JPH05344894A - ミコバクテリウム・ツベルクロシス（ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ）の ３８ ｋＤａ 抗原発現用のハイブリッドプラスミド、ハイブリッドプラスミドの宿主としてのエシエリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、 ３８ ｋＤａ 抗原及び約 ３３ ｋＤａ の大きさのタンパク質 - Google Patents
ミコバクテリウム・ツベルクロシス（ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ）の ３８ ｋＤａ 抗原発現用のハイブリッドプラスミド、ハイブリッドプラスミドの宿主としてのエシエリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、 ３８ ｋＤａ 抗原及び約 ３３ ｋＤａ の大きさのタンパク質Info
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- JPH05344894A JPH05344894A JP4149895A JP14989592A JPH05344894A JP H05344894 A JPH05344894 A JP H05344894A JP 4149895 A JP4149895 A JP 4149895A JP 14989592 A JP14989592 A JP 14989592A JP H05344894 A JPH05344894 A JP H05344894A
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- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【構成】 ミコバクテリウム・ツベルクロシス(Mycobac
terium tuberculosis)の融合していない 38 kDa 抗原を
エシエリキア・コリ(Escherichia coli)に発現するため
のハイブリッドプラスミド、該ハイブリッドプラスミド
の宿主としてのエシエリキア・コリ(Escherichia col
i)、発現された 38 kDa 抗原及び約 33 kDa の大きさの
タンパク質およびその製造方法。 【効果】 グラム陽性菌ミコバクテリウム・ツベルクロ
シスH37Rv の 38 kDa タンパク質は免疫性のある抗原
で、診断及びワクチンの開発に利用可能と見なされる。
この可能性を確認するには大量の精製された本タンパク
質を必要とするが、上述の方法により容易に提供され
る。
terium tuberculosis)の融合していない 38 kDa 抗原を
エシエリキア・コリ(Escherichia coli)に発現するため
のハイブリッドプラスミド、該ハイブリッドプラスミド
の宿主としてのエシエリキア・コリ(Escherichia col
i)、発現された 38 kDa 抗原及び約 33 kDa の大きさの
タンパク質およびその製造方法。 【効果】 グラム陽性菌ミコバクテリウム・ツベルクロ
シスH37Rv の 38 kDa タンパク質は免疫性のある抗原
で、診断及びワクチンの開発に利用可能と見なされる。
この可能性を確認するには大量の精製された本タンパク
質を必要とするが、上述の方法により容易に提供され
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ミコバクテリウム・ツ
ベルクロシス（Mycobacterium tuberculosis）の融合し
ていない 38 kDa 抗原をエシエリキア・コリに発現する
ためのハイブッリドプラスミド、該ハイブリッドプラス
ミドの宿主としてのエシエリキア・コリ（Escherichia
coli）、38 kDa抗原及び約 33 kDa の大きさのタンパク
質に関する。
ベルクロシス（Mycobacterium tuberculosis）の融合し
ていない 38 kDa 抗原をエシエリキア・コリに発現する
ためのハイブッリドプラスミド、該ハイブリッドプラス
ミドの宿主としてのエシエリキア・コリ（Escherichia
coli）、38 kDa抗原及び約 33 kDa の大きさのタンパク
質に関する。
【０００２】
【発明の背景】結核症は人類にとって非常に感染し易い
伝染病であり、毎年三百万人の犠牲者と八百万人の新患
者をもたらしている。エイズの出現により免疫の効果の
あった患者の休止していたミコバクテリウム・ツベルク
ロシス（Mycobacterium tuberculosis ）が活発になる
ために、状況は更に悪化しているようである。結核症の
場合感染に必要な量は極めて少なく、肺の中で初期変化
をひき起こすには１個乃至３個の結核菌で充分である。
この病気の疫学、予防措置、蔓延に対しては感染した患
者の診断が非常に重要である。現在咯痰からのミコバク
テリウム・ツベルクロシスの培養を基にして診断を行っ
ているが、菌の成長が遅いため約６週間を必要とする。
もう一つの重要な診断の方法として『ツベルクリン検
定』がある。ツベルクリン又はその精製したタンパク質
誘導体(PPD) は、加熱殺菌したミコバクテリウム・ツベ
ルクロシスの培養濾液からのタンパク質混合物である。
この検定には、他のミコバクテリアに感染したか或いは
それに対して予防接種された個人に於ける交差反応があ
るために、非特異性が高い。従って、限定された特異性
のある結核症の血清学的診断用及び皮膚試験用の試薬の
開発が緊急の課題である。
伝染病であり、毎年三百万人の犠牲者と八百万人の新患
者をもたらしている。エイズの出現により免疫の効果の
あった患者の休止していたミコバクテリウム・ツベルク
ロシス（Mycobacterium tuberculosis ）が活発になる
ために、状況は更に悪化しているようである。結核症の
場合感染に必要な量は極めて少なく、肺の中で初期変化
をひき起こすには１個乃至３個の結核菌で充分である。
この病気の疫学、予防措置、蔓延に対しては感染した患
者の診断が非常に重要である。現在咯痰からのミコバク
テリウム・ツベルクロシスの培養を基にして診断を行っ
ているが、菌の成長が遅いため約６週間を必要とする。
もう一つの重要な診断の方法として『ツベルクリン検
定』がある。ツベルクリン又はその精製したタンパク質
誘導体(PPD) は、加熱殺菌したミコバクテリウム・ツベ
ルクロシスの培養濾液からのタンパク質混合物である。
この検定には、他のミコバクテリアに感染したか或いは
それに対して予防接種された個人に於ける交差反応があ
るために、非特異性が高い。従って、限定された特異性
のある結核症の血清学的診断用及び皮膚試験用の試薬の
開発が緊急の課題である。
【０００３】血清学的研究の結果、ミコバクテリウム・
ツベルクロシスの 38 kDa 抗原が、ミコバクテリウム・
ツベルクロシスのビルエント菌株に対して特異的に作用
する免疫性のエピトープを有することが判った。この抗
原は、ウシの結核菌ミコバクテリウム・ボビス（ M. bo
vis ）のアビルエント誘導体であるワクチン菌種BCGの
中に少量生産される。従って、血清学的方法に基づい
て、ミコバクテリウム・ツベルクロシス複合体の生物体
と他のミコバクテリアとを区別するために、この抗原を
使用することが可能である。生の 38 kDa 抗原を直接ミ
コバクテリウム・ツベルクロシスから精製するのは、収
率が低く、成長が遅く、本生物体のビルエント性のため
実施不可能である
ツベルクロシスの 38 kDa 抗原が、ミコバクテリウム・
ツベルクロシスのビルエント菌株に対して特異的に作用
する免疫性のエピトープを有することが判った。この抗
原は、ウシの結核菌ミコバクテリウム・ボビス（ M. bo
vis ）のアビルエント誘導体であるワクチン菌種BCGの
中に少量生産される。従って、血清学的方法に基づい
て、ミコバクテリウム・ツベルクロシス複合体の生物体
と他のミコバクテリアとを区別するために、この抗原を
使用することが可能である。生の 38 kDa 抗原を直接ミ
コバクテリウム・ツベルクロシスから精製するのは、収
率が低く、成長が遅く、本生物体のビルエント性のため
実施不可能である
【０００４】前述のようにミコバクテリウム・ツベルク
ロシスは、人類にとって広く蔓延した病気の一つであ
り、毎年約三百万人の生命を奪う結核症の病原体であ
る。このミコバクテリアの研究の重要な目的は、更に有
効なワクチンにより結核症に対する免疫を作ること並び
に皮膚試験用／血清診断用の特異性のある試薬を開発す
ることにある。この目的を達成する前提条件として、個
々のミコバクテリアの抗原の免疫学的機能を特徴づけ、
詳細に評価する必要がある。それには充分の量の抗原を
必要とする。抗原をミコバクテリウム・ツベルクロシス
から直接精製することは、細胞収率が僅かであり、本生
物体のビルレント性のために困難である (10、26) 。こ
の問題を解決する方法として生物工学的に利用できる生
物体、例えばエシエリキア・コリの中に組換え体抗原を
生産する方法がある。
ロシスは、人類にとって広く蔓延した病気の一つであ
り、毎年約三百万人の生命を奪う結核症の病原体であ
る。このミコバクテリアの研究の重要な目的は、更に有
効なワクチンにより結核症に対する免疫を作ること並び
に皮膚試験用／血清診断用の特異性のある試薬を開発す
ることにある。この目的を達成する前提条件として、個
々のミコバクテリアの抗原の免疫学的機能を特徴づけ、
詳細に評価する必要がある。それには充分の量の抗原を
必要とする。抗原をミコバクテリウム・ツベルクロシス
から直接精製することは、細胞収率が僅かであり、本生
物体のビルレント性のために困難である (10、26) 。こ
の問題を解決する方法として生物工学的に利用できる生
物体、例えばエシエリキア・コリの中に組換え体抗原を
生産する方法がある。
【０００５】ミコバクテリウム・ツベルクロシスからの
38 kDa-抗原タンパク質が免疫学的、並びに診断学的に
重要で有ることは既に指摘されている (2, 26)。本タン
パク質は種特異性のＢ細胞エピトープ(2) とＴ細胞とを
含み、後者は免疫にしたマウス、モルモット又はヒトか
ら分離され、抗原の存在下で培養すれば増殖する (10,
24, 26) 。アクティブな結核症に罹った多くの人々（特
にHLA type DR2の人々) には 38 kDa-抗原に対する抗体
が生産される (4)。
38 kDa-抗原タンパク質が免疫学的、並びに診断学的に
重要で有ることは既に指摘されている (2, 26)。本タン
パク質は種特異性のＢ細胞エピトープ(2) とＴ細胞とを
含み、後者は免疫にしたマウス、モルモット又はヒトか
ら分離され、抗原の存在下で培養すれば増殖する (10,
24, 26) 。アクティブな結核症に罹った多くの人々（特
にHLA type DR2の人々) には 38 kDa-抗原に対する抗体
が生産される (4)。
【０００６】
【発明が解決しようとする問題点】グラム陽性菌ミコバ
クテリウム・ツベルクロシスH37Rv の 38 kDa タンパク
質は免疫性のある抗原で、診断及びワクチンの開発に利
用可能と見なされる。この可能性を確認するには大量の
精製された本タンパク質を必要とするが、これをミコバ
クテリウム・ツベルクロシス自体から取得しなければな
らないとすれば、それは不可能ではないとしても非常に
困難である。
クテリウム・ツベルクロシスH37Rv の 38 kDa タンパク
質は免疫性のある抗原で、診断及びワクチンの開発に利
用可能と見なされる。この可能性を確認するには大量の
精製された本タンパク質を必要とするが、これをミコバ
クテリウム・ツベルクロシス自体から取得しなければな
らないとすれば、それは不可能ではないとしても非常に
困難である。
【０００７】
【問題を解決するための手段】本発明の一つの実施態様
は、ミコバクテリウム・ツベルクロシスの融合していな
い 38 kDa 抗原をエシエリキア・コリに発現するための
ハイブリッドプラスミドを提供する。このプラスミドは − 38 kDa抗原 (プレタンパク質) のシグナル配列と − その認識配列の中に、読み取り方向で最初のアミノ
酸Ｍをコードする３塩基連鎖ATG を含む１個の制限部位
とを含む。
は、ミコバクテリウム・ツベルクロシスの融合していな
い 38 kDa 抗原をエシエリキア・コリに発現するための
ハイブリッドプラスミドを提供する。このプラスミドは − 38 kDa抗原 (プレタンパク質) のシグナル配列と − その認識配列の中に、読み取り方向で最初のアミノ
酸Ｍをコードする３塩基連鎖ATG を含む１個の制限部位
とを含む。
【０００８】このハイブリッドプラスミドは、前記 38
kDa 抗原が野性型ミコバクテリウム・ツベルクロシス或
いは同様に結核症を惹起し得る一種の変異型ミコバクテ
リウム・ツベルクロシスのいずれかの一種のタンパク質
で有ることを特徴とすることができる。
kDa 抗原が野性型ミコバクテリウム・ツベルクロシス或
いは同様に結核症を惹起し得る一種の変異型ミコバクテ
リウム・ツベルクロシスのいずれかの一種のタンパク質
で有ることを特徴とすることができる。
【０００９】本発明のハイブリッドプラスミドは更に、
前記シグナル配列が 17, 18, 19,20, 21, 22, 23 又は
24 個のコドンを含むことを特徴とするものであっても
よい。
前記シグナル配列が 17, 18, 19,20, 21, 22, 23 又は
24 個のコドンを含むことを特徴とするものであっても
よい。
【００１０】本発明のハイブリッドプラスミドは更に、
前記Ｎ末端の 38 kDa 抗原 (プレタンパク質) をコード
するDNA-配列が原料べクター、例えば pJLA603の１個の
NcoI-部位、Nde I-部位又は SphＩ- 部位に挿入してあ
ることを特徴とするものであってもよい。
前記Ｎ末端の 38 kDa 抗原 (プレタンパク質) をコード
するDNA-配列が原料べクター、例えば pJLA603の１個の
