JPH0534338A

JPH0534338A - 単核球分離管および単核球分離方法

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Publication number: JPH0534338A
Application number: JP3210252A
Authority: JP
Inventors: Yuichi Yamamoto; 雄一山本; Tomoharu Kaneki; 智晴金木
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 1991-07-26
Filing date: 1991-07-26
Publication date: 1993-02-09
Anticipated expiration: 2015-07-17
Also published as: JP3065727B2

Abstract

(57)【要約】単核球分離管および単核球分離方法［目的］ヒト末梢血より単核球を簡便かつ効率的に、し
かも赤血球を混入させることなく分離でき、細胞機能を
損なうことなく単核球を回収することを可能とする単核
球分離管および単核球分離方法を提供すること。［構成］遠心分離管２内に、比重が１．０６４〜１．０
７９ｇ／ｍｌに調整された高比重液層３と、当該高比重
液層を封入するよう積層され、２価カチオンによって水
不溶性とされたハイドロゲルを主成分とする不溶性ハイ
ドロゲル層４とを収納してなる遠心分離管および当該遠
心分離管を用いた遠心分離方法である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、単核球分離管および単
核球分離方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、抗
凝固処理された血液から、単核球（リンパ球および単核
大白血球）を簡便に純度よく分離、採取することが可能
な単核球分離管および単核球分離方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】免疫監視機構で重要な役割を担っている
リンパ球の機能や、そのサブセット（亜分画）の割合を
調べることは、各種疾患、特に免疫不全症や自己免疫疾
患の診断と病態の推移を知る上で重要である。また、骨
髄移植も含めた輸血や臓器移植の実施に際して、白血球
の型であるＨＬＡ（主要組織適合抗原）の適合性を検査
することは、移植後の拒絶反応あるいは副作用の抑制に
とって重要である。

【０００３】これらの検査において、さらに、腫瘍免疫
におけるリンパ球のキラー活性や、細胞間相互作用を解
析する上で、単核球の分離は必須な技術であり、そのた
めの簡便な用具、装置、方法の提供が望まれている。

【０００４】ヒトの末梢血から単核球を分離する最も一
般的な技術としては、５．７％ｗ／ｖのフィコール４０
０と、９．０％ｗ／ｖのSodium diatrizoateの水溶液
であって、比重（密度）が１．０７７ｇ／ｍｌに調整さ
れたフィコール・パック（Ficoll-Paque、登録商標、フ
ァルマシア・ファイン・ケミカルズ（Pharmacia FineCh
emicals)社製）を用いた遠心分離方法をあげることがで
きる。

【０００５】この方法は、下記の基本的な工程（１）〜
（４）からなる。（１）予め決められた量のフィコール
・パックを試験管の底に設置する工程、（２）そのまま
或いは希釈した血液試料を注意深くフィコール・パック
上にピペットで移す工程、（３）フィコール・パックの
比重よりも大きい比重を有する血液成分が、フィコール
・パック中に進むか、あるいはフィコール・パックを通
過するように、フィコール・パック血液調整物を４００
〜５００Ｇで約３０〜４０分間遠心分離する工程、
（４）ピペットでフィコール・パックの上方に分離され
た単核球層を採取する工程。

【０００６】しかしながら、この方法は次のような欠点
を有している。すなわち、最初に血液試料をピペットを
用いてフィコール・パック上に移すとき、白血球がもし
フィコール・パックの表面より下に広がった場合には、
フィコール・パックの比重が局部的に減少するという問
題を有している。従って、血液を移す際には、フィコー
ル・パックとの界面を乱さないように、血液を静かに重
層しなければならず、また、用時に必要量のフィコール
・パックを試験管内に設置しなければならず、操作が煩
雑であるという問題点を有するものであった。

【０００７】また、予め試験管内にフィコール・パック
を収容しておくことも考えられるが、高い流動性を有す
るため、界面形状が安定するまで試験管を静置してか
ら、血液を供給しなければならず、操作が非効率的であ
るという問題があった。

【０００８】この問題を解決するものとして、比重が
１．０７７ｇ／ｍｌに調整された高比重液を、チキソト
ロピー性を有する水不溶性ゲル状物質で封入した構成を
有する単核球分離管を用いた方法が開示されている（Ｕ
ＳＰ４．１９０．５３５号明細書）。

