JPH0534945B2

JPH0534945B2 -

Info

Publication number: JPH0534945B2
Application number: JP22699185A
Authority: JP
Inventors: Keiichi Yamada; Masaaki Kitajima; Masao Karya; Chikao Tozaki
Original assignee: Japan Synthetic Rubber Co Ltd
Current assignee: JSR Corp
Priority date: 1985-10-14
Filing date: 1985-10-14
Publication date: 1993-05-25
Also published as: JPS6287092A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、接着依存性細胞の担体粒子への接着
方法および装置に関するものである。

〔従来の技術〕

一般に細胞の培養においては、培養対象細胞が
浮遊増殖性細胞、すなわち液体培地中に細胞自体
が浮遊した状態で増殖することが可能な細胞であ
る場合には、その栄養源である液体培地中に浮遊
させることにより培地と接触させるが、細胞が接
着依存性細胞、すなわち液体培地中における生育
および増殖において基質に対する接着が必須の細
胞である場合には、適当な基質の表面に当該細胞
を接着させたうえで液体培地と接触させることが
必要である。そして接着依存性細胞を接着させる
基質としては、大きな接着面積を容易に得ること
ができることから、最近においては小径の担体粒
子（以下、単に「担体粒子」という。）が用いら
れるようになつてきている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかして目的とする接着依存性細胞（以下、単
に「細胞」という。）の培養を高い効率で行うた
めには、培養対象細胞を担体粒子に接着させる際
に、当該細胞の混合された液体培地中において担
体粒子を高い分散度で分散させることができれ
ば、当該細胞の接着に利用することができる担体
粒子の表面の有効利用面積が大きくなり、培養効
率を高めるうえで極めて有利である。

従来において、培養対象細胞を担体粒子に接着
させる方法としては、液体培地中に培養対象細胞
と担体粒子とを混合した系を回転翼によつて撹拌
する方法が一般的であるが、しかしながらこの方
法は、液体培地、細胞および担体粒子からなる混
合系に剪断力を加えて分散を行う方法であるた
め、回転翼を回転した状態、すなわち細胞および
担体粒子の分散を行つている状態では、当該細胞
を担体粒子に接着させることが困難である。した
がつて細胞を担体粒子に接着させるために、静置
工程と撹拌工程とを繰り返して実行しなければな
らず、その結果、担体粒子に接着する細胞の数に
偏りが生じやすく、結局担体粒子の表面の有効利
用面積が小さくなり、接着効率を十分高めるに至
つていない。

このような問題点を解消するために種々の方策
が研究されてはいるが、かかる問題点を本質的に
解決する細胞の担体粒子への接着方法および装置
は未だ開発されていないのが現状である。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、以上のような事情に基いて鋭意研究
を重ねた結果完成されたものであつて、その目的
とするところは、液体培地中において細胞を担体
粒子に高い効率で接着させることができる接着方
法および装置を提供することにある。

本発明方法の特徴とするところは、液体培地、
細胞および担体粒子よりなる混合系を実質的に充
満するように充填した容器を水平に対し０〜55゜
の範囲の角度に保持した軸の周りに自転するよう
に回転させて当該混合系を前記容器と共に定常的
に回転させ、これにより当該混合系内において担
体粒子に細胞を接着させる点にある。

また本発明装置の特徴とするところは、水平に
対し０〜55゜の範囲の角度に軸支された回転軸を
有する容器と、この容器をその軸の周りに自転す
るよう回転させる駆動機構とを有してなり、前記
駆動機構は前記容器内に実質的に充満するように
充填された液体培地、細胞および担体粒子よりな
る混合系を容器と共に定常的に回転させる機能を
有するものである点にある。

以下、本発明について具体的に説明する。

本発明においては、第１図および第２図に示す
ように、例えば円筒状の密閉された容器１内に、
細胞および担体粒子２を混合した液体培地３を、
容器１の内部空間に実質的に充満されるように充
填し、容器１の軸Ｘを水平面(H)に対し、０〜55゜、
好ましくは０〜45゜、特に好ましくは０〜5゜の範
囲の角度（α）に保持させた状態で、この軸Ｘの
周りに容器１を一定の回転速度で自転させる。こ
のとき角度（α）が過大であると細胞および担体
粒子の液体培地中への分散性が低下し、すなわち
細胞および担体粒子２が液体培地３の一部に偏つ
て存在するようになつて効率的な接着を行うこと
が困難となる。

このように容器１を自転させることによつて、
自転開始直後の初期期間を経過した後は、容器１
内の液体培地３と細胞および担体粒子２との混合
系が液体培地３の粘性により容器１といわば一体
的に機械的な流れのない状態で軸Ｘの周りに定常
的に回転するようになる。従つて細胞および担体
粒子２は、容器１内の液体培地３に対する相対的
位置をほとんど変えることなく容器１外に対する
存在位置を変えることとなり、このため容器１内
の細胞および担体粒子２には順次異なる方向から
重力が作用する状態となり、これにより細胞およ
び担体粒子２が液体培地３中に高い分散度で分散
するようになる。このような状態は、細胞および
担体粒子２の比重および大きさ、液体培地３の比
重および粘性、容器１の回転速度などを適宜に選
定することによつて実現することができる。

