この反応系を構成する補酵素、電子
伝達体、或いは電子受容体への当該反応以外の干
渉反応もあつて、決して満足できる測定法にはな
つていない。この生体液の分析に伴なう干渉反応
は、分光光学的分析法、電気的分析法のいかんに
関らず、脱水素酵素、電子伝達体、電子受容体か
ら成る反応系に本質的なものであり、本発明の第
１の目的は、これを改良する試薬を提供すること
である。
分の染色や電気泳動像の染色など難溶性という性
質がメリツトとなる反面、試験管や比色時に用い
るキユベツト、チユーブ類に著しく吸着するた
め、自動分析機など高価な機材での使用は敬遠さ
れており、その利用度はかなり低い。さらに水溶
性のインデイケーターの場合には一定のモル吸光
係数を示すものに対してホルマザンは難溶性なた
めに、反応溶媒の脂溶性の程度によつてモル吸光
係数が変動するという欠点を持つ。（又モル吸光
係数は、最大でも約２万である。）従つて生体液
中に比較的、高濃度に含有される成分、或いは他
の方法が適用できない成分に限られることにな
る。さらに、この反応系を構成する補酵素、電子
伝達体、或いは電子受容体への当該反応以外の干
渉反応もあつて、決して満足できる測定法にはな
つていない。この生体液の分析に伴なう干渉反応
は、分光光学的分析法、電気的分析法のいかんに
関らず、脱水素酵素、電子伝達体、電子受容体か
ら成る反応系に本質的なものであり、本発明の第
１の目的は、これを改良する試薬を提供すること
である。
最近、Feを電子受容体とするトリグリセリ
ドの測定法が提案され（公開特許公報昭54−
80192）、ホルマザンと異なる水溶性の発色性電子
受容体の脱水素酵素への適用が示唆された。しか
し、この反応例では特に生体液中に存在する目的
成分以外の成分による干渉作用を受け易いため、
この場合においても、測定可能な成分は、検体量
が微量ですむ比較的高濃度に含有されるものに限
られてしまう。又、Fe自身の保存性が悪く、
しばしば赤褐色の沈殿形成やFeへの還元が自
然におこる結果、経時的な試薬ブランク値の上昇
が著しい。このように、試薬として著しく不安定
であり、検体の添加以前に発色が見られるため、
検体ごとに試薬ブランク値を読みとる必要があつ
て、非常に取り扱いにくい。これらのことは日常
の検査においては非常に不便である。さらに鉄を
含む重金属類は、酵素特にSH酵素などに阻害的
な影響を与えて失活させ、又、鉄キレート剤も鉄
を含有する金属酵素類に失活をおこさせること
が、一般に認識されている。この意味において、
Feと、鉄キレート剤を用いた方法を広く種々
の成分の測定に適用するのは、何らかの対策なく
しては困難である。
ドの測定法が提案され（公開特許公報昭54−
80192）、ホルマザンと異なる水溶性の発色性電子
受容体の脱水素酵素への適用が示唆された。しか
し、この反応例では特に生体液中に存在する目的
成分以外の成分による干渉作用を受け易いため、
この場合においても、測定可能な成分は、検体量
が微量ですむ比較的高濃度に含有されるものに限
られてしまう。又、Fe自身の保存性が悪く、
しばしば赤褐色の沈殿形成やFeへの還元が自
然におこる結果、経時的な試薬ブランク値の上昇
が著しい。このように、試薬として著しく不安定
であり、検体の添加以前に発色が見られるため、
検体ごとに試薬ブランク値を読みとる必要があつ
て、非常に取り扱いにくい。これらのことは日常
の検査においては非常に不便である。さらに鉄を
含む重金属類は、酵素特にSH酵素などに阻害的
な影響を与えて失活させ、又、鉄キレート剤も鉄
を含有する金属酵素類に失活をおこさせること
が、一般に認識されている。この意味において、
Feと、鉄キレート剤を用いた方法を広く種々
の成分の測定に適用するのは、何らかの対策なく
しては困難である。
一方脱水素酵素反応のインデイケーターとして