【０００９】しかしながら、この方法に用いられるゲル
状物質は水不溶性であるため、遠心操作後、赤血球およ
び顆粒球の一部がゲル状物質と試験管内壁との間に残存
し、このため単核球層を分離、採取する際に、赤血球お
よび顆粒球が混入する虞れが高くなるという問題を有す
るものであった。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、ヒ
ト末梢血より単核球を簡便かつ効率的に、しかも赤血球
を混入させることなく分離でき、細胞機能を損なうこと
なく単核球を回収することを可能とする単核球分離管お
よび単核球分離方法を提供することを目的とするもので
ある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】上記の目的は、以下に示
す本発明によって達成される。（１）遠心分離管内に、比重が１．０６４〜１．０７９
ｇ／ｍｌに調整された高比重液層と、当該高比重液層を
封入するよう積層され、２価カチオンによって水不溶性
とされたハイドロゲルを主成分とする不溶性ハイドロゲ
ル層とを収納してなることを特徴とする単核球分離管。（２）前記不溶性ハイドロゲル層中には、結合剤を含有
する前記（１）記載の単核球分離管（３）遠心分離管内に、比重が１．０６４〜１．０７９
ｇ／ｍｌに調整された高比重液層を収容し、さらに当該
高比重液層を封入するように、２価カチオンによって水
不溶性とされたハイドロゲルを主成分する不溶性ハイド
ロゲル層を積層する工程と、血液を採取し、得られた血
液を前記２価カチオンと錯体を形成する結合成分を含む
抗凝固剤で抗凝固処理する工程と、前記抗凝固剤を含む
血液を前記遠心分離管内に供給する工程と、供給された
血液に遠心処理を施し、前記抗凝固剤中の結合成分の作
用により前記ハイドロゲルを水不溶性から水溶性に変化
させて、前記高比重液層を血液と接触可能とすると同時
に、供給された血液を、血漿および血小板よりなる第１
層と、単核球よりなる第２層と、赤血球および顆粒球よ
りなる第３層と、当該第２層と第３層との間に位置せし
められた高比重液層とに分離する工程と、前記工程にて
分離された第２層を採取する工程よりなる単核球分離方
法。

【００１２】以下、本発明を図１ないし図５を参照して
詳細に説明する。

【００１３】図１は、本発明における単核球分離管の構
造を示す断面図である。

【００１４】本発明の単核球分離管１は、片端が閉塞し
た遠心分離管２内に、比重が１．０６４〜１．０７９ｇ
／ｍｌに調整された高比重液層３と、当該高比重液層を
封入するよう積層され、２価カチオンによって水不溶性
とされたハイドロゲルを主成分とする不溶性ハイドロゲ
ル層４とを収納してなるものである。

【００１５】本発明において、水不溶性ハイドロゲル層
４を構成するゲル前駆体成分としては、２価カチオンに
よって架橋、水不溶性され得るものであれば特に限定さ
れず、具体的には、錯体形成物質やポリアニオンを挙げ
ることができる。それらの中でも、分子量が大きいため
に膠質浸透圧の変化を起こし難く、血液中の細胞に悪影
響を与えない多糖が好ましい。

【００１６】多糖は、多数の単糖がグリコシド結合によ
って脱水縮合した高分子化合物の総称であり、酸によっ
て加水分解されて多数の、かつ一般に不定数の多糖、単
糖を生成する。これらの多糖のなかで、２価カチオンと
結合して不溶性ハイドロゲルを形成するものとしては、
グリクロナン（ポリウロン酸）を挙げることができる。
グリクロナンとしては、ペクチン酸、アルギン酸、プロ
ツベリン酸等が知られているが、そのなかでも、２価カ
チオンの作用によって容易に不溶性ハイドロゲルを形成
することができ、しかもそのゲル強度の高いアルギン酸
を使用することが好ましい。

【００１７】グリクロナンと結合して水不溶性ハイドロ
ゲルを形成する２価カチオンとしては、ジアミン類、ポ
リアミノ酸等の有機２価カチオンや、アルカリ土類金
属、遷移金属等の無機２価カチオンをあげることができ
る。そのなかでも、グリクロナンとの結合速度が早く、
かつ結合が強固で、得られるゲルの透明性に優れたカル
シウムイオンや亜鉛イオンが好適である。

【００１８】水不溶性ハイドロゲル層４を構成するゲル
前駆体成分および２価カチオンの組み合わせは、上記の
ものに限定されず、通常は水不溶性であって、後述する
抗凝固剤中の結合成分の作用によって水溶性となるもの
ならば、特に限定されるものではない。