NcoI-部位、Nde I-部位又は SphＩ- 部位に挿入してあ
ることを特徴とするものであってもよい。
【００１１】本発明のハイブリッドプラスミドは更に、
前記 38 kDa 抗原 (プレタンパク質) をコードする、図
1A又は図1Cの１個のDNA-配列を特徴とするものであって
もよい。
前記 38 kDa 抗原 (プレタンパク質) をコードする、図
1A又は図1Cの１個のDNA-配列を特徴とするものであって
もよい。
【００１２】本発明のもう一つの実施態様によれば本発
明は、本発明のいずれかのハイブリッドプラスミドを有
するエシエリキア・コリに関する。
明は、本発明のいずれかのハイブリッドプラスミドを有
するエシエリキア・コリに関する。
【００１３】本発明のもう一つの実施態様によれば本発
明は、シグナル配列が 17 乃至 24個のコドンを含み、
その際23個のコドンを含む１個のシグナル配列が除去さ
れている、本発明のエシエリキア・コリを用いて生産可
能の、ミコバクテリウム・ツベルクロシスの 38 kDa 抗
原 (プレタンパク質) に関する。
明は、シグナル配列が 17 乃至 24個のコドンを含み、
その際23個のコドンを含む１個のシグナル配列が除去さ
れている、本発明のエシエリキア・コリを用いて生産可
能の、ミコバクテリウム・ツベルクロシスの 38 kDa 抗
原 (プレタンパク質) に関する。
【００１４】この 38 kDa 抗原 (プレタンパク質) は、
次のシグナル配列、 ＭＫＩＲＬＨＴＬＬＡＶＬＴＡＡＰＬＬＬＡＡＡＧ の内の 22 乃至 17 個のアミノ酸、例えば第１(M) と第
８(L) から第23(G) までのアミノ酸を特徴とすることが
できる。
次のシグナル配列、 ＭＫＩＲＬＨＴＬＬＡＶＬＴＡＡＰＬＬＬＡＡＡＧ の内の 22 乃至 17 個のアミノ酸、例えば第１(M) と第
８(L) から第23(G) までのアミノ酸を特徴とすることが
できる。
【００１５】本発明のもう一つの実施態様によれば本発
明は、発現プラスミドとしての pJLA603の宿主としての
エシエリキア・コリを用いて取得可能の、次の特性を有
する約 33 kDa の大きさのタンパク質に関する。 − ミコバクテリウム・ツベルクロシスのＮ末端の 38
kDa 抗原 (プレタンパク質) をコードする １個のDN
A-配列が pJLA603の１個の Ncol-部位、 NdeＩ- 部位又
は SphＩ- 部位 に挿入してあり、 − この挿入したDNA-配列が抗原のシグナル配列を含
み、 − 前記部位の認識配列が読み取り方向で最初のアミノ
酸Ｍをコードする３塩基連鎖ATG を含み、且つ − 約 33 kDa の大きさの前記タンパク質が、場合によ
っては同様に発現した38 kDa 抗原から分離されてい
る。
明は、発現プラスミドとしての pJLA603の宿主としての
エシエリキア・コリを用いて取得可能の、次の特性を有
する約 33 kDa の大きさのタンパク質に関する。 − ミコバクテリウム・ツベルクロシスのＮ末端の 38
kDa 抗原 (プレタンパク質) をコードする １個のDN
A-配列が pJLA603の１個の Ncol-部位、 NdeＩ- 部位又
は SphＩ- 部位 に挿入してあり、 − この挿入したDNA-配列が抗原のシグナル配列を含
み、 − 前記部位の認識配列が読み取り方向で最初のアミノ
酸Ｍをコードする３塩基連鎖ATG を含み、且つ − 約 33 kDa の大きさの前記タンパク質が、場合によ
っては同様に発現した38 kDa 抗原から分離されてい
る。
【００１６】本発明のもう一つの実施態様によれば本発
明は、ミコバクテリウム・ツベルクロシスのＮ末端の38
kDa抗原 (プレタンパク質) に対してシグナル配列とさ
らに24 個のアミノ酸だけ欠如していることを特徴とす
る約 33 kDa の大きさのタンパク質に関する。
明は、ミコバクテリウム・ツベルクロシスのＮ末端の38
kDa抗原 (プレタンパク質) に対してシグナル配列とさ
らに24 個のアミノ酸だけ欠如していることを特徴とす
る約 33 kDa の大きさのタンパク質に関する。
【００１７】本発明のもう一つの実施態様によれば本発
明は、本発明のエシエリキア・コリを用いて生産され、
且つ次の方法で復元されるミコバクテリウム・ツベルク
ロシスの 38 kDa 抗原及び／又は約 33 kDa の大きさの
タンパク質に関する。 − 封入体として生成する抗原及び／又はタンパク質を
（場合によっては１種の還元剤の存在下で）塩酸グアニ
ジンに可溶性とし、 − 次にセファデックス・クロマトグラフィーにより復
元する。
明は、本発明のエシエリキア・コリを用いて生産され、
且つ次の方法で復元されるミコバクテリウム・ツベルク
ロシスの 38 kDa 抗原及び／又は約 33 kDa の大きさの
タンパク質に関する。 − 封入体として生成する抗原及び／又はタンパク質を
（場合によっては１種の還元剤の存在下で）塩酸グアニ
ジンに可溶性とし、 − 次にセファデックス・クロマトグラフィーにより復
元する。
【００１８】この 38 kDa 抗原及び／又は約 33 kDa の
大きさのタンパク質は、 − 可溶化の際に約６Ｍの塩酸グアニジンを用い、及び
／又はジチオトレイトール（DTT) の存在下で処理し、
及び／又は − 復元をセファデックス G-25 を用いて実施したこと
を特徴とすることができる。
大きさのタンパク質は、 − 可溶化の際に約６Ｍの塩酸グアニジンを用い、及び
／又はジチオトレイトール（DTT) の存在下で処理し、
及び／又は − 復元をセファデックス G-25 を用いて実施したこと
を特徴とすることができる。
【００１９】
【発明の概要】本発明によれば、ミコバクテリウム・ツ
ベルクロシスの 38 kDa 抗原をエシエリキア・コリの中
に高レベルで生産する組換え体プラスミドが形成され
た。本発明の組換え体の形成により、融合していない
(ユニークな) 38 kDaタンパク質を主として封入体の形
でエシエリキア・コリの中に大量に生産することができ
る。発明者は更に本組換え体抗原を封入体から分離し精
製する方法を開発した。その際生産された精製 38 kDa
抗原はミコバクテリウム・ツベルクロシスの生の 38kDa
抗原と免疫学的に区別がつかない。ミコバクテリウム
・ツベルクロシスに対して高い特異性を有するので、こ
の組換え体抗原を結核症の血清学的診断に世界的に有効
に使用することができると思われる。又本抗原は免疫性
のあるＴ細胞エピトープを含んでいるので結核症用ワク
チンとして使用される可能性もある。
ベルクロシスの 38 kDa 抗原をエシエリキア・コリの中
に高レベルで生産する組換え体プラスミドが形成され
た。本発明の組換え体の形成により、融合していない
(ユニークな) 38 kDaタンパク質を主として封入体の形
でエシエリキア・コリの中に大量に生産することができ
る。発明者は更に本組換え体抗原を封入体から分離し精
製する方法を開発した。その際生産された精製 38 kDa
抗原はミコバクテリウム・ツベルクロシスの生の 38kDa
抗原と免疫学的に区別がつかない。ミコバクテリウム
・ツベルクロシスに対して高い特異性を有するので、こ
の組換え体抗原を結核症の血清学的診断に世界的に有効
に使用することができると思われる。又本抗原は免疫性
のあるＴ細胞エピトープを含んでいるので結核症用ワク
チンとして使用される可能性もある。
【００２０】この抗原をコードする遺伝子は既にクロー
ニングされており、本発明では強い転写信号 (バクテリ
オファージλP R P L ) と翻訳信号 (atpE) との調節に
よりエシエリキア・コリの中で融合していないタンパク
質として発現した。lon-プロテアーゼと熱ショック応答
の欠如している組換え体エシエリキア・コリ-K-12 菌株
CAG629 (pMS9-2)の醗酵により、組換え体抗原が高レベ
ルで生産された (全細胞タンパク質の約 10 %)。本組換
え体抗原は封入体として蓄積されたが、これを6 Mの塩
酸グアニジンに完全に溶解し、再生して、精製後均質な
状態とした。本製品は予想通りのアミノ酸組成と分子量
とを有し、３種の異なる単クローン性抗体に対して生の
タンパク質と同様の強い反応性を示した。本組換え体抗
原に対して生産された多クローン性抗体は、エンザイム
イムノソルベントアッセイに於いて生の抗原と強く反応
した。これらの結果より、ミコバクテリウム・ツベルク
ロシスの生のタンパク質とは免疫学的に区別できない組
換え体 38 kDa 抗原がエシエリキア・コリの中に充分の
量生産し得ることが判明した。
ニングされており、本発明では強い転写信号 (バクテリ
オファージλP R P L ) と翻訳信号 (atpE) との調節に
よりエシエリキア・コリの中で融合していないタンパク
質として発現した。lon-プロテアーゼと熱ショック応答
の欠如している組換え体エシエリキア・コリ-K-12 菌株
CAG629 (pMS9-2)の醗酵により、組換え体抗原が高レベ
ルで生産された (全細胞タンパク質の約 10 %)。本組換
え体抗原は封入体として蓄積されたが、これを6 Mの塩
酸グアニジンに完全に溶解し、再生して、精製後均質な
状態とした。本製品は予想通りのアミノ酸組成と分子量
とを有し、３種の異なる単クローン性抗体に対して生の
タンパク質と同様の強い反応性を示した。本組換え体抗
原に対して生産された多クローン性抗体は、エンザイム
イムノソルベントアッセイに於いて生の抗原と強く反応
した。これらの結果より、ミコバクテリウム・ツベルク
ロシスの生のタンパク質とは免疫学的に区別できない組
換え体 38 kDa 抗原がエシエリキア・コリの中に充分の
量生産し得ることが判明した。
【００２１】
【実施例】図１は、 38 kDa タンパク質のプレフォーム
(A) と短縮した形(C) とをコードする、形成された遺伝
子の5'末端のヌクレオチド配列の図である。Nde Ｉ (CA
TATG) 部位は、オリゴヌクレオチド 5'-AGCACAGAAAGGTA
TCATATGAAAATTCGTTTGCATA-3'(Aに対して) 及びオリゴヌ
クレオチド 5'-ATTCGTTTGCATATGCTGTTGGCCGTGT-3'(Cに
対して) を用いてオリゴヌクレオチド変異誘発により作
製された。誘導されたアミノ酸配列は一文字記号で表し
た。配列の上の矢印はプロセシングの推定部位である。
プレフォーム(B) と短縮した形(D) とのATG 出発コドン
の領域に於けるRNA の安定性は、ツッカー（Zucker），
シュティーグラー（Stiegler）の方法(28) により計算
した。atp E 遺伝子上のリボソーム結合部位と 38 kDa
抗原遺伝子の開始コドンとはそれぞれ星印及び三角で示
した。
(A) と短縮した形(C) とをコードする、形成された遺伝
子の5'末端のヌクレオチド配列の図である。Nde Ｉ (CA
TATG) 部位は、オリゴヌクレオチド 5'-AGCACAGAAAGGTA
TCATATGAAAATTCGTTTGCATA-3'(Aに対して) 及びオリゴヌ
クレオチド 5'-ATTCGTTTGCATATGCTGTTGGCCGTGT-3'(Cに
対して) を用いてオリゴヌクレオチド変異誘発により作
製された。誘導されたアミノ酸配列は一文字記号で表し
た。配列の上の矢印はプロセシングの推定部位である。
プレフォーム(B) と短縮した形(D) とのATG 出発コドン
の領域に於けるRNA の安定性は、ツッカー（Zucker），
シュティーグラー（Stiegler）の方法(28) により計算
した。atp E 遺伝子上のリボソーム結合部位と 38 kDa
抗原遺伝子の開始コドンとはそれぞれ星印及び三角で示
した。
【００２２】図２は、発現プラスミドの形成の図であ
る。 38 kDa タンパク質に対する遺伝子を含む2.0 kb E
coRI- フラグメントが、Nde I (CATATG)部位が遺伝子の
開始コドンを含むようにこの部位を作るために、λ AA5
9 (3) から M13mp19にクローニングされ、変異誘発され
た。次に 1.2 kb Nde Ｉ-Sph Ｉ- フラグメントが発現
ベクター pJLA603のNde Ｉ-Sph Ｉ- 部位にサブクロー
ニングされた。このベクターはタンデム配列のバクテリ
オファージλのプロモーター PR 、P L 、atp E-翻訳開
始領域 (白枠) 、転写ターミネーター fd 及び全ての３
個の読み枠での翻訳終止コドンを含む (20) 。プラスミ
ドはスケール通りには図示されていない。
る。 38 kDa タンパク質に対する遺伝子を含む2.0 kb E
coRI- フラグメントが、Nde I (CATATG)部位が遺伝子の
開始コドンを含むようにこの部位を作るために、λ AA5
9 (3) から M13mp19にクローニングされ、変異誘発され
た。次に 1.2 kb Nde Ｉ-Sph Ｉ- フラグメントが発現
ベクター pJLA603のNde Ｉ-Sph Ｉ- 部位にサブクロー
ニングされた。このベクターはタンデム配列のバクテリ
オファージλのプロモーター PR 、P L 、atp E-翻訳開
始領域 (白枠) 、転写ターミネーター fd 及び全ての３
個の読み枠での翻訳終止コドンを含む (20) 。プラスミ
ドはスケール通りには図示されていない。
【００２３】図３は、バッチ培養(A) 及びバイオリアク
ター(B) に於けるエシエリキア・コリ CAG629 の中での
組換え体 38 kDa タンパク質の発現の図である。 Ａ: 銀染色したゲル (列 1-7) と相当する MAb HBT12と
のイムノブロット (列8-14) で、CAG629 (pMS9-2) によ
り30℃での成長 (列1/8 、2/9)及び42℃での成長(列3/1
0、4/11) 後に生産されたタンパク質を示す。42℃での
誘導後のCAG629(pMS10-4) のタンパク質パターンは列6/
13、7/14に示した。列１、３、６は可溶性のフラクショ
ン、列２、４、７は封入体、列５は分子量指標（左側に
キロドルトンの値を示す）で、12は予め染色した標準で