の鉄錯体は、上記のホルマザンに比べ、有利な特
性を有する。すなわち、１分子の成分の脱水素反
応によつて生成される２個の電子が、そのまま２
分子のFeを還元するため、感度が倍増し、非
常に高感度な測定系が成立する。しかも、生成し
た錯体は、水溶性であるので、従来のホルマザン
の持つ難溶性という問題点が完全に除去できる性
質を持つものである。従つて、この発色剤は胆汁
酸クレアチニン、クレアチン等の生体液中に微量
に含有される成分の測定に有利な方法を提供する
ものであるが、先に述べたように、干渉物質の影
響を受け易いために、しばしば目的成分由来の反
応に比べて干渉物質による反応が大きくなつてし
まい、測定の信頼度を著しく損う。又、この干渉
作用は、各種検査機関等ですでに日常検査として
汎用されている分光分析法においても、充分に回
避されていないものであるから、上述の色素系に
おける種々の課題と合わせこれを解決すること、
すなわち、脱水素酵素、電子伝達体、電子受容体
の反応に本質的に存在する干渉作用を抑制して日
常検査をより簡便でより正確なものとし、さらに
微量成分の測定が可能な色素系を実用化させるこ
とは、重要なテーマであり、実際面への寄与も大
きいものである。
の鉄錯体は、上記のホルマザンに比べ、有利な特
性を有する。すなわち、１分子の成分の脱水素反
応によつて生成される２個の電子が、そのまま２
分子のFeを還元するため、感度が倍増し、非
常に高感度な測定系が成立する。しかも、生成し
た錯体は、水溶性であるので、従来のホルマザン
の持つ難溶性という問題点が完全に除去できる性
質を持つものである。従つて、この発色剤は胆汁
酸クレアチニン、クレアチン等の生体液中に微量
に含有される成分の測定に有利な方法を提供する
ものであるが、先に述べたように、干渉物質の影
響を受け易いために、しばしば目的成分由来の反
応に比べて干渉物質による反応が大きくなつてし
まい、測定の信頼度を著しく損う。又、この干渉
作用は、各種検査機関等ですでに日常検査として
汎用されている分光分析法においても、充分に回
避されていないものであるから、上述の色素系に
おける種々の課題と合わせこれを解決すること、
すなわち、脱水素酵素、電子伝達体、電子受容体
の反応に本質的に存在する干渉作用を抑制して日
常検査をより簡便でより正確なものとし、さらに
微量成分の測定が可能な色素系を実用化させるこ
とは、重要なテーマであり、実際面への寄与も大
きいものである。
本発明者らは、かかる要件に着目し、鋭意研究
した結果、本発明を完成するに至つた。
した結果、本発明を完成するに至つた。
「問題点を解決するための手段」 （及び効果）
すなわち本発明は電子伝達体及び検出に要する
電子受容体の存在下、遊離の補酵素を必要とする
脱水素酵素或いは、補酵素を補欠分子族として保
持する脱水素酵素を介する反応により生成される
電子を検出することによる生体液中の成分の測定
方法において、試料中に共存する還元性物質、脱
水素酵素或いはアルブミンによる当該反応以外の
干渉反応を抑制するために、試薬中に酒石酸或い
はそのアルカリ塩を添加して成ることを特徴とす
る生体液中の成分の定量用試薬である。
電子受容体の存在下、遊離の補酵素を必要とする
脱水素酵素或いは、補酵素を補欠分子族として保
持する脱水素酵素を介する反応により生成される
電子を検出することによる生体液中の成分の測定
方法において、試料中に共存する還元性物質、脱
水素酵素或いはアルブミンによる当該反応以外の
干渉反応を抑制するために、試薬中に酒石酸或い
はそのアルカリ塩を添加して成ることを特徴とす
る生体液中の成分の定量用試薬である。
以下本発明を詳しく説明する。本発明は脱水素
酵素、電子伝達体、電子受容体への一連の反応を
行なわしめる時、そこに酒石酸或いはそのアルカ
リ塩を共存させると、干渉作用の影響が著しく減
少することに基き、これによつて脱水素酵素を用