【００１９】水不溶性ハイドロゲル層４中には、さらに
結合剤を含むことが好ましい。この結合剤の作用によ
り、容器内壁への付着性が高まり、運搬時の振動に対し
てもゲルの形状を好適に保持することができる。さら
に、血液をゲル上に重層する際にも、ゲルの界面が乱れ
ることが少ないため、効率的に単核球分離操作が行え
る。結合剤としては、ポリビニルピロリドン、ポリビニ
ルアルコール、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキ
シプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセル
ロース、ビニルアセテート、結晶セルロース、ヒドロキ
シプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロース等の
合成、半合成高分子化合物や、デキストリン、ゼラチ
ン、アラビアゴム、トラガントゴム、デンプン等の天然
高分子化合物を使用できる。このなかでも、容器内壁へ
の接着性とゲル形成保持能の点から、ヒドロキシエチル
セルロースとカルボキシメチルセルロースが特に好まし
い。

【００２０】このようなハイドロゲル層４の下方には、
高比重液層３が封入されている。

【００２１】この高比重液層３を構成する高比重液は、
デキストラン、アラビアゴム、アルブミンなどの低比重
成分と、粘度、シリカ粉末等の無機物、又はトリヨード
安息香酸誘導体等の有機物からなる高比重成分を所定割
合で配合し、比重を１．０６４〜１．０７９ｇ／ｍｌに
調整したものである。

【００２２】高比重成分としては、比重が大きく、高濃
度でも溶液の粘度が低く、浸透圧も比較的低い、トリヨ
ード安息香酸誘導体が特に好ましい。

【００２３】この高比重液としては、前述のフィコール
・パックを使用できる。

【００２４】本発明の単核球分離管１を構成する遠心分
離管２としては、４００〜３０００Ｇの遠心加速度に耐
えられ、内部が密閉可能な構造であれば特に限定されな
い。具体的には、図１に示すように、片端が閉塞し、他
端が穿刺可能な栓体５で無菌的に密封された構造を呈
し、湿熱滅菌、放射線滅菌、化学滅菌のいずれかの滅菌
操作により内部の滅菌が維持されたものであることが望
まれる。材質としては、ガラス、ポリエチレン、ポリプ
ロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチ
ルメタクリレート等を使用することができるが、各種滅
菌方法が適用可能なポリプロピレン、ポリカーボネート
が特に好ましい。また、前記栓体５の代わりに、ある程
度の強度を有する菌不透過性膜を用いてもよい。

【００２５】次に、本発明の単核球分離方法について図
２ないし図５を参照して説明する。図２ないし図５は、
本発明の単核球分離方法の概略を示す図である。

【００２６】まず、片端が閉塞し、他端が穿刺可能な栓
体５で封止された遠心分離管内２に、比重が１．０６４
〜１．０７９ｇ／ｍｌに調整された高比重液３を収容
し、この高比重液３上に、後述する水不溶性ハイドロゲ
ル形成の足場となる板状担体（図示しない）を載置す
る。この板状担体としては、ポリプロピレン等の樹脂製
の薄膜に２価カチオンを担持させた濾紙を積層した構造
のものが好適に使用される。

【００２７】次いで、この板状担体上に、前記の水不溶
性ハイドロゲル前駆体成分と結合剤を含む溶液を重層
し、さらに２価カチオンを含む溶液を添加、接触させ
て、不溶性ハイドロゲル層４を形成し、単核球分離管１
を作製する。

【００２８】一方、予め抗凝固剤が封入されたシリンジ
７等で血液６を採取し、これを単核球分離管内に供給す
る（図２）。抗凝固剤としては、不溶性ハイドロゲルに
添加された２価カチオンと錯体を形成する結合成分を含
むものであり、具体的には、ＡＣＤ液、ＡＣＤ−Ａ液、
ＣＰＤ液、ＥＤＴＡ液などを使用することができる。

【００２９】次いで、前述のようにして血液６が供給さ
れた単核球分離管１を、１５〜３０℃程度において、４
００〜２０００Ｇの遠心加速度で、１０〜４０分間程度
遠心操作を行う。この遠心操作により、前記抗凝固剤中
の結合成分が、前記ハイドロゲル中の２価カチオンと錯
体を形成し、これによりハイドロゲルが水不溶性から水
溶性に変化する。こうしてハイドロゲルが可溶性となる
と、前記高比重液層３が血液６と接触可能となり、それ
と同時に供給された血液６が、血漿および血小板よりな
る第１層８と、単核球よりなる第２層９と、赤血球およ
び顆粒球よりなる第３層１０と、当該第２層と第３層と
の間に位置せしめられた高比重液層３とに分離される
（図３）。