ある。 Ｂ: バイオリアクターに於ける30℃ (列３）と42℃での
誘導後 (列4-9)の組換え体 38 kDa タンパク質の蓄積
で、サンプルは30分毎に取り出した。列１は分子量指
標、列２は CAG629 (pMS9-2)のバッチ培養からの封入体
から精製した少量の38kDa タンパク質である。矢印は組
換え体生産物に相当する二重のバンドを示す。
ター(B) に於けるエシエリキア・コリ CAG629 の中での
組換え体 38 kDa タンパク質の発現の図である。 Ａ: 銀染色したゲル (列 1-7) と相当する MAb HBT12と
のイムノブロット (列8-14) で、CAG629 (pMS9-2) によ
り30℃での成長 (列1/8 、2/9)及び42℃での成長(列3/1
0、4/11) 後に生産されたタンパク質を示す。42℃での
誘導後のCAG629(pMS10-4) のタンパク質パターンは列6/
13、7/14に示した。列１、３、６は可溶性のフラクショ
ン、列２、４、７は封入体、列５は分子量指標（左側に
キロドルトンの値を示す）で、12は予め染色した標準で
ある。 Ｂ: バイオリアクターに於ける30℃ (列３）と42℃での
誘導後 (列4-9)の組換え体 38 kDa タンパク質の蓄積
で、サンプルは30分毎に取り出した。列１は分子量指
標、列２は CAG629 (pMS9-2)のバッチ培養からの封入体
から精製した少量の38kDa タンパク質である。矢印は組
換え体生産物に相当する二重のバンドを示す。
【００２４】図４は、CAG629 (pMS9-2) の断面の電子顕
微鏡写真で、封入体をしめす (矢印) 。図５は、種々の
精製段階の SDS-12.5 %-PAGE-(銀染色)-分析結果の図で
ある。列１と４が分子量指標で、列２は可溶化した封入
体、列３は封入体の洗浄中に可溶化の前に遊離したタン
パク質、列５はセファデックス G25で復元したタンパク
質、列6-7 は QAEセファロース溶出液で、矢印は組換え
体 38 kDa タンパク質を示す。
微鏡写真で、封入体をしめす (矢印) 。図５は、種々の
精製段階の SDS-12.5 %-PAGE-(銀染色)-分析結果の図で
ある。列１と４が分子量指標で、列２は可溶化した封入
体、列３は封入体の洗浄中に可溶化の前に遊離したタン
パク質、列５はセファデックス G25で復元したタンパク
質、列6-7 は QAEセファロース溶出液で、矢印は組換え
体 38 kDa タンパク質を示す。
【００２５】図６は、FPLCで精製した 38 kDa タンパク
質標品の SDS-PAGE-分析とイムノブロット分析の結果を
示す。約１μg を含むサンプルを SDS-12.5 %-PAGEによ
り分離し、銀染色する (列1-3)か、又は抗-38 kDa-MAb
を用いてイムノブロッティングした: HAT2 (列4-6)、HB
T12(列8-9)、HYT28(列10-12)。３種のMAb と反応した組
換え体タンパク質には２個の主ピークが、一つは NaCl
100 mM (列１、４、７、10) 、もう一つは NaCl 130-20
0 mM (列３、６、９、12) の所に現れた。列２、５、
８、11はトリトン X-100の存在下で精製したタンパク質
(NaCl 170 mM で溶出) を示す。分子量標準は列Ｓに記
した (大きさをキロドルトンで左側に記載した) 。列Ｐ
はイムノブロットの際に使用した予め染色した標識であ
る。
質標品の SDS-PAGE-分析とイムノブロット分析の結果を
示す。約１μg を含むサンプルを SDS-12.5 %-PAGEによ
り分離し、銀染色する (列1-3)か、又は抗-38 kDa-MAb
を用いてイムノブロッティングした: HAT2 (列4-6)、HB
T12(列8-9)、HYT28(列10-12)。３種のMAb と反応した組
換え体タンパク質には２個の主ピークが、一つは NaCl
100 mM (列１、４、７、10) 、もう一つは NaCl 130-20
0 mM (列３、６、９、12) の所に現れた。列２、５、
８、11はトリトン X-100の存在下で精製したタンパク質
(NaCl 170 mM で溶出) を示す。分子量標準は列Ｓに記
した (大きさをキロドルトンで左側に記載した) 。列Ｐ
はイムノブロットの際に使用した予め染色した標識であ
る。
【００２６】図７は、生の 38 kDa 抗原と組換え体 38
kDa 抗原との比較を示す図である。 Ａ: アフィニティークロマトグラフィーで精製した約１
μg の生のタンパク質(列１と３）及び約１μg の組換
え体タンパク質、標品Ｉ（列２と４）を SDS-12.5 %-PA
GE により分離し、銀染色する (列１と２) か又はMAb
のHBT12 を用いてイムノブロッティングした (列３と
４）。列Ｐは予め染色した分子量標準である。 Ｂ: 生の 38 kDa タンパク質と組換え体 38 kDa タンパ
ク質とのレーザーデンシトメトリーによる免疫反応性の
比較である。(A) に示した銀染色したゲルとイムノブロ
ットとをレーザーデンシトメーターで走査した。銀染色
した生のタンパク質 (Nat. Silver)と組換え体タンパク
質 (Rec. Silver)のピーク領域、並びにイムノブロッテ
ィングした生のタンパク質 (Nat. Immuno)と組換え体タ
ンパク質(Rec. Immuno) のピーク領域とを図示した。
kDa 抗原との比較を示す図である。 Ａ: アフィニティークロマトグラフィーで精製した約１
μg の生のタンパク質(列１と３）及び約１μg の組換
え体タンパク質、標品Ｉ（列２と４）を SDS-12.5 %-PA
GE により分離し、銀染色する (列１と２) か又はMAb
のHBT12 を用いてイムノブロッティングした (列３と
４）。列Ｐは予め染色した分子量標準である。 Ｂ: 生の 38 kDa タンパク質と組換え体 38 kDa タンパ
ク質とのレーザーデンシトメトリーによる免疫反応性の
比較である。(A) に示した銀染色したゲルとイムノブロ
ットとをレーザーデンシトメーターで走査した。銀染色
した生のタンパク質 (Nat. Silver)と組換え体タンパク
質 (Rec. Silver)のピーク領域、並びにイムノブロッテ
ィングした生のタンパク質 (Nat. Immuno)と組換え体タ
ンパク質(Rec. Immuno) のピーク領域とを図示した。
【００２７】図８は、Ａ: 多クローン性血清の 38 kDa
抗原による滴定曲線である。ラビットの血清を生の 38
kDa タンパク質（●）と組換え体 38 kDa タンパク質
（■）とにより免疫にした。1:100 の希釈度から初めて
２倍づつ希釈した液を、組換え体 38 kDa タンパク質の
標品Ｉ(0.1μg/ウエル) を塗布した微量滴定板に滴下し
た。結合した免疫グロブリンを、ブタの抗ラビット免疫
グロブリンとセイヨウワサビペルオキシダーゼとの複合
体を1:1000に希釈した液 (P 217, Dakopatts, Glostru
p, DK) により検出した。 Ｂ: 微量滴定板に生の 38 kDa タンパク質(0.1μg/ウエ
ル) を塗布して、(A) と同様に実施した。
抗原による滴定曲線である。ラビットの血清を生の 38
kDa タンパク質（●）と組換え体 38 kDa タンパク質
（■）とにより免疫にした。1:100 の希釈度から初めて
２倍づつ希釈した液を、組換え体 38 kDa タンパク質の
標品Ｉ(0.1μg/ウエル) を塗布した微量滴定板に滴下し
た。結合した免疫グロブリンを、ブタの抗ラビット免疫
グロブリンとセイヨウワサビペルオキシダーゼとの複合
体を1:1000に希釈した液 (P 217, Dakopatts, Glostru
p, DK) により検出した。 Ｂ: 微量滴定板に生の 38 kDa タンパク質(0.1μg/ウエ
ル) を塗布して、(A) と同様に実施した。
【００２８】
バクテリア菌株、ファージ、プラスミド、成長条件 本発明に使用したエシエリキア・コリ株は、TG-1 (Δla
c-pro, supE, thi, hsd D5/F' tra - D36, proA + B
+ , lac I q , lac Z ΔM15), DH5alpha (end A1, rec
A1, hsd R17,sup E44, thi -1, gyr A96, rel A1, ( l
ac ZYA-arg F), φ80ｄ/ lac Z ΔM15), EC 538, CA
G629 ( lon , htp R165-Tn 10 ; C. Gross)であった。
組換え体λ gt11-バクテリオファージ、クローン AA59
は以前の研究(3) に於いて、R. A. Young (27)が設立し
たミコバクテリウム・ツベルクロシスのゲノムDNA-ライ
ブラリーから分離した。
c-pro, supE, thi, hsd D5/F' tra - D36, proA + B
+ , lac I q , lac Z ΔM15), DH5alpha (end A1, rec
A1, hsd R17,sup E44, thi -1, gyr A96, rel A1, ( l
ac ZYA-arg F), φ80ｄ/ lac Z ΔM15), EC 538, CA
G629 ( lon , htp R165-Tn 10 ; C. Gross)であった。
組換え体λ gt11-バクテリオファージ、クローン AA59
は以前の研究(3) に於いて、R. A. Young (27)が設立し
たミコバクテリウム・ツベルクロシスのゲノムDNA-ライ
ブラリーから分離した。
【００２９】特記しない限り、菌株はルリア・ベルタニ
（ Luria-Bertani）培地 (15) で37℃で培養した。培養
液をPilot-振とう器 (Kuhne,スイス) の中で 160 rpm
の速度で振とうして、培養液に酸素を供給した。
（ Luria-Bertani）培地 (15) で37℃で培養した。培養
液をPilot-振とう器 (Kuhne,スイス) の中で 160 rpm
の速度で振とうして、培養液に酸素を供給した。
【００３０】DNA-マニプレーション DNA の調製と処理は標準のプロトコルに準じて実施した
(15)。形質転換はHa-nahan の記載のように行った(8)
。DNA のシークエンシングにはジデオキシヌクレオチ
ド鎖終結法を用いた(18)。オリゴヌクレオチドはアプラ
イド・バイオシステムズ（ Applied Biosystems ）のDN
A-シンセサイザー model 380B を用いて作製し、OPC-カ
ラム (Applied Biosy-stems Inc.) により精製した。
(15)。形質転換はHa-nahan の記載のように行った(8)
。DNA のシークエンシングにはジデオキシヌクレオチ
ド鎖終結法を用いた(18)。オリゴヌクレオチドはアプラ
イド・バイオシステムズ（ Applied Biosystems ）のDN
A-シンセサイザー model 380B を用いて作製し、OPC-カ
ラム (Applied Biosy-stems Inc.) により精製した。
【００３１】オリゴヌクレオチドの変異誘発 ゲノムクローンλ AA59 (3) からの 2.0 kb Eco RI- 断
片を M13mp19 に導入した。一本鎖DNA の調製とオリゴ
ヌクレオチドの変異誘発とは Amersham-キット(RPN 152
3)を用いて行った。変異誘発前後のDNA-配列は、DNA の
シークエンシング(18)により確認した。
片を M13mp19 に導入した。一本鎖DNA の調製とオリゴ
ヌクレオチドの変異誘発とは Amersham-キット(RPN 152
3)を用いて行った。変異誘発前後のDNA-配列は、DNA の
シークエンシング(18)により確認した。
【００３２】粗タンパク質抽出物の小規模の調製 菌株を、アンピシリン（100 μg/ｍｌ) を追加した LB-
培地を用い、30℃で、580 nmの吸収が 0.6になるまで培
養した。次に培地を振とう水浴中で、42℃まで３時間掛
けて加温して誘発した。培地 1ｍｌから細菌を採取し、
サンプル緩衝液(トリス塩酸 62 mM、pH 6.8、ドデシル
硫酸ナトリウム 2 %、2-メルカプトエタノール 0.7 M、
グリセリン 10 % 、ブロムフェノールブルー 0.002 %)
に懸濁し、Braun Labsonic 2000 を用いて氷水中で超音
波処理して破砕した。サンプルを95℃で10分加熱し、そ
の10 μｌをポリアクリルアミドゲル電気泳動により分
析した。
培地を用い、30℃で、580 nmの吸収が 0.6になるまで培
養した。次に培地を振とう水浴中で、42℃まで３時間掛
けて加温して誘発した。培地 1ｍｌから細菌を採取し、
サンプル緩衝液(トリス塩酸 62 mM、pH 6.8、ドデシル
硫酸ナトリウム 2 %、2-メルカプトエタノール 0.7 M、
グリセリン 10 % 、ブロムフェノールブルー 0.002 %)
に懸濁し、Braun Labsonic 2000 を用いて氷水中で超音
波処理して破砕した。サンプルを95℃で10分加熱し、そ
の10 μｌをポリアクリルアミドゲル電気泳動により分
析した。
【００３３】バイオリアクターでの培養 一部変更した濃縮 LB-培地 (トリプトン 40 g/ｌ、酵母
抽出物 20 g/ｌ、食塩5 g/ｌ) 30 ｌをウコルブ N38
アンチフォーム（Ucolub N38 Antifoam ）(Brenntag, M
uhlheim,独) 3.5 m ｌの存在下で、50 ｌ のバイオリ
アクター (Biostat U30D, Braun Melsungen, 独) の中
で殺菌した。これに、同じ培地で１晩成長させた生物体
の培地 0.5 ｌを接種して培養を開始した。最初の吸収
A546 は0.04 であった。攪拌速度を 300 rpmに一定に
保って、溶存酸素の濃度を飽和に近い状態に維持し、pH
を 6.9に調節した。醗酵４時間後 (A 546 = 0.4)に温
度を30℃から43℃に上げ、この温度を更に４時間保持し
た。誘導期間の最後に、懸濁液を密閉システム中で、0.