いた測定法をより正確で信頼度の高いものとした
ものである。第１図は血清由来干渉反応に対する
0.2Mの酒石酸ナトリウムによる干渉作用の低下
（図中Ｔで示されるグラフ）の状況を対称（図中
Ｃで示されるグラフ）と対比して吸光度
（564nm）と反応時間の関係で表わしたもの（但
し、血清100μ／1.5ml）であるが、顕著な効果
が認められる。
酵素、電子伝達体、電子受容体への一連の反応を
行なわしめる時、そこに酒石酸或いはそのアルカ
リ塩を共存させると、干渉作用の影響が著しく減
少することに基き、これによつて脱水素酵素を用
いた測定法をより正確で信頼度の高いものとした
ものである。第１図は血清由来干渉反応に対する
0.2Mの酒石酸ナトリウムによる干渉作用の低下
（図中Ｔで示されるグラフ）の状況を対称（図中
Ｃで示されるグラフ）と対比して吸光度
（564nm）と反応時間の関係で表わしたもの（但
し、血清100μ／1.5ml）であるが、顕著な効果
が認められる。
更に本発明においては、色素系として感度が高
く水溶性であるという面で有利なFe及びその
発色性キレート剤を用いる時、鉄自身の安定性、
酸化状態でのFeと鉄キレート剤間の安定性反
応後の還元発色状態での安定性を保持ししかも脱
水素酵素への阻害を回避し、干渉反応を抑制する
ためにはシユウ酸或いはそのアルカリ塩を共存さ
せるとより好ましい効果が得られる。第２図は最
終濃度0.2モラーのFeのFeへの変化に対する
PHの影響において１ミリモラーのシユウ酸ナトリ
ウムの存在がその影響を緩和してFeを安定化
させている状況（図中Ｏで示されるグラフ）を対
称（図中Ｃで示されるグラフ）と対比して表した
ものである。
く水溶性であるという面で有利なFe及びその
発色性キレート剤を用いる時、鉄自身の安定性、
酸化状態でのFeと鉄キレート剤間の安定性反
応後の還元発色状態での安定性を保持ししかも脱
水素酵素への阻害を回避し、干渉反応を抑制する
ためにはシユウ酸或いはそのアルカリ塩を共存さ
せるとより好ましい効果が得られる。第２図は最
終濃度0.2モラーのFeのFeへの変化に対する
PHの影響において１ミリモラーのシユウ酸ナトリ
ウムの存在がその影響を緩和してFeを安定化
させている状況（図中Ｏで示されるグラフ）を対
称（図中Ｃで示されるグラフ）と対比して表した
ものである。
生体試料中に含まれ、干渉作用を有すると思わ
れる物質としては、例えばアスコルビン酸、尿酸
ビリルビンに代表される還元性物質が挙げられ
る。又、試料中に含まれる他の脱水素酵素の反応
或いは種々の低分子物質を吸着したアルブミン等
も、Fe等の電子受容体を還元し、誤差の要因
になると考えられる。第２図に示したようにFe
は酸性から中性において、徐々にFeへと変
化し、反応時に不都合な着色をもたらす。又弱酸
性からアルカリ性においてヒドロキソ錯体Fe
（OH-）ｎを生じOH-がこの錯体同志を架橋する
ために重合が起こつて、沈殿を形成してしまうこ
ともある。これらの現象を防ぐためには、Fe
の弱い配位子となる物質を安定剤として共存させ
る必要があるが、この安定剤はFe或いはFe
と鉄キレート剤間の安定性のみならず、Feと
電子伝達体との反応性にも影響を与え、干渉反応
を抑制する作用をも有していた。すなわち、Fe
の安定化効果は、しばしば本反応や干渉反応を
抑制する傾向にあつた。シユウ酸はFeを安定
に保ち、しかも電子伝達体からの電子の流れを妨
げることなく、円滑に行わせる最も適切な安定剤
として選ばれたものである。
れる物質としては、例えばアスコルビン酸、尿酸
ビリルビンに代表される還元性物質が挙げられ
る。又、試料中に含まれる他の脱水素酵素の反応
或いは種々の低分子物質を吸着したアルブミン等
も、Fe等の電子受容体を還元し、誤差の要因
になると考えられる。第２図に示したようにFe