【００３０】このとき、水溶性となったハイドロゲルの
ほとんどは、第１層８中に混入する。また、板状担体
は、最下方に沈降する。

【００３１】このようにして遠心分離を行った後、血漿
および血小板よりなる第１層８を吸引管１１等を用いて
吸引、除去してスピッツ管（図示せず）等に移注する
（図４）。続いて、ピペット１２等を用いて、別のスピ
ッツ管（図示せず）に単核球よりなる第２層９を採取す
る（図５）。そして、採取された単核球は、リン酸緩衝
化平衡塩溶液や細胞培養液などを用いて洗浄され、検査
等に使用される。

【００３２】次に、実施例を示して本発明をさらに詳細
に説明する。

【００３３】

【実施例】

［実施例１］ポリスチレン製スピッツ管にフィコール・
パック溶液（Ficoll-Paque、登録商標、ファルマシア・
ファイン・ケミカルズ製）１ｍｌを入れ、その上にポリ
プロピレン製円形薄膜と、０．５Ｍ硫酸亜鉛溶液をしみ
こませた円形濾紙を、この順に載置した。さらに、この
上に、１％ｗ／ｖアルギン酸ナトリウムと、１％ｗ／ｖ
ヒドロキシエチルセルロースの混合溶液０．１５ｍｌを
重層し、その上から０．５Ｍ硫酸亜鉛溶液１５μｌを添
加して、ハイドロゲルが十分に形成されるまで、室温下
に放置した。

【００３４】こうして作成された単核球分離管に、抗凝
固剤としてＣＰＤ液を添加して採取した末梢血２ｍｌを
供給し、４００Ｇで３０分間遠心操作を施した。そし
て、遠心操作によって分離された血漿・血小板層をピペ
ットで吸い取って除いた後、スピッツ管に単核球層を採
取し、１％ｗ／ｖアルブミン溶液を含むリン酸緩衝化平
衡塩溶液（Ａ−ＰＢＳ）を添加し、１２００Ｇで遠心分
離した。上清を捨て、血球をＡ−ＰＢＳに懸濁させた
後、７００Ｇで再び遠心分離し、上清の１部分を捨て
て、１ｍｌの細胞懸濁液とした。

【００３５】この細胞懸濁液中の各血球数を、多項目自
動血液分析装置（東亜医用電子社製ＳｙｓｍｅｘＮＥ
−６０００）によって算定し、単核球分離前の血液中の
血球数と比較することにより、血球回収率を算出した。
その結果を表１に示す。

【００３６】［実施例２］１％ｗ／ｖアルギン酸ナトリ
ウムと１％ｗ／ｖヒドロキシエチルセルロースの混合溶
液を用いる代わりに、１％ｗ／ｖアルギン酸ナトリウム
と１％ｗ／ｖカルボキシメチルセルロースの混合溶液を
使用する以外は、実施例１と同様にして単核球を分離
し、各血球数の回収率を算出した。その結果を表１に示
す。

【００３７】［実施例３］４００Ｇ・３０分間の遠心分
離条件を、１６００Ｇ・１５分間に変更する以外は、実
施例１と同様にして単核球を分離し、各血球の回収率を
算出した。その結果を表１に示す。

【００３８】［実施例４］４００Ｇ・３０分間の遠心分
離条件を、１６００Ｇ・１５分間に変更する以外は、実
施例２と同様にして単核球を分離し、各血球の回収率を
算出した。その結果を表１に示す。

【００３９】［比較例１］ポリスチレン製スピッツ管
に、フィコール・パック溶液２ｍｌを入れ、その上にＣ
ＰＤ加末梢血２ｍｌを静かに重層し、４００Ｇで３０分
間遠心分離した。その後の操作は、実施例１と同様にし
て単核球を分離し、各血球の回収率を算出した。その結
果を表１に示す。

【００４０】［比較例２］４００Ｇ・３０分間の遠心分
離条件を、１６００Ｇ・１５分間に変更する以外は、比
較例１と同様にして単核球を分離し、各血球の回収率を
算出した。その結果を表１に示す。

【表１】

【００４０】表１より、本発明の単核球分離管を用いる
ことにより、赤血球、血小板の混入率の低い単核球を採
取することができることが確認された。また、本発明の
単核球分離管は、比較例の単核球分離管のように、血液
を静かに重層するという操作上の煩わしさがなく、簡便
に使用できるものであった。

【００４１】［比較例３］ＵＳＰ４．１９０．５３５号
明細書記載の単核球分離管（商品名リューコプレップ、
ベクトンデイキンソンアンドカンパニー社製）を
用い、これにＣＰＤ加末梢血２ｍｌを供給し、１６００
Ｇ・１５分間遠心分離した。その後、遠心操作によって
分離された血漿・血小板層をピペットで吸い取って除い
た後、単核球層をピペットにて採取しようとしたとこ
ろ、チキソトロピーゲル上部と分離管内壁の間に赤血球
および顆粒球が残存していたため、これらが単核球に混
入してしまい、精度よい分離が困難であった。