23 m2 の アキュラール（Accural ）膜 (孔径 0.2μm
、Enka, Wuppertal, 独) を備えたクロスフロー式ミ
クロ濾過装置 (Enkamodule type A7 ABA 3A) により、
最終容積が 10 ｌになるまで濃縮した。
抽出物 20 g/ｌ、食塩5 g/ｌ) 30 ｌをウコルブ N38
アンチフォーム（Ucolub N38 Antifoam ）(Brenntag, M
uhlheim,独) 3.5 m ｌの存在下で、50 ｌ のバイオリ
アクター (Biostat U30D, Braun Melsungen, 独) の中
で殺菌した。これに、同じ培地で１晩成長させた生物体
の培地 0.5 ｌを接種して培養を開始した。最初の吸収
A546 は0.04 であった。攪拌速度を 300 rpmに一定に
保って、溶存酸素の濃度を飽和に近い状態に維持し、pH
を 6.9に調節した。醗酵４時間後 (A 546 = 0.4)に温
度を30℃から43℃に上げ、この温度を更に４時間保持し
た。誘導期間の最後に、懸濁液を密閉システム中で、0.
23 m2 の アキュラール（Accural ）膜 (孔径 0.2μm
、Enka, Wuppertal, 独) を備えたクロスフロー式ミ
クロ濾過装置 (Enkamodule type A7 ABA 3A) により、
最終容積が 10 ｌになるまで濃縮した。
【００３４】タンパク質の精製 バイオリアクターで得られた細胞を、高圧ホモジナイザ
ー LAB 60/500/2 (A.P.V.-Schroder, Lubeck, 独) を
500 barの圧力で 60 ｌ/h の流速で１回通過させて破
砕した。遠心分離器 SA 1-01-175 (Westfalia, Oelde,
独) を用いて粗封入体を分離した。この装置は培養液か
ら封入体を 15-20ｌ/hの流速で分離する能力がある。封
入体を、トリトン X-100 2 %を含む 200 mｌの緩衝液 L
(トリス- HCl 50 mM, EDTA 10 mM, pH 8.0)で２回洗浄
した。洗浄した沈澱を、塩酸グアニジン6 M とDTT 20 m
M とを含む緩衝液 L 3ｌに 4℃で16時間ゆっくり攪拌し
て再度懸濁した。7000 gで遠心分離してからその上澄み
液を、塩酸グアニジンを除去し、組換え体抗原の復元を
行うために、100 mMの塩化ナトリウムを含むトリス- HC
l 緩衝液 pH 7.0 で平衡化したセファデックス G-25 ゲ
ル濾過カラム (10×90cm) を通した。溶液は 2ｌのアリ
コートづつ 7 ｌ/h の流速で注入し、溶出液の0.D.
260 と電気伝導率とをモニタした。脱塩、復元した抗原
溶液は、主として塩酸グアニジンを含む塩のピークから
よく分離されて、8 mS/cm の伝導度の出発緩衝液中に現
れた。これらの抗原ピークを合体し、蒸留水で希釈して
伝導度を5 mS/cm とし、1 M のトリスで pH を 8.5に
調節した。この溶液をその後の精製工程のために２分割
した。
ー LAB 60/500/2 (A.P.V.-Schroder, Lubeck, 独) を
500 barの圧力で 60 ｌ/h の流速で１回通過させて破
砕した。遠心分離器 SA 1-01-175 (Westfalia, Oelde,
独) を用いて粗封入体を分離した。この装置は培養液か
ら封入体を 15-20ｌ/hの流速で分離する能力がある。封
入体を、トリトン X-100 2 %を含む 200 mｌの緩衝液 L
(トリス- HCl 50 mM, EDTA 10 mM, pH 8.0)で２回洗浄
した。洗浄した沈澱を、塩酸グアニジン6 M とDTT 20 m
M とを含む緩衝液 L 3ｌに 4℃で16時間ゆっくり攪拌し
て再度懸濁した。7000 gで遠心分離してからその上澄み
液を、塩酸グアニジンを除去し、組換え体抗原の復元を
行うために、100 mMの塩化ナトリウムを含むトリス- HC
l 緩衝液 pH 7.0 で平衡化したセファデックス G-25 ゲ
ル濾過カラム (10×90cm) を通した。溶液は 2ｌのアリ
コートづつ 7 ｌ/h の流速で注入し、溶出液の0.D.
260 と電気伝導率とをモニタした。脱塩、復元した抗原
溶液は、主として塩酸グアニジンを含む塩のピークから
よく分離されて、8 mS/cm の伝導度の出発緩衝液中に現
れた。これらの抗原ピークを合体し、蒸留水で希釈して
伝導度を5 mS/cm とし、1 M のトリスで pH を 8.5に
調節した。この溶液をその後の精製工程のために２分割
した。
【００３５】溶液の一部を、pH 8.0のトリス-HCl緩衝液
20 mMで平衡化した FPLC-カラム(QAE- セファロース F
F, 5×18 cm) に通した。流速は 1.72 ｌ/hで、これは
線速度86.6 cm/h に相当する。出発緩衝液で充分洗浄し
てから、抗原の溶離を、出発緩衝液中の食塩濃度を 50m
M, 100 mM, 250 mM, 500 mM, 1M とした濃度傾斜の溶離
液を用いて実施した。次にカラムを出発緩衝液により再
度平衡化してから、ゲル濾過カラムからの第２の部分を
通し、前述のように溶離した。２回のQAE-セファロース
操作からの抗原を含むフラクションを合体し、アミコン
（Amicon）中空繊維カートリッジ (タイプ H1P10、カッ
トオフ 10,000)を用いた限外濾過により濃縮し、透析濾
過した (2 ms/cm)。
20 mMで平衡化した FPLC-カラム(QAE- セファロース F
F, 5×18 cm) に通した。流速は 1.72 ｌ/hで、これは
線速度86.6 cm/h に相当する。出発緩衝液で充分洗浄し
てから、抗原の溶離を、出発緩衝液中の食塩濃度を 50m
M, 100 mM, 250 mM, 500 mM, 1M とした濃度傾斜の溶離
液を用いて実施した。次にカラムを出発緩衝液により再
度平衡化してから、ゲル濾過カラムからの第２の部分を
通し、前述のように溶離した。２回のQAE-セファロース
操作からの抗原を含むフラクションを合体し、アミコン
（Amicon）中空繊維カートリッジ (タイプ H1P10、カッ
トオフ 10,000)を用いた限外濾過により濃縮し、透析濾
過した (2 ms/cm)。
【００３６】得られたタンパク質の約 20 mgを、pH 8.0
のトリス-HCl 20 mMで平衡化したMono Q HR (5/5) FPLC
カラムに注入した。カラムを出発緩衝液により、流速 2
mｌ/min、圧力 25 bar で洗浄してから、出発緩衝液中
の食塩濃度を 0.5 Mまで段階的に高めた溶離液により溶
出した。全体で３回のMono Q HR (5/5) 操作を上述の条
件で実施した。
のトリス-HCl 20 mMで平衡化したMono Q HR (5/5) FPLC
カラムに注入した。カラムを出発緩衝液により、流速 2
mｌ/min、圧力 25 bar で洗浄してから、出発緩衝液中
の食塩濃度を 0.5 Mまで段階的に高めた溶離液により溶
出した。全体で３回のMono Q HR (5/5) 操作を上述の条
件で実施した。
【００３７】ポリアクリルアミド電気泳動とイムノブロ
ッティング 大まかに精製したタンパク質と高度に精製したタンパク
質とをドデシル硫酸ナトリウム／ポリアクリルアミド
（12 %)-ゲル電気泳動 (11) により分析した。タンパク
質サンプルを 2X サンプル緩衝液と 1:1の割合で混合
し、95℃で10分加熱してからゲルに加えた。電気泳動に
続いてポリペブチドを銀染色して可視化した(5) 。タン
パク質の濃度はリウリー（ Lowry）などの方法で測定し
た (13) 。これらのタンパク質を、自家製の半乾式ブロ
ッティング装置により、トリス 25 mM、グリシン 192 m
M 、メタノール 20 % 、pH 7.4を使用してニトロセルロ
ーズ膜(BioRad)に移した。非特異性の結合は、10 %のミ
ルク溶液 (脂肪分 0.3 %) を含む TBS (トリス-HCl 50
mM, NaCl 200 mM, pH 7.5)の中でフィルタをインキュベ
ートすることにより阻止された。一次の抗体 (マウスか
らの単クローン性抗体)を TBSで1000倍に希釈し、フィ
ルタを抗体と共に 4℃で１晩インキュベートした。フィ
ルタを TBSで３回洗浄し、免疫検出をビオチニル化した
マウス抗-IgGとストレプタビジン・アルカリ性ホスファ
ターゼ・抱合体 (BRL, Gaithersburg, MD,USA)とを用い
て実施した。イムノドット・ブロットアッセイのため
に、タンパク質サンプルを、BioRad Bio-Dot装置を用い
てニトロセルローズ膜で濾過し、上述のように処理し
た。単クローン性抗体 HAT2, HBT12, HYT28 に就いては
既に報告がある(2, 12, 21) 。銀染色したゲルとウエス
ターンブロットのデンシトメトリー測定はレーザーデン
シトメーター (LKB) を用いて実施した。
ッティング 大まかに精製したタンパク質と高度に精製したタンパク
質とをドデシル硫酸ナトリウム／ポリアクリルアミド
（12 %)-ゲル電気泳動 (11) により分析した。タンパク
質サンプルを 2X サンプル緩衝液と 1:1の割合で混合
し、95℃で10分加熱してからゲルに加えた。電気泳動に
続いてポリペブチドを銀染色して可視化した(5) 。タン
パク質の濃度はリウリー（ Lowry）などの方法で測定し
た (13) 。これらのタンパク質を、自家製の半乾式ブロ
ッティング装置により、トリス 25 mM、グリシン 192 m
M 、メタノール 20 % 、pH 7.4を使用してニトロセルロ
ーズ膜(BioRad)に移した。非特異性の結合は、10 %のミ
ルク溶液 (脂肪分 0.3 %) を含む TBS (トリス-HCl 50
mM, NaCl 200 mM, pH 7.5)の中でフィルタをインキュベ
ートすることにより阻止された。一次の抗体 (マウスか
らの単クローン性抗体)を TBSで1000倍に希釈し、フィ
ルタを抗体と共に 4℃で１晩インキュベートした。フィ
ルタを TBSで３回洗浄し、免疫検出をビオチニル化した
マウス抗-IgGとストレプタビジン・アルカリ性ホスファ
ターゼ・抱合体 (BRL, Gaithersburg, MD,USA)とを用い
て実施した。イムノドット・ブロットアッセイのため
に、タンパク質サンプルを、BioRad Bio-Dot装置を用い
てニトロセルローズ膜で濾過し、上述のように処理し
た。単クローン性抗体 HAT2, HBT12, HYT28 に就いては
既に報告がある(2, 12, 21) 。銀染色したゲルとウエス
ターンブロットのデンシトメトリー測定はレーザーデン
シトメーター (LKB) を用いて実施した。
【００３８】アミノ酸の分析 アミノ酸の分析は、タンパク質のサンプルを、0.1 % の
フェノールを含む 6 Nの塩酸中で 105℃で24時間加水分
解してから、Biotronik LC-5001 アミノ酸分析器 (Main
tal, 独) を用いて実施した。
フェノールを含む 6 Nの塩酸中で 105℃で24時間加水分
解してから、Biotronik LC-5001 アミノ酸分析器 (Main
tal, 独) を用いて実施した。
【００３９】多クローン性抗-38 kDa-タンパク質血清の
作製 ラビットを、アフィニティークロマトグラフィーで精製
した 38 kDa タンパク質 (25) 又は組換え体 38 kDa タ
ンパク質 (標品Ｉ) の何れかで皮下的に免疫にした。抗
原 (10μg/１回量）を水酸化アルミニウム (2.4 mg) に
吸着させ、これに 1 mｌの不完全フロイントアジュバン
トを混合した。ラビットは２週間置きに３回免疫にし
た。最後の免疫措置後10日目に血液を採取し、IgG-フラ
クションをハルベ（Harboe）とイングリッド（Inglid）
の方法 (9)で精製した。
作製 ラビットを、アフィニティークロマトグラフィーで精製
した 38 kDa タンパク質 (25) 又は組換え体 38 kDa タ
ンパク質 (標品Ｉ) の何れかで皮下的に免疫にした。抗
原 (10μg/１回量）を水酸化アルミニウム (2.4 mg) に
吸着させ、これに 1 mｌの不完全フロイントアジュバン
トを混合した。ラビットは２週間置きに３回免疫にし
た。最後の免疫措置後10日目に血液を採取し、IgG-フラ
クションをハルベ（Harboe）とイングリッド（Inglid）
の方法 (9)で精製した。
【００４０】電子顕微鏡 細胞を、PBS(リン酸カリウム 50mM, NaCl 0.9 %, pH 6.