は酸性から中性において、徐々にFeへと変
化し、反応時に不都合な着色をもたらす。又弱酸
性からアルカリ性においてヒドロキソ錯体Fe
（OH-）ｎを生じOH-がこの錯体同志を架橋する
ために重合が起こつて、沈殿を形成してしまうこ
ともある。これらの現象を防ぐためには、Fe
の弱い配位子となる物質を安定剤として共存させ
る必要があるが、この安定剤はFe或いはFe
と鉄キレート剤間の安定性のみならず、Feと
電子伝達体との反応性にも影響を与え、干渉反応
を抑制する作用をも有していた。すなわち、Fe
の安定化効果は、しばしば本反応や干渉反応を
抑制する傾向にあつた。シユウ酸はFeを安定
に保ち、しかも電子伝達体からの電子の流れを妨
げることなく、円滑に行わせる最も適切な安定剤
として選ばれたものである。
さらに、詳しく本発明を説明すれば脱水素酵
素、電子伝達体、電子受容体の存在下に干渉反応
抑制のために使用する酒石酸或いはそのアルカリ
塩の反応液中の終濃度は0.01〜1.0M、であり、
好ましくは0.1〜0.5Mである。一連の反応又はFe
と鉄キレート剤間の安定化のために使用するシ
ユウ酸或いはそのアルカリ塩は、同反応液中に
0.5〜100mMさらに好ましくは、２〜50mMの濃
度範囲で使用できる。
素、電子伝達体、電子受容体の存在下に干渉反応
抑制のために使用する酒石酸或いはそのアルカリ
塩の反応液中の終濃度は0.01〜1.0M、であり、
好ましくは0.1〜0.5Mである。一連の反応又はFe
と鉄キレート剤間の安定化のために使用するシ
ユウ酸或いはそのアルカリ塩は、同反応液中に
0.5〜100mMさらに好ましくは、２〜50mMの濃
度範囲で使用できる。
電子受容体としてFeと鉄キレート剤を用い
る分光分析では、用いられる鉄キレート剤は、バ
ソフエナンスロリンやそのスルホン酸塩、或いは
２−（５−ブロモピリジルアゾ）−５−（Ｎ−プロ
ピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）アリニンナト
リウム塩（５−Br−PSAA）、３−（２−ピリジ
ル）−５，６−ビス（４−スルホフエニル）−１，
２，４−トリアジン２ナトリウム塩（PDTS）が
これらの干渉作用に対して最も有利であり、当該
の脱水素反応に影響なく円滑に反応を進ませ目的
成分以上の干渉作用を受けにくいものとして選ば
れるが、これはFeと鉄キレート剤との錯体に
おける固有の酸化還元電位に由来する問題であつ
て、本発明の干渉作用を抑制する物質や安定剤の
選定に関する本質とは直接関係しない。又、これ
までに述べた脱水素酵素、電子伝達体、電子受容
体への一連の反応を行い得る適切なPHは４〜10、
さらに好ましくは、６〜９の範囲である。以上の
条件を用いる時、Fe自身の安定性及び酸化状
態でのFeと鉄キレート剤間の安定性は飛躍的
に向上し、脱水素酵素、電子伝達体を介した一連
の還元発色反応においては、生体液由来の干渉反
応に殆ど影響されることなく目的成分の正確な測
定が可能となる。
る分光分析では、用いられる鉄キレート剤は、バ
ソフエナンスロリンやそのスルホン酸塩、或いは
２−（５−ブロモピリジルアゾ）−５−（Ｎ−プロ
ピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）アリニンナト
リウム塩（５−Br−PSAA）、３−（２−ピリジ
ル）−５，６−ビス（４−スルホフエニル）−１，
２，４−トリアジン２ナトリウム塩（PDTS）が
これらの干渉作用に対して最も有利であり、当該
の脱水素反応に影響なく円滑に反応を進ませ目的
成分以上の干渉作用を受けにくいものとして選ば
れるが、これはFeと鉄キレート剤との錯体に
おける固有の酸化還元電位に由来する問題であつ
て、本発明の干渉作用を抑制する物質や安定剤の
選定に関する本質とは直接関係しない。又、これ