【００４２】

【発明の効果】以上、詳述したように、本発明の単核球
分離管は、遠心分離管内に、比重が１．０６４〜１．０
７９ｇ／ｍｌに調整された高比重液層と、当該高比重液
層を封入するよう積層され、２価カチオンによって水不
溶性とされたハイドロゲルを主成分とする不溶性ハイド
ロゲル層とを収納してなることを特徴とするものである
から、ヒト末梢血より単核球を簡便かつ効率的に、しか
も赤血球を混入させることなく分離でき、細胞機能を損
なうことなく単核球を回収することが可能である。従っ
て、本発明の単核球分離管は、免疫学的基礎研究やＨＬ
Ａの適合性検査、リンパ球の機能検査等において、有効
に適用することができる。

【００４３】また、本発明の単核球分離方法は、遠心分
離管内に、比重が１．０６４〜１．０７９ｇ／ｍｌに調
整された高比重液層を収容し、さらに当該高比重液層を
封入するように、２価カチオンによって水不溶性とされ
たハイドロゲルを主成分する不溶性ハイドロゲル層を積
層する工程と、血液を採取し、得られた血液を前記２価
カチオンと錯体を形成する結合成分を含む抗凝固剤で抗
凝固処理する工程と、前記抗凝固剤を含む血液を前記遠
心分離管内に供給する工程と、供給された血液に遠心処
理を施し、前記抗凝固剤中の結合成分の作用により前記
ハイドロゲルを水不溶性から水溶性に変化させて、前記
高比重液層を血液と接触可能とすると同時に、供給され
た血液を、血漿および血小板からなる第１層と、単核球
よりなる第２層と、赤血球および顆粒球よりなる第３層
と、当該第２層と第３層との間に位置せしめられた高比
重液層とに分離する工程と、前記工程にて分離された第
２層を採取する工程よりなるものであるから、ヒト末梢
血より単核球を簡便かつ効率的に、しかも赤血球を混入
させることなく分離でき、細胞機能を損なうことなく単
核球を回収することが可能である。従って、本発明の単
核球分離方法は、免疫学的基礎研究やＨＬＡの適合性検
査、リンパ球の機能検査等において、有効に適用するこ
とができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の単核球分離管の構造を示す図である。

【図２】本発明の単核球分離方法の概略を示す図であ
る。

【図３】本発明の単核球分離方法の概略を示す図であ
る。

【図４】本発明の単核球分離方法の概略を示す図であ
る。

【図５】本発明の単核球分離方法の概略を示す図であ
る。

【符号の説明】

１単核球分離管２遠心分離管３高比重液４水不溶性ハイドロゲル５栓体６血液７シリンジ８血漿および血小板層９単核球層１０赤血球および顆粒球層１１吸引管１２ピペット

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】遠心分離管内に、比重が１．０６４〜
１．０７９ｇ／ｍｌに調整された高比重液層と、当該高
比重液層を封入するよう積層され、２価カチオンによっ
て水不溶性とされたハイドロゲルを主成分とする不溶性
ハイドロゲル層とを収納してなることを特徴とする単核
球分離管。
【請求項２】前記不溶性ハイドロゲル層中には、結合
剤を含有する請求項１記載の単核球分離管
【請求項３】遠心分離管内に、比重が１．０６４〜
１．０７９ｇ／ｍｌに調整された高比重液層を収容し、
さらに当該高比重液層を封入するように、２価カチオン
によって水不溶性とされたハイドロゲルを主成分する不
溶性ハイドロゲル層を積層する工程と、血液を採取し、得られた血液を前記２価カチオンと錯体
を形成する結合成分を含む抗凝固剤で抗凝固処理する工
程と、前記抗凝固剤を含む血液を前記遠心分離管内に供給する
工程と、供給された血液に遠心処理を施し、前記抗凝固剤中の結
合成分の作用により前記ハイドロゲルを水不溶性から水
溶性に変化させて、前記高比重液層を血液と接触可能と
すると同時に、供給された血液を、血漿および血小板よ
りなる第１層と、単核球よりなる第２層と、赤血球およ
び顆粒球よりなる第３層と、当該第２層と第３層との間
に位置せしめられた高比重液層とに分離する工程と、前記工程にて分離された第２層を採取する工程よりなる
単核球分離方法。