9)中のホルムアルデヒド 1 %とグルタルアルデヒド 0.2
%とにより１時間氷の上で固定した。PBS で数回洗浄
後、細胞を漸進的温度低下法 (PLT) (17) により包埋し
た。細胞を先ず10% 、次に30 %のエタノールで氷の上で
30分、続いて50 %のエタノールで -20℃で30分、70 %,
90 %, 100 % のエタノールで -35℃でそれぞれ30分、最
後に100 %のエタノールで -35℃で１時間脱水した。ロ
ビクリル（Lowicryl）樹脂 K4Mによる浸透は次のように
行った。エタノール１部／K4M-樹脂１部の中に -35℃で
１晩、エタノール１部／K4M-樹脂２部の中と純K4M-樹脂
の中にそれぞれ -35℃で２日間、何回も樹脂混合液を取
り替えながら浸漬した。樹脂の重合は、紫外線 (366nm)
を用いて -35℃で１日、続いて常温で更に２日で達成
した。超薄切片は酢酸ウラニルとクエン酸鉛により着色
してから、Zeiss EM 10B透過型電子顕微鏡により、加速
電圧80 kV で観察した。
9)中のホルムアルデヒド 1 %とグルタルアルデヒド 0.2
%とにより１時間氷の上で固定した。PBS で数回洗浄
後、細胞を漸進的温度低下法 (PLT) (17) により包埋し
た。細胞を先ず10% 、次に30 %のエタノールで氷の上で
30分、続いて50 %のエタノールで -20℃で30分、70 %,
90 %, 100 % のエタノールで -35℃でそれぞれ30分、最
後に100 %のエタノールで -35℃で１時間脱水した。ロ
ビクリル（Lowicryl）樹脂 K4Mによる浸透は次のように
行った。エタノール１部／K4M-樹脂１部の中に -35℃で
１晩、エタノール１部／K4M-樹脂２部の中と純K4M-樹脂
の中にそれぞれ -35℃で２日間、何回も樹脂混合液を取
り替えながら浸漬した。樹脂の重合は、紫外線 (366nm)
を用いて -35℃で１日、続いて常温で更に２日で達成
した。超薄切片は酢酸ウラニルとクエン酸鉛により着色
してから、Zeiss EM 10B透過型電子顕微鏡により、加速
電圧80 kV で観察した。
【００４１】
発現プラスミドの構造 38 kDa タンパク質遺伝子のDNA-配列は、374 のアミノ
酸のポリペプチドをコードし、出発コドンとしてGTG を
含む開放型読み枠であることが判った (1)。更に細菌の
リポタンパク質のシグナル配列に類似の24のアミノ酸の
長さのシグナル配列 (図1A) が存在した。本発明では遺
伝子をマニプレートして、融合していない 38 kDa 抗原
を発現ベクター pJLA603 (図２）中に高レベルで発現す
ることができた(20)。この種のベクターのクローニング
と発現には、外部の遺伝子が１個の制限部位、例えば N
col, Ndel, Sphl を有し、それにはその認識配列の中に
読み枠のATG が含まれていることが必要である。 38 kD
a 遺伝子の開始コドンの付近にはそのような部位がない
ので、開始コドンをGTG からATG に変えることによって
Ｎ末端に Ndel 部位を作るために、M13mp19 中でオリゴ
ヌクレオチドの変異誘発を実施した。変異誘発後に M13
誘導体から切除できた 1.2 kb Nde I-SphI 断片は pJ
LA603 の Nde I-Sph I部位の間にクローニングされ
た。この 38 kDa タンパク質をその元のシグナルペブチ
ドを変えることなく発現するように計画された組換え体
プラスミドは pMS9-2 と名付けられた。同様にシグナル
配列で最初の６個のアミノ酸が欠失した組換え体プラス
ミド pMS10-4が作製された（図1C) 。pMS9-2が特異的に
識別する m-RNA の翻訳開始領域のコンピューター分析
は、エシエリキア・コリ中に高レベルで発現するのに非
常に適しているとみなされる緩い２次構造（図1B) を予
測した(14)。一方 pMS10-4はより安定な２次構造（図1
D) を示し、このプラスミドからの発現は pMS9-2 から
の発現より劣っていることが示唆された。両方の組換え
体プラスミドが発現の研究に使用された。
酸のポリペプチドをコードし、出発コドンとしてGTG を
含む開放型読み枠であることが判った (1)。更に細菌の
リポタンパク質のシグナル配列に類似の24のアミノ酸の
長さのシグナル配列 (図1A) が存在した。本発明では遺
伝子をマニプレートして、融合していない 38 kDa 抗原
を発現ベクター pJLA603 (図２）中に高レベルで発現す
ることができた(20)。この種のベクターのクローニング
と発現には、外部の遺伝子が１個の制限部位、例えば N
col, Ndel, Sphl を有し、それにはその認識配列の中に
読み枠のATG が含まれていることが必要である。 38 kD
a 遺伝子の開始コドンの付近にはそのような部位がない
ので、開始コドンをGTG からATG に変えることによって
Ｎ末端に Ndel 部位を作るために、M13mp19 中でオリゴ
ヌクレオチドの変異誘発を実施した。変異誘発後に M13
誘導体から切除できた 1.2 kb Nde I-SphI 断片は pJ
LA603 の Nde I-Sph I部位の間にクローニングされ
た。この 38 kDa タンパク質をその元のシグナルペブチ
ドを変えることなく発現するように計画された組換え体
プラスミドは pMS9-2 と名付けられた。同様にシグナル
配列で最初の６個のアミノ酸が欠失した組換え体プラス
ミド pMS10-4が作製された（図1C) 。pMS9-2が特異的に
識別する m-RNA の翻訳開始領域のコンピューター分析
は、エシエリキア・コリ中に高レベルで発現するのに非
常に適しているとみなされる緩い２次構造（図1B) を予
測した(14)。一方 pMS10-4はより安定な２次構造（図1
D) を示し、このプラスミドからの発現は pMS9-2 から
の発現より劣っていることが示唆された。両方の組換え
体プラスミドが発現の研究に使用された。
【００４２】小規模の培養に於ける組換え体抗原の発現 数種のエシエリキア・コリ株 (DH5 α, EC538, CAG629)
を、pMS9-2 及び pMS10-4によりコードされた組換え体
38 kDa 抗原の発現に対して試験したが、その中でLon
htp R-菌種が最強の発現を示した。42℃で誘導した CAG
629(pMS9-2) 細胞の抽出物は多量の組換え体タンパク質
を含んでいたが (図３、列３と４参照）、誘導しなかっ
た細胞の抽出物にはこれが見られなかった (図３、列
１）。組換え体菌株は誘導後も何らの障害を示さず、指
数的に成長を続けた（データは記載せず）。MAb の HBT
12 (図3A、列10、11) 、HAT2、HYT28 （データは記載せ
ず）は、イムノブロッティングに於いて、組換え体 38
kDa タンパク質とポジティブな反応を示した。組換え体
タンパク質の大部分は破砕された細胞の細胞ペレットフ
ラクションに存在しており上澄み液には僅かの部分だけ
が認められた (図3A、列10、11) 。組換え体クローン C
AG629(pMS10-4)は、２次構造の予測から期待されたよう
に、pMS9-2 (図3A、列13、14) よりも著しく少ないタン
パク質しか生産しなかった。38 kDaタンパク質よりもゆ
っくり移動した、イムノブロット上の薄いバンドは、組
換え体タンパク質のSDS に不溶の凝集した形態に相当す
る。
を、pMS9-2 及び pMS10-4によりコードされた組換え体
38 kDa 抗原の発現に対して試験したが、その中でLon
htp R-菌種が最強の発現を示した。42℃で誘導した CAG
629(pMS9-2) 細胞の抽出物は多量の組換え体タンパク質
を含んでいたが (図３、列３と４参照）、誘導しなかっ
た細胞の抽出物にはこれが見られなかった (図３、列
１）。組換え体菌株は誘導後も何らの障害を示さず、指
数的に成長を続けた（データは記載せず）。MAb の HBT
12 (図3A、列10、11) 、HAT2、HYT28 （データは記載せ
ず）は、イムノブロッティングに於いて、組換え体 38
kDa タンパク質とポジティブな反応を示した。組換え体
タンパク質の大部分は破砕された細胞の細胞ペレットフ
ラクションに存在しており上澄み液には僅かの部分だけ
が認められた (図3A、列10、11) 。組換え体クローン C
AG629(pMS10-4)は、２次構造の予測から期待されたよう
に、pMS9-2 (図3A、列13、14) よりも著しく少ないタン
パク質しか生産しなかった。38 kDaタンパク質よりもゆ
っくり移動した、イムノブロット上の薄いバンドは、組
換え体タンパク質のSDS に不溶の凝集した形態に相当す
る。
【００４３】組換え体 38 kDa タンパク質は、銀染色し
た SDS-PAGE-ゲルのレーザーデンシトメーターによる測
定結果が示すように、高レベル (全細胞タンパク質の約
10%)で生産された。エシエリキア・コリの中に高レベル
で生産される組換え体タンパク質の場合にしばしば見ら
れるように (７、19) 、この 38 kDa タンパク質も大部
分細胞質凝集体或いは封入体の中に含まれていた (図
４）。
た SDS-PAGE-ゲルのレーザーデンシトメーターによる測
定結果が示すように、高レベル (全細胞タンパク質の約
10%)で生産された。エシエリキア・コリの中に高レベル
で生産される組換え体タンパク質の場合にしばしば見ら
れるように (７、19) 、この 38 kDa タンパク質も大部
分細胞質凝集体或いは封入体の中に含まれていた (図
４）。
【００４４】組換え体エシエリキア・コリの醗酵と組換
え体抗原の精製 組換え体クローン CAG629(pMS9-2) はバッチ培養で抗原
を高レベルで生産し又寛容し、且つ損傷のないシグナル
配列を備えた 38 kDa タンパク質をコードするので、30
ｌの醗酵にはこのクローンを使用した。バイオリアクタ
ーの中での組換え体抗原の生産の時間的経過をモニター
した (図3B) 。全細胞抽出物の SDS-PAGE が示すよう
に、温度が30℃から42℃に上昇してから30分以内に 38
kDa の大きさの二重のバンドが銀染色したゲルの上に明
らかに認められた。
え体抗原の精製 組換え体クローン CAG629(pMS9-2) はバッチ培養で抗原
を高レベルで生産し又寛容し、且つ損傷のないシグナル
配列を備えた 38 kDa タンパク質をコードするので、30
ｌの醗酵にはこのクローンを使用した。バイオリアクタ
ーの中での組換え体抗原の生産の時間的経過をモニター
した (図3B) 。全細胞抽出物の SDS-PAGE が示すよう
に、温度が30℃から42℃に上昇してから30分以内に 38
kDa の大きさの二重のバンドが銀染色したゲルの上に明
らかに認められた。
【００４５】醗酵培地から得られた封入体を、トリトン
X-100 を含む緩衝液で洗浄したが、いくらかの汚染した
タンパク質 (図５、列３）が除去されただけで、組換え
体抗原の損失は認められなかった (図５、列２）。セフ
ァデックス G-25 カラムを用いて抗原を脱塩し復元した
(図５、列６）が、この段階では抗体の再凝集は認めら
れなかった。抗原を更に数回の FPLC-陰イオン交換クロ
マトグラフィーにより精製した (図６）が、その際抗原
は NaCl 100 mM (標品Ｉ) と NaCl 130-200 mM(標品II
I)に於いて溶出した。図６の標品IIは、陰イオン交換ク
ロマトグラフィーの初期の段階で得られた凝集・汚染フ
ラクションをトリトンX-100 の存在下でFPLC-陰イオン
交換カラムにより精製した抗原を示す。
X-100 を含む緩衝液で洗浄したが、いくらかの汚染した
タンパク質 (図５、列３）が除去されただけで、組換え
体抗原の損失は認められなかった (図５、列２）。セフ
ァデックス G-25 カラムを用いて抗原を脱塩し復元した
(図５、列６）が、この段階では抗体の再凝集は認めら
れなかった。抗原を更に数回の FPLC-陰イオン交換クロ
マトグラフィーにより精製した (図６）が、その際抗原
は NaCl 100 mM (標品Ｉ) と NaCl 130-200 mM(標品II
I)に於いて溶出した。図６の標品IIは、陰イオン交換ク