までに述べた脱水素酵素、電子伝達体、電子受容
体への一連の反応を行い得る適切なPHは４〜10、
さらに好ましくは、６〜９の範囲である。以上の
条件を用いる時、Fe自身の安定性及び酸化状
態でのFeと鉄キレート剤間の安定性は飛躍的
に向上し、脱水素酵素、電子伝達体を介した一連
の還元発色反応においては、生体液由来の干渉反
応に殆ど影響されることなく目的成分の正確な測
定が可能となる。
微量成分である胆汁酸、クレアチン、クレアチ
ニンなどは、従来から前述の問題を有するホルマ
ザン発色法、抗体を使つた免疫学的手法や蛍光色
素を用いた方法により測定されているが、抗体の
特異性と反応性に関する品質管理上の難しさや、
蛍光光度計など特殊な機器が必要であつた。これ
らの先行技術に比較して、本発明は、既存の設備
を用いる中で最も高い感度と水溶性というホルマ
ザンには欠く性質を持つ、広く目的成分に関る脱
水素酵素反応に依存した実用的測定試薬を提供す
るものである。
ニンなどは、従来から前述の問題を有するホルマ
ザン発色法、抗体を使つた免疫学的手法や蛍光色
素を用いた方法により測定されているが、抗体の
特異性と反応性に関する品質管理上の難しさや、
蛍光光度計など特殊な機器が必要であつた。これ
らの先行技術に比較して、本発明は、既存の設備
を用いる中で最も高い感度と水溶性というホルマ
ザンには欠く性質を持つ、広く目的成分に関る脱
水素酵素反応に依存した実用的測定試薬を提供す
るものである。
「実施例」
以下に実施例によつてさらに詳しく説明する。
実施例 １
血清中の総胆汁酸の測定
１ 試薬
溶液 Ａ
10mM3−（２−ピリジル）−５，６−ビス（４
−スルホフエニル）−１，２，４−トリアジン２
ナトリウム塩（PDTS）、0.42Mロツシエル塩と
80μMメトキシ−フエナジンメトサルフエートを
含む0.1Mトリーエタノールアミン緩衝液PH7.0 溶液 Ｂ 0.55mM鉄ミヨウバン、37mMシユウ酸ナトリ
ウム、１％TritonX−100、リパーゼ400U／ml、
3α−ヒドロキシステロイド脱水素酵素0.4U／ml、
と6mM NADを含む0.1Mトリエタノールアミン
緩衝液PH7.0 溶液 Ｃ 3α−ヒドロキシステロイド脱水素酵素を除く
溶液Ｂと同様の試薬 溶液 Ｄ 1mMジエチレントリアミン５酢酸（DTPA）
を含む0.1M3，３−ジメチルグルタル酸緩衝液PH
6.0 ２ 操作方法 血清100μ、溶液A0.25mlを試験管にとり溶液
B0.25mlを加えて37℃で正確に10分間反応させた
後、ただちに溶液D1mlを添加して室温に戻す。
同時に溶液Ｂを溶液Ｃに代えて同様に操作したも
のを検体ブランクとして564nmの吸光度を測定す
る。次に血清検体と同一方法で処理した既知コー
ル酸ナトリウムの溶液によつて示される吸光度と
測定吸光度から検体ブランク吸光度を差し引いた
吸光度との比較によつて血清検体中の総胆汁酸濃
度を算出する。上記の諸条件下で第３図に示す如
く直線的な吸光度の応答が200μMの総胆汁酸の
レベルまで認められた。
−スルホフエニル）−１，２，４−トリアジン２
ナトリウム塩（PDTS）、0.42Mロツシエル塩と
80μMメトキシ−フエナジンメトサルフエートを
含む0.1Mトリーエタノールアミン緩衝液PH7.0 溶液 Ｂ 0.55mM鉄ミヨウバン、37mMシユウ酸ナトリ
ウム、１％TritonX−100、リパーゼ400U／ml、
3α−ヒドロキシステロイド脱水素酵素0.4U／ml、
と6mM NADを含む0.1Mトリエタノールアミン
緩衝液PH7.0 溶液 Ｃ 3α−ヒドロキシステロイド脱水素酵素を除く
溶液Ｂと同様の試薬 溶液 Ｄ 1mMジエチレントリアミン５酢酸（DTPA）
を含む0.1M3，３−ジメチルグルタル酸緩衝液PH
6.0 ２ 操作方法 血清100μ、溶液A0.25mlを試験管にとり溶液
B0.25mlを加えて37℃で正確に10分間反応させた
後、ただちに溶液D1mlを添加して室温に戻す。
同時に溶液Ｂを溶液Ｃに代えて同様に操作したも
のを検体ブランクとして564nmの吸光度を測定す
る。次に血清検体と同一方法で処理した既知コー
ル酸ナトリウムの溶液によつて示される吸光度と
測定吸光度から検体ブランク吸光度を差し引いた
吸光度との比較によつて血清検体中の総胆汁酸濃
度を算出する。上記の諸条件下で第３図に示す如
く直線的な吸光度の応答が200μMの総胆汁酸の
レベルまで認められた。
実施例 ２
血清中のクレアチンの測定
１ 試薬
溶液 Ａ
10mM3−（２−ピリジル）−５，６−ビス（４
−スルホフエニル）−１，２，４−トリアジン２
ナトリウム塩（PDTS）、0.42Mロツシエル塩と
80μMメトキシフエナジン−メトサルフエ−トを
含む0.1Mトリエタノールアミン緩衝液PH7.0 溶液 Ｂ 2.2mM鉄ミヨウバン、90mMシユウ酸、１％
Triton Ｘ−100、リパーゼ400U／ml、クレアチ
ナーゼ70U／ml、ザルコシン脱水素酵素30U／
ml、0.1％（Ｗ／Ｖ）牛アルブミンを含む0.1Mト
リエタノールアミン緩衝液PH7.0 溶液 Ｃ 50mMリン酸ナトリウム緩衝液PH7.0 ２ 操作方法 血清20μ、溶液A0.5mlを試験官にとり溶液
B0.5mlを加えて37℃で10分間反応させた後、た
だちに溶液C1mlを添加して室温に戻す。別に血
清を加えずに同様に操作したものを試薬ブランク
として564nmの吸光度を測定する。次に血清検体
のクレアチン含量を血清検体と同一方法で処理し
た既知クレアチン含量の溶液によつて示される吸
光度と測定吸光度との比較によつて算出する。上
記の諸条件下で第４図に示す如く直線的な吸光度
の応答が20mg／dlのクレアチンのレベルまで認め
られた。
−スルホフエニル）−１，２，４−トリアジン２
ナトリウム塩（PDTS）、0.42Mロツシエル塩と
80μMメトキシフエナジン−メトサルフエ−トを
含む0.1Mトリエタノールアミン緩衝液PH7.0 溶液 Ｂ 2.2mM鉄ミヨウバン、90mMシユウ酸、１％
Triton Ｘ−100、リパーゼ400U／ml、クレアチ
ナーゼ70U／ml、ザルコシン脱水素酵素30U／
ml、0.1％（Ｗ／Ｖ）牛アルブミンを含む0.1Mト
リエタノールアミン緩衝液PH7.0 溶液 Ｃ 50mMリン酸ナトリウム緩衝液PH7.0 ２ 操作方法 血清20μ、溶液A0.5mlを試験官にとり溶液
B0.5mlを加えて37℃で10分間反応させた後、た
だちに溶液C1mlを添加して室温に戻す。別に血
清を加えずに同様に操作したものを試薬ブランク
として564nmの吸光度を測定する。次に血清検体
のクレアチン含量を血清検体と同一方法で処理し
た既知クレアチン含量の溶液によつて示される吸
光度と測定吸光度との比較によつて算出する。上
記の諸条件下で第４図に示す如く直線的な吸光度
の応答が20mg／dlのクレアチンのレベルまで認め
られた。
「発明の効果」
以上から明らかな如く、本発明によれば電子伝
達体及び検出に要す電子受容体の存在下、遊離の
補酵素を必要とする脱水素酵素或いは、補酵素を
補欠分子族として保持する脱水素酵素を介する反
応により生成される電子を検出することによる生
体液中の成分の測定方法において、酒石酸或いは
そのアルカリ塩を用いることにより、当該反応以
外の干渉反応を著るしく抑制することができ、測
定を正確にしかもより簡便にすることができる。
達体及び検出に要す電子受容体の存在下、遊離の
補酵素を必要とする脱水素酵素或いは、補酵素を
補欠分子族として保持する脱水素酵素を介する反
応により生成される電子を検出することによる生
体液中の成分の測定方法において、酒石酸或いは
そのアルカリ塩を用いることにより、当該反応以
外の干渉反応を著るしく抑制することができ、測