ロマトグラフィーの初期の段階で得られた凝集・汚染フ
ラクションをトリトンX-100 の存在下でFPLC-陰イオン
交換カラムにより精製した抗原を示す。
【００４６】精製した組換え体タンパク質の構造、免疫
学的反応、免疫原性 精製した抗原標品の免疫学的反応は、単クローン性抗体
HAT2, HBT12, HYT28を用いて試験した。この３種の抗
体は全て精製した抗原標品と反応した (図６)。アフィ
ニティークロマトグラフィーにより精製した生の抗原
を、SDS-PAGE及びイムノブロットを用いて組換え体抗原
(標品Ｉ) と比較したが、その間に何らの相違が認めら
れなかった (図7A) 。図7Aの銀染色したゲルとイムノブ
ロットを更にレーザーデンシトメーターで分析したが、
注入したタンパク質の量の相違を標準化した後では、生
の抗原と組換え体抗原とが単クローン性抗体 HBT12 (図
7B）並びに HAT2 、HYT28 （データは記載せず）と全く
同様に反応することが判明した。
学的反応、免疫原性 精製した抗原標品の免疫学的反応は、単クローン性抗体
HAT2, HBT12, HYT28を用いて試験した。この３種の抗
体は全て精製した抗原標品と反応した (図６)。アフィ
ニティークロマトグラフィーにより精製した生の抗原
を、SDS-PAGE及びイムノブロットを用いて組換え体抗原
(標品Ｉ) と比較したが、その間に何らの相違が認めら
れなかった (図7A) 。図7Aの銀染色したゲルとイムノブ
ロットを更にレーザーデンシトメーターで分析したが、
注入したタンパク質の量の相違を標準化した後では、生
の抗原と組換え体抗原とが単クローン性抗体 HBT12 (図
7B）並びに HAT2 、HYT28 （データは記載せず）と全く
同様に反応することが判明した。
【００４７】組換え体抗原の免疫原性は、ラビットの中
で同様の条件で生の抗原と組換え体抗原とに対して多ク
ローン性抗血清を生成させることによって試験した。次
にこの抗血清をエンザイムイムノソルベントアッセイ
（エリザ）により組換え体抗原（図8A）及び生の抗原
（図8B）の両方に対して試験した。測定曲線の傾斜が同
一であり、この抗血清が生のタンパク質と組換え体 38
kDa タンパク質との両方に同様によく結合することが示
された。
で同様の条件で生の抗原と組換え体抗原とに対して多ク
ローン性抗血清を生成させることによって試験した。次
にこの抗血清をエンザイムイムノソルベントアッセイ
（エリザ）により組換え体抗原（図8A）及び生の抗原
（図8B）の両方に対して試験した。測定曲線の傾斜が同
一であり、この抗血清が生のタンパク質と組換え体 38
kDa タンパク質との両方に同様によく結合することが示
された。
【００４８】組換え体 38 kDa タンパク質のアミノ酸の
組成は、ヌクレオチド配列から誘導されたアミノ酸の組
成に良く似ている（表１）。
組成は、ヌクレオチド配列から誘導されたアミノ酸の組
成に良く似ている（表１）。
【００４９】
【表１】
【００５０】
【考察】本発明に於いて、ミコバクテリウム・ツベルク
ロシスのDNA-断片を発現ベクターにクローニングして、
融合していない 38 kDa タンパク質を高レベルで生産す
る方法を開発し、実施した。このベクターは、λ-PR P
L - プロモーターと atpE-遺伝子の有効な翻訳開始領域
を含むので、非相同の 38 kDa 抗原がエシエリキア・コ
リの中に、全細胞タンパク質の10 %に相当する高レベル
で発現した。この条件で組換え体タンパク質が約 15 mg
/ ｌ生産された。しかしここで強調するが、本発明の目
的は、この多量に発現した組換え体抗原が、ミコバクテ
リウム・ツベルクロシスから得た生の抗原と免疫学的に
区別できない抗原形態に復元されたかどうかであって、
醗酵収率の最適化ではなかった。
ロシスのDNA-断片を発現ベクターにクローニングして、
融合していない 38 kDa タンパク質を高レベルで生産す
る方法を開発し、実施した。このベクターは、λ-PR P
L - プロモーターと atpE-遺伝子の有効な翻訳開始領域
を含むので、非相同の 38 kDa 抗原がエシエリキア・コ
リの中に、全細胞タンパク質の10 %に相当する高レベル
で発現した。この条件で組換え体タンパク質が約 15 mg
/ ｌ生産された。しかしここで強調するが、本発明の目
的は、この多量に発現した組換え体抗原が、ミコバクテ
リウム・ツベルクロシスから得た生の抗原と免疫学的に
区別できない抗原形態に復元されたかどうかであって、
醗酵収率の最適化ではなかった。
【００５１】組換え体 38 kDa タンパク質は大部分封入
体の形で蓄積した。この封入体を可溶化するには、高濃
度の還元剤 (DTT)を加えた 6 M塩酸グアニジンが最適で
あることが判明した。封入体のタンパク質の復元、特に
疎水性膜タンパク質の復元は困難なことが多く、実験条
件の入念な最適化を必要とするが、本発明の場合にはタ
ンパク質濃度が非常に低い場合 (0.05 mg/m ｌ) でも、
通常の透析又は段階的透析により組換え体 38 kDa タン
パク質の沈殿が得られた。一方では、セファデックス G
-25 による組換え体タンパク質の復元が有効であること
が判明し, その際タンパク質の再凝集は殆ど認められな
かった。約 200 mg の全タンパク質を含む封入体から、
銀着色した SDS-PAGE-ゲルが示すように、純度が95 %を
超える38 kDaタンパク質 19 mgを精製することができ
た。
体の形で蓄積した。この封入体を可溶化するには、高濃
度の還元剤 (DTT)を加えた 6 M塩酸グアニジンが最適で
あることが判明した。封入体のタンパク質の復元、特に
疎水性膜タンパク質の復元は困難なことが多く、実験条
件の入念な最適化を必要とするが、本発明の場合にはタ
ンパク質濃度が非常に低い場合 (0.05 mg/m ｌ) でも、
通常の透析又は段階的透析により組換え体 38 kDa タン
パク質の沈殿が得られた。一方では、セファデックス G
-25 による組換え体タンパク質の復元が有効であること
が判明し, その際タンパク質の再凝集は殆ど認められな
かった。約 200 mg の全タンパク質を含む封入体から、
銀着色した SDS-PAGE-ゲルが示すように、純度が95 %を
超える38 kDaタンパク質 19 mgを精製することができ
た。
【００５２】ミコバクテリウム・ツベルクロシスからの
38 kDa 抗原は間違いなくリポタンパク質と思われる
（D.B. Young and T.R. Garbe, Res. Microbiol. 142,
− (1991) 印刷中) 。リポタンパク質は SDS-PAGE-ゲル
上に特異な拡散したバンドを示す(16, 22)。他のリポタ
ンパク質の場合のように、本発明の組換え体 38 kDa 抗
原にも、陰イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過
による濃縮の際に明らかな凝集の傾向が認められた。限
外濾過の際に凝集した一部の抗原は、2 % トリトン X-1
00に溶解して Mono Q のFPLC処理により回収することが
できた。
38 kDa 抗原は間違いなくリポタンパク質と思われる
（D.B. Young and T.R. Garbe, Res. Microbiol. 142,
− (1991) 印刷中) 。リポタンパク質は SDS-PAGE-ゲル
上に特異な拡散したバンドを示す(16, 22)。他のリポタ
ンパク質の場合のように、本発明の組換え体 38 kDa 抗
原にも、陰イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過
による濃縮の際に明らかな凝集の傾向が認められた。限
外濾過の際に凝集した一部の抗原は、2 % トリトン X-1
00に溶解して Mono Q のFPLC処理により回収することが
できた。
【００５３】生の 38 kDa タンパク質は SDS- ポリアク
リルアミドゲル上に二重のバンドを示す。その理由は不
明であるが、或いはプレタンパク質のアシル化とプロセ
ッシングとによるものかも知れない。N-末端システイン
の所のリポイル部分の存在がタンパク質抗原の免疫原性
に重要であり得る(6) ので、抗原を高レベルで作製する
までは、シグナル配列を除去しなかった。本発明に於い
て精製した組換え体タンパク質は同様に二重のバンドを
示した。標品I では大部分上のバンドで、下のバンドは
僅かであったが、標品IIでは両方のバンドがほぼ同じ量
であった。標品III は 38 kDa 抗原のタンパク質分解的
に短くした誘導体 (約 33 kDa)である。
リルアミドゲル上に二重のバンドを示す。その理由は不
明であるが、或いはプレタンパク質のアシル化とプロセ
ッシングとによるものかも知れない。N-末端システイン
の所のリポイル部分の存在がタンパク質抗原の免疫原性
に重要であり得る(6) ので、抗原を高レベルで作製する
までは、シグナル配列を除去しなかった。本発明に於い
て精製した組換え体タンパク質は同様に二重のバンドを
示した。標品I では大部分上のバンドで、下のバンドは
僅かであったが、標品IIでは両方のバンドがほぼ同じ量
であった。標品III は 38 kDa 抗原のタンパク質分解的
に短くした誘導体 (約 33 kDa)である。
【００５４】ミコバクテリウム・ツベルクロシスの培養
上澄み液から分離した生の 38 kDaタンパク質と標品Ｉ
及びIIの精製した組換え体タンパク質とは、大きさが同
じであり、SDS-PAGE- ゲルの上に二重バント特性を有し
た。更に精製したタンパク質と生のタンパク質とはイム
ノブロット上で単クローン性抗体 HAT2, HBT12, HYT28
と同一の反応を示した。組換え体タンパク質 (標品Ｉ)
に対して形成された多クローン性抗体は生の抗原を認識
し、エリザに於いて生の抗原に対して形成された血清と
同様に反応した。両方の血清をエリザで組換え体抗原に
対して試験した場合にも同様な結果が得られた。これら
の結果から、組換え体タンパク質は、ミコバクテリウム
・ツベルクロシスから精製し得る生の 38 kDa タンパク
質と同様に、類似のエピトープを有し、同様に免疫原性
であることが判る。
上澄み液から分離した生の 38 kDaタンパク質と標品Ｉ
及びIIの精製した組換え体タンパク質とは、大きさが同
じであり、SDS-PAGE- ゲルの上に二重バント特性を有し
た。更に精製したタンパク質と生のタンパク質とはイム
ノブロット上で単クローン性抗体 HAT2, HBT12, HYT28
と同一の反応を示した。組換え体タンパク質 (標品Ｉ)
に対して形成された多クローン性抗体は生の抗原を認識
し、エリザに於いて生の抗原に対して形成された血清と
同様に反応した。両方の血清をエリザで組換え体抗原に
対して試験した場合にも同様な結果が得られた。これら
の結果から、組換え体タンパク質は、ミコバクテリウム
・ツベルクロシスから精製し得る生の 38 kDa タンパク
質と同様に、類似のエピトープを有し、同様に免疫原性
であることが判る。
【００５５】
【発明の効果】要約すれば、本発明に於いてミコバクテ
リウム・ツベルクロシスからの 38 kDa タンパク質をエ
シエリキア・コリに発現するシステムとその作製方法、
精製方法を開発したが、これによってこの抗原を大量に
分離することが可能になった。本組換え体抗原は生の抗
原と免疫学的に区別することができない。
リウム・ツベルクロシスからの 38 kDa タンパク質をエ
シエリキア・コリに発現するシステムとその作製方法、
精製方法を開発したが、これによってこの抗原を大量に
分離することが可能になった。本組換え体抗原は生の抗
原と免疫学的に区別することができない。
【００５６】これらの結果により、本抗原の診断及びワ
クチン開発に対する有用性の評価が増大するものと思わ
れる。
クチン開発に対する有用性の評価が増大するものと思わ
れる。
【００５７】生物体材料 λ-AA59: 2.0 kb EcoRI- フラグメント用ゲノムクロー
ン 文献 (3); 入手先: DSM 6524 M13mp19: 2.0 kb EcoRI- フラグメント導入用ファージ 入手先: Pharmacia pJLA603: 2.0 kb EcoRI- フラグメントの導入と変異誘