定を正確にしかもより簡便にすることができる。
第１図は、酒石酸ナトリウムの血清由来干渉反
応に対する抑制効果を表すグラフ図であり、第２
図は、Feの安定性に及ぼすシユウ酸ナトリウ
ムとPHの影響を表すグラフ図であり、第３図は、
胆汁酸測定時の検量線を表すグラフ図であり、第
４図は、クレアチン測定時の検量線を表すグラフ
図である。
応に対する抑制効果を表すグラフ図であり、第２
図は、Feの安定性に及ぼすシユウ酸ナトリウ
ムとPHの影響を表すグラフ図であり、第３図は、
胆汁酸測定時の検量線を表すグラフ図であり、第
４図は、クレアチン測定時の検量線を表すグラフ
図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 電子伝達体及び検出に要する電子受容体の存
在下、遊離の補酵素を必要とする脱水素酵素或い
は、補酵素を補欠分子族として保持する脱水素酵
素を介する反応により生成される電子を検出する
ことによる生体液中の成分の測定方法において、
試料中に共存する還元性物質、脱水素酵素或いは
アルブミンによる当該反応以外の干渉反応を抑制
するために、試薬中に酒石酸或いはそのアルカリ
塩を添加して成ることを特徴とする生体液中の成
分の定量用試薬。 ２ 検出に要する電子受容体が第二鉄イオン
（Fe+++）及び発色性鉄キレート剤の組合せであ
り、さらにこれらを安定化する試薬としてシユウ
酸を加えることにより成る特許請求の範囲第１項
記載の生体液中の成分の定量用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14440884A JPS6125498A (ja) | 1984-07-13 | 1984-07-13 | 生体液中の成分の定量用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14440884A JPS6125498A (ja) | 1984-07-13 | 1984-07-13 | 生体液中の成分の定量用試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6125498A JPS6125498A (ja) | 1986-02-04 |
| JPH0534000B2 true JPH0534000B2 (ja) | 1993-05-20 |
Family
ID=15361476
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14440884A Granted JPS6125498A (ja) | 1984-07-13 | 1984-07-13 | 生体液中の成分の定量用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6125498A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0668490B2 (ja) * | 1987-02-17 | 1994-08-31 | 東洋紡績株式会社 | 生体試料中の還元物質の除去法 |
| CA2145406C (en) * | 1992-09-28 | 2005-04-05 | Chi-Neng Arthur Han | Stable reagent for ferric ion complex indicator systems |
-
1984
- 1984-07-13 JP JP14440884A patent/JPS6125498A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6125498A (ja) | 1986-02-04 |
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