発後の M13mp19 のNdeI-SphI- フラグメントを受け入
れるためのベクター 文献 (20); 入手先: Medac (Hamburg, 独)
ン 文献 (3); 入手先: DSM 6524 M13mp19: 2.0 kb EcoRI- フラグメント導入用ファージ 入手先: Pharmacia pJLA603: 2.0 kb EcoRI- フラグメントの導入と変異誘
発後の M13mp19 のNdeI-SphI- フラグメントを受け入
れるためのベクター 文献 (20); 入手先: Medac (Hamburg, 独)
【００５８】引用文献 1. Andersen, A.B., and E.B. Hansen. 1989. タンパク質抗原 b、ミコバクテリウム・ツベルクロシス
（Mycodacterium tuberculosis）の38,000分子量タンパ
ク質の抗原領域の構造と地図作成 Infect. Immun. 57: 2481-2488. 2. Andersen, A.B., Z.-L. Yuan, K. Haslov, B. Verg
mann and J. Bennedsen.1986. イムノブロッティング及びエンザイムイムノソルベント
アッセイにより試験したミコバクテリウム・ツベルクロ
シス（ Mycobacterium tuberculosis ）に対する５種の
単クローン性抗体の種間反応性 J. Clin. Mocrobiol. 23: 446-451. 3. Andersen, A.B., A. Worsaae, and S.D. Chaparas.
1988. 免疫学的に重要と思われる８種のミコバクテリア抗原を
発現する組換え体λgt11 バクテリオファージの分離と
特徴づけ Infect. Immun. 56: 1344-1351. 4. Bothamley, G.H., J.S. Beck, G.M.T. Schreuder,
J. D'Amaro, R.R.P. deVries, T. Kardijito, and J. I
vanyi. 1989 結核症と HLAを有するミコバクテリウム・ツベルクロシ
ス（ Mycobacteriumtuberculosis ）特異性抗体レベル
との組み合わせ J. Infect. Dis. 159: 549-555. 5. Damerval, C., M. le Guilloux, J. Blaissonneau,
and D. de Vienne.1987. タンパク質銀染色法のHeukeshoven and Bernick による
簡易化 Elektrophoresis 8: 158-169. 6. Deres, K., H. Schild, K.-H. Wiesm7ller, G. Jun
g, and H.G. Ramensee.1989. 合成リポペプチドワクチンによるウイルス特異性細胞障
害性Ｔリンパ球の生体内開始 Nature 342: 561-564. 7. Halenbeck, R., E. Kawasaki, J. Wrin, and K. Ko
ths. 1989. エシエリキア・コリ（Escherichia coli）に発現された
生物学的活性の組換え体ヒトマクロファージ・コロニー
刺激因子の復元と精製 Biotechnology 7: 710-715. 8. Hanahan, D. 1983. エシエリキア・コリ（Escherichia coli）のプラスミド
による形質転換の研究 J. Mol. Biol. 166: 557-580. 9. Harboe, N., and A. Inglid. 1983. 免疫グロブリンの免疫化、分離と抗体の滴定測定 Scand. J. Immunol. 17S10: 345-351. 10. Kadival, G.V., S.D. Chaparas, and D. Hussong.
1987. ミコバクテリウム・ツベルクロシス（Mycobacterium tu
berculosis）から分離した 38 kDa 抗原の血清学的並び
に細胞を介しての反応性の特徴づけ J. Immunol. 139: 2447 -2451. 11. Laemmli, U.K. 1970. バクテリオファージ T4 の頭部の集合の際の構造タンパ
ク質の切断 Nature (London) 227: 680-683. 12. Ljungqvist, L., A. Worsaae, and I. Heron. 198
8. 近親交配マウスの11の菌株の中でのミコバクテリウム・
ツベルクロシス（ Mycobacterium tuberculosis ）に対
する抗体の応答: BALB.B10とCBA/J マウスのひ臓を用い
て、融合により生産した新規の単クロナール抗体の特異
性 Infect. Immun. 56: 1994-1998. 13. Lowry, O.H., A.L. Farr, N.J. Rosenbrough, and
R. Randall. 1951. フォリン・フェノール試薬によるタンパク質の測定 J. Biol. Chem. 193: 265-275. 14. McCarthy, J.E.G., and C. Bokelmann. 1988. エシエリキア・コリ（Escherichia coli）の atp オペ
ロンの翻訳開始効率の測定 Molec. Microbiol. 2: 455-465. 15. Maniatis, T., E.F. Fritsch, and J. Sambrook. 1
982. 分子クローニング: 実験室必携．Cold Spring Harbor L
aboratory, ColdSpring Harbor, N.Y. 16. Pugsley, A.P., C. Chapon, and M. Schwartz. 198
6. クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella Pneumoniae
）の細胞外プルラナーゼはリポタンパク質 J. Bacteriol. 166: 1083-1088. 17．Roth, J., M. Bendayan, E. Carlemalm, W. Villig
er, and M. Garavito.1981. 低温で包埋した膵臓組織に於ける構造保存の増強と免疫
細胞化学的染色 J. Histochem. Cytochem. 29: 663-669. 18. Sanger, F., S. Nicklen, and A.R. Coulson. 197
7. 鎖終結インヒビーターによる DNAの配列決定 Proc. Natl. Acad. Sci, USA 74: 5463-5467. 19. Sarmientos, P., M. Duchesne, P. Denefle, J. Bo
iziau, N. Fromage, N.Delaporte, F. Parker, Y. Leli
evre, J-F. Mayaux, and T. Cartwright.1989. エシエリキア・コリからの活性ヒト組織プラスミノーゲ
ン活性化因子の合成と精製 Biotechnology 7: 495-501. 20. Schauder, B., H. Bl6cker, R. Frank, and J.E.G.
McCarthy. 1987. エシエリキア・コリ atpE 翻訳開始領域を合体する誘導
発現ベクター Gene. 52: 279-283. 21. Schou, C., Z.-L. Yuan, A.B. Andersen, and J. B
ennedsen. 1985. ミコバクテリウム・ツベルクロシスに対する単クローン
性ハイブリドーマ抗体の生産と部分的特徴づけ Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand. Sect. C 9
3: 265-272. 22. Schouls, L.M., R. Mount, J. Dekkert, and J.D.
A. van Embden. 1989. エシエリキア・コリに発現したトレポネマ・パリドム
（ Treponema Palidum）の脂質修飾抗原性タンパク質の
特徴づけ Microbiol. Pathogen. 7: 175-188. 23. Styblo, K. 1989. 発展途上国の監視に重点を置いた世界の結核症の現状の
概観と疫学的評価 Rev. Infect. Dis. 11: 5339-5346. 24．Worsaae, A., L. Ljungqvist, K. Haslov, I. Hero
n, and J. Bennedsen.1987. 感作したモルモット中のミコバクテリウム・ツベルクロ
シスからの３種の抗原のアレルギー性活性と幼若化活性 Infect. Immun. 55: 2922-2927. 25. Worsaae, A., L. Ljungqvist, and I. Heron. 198
8. BALB.B10マウスに生産された単クローン性抗体はミコバ
クテリウム・ツベルクロシスの培養濾液調製に於ける新
規の抗原決定因子を定める。
（Mycodacterium tuberculosis）の38,000分子量タンパ
ク質の抗原領域の構造と地図作成 Infect. Immun. 57: 2481-2488. 2. Andersen, A.B., Z.-L. Yuan, K. Haslov, B. Verg
mann and J. Bennedsen.1986. イムノブロッティング及びエンザイムイムノソルベント
アッセイにより試験したミコバクテリウム・ツベルクロ
シス（ Mycobacterium tuberculosis ）に対する５種の
単クローン性抗体の種間反応性 J. Clin. Mocrobiol. 23: 446-451. 3. Andersen, A.B., A. Worsaae, and S.D. Chaparas.
1988. 免疫学的に重要と思われる８種のミコバクテリア抗原を
発現する組換え体λgt11 バクテリオファージの分離と
特徴づけ Infect. Immun. 56: 1344-1351. 4. Bothamley, G.H., J.S. Beck, G.M.T. Schreuder,
J. D'Amaro, R.R.P. deVries, T. Kardijito, and J. I
vanyi. 1989 結核症と HLAを有するミコバクテリウム・ツベルクロシ
ス（ Mycobacteriumtuberculosis ）特異性抗体レベル
との組み合わせ J. Infect. Dis. 159: 549-555. 5. Damerval, C., M. le Guilloux, J. Blaissonneau,
and D. de Vienne.1987. タンパク質銀染色法のHeukeshoven and Bernick による
簡易化 Elektrophoresis 8: 158-169. 6. Deres, K., H. Schild, K.-H. Wiesm7ller, G. Jun
g, and H.G. Ramensee.1989. 合成リポペプチドワクチンによるウイルス特異性細胞障
害性Ｔリンパ球の生体内開始 Nature 342: 561-564. 7. Halenbeck, R., E. Kawasaki, J. Wrin, and K. Ko
ths. 1989. エシエリキア・コリ（Escherichia coli）に発現された
生物学的活性の組換え体ヒトマクロファージ・コロニー
刺激因子の復元と精製 Biotechnology 7: 710-715. 8. Hanahan, D. 1983. エシエリキア・コリ（Escherichia coli）のプラスミド
による形質転換の研究 J. Mol. Biol. 166: 557-580. 9. Harboe, N., and A. Inglid. 1983. 免疫グロブリンの免疫化、分離と抗体の滴定測定 Scand. J. Immunol. 17S10: 345-351. 10. Kadival, G.V., S.D. Chaparas, and D. Hussong.
1987. ミコバクテリウム・ツベルクロシス（Mycobacterium tu
berculosis）から分離した 38 kDa 抗原の血清学的並び
に細胞を介しての反応性の特徴づけ J. Immunol. 139: 2447 -2451. 11. Laemmli, U.K. 1970. バクテリオファージ T4 の頭部の集合の際の構造タンパ
ク質の切断 Nature (London) 227: 680-683. 12. Ljungqvist, L., A. Worsaae, and I. Heron. 198
8. 近親交配マウスの11の菌株の中でのミコバクテリウム・
ツベルクロシス（ Mycobacterium tuberculosis ）に対
する抗体の応答: BALB.B10とCBA/J マウスのひ臓を用い
て、融合により生産した新規の単クロナール抗体の特異
性 Infect. Immun. 56: 1994-1998. 13. Lowry, O.H., A.L. Farr, N.J. Rosenbrough, and
R. Randall. 1951. フォリン・フェノール試薬によるタンパク質の測定 J. Biol. Chem. 193: 265-275. 14. McCarthy, J.E.G., and C. Bokelmann. 1988. エシエリキア・コリ（Escherichia coli）の atp オペ
ロンの翻訳開始効率の測定 Molec. Microbiol. 2: 455-465. 15. Maniatis, T., E.F. Fritsch, and J. Sambrook. 1
982. 分子クローニング: 実験室必携．Cold Spring Harbor L
aboratory, ColdSpring Harbor, N.Y. 16. Pugsley, A.P., C. Chapon, and M. Schwartz. 198
6. クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella Pneumoniae
）の細胞外プルラナーゼはリポタンパク質 J. Bacteriol. 166: 1083-1088. 17．Roth, J., M. Bendayan, E. Carlemalm, W. Villig
er, and M. Garavito.1981. 低温で包埋した膵臓組織に於ける構造保存の増強と免疫
細胞化学的染色 J. Histochem. Cytochem. 29: 663-669. 18. Sanger, F., S. Nicklen, and A.R. Coulson. 197
7. 鎖終結インヒビーターによる DNAの配列決定 Proc. Natl. Acad. Sci, USA 74: 5463-5467. 19. Sarmientos, P., M. Duchesne, P. Denefle, J. Bo
iziau, N. Fromage, N.Delaporte, F. Parker, Y. Leli
evre, J-F. Mayaux, and T. Cartwright.1989. エシエリキア・コリからの活性ヒト組織プラスミノーゲ
ン活性化因子の合成と精製 Biotechnology 7: 495-501. 20. Schauder, B., H. Bl6cker, R. Frank, and J.E.G.
McCarthy. 1987. エシエリキア・コリ atpE 翻訳開始領域を合体する誘導
発現ベクター Gene. 52: 279-283. 21. Schou, C., Z.-L. Yuan, A.B. Andersen, and J. B
ennedsen. 1985. ミコバクテリウム・ツベルクロシスに対する単クローン
性ハイブリドーマ抗体の生産と部分的特徴づけ Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand. Sect. C 9
3: 265-272. 22. Schouls, L.M., R. Mount, J. Dekkert, and J.D.
A. van Embden. 1989. エシエリキア・コリに発現したトレポネマ・パリドム
（ Treponema Palidum）の脂質修飾抗原性タンパク質の
特徴づけ Microbiol. Pathogen. 7: 175-188. 23. Styblo, K. 1989. 発展途上国の監視に重点を置いた世界の結核症の現状の
概観と疫学的評価 Rev. Infect. Dis. 11: 5339-5346. 24．Worsaae, A., L. Ljungqvist, K. Haslov, I. Hero
n, and J. Bennedsen.1987. 感作したモルモット中のミコバクテリウム・ツベルクロ
シスからの３種の抗原のアレルギー性活性と幼若化活性 Infect. Immun. 55: 2922-2927. 25. Worsaae, A., L. Ljungqvist, and I. Heron. 198
8. BALB.B10マウスに生産された単クローン性抗体はミコバ
クテリウム・ツベルクロシスの培養濾液調製に於ける新
規の抗原決定因子を定める。
【００５９】Infect. Immun. 56: 2608-2614. 26. Young, D., L. Kent, A. Rees, J. Lamb, and J. I
vanyi. 1986. ミコバクテリウム・ツベルクロシスから精製した 38 キ
ロダルトンタンパク質の免疫学的活性 Infect. Immun. 54: 177-183. 27. Young, R.A., B.R. Bloom, C.M. Grosskinsky, J.
Ivanyi, D.D. Thomas,and R.W. Davis. 1985. 組換え体 DNA を用いたミコバクテリウム・ツベルクロ
シス抗原の切開 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 2583-2587. 28. Zucker, M., and P. Stiegler. 1981. 熱力学と補助情報を用いた、大きな RNA配列の最適コン
ピュータ折りたたみ Nucl. Acids Res. 9: 133-148.
vanyi. 1986. ミコバクテリウム・ツベルクロシスから精製した 38 キ
ロダルトンタンパク質の免疫学的活性 Infect. Immun. 54: 177-183. 27. Young, R.A., B.R. Bloom, C.M. Grosskinsky, J.
Ivanyi, D.D. Thomas,and R.W. Davis. 1985. 組換え体 DNA を用いたミコバクテリウム・ツベルクロ
シス抗原の切開 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 2583-2587. 28. Zucker, M., and P. Stiegler. 1981. 熱力学と補助情報を用いた、大きな RNA配列の最適コン
ピュータ折りたたみ Nucl. Acids Res. 9: 133-148.
【図１】図１ａ及び図１ｃは、それぞれ 38 kDa タンパ
ク質のプレフォーム及び、短縮した形をコードする、形
成された遺伝子の5'末端のヌクレオチド配列図。図１ｂ
及び、図１ｄは、それぞれ辞１ａ及び、図１ｃのATG 出
発コドンの領域に於けるRNA の安定性を示す図。
ク質のプレフォーム及び、短縮した形をコードする、形
成された遺伝子の5'末端のヌクレオチド配列図。図１ｂ
及び、図１ｄは、それぞれ辞１ａ及び、図１ｃのATG 出
発コドンの領域に於けるRNA の安定性を示す図。
【図２】発現プラスミドの形成を示す図。
【図３】図３ａ及び図３ｂは、バッチ培養及びバイオリ
アクターに於けるエシエリキア・コリ CAG629 の中での
組換え体 38 kDa タンパク質の発現図。
アクターに於けるエシエリキア・コリ CAG629 の中での
組換え体 38 kDa タンパク質の発現図。
【図４】CAG629 (pMS9-2) の断面の電子顕微鏡写真。
【図５】種々の精製段階における SDS-12.5 %-PAGE-(銀
染色)-分析結果の図。
染色)-分析結果の図。
【図６】FPLCで精製した 38 kDa タンパク質標品の SDS
-PAGE-分析とイムノブロット分析結果の図。
-PAGE-分析とイムノブロット分析結果の図。
【図７】図７ａ及び図７ｂは、それぞれ生の 38 kDa 抗
原と組換え体 38 kDa 抗原との銀染色比較図及びレーザ
ーデンシトメトリーによる免疫反応性比較図。
原と組換え体 38 kDa 抗原との銀染色比較図及びレーザ
ーデンシトメトリーによる免疫反応性比較図。
【図８】図８ａ及び図８ｂは、それぞれ組換え体 38 kD
a タンパク及び生の 38 kDa タンパク質の 38 kDa 抗原
による滴定曲線図。
a タンパク及び生の 38 kDa タンパク質の 38 kDa 抗原
による滴定曲線図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 39/04 ＡＤＺ 9284−4Ｃ Ｃ０７Ｋ 13/00 8619−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ 15/31 15/62 // Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/569 Ｆ 9015−2Ｊ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/31 Ｃ１２Ｒ 1:32） (72)発明者 マハビヤ・シン ドイツ連邦共和国 デー−3000 ブラウン シュヴァイク、マシェローデル・ヴェーク １ (72)発明者 ケニス・ナイジェル・ティムス ドイツ連邦共和国 デー−3000 ブラウン シュヴァイク、マシェローデル・ヴェーク １ (54)【発明の名称】 ミコバクテリウム・ツベルクロシス（ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ ｓ ）の 38 ｋＤａ 抗原発現用のハイブリッドプラスミド、ハイブリッドプラスミドの宿主 としてのエシエリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、 38 ｋＤａ 抗原及び 約 33 ｋＤａ の大きさのタンパク質
Claims (12)
- 【請求項１】 ミコバクテリウム・ツベルクロシス（My
cobacterium tuberilosis ）の融合していない 38 kD
a 抗原をエシエリキア・コリ（Escherichiacoli）に発
現するためのハイブリッドプラスミドであって、該プラ
スミドが − 38 kDa抗原 (プレタンパク質) のシグナル配列と − その認識配列の中に、読み取り方向で最初のアミノ
酸Ｍをコードする３塩基連鎖ATG を含む１個の制限部位
とを含む前記プラスミド。 - 【請求項２】 前記 38 kDa 抗原が、野性型ミコバクテ
リウム・ツベルクロシス（Mycobacterium tuberculosis
）の１種のタンパク質か、或いは同様に結核症を惹起
し得る一種の変異型ミコバクテリウム・ツベルクロシス
（Mycobacterium tuberculosis ）の１種のタンパク質
かの何れかで有ることを特徴とする請求項１のハイブリ
ッドプラスミド。 - 【請求項３】 前記シグナル配列が、17, 18, 19, 20,
21, 22, 23 又は24 個のコドンを含むことを特徴とする
請求項１又は２のハイブリッドプラスミド。 - 【請求項４】 前記Ｎ末端の 38 kDa 抗原 (プレタンパ
ク質) をコードするDNA-配列が原料べクター、例えば p
JLA603の１個の Ncol-部位、Nde I-部位又はSphI-部位
に挿入してあることを特徴とする前記請求項の何れか１
項のハイブリッドプラスミド。 - 【請求項５】 前記 38 kDa 抗原 (プレタンパク質) を
コードする、図1A又は図1Cの１個のDNA-配列を特徴とす
る前記請求項の何れか１項のハイブリッドプラスミド。 - 【請求項６】 前記請求項の何れか１項のハイブリッド
プラスミドを有するエシエリキア・コリ。 - 【請求項７】 シグナル配列が 17 乃至 24 個のコドン
を含み、その際23個のコドンを含む１個のシグナル配列
が除去されている、請求項６のエシエリキア・コリ（Es
cherichiacoli ）を用いて生産可能の、ミコバクテリウ
ム・ツベルクロシス（Mycobacterium tuberculosis ）
の 38 kDa 抗原 (プレタンパク質) 。 - 【請求項８】 次のシグナル配列、 ＭＫＩＲＬＨＴＬＬＡＶＬＴＡＡＰＬＬＬＡＡＡＧ の内の 17 乃至 22 個のアミノ酸、例えば第１(M) と第
８(L) から第23(G) までのアミノ酸を特徴とする請求項
７の 38 kDa 抗原 (プレタンパク質) 。 - 【請求項９】 発現プラスミドとしての pJLA603の宿主
としてのエシエリキア・コリ（Escherichia coli）を用
いて取得可能の、次の特性を有する約 33 kDa の大きさ
のタンパク質。 − ミコバクテリウム・ツベルクロシス（Mycobacteriu
m tuberculosis ）のＮ末端の 38 kDa 抗原 (プレタン
パク質) をコードする１個のDNA-配列が pJLA603の１個
の Ncol-部位、Nde I-部位又は Sphl-部位に挿入してあ
り、 − この挿入したDNA-配列が抗原のシグナル配列を含
み、 − 前記部位の認識配列が読み取り方向で最初のアミノ
酸Ｍをコードする３塩基連鎖ATG を含み、且つ − 約 33 kDa の大きさの前記タンパク質が、場合によ
っては同様に発現した38 kDa 抗原から分離されてい
る。 - 【請求項１０】 ミコバクテリウム・ツベルクロシス
（Mycobacterium tuberculosis ）のＮ末端の 38 kDa
抗原 (プレタンパク質) に対してシグナル配列とさらに
24 個のアミノ酸だけ欠如していることを特徴とする約
33 kDa の大きさのタンパク質。 - 【請求項１１】 請求項６のエシエリキア・コリ（Esch
erichia coli）を用いて生産され、且つ次の方法で復元
されるミコバクテリウム・ツベルクロシス（Mycobacter
ium tuberculosis ）の 38 kDa 抗原及び／又は約 33
kDa の大きさのタンパク質。 − 封入体として生成する抗原及び／又はタンパク質を
（場合によっては１種の還元剤の存在下で）塩酸グアニ
ジンに可溶性とし、 − 次にセファデックス・クロマトグラフィーにより復
元する。 - 【請求項１２】− 可溶化の際に約６Ｍの塩酸グアニジ
ンを用い、及び／又はジチオトレイトール（DTT) の存
在下で処理し、及び／又は − 復元をセファデックス G-25 を用いて実施したこと
を特徴とする請求項１１の 38 kDa 抗原及び／又は約 3
3 kDa の大きさのタンパク質。
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