このような回転操作期間中において、混合系内
の細胞および担体粒子２に着目すると、１個の細
胞または担体粒子は、第３図に模式的に示すよう
に、液体培地３内において、相対的に矢印Ａに示
すような円運動をすることとなり、この運動力に
より細胞および担体粒子２が液体培地３内におい
て均一に分散するようになるものと推察される。
この分散は、条件にもよるが極めて速やかに生ず
るものであり、細胞および担体粒子２は軸Ｘ方向
にも分散するようになるため、極めて高い分散度
で細胞および担体粒子２を液体培地３内に分散さ
せることができる。

本発明においては、容器内に液体培地、細胞お
よび担体粒子を充填するために特殊な方法を必要
とするものではなく、例えば事前に混合された液
体培地、細胞および担体粒子の混合系を充填して
もよく、あるいは液体培地に細胞を加え、次いで
担体粒子を加えてもよく、また液体培地に担体粒
子を加え、次いで細胞を加えてもよい。

本発明の適用においては、用いる細胞は担体粒
子への接着性を有するものであれば何ら制限され
るものではなく、例えばヒト子宮ガン細胞
HeLa、チヤイニーズ−ハムスター肺繊維芽細胞
Ｖ−79、ヒト胎児肺細胞MRC−５、チンパンジ
ー肝繊維芽細胞、ヒト包皮細胞、ニワトリ胎児繊
維芽細胞、初代サル腎細胞、マウス転移繊維芽細
胞、脳下垂体腫瘍細胞、リンパ球系細胞などを挙
げることができる。

本発明の適用において、用いる液体培地は特に
限定されるものではなく、公知の培地をそのまま
使用することができ、例えば１〜30％（Ｖ／Ｖ）
の子牛血清または牛胎児血清を含むミニマル−エ
ツセンシヤル培地（minimal essential
medium：汎用細胞培養用基礎培地）、１〜30％
（Ｖ／Ｖ）の子牛血清または牛胎児血清を含むダ
ルベツコ変法イーグル培地、HB 101（ハナバイ
オロジクス社製）、HB 102（ハナバイオロジクス
社製）などを挙げることができる。これらの液体
培地の比重は1.00〜1.05のものが一般的である。
なおこれらの液体培地には、通常、酸素および炭
酸ガスを溶存させることが必要である。また細胞
の担体粒子への接着時の液体培地の温度は、通
常、30〜40℃であり、好ましくは37℃である。

本発明の適用において、用いる担体粒子は特に
限定されるものではなく、細胞の接着性さらには
増殖性に適したものであればよく、例えばポリス
チレンなどの合成高分子材料、またはタン白質、
多糖類などの天然高分子材料により表面が形成さ
れた粒子を挙げることができる。かかる担体粒子
は、磁性を有するものであることが有利であり、
そのような担体粒子を用いるときには、磁石を用
いて担体粒子の捕集、移動、処理、その他の取扱
いを簡便に、且つ迅速に行うことが可能となる。
磁性を有する担体粒子としては、磁性体粉を前記
高分子材料により結着してなるもの、磁性を有す
るコアを前記高分子材料により被覆してなるもの
などを例示することができ、磁性体粉または磁性
を有するコアを形成するための磁性体の具体例と
しては、鉄、コバルト、ニツケル、これらの合
金、低炭素鋼、ケイ素鋼、γ−酸化鉄、フエライ
ト、マグネタイトなどを挙げることができる。担
体粒子の比重は、液体培地の粘性および比重など
によつても異なるが、一般的に1.0〜1.5の範囲内
のものとされる。また担体粒子の粒径は40〜
500μm程度が好ましく、形状は球形が望ましい
が、顆粒状、円筒状などであつてもよく、不定形
のものであつても差支えない。

液体培地１ml当りの細胞の播種量は、一般的に
は１×10⁴〜１×10⁶個であり、また使用する担体
粒子の数は、通常、液体培地１ml当り１×10⁴〜
１×10⁷個程度であり、担体粒子１個当たりの播
種細胞数は、一般的には１〜10個程度である。

本発明においては、容器内には液体培地、細胞
および担体粒子の混合系が、空間が存在しないよ
うに充満状態に充填されていることが望ましく、
これによつて当該混合系を容易に容器と共に回転
させることが可能となり、空間が存在するときに
もそれが僅かであればその空間が存在することに
よる液体培地における撹乱は容器内の混合系の上
層部分の僅かな領域に限定されるので、事実上本
発明による効果を無効とするものではない。しか
し容器内の空間の割合が多くなると混合系を実質
的に撹乱することなく容器と共に回転させること
が困難となる傾向が生じ、本発明の目的を達成す
ることができない。従つて本発明においては、容
器内における混合系の充填割合が80容量％以上の
場合を実質的な充満状態とし、好ましくは90容量
％以上であり、特に好ましくは98容量％以上であ
る。

本発明において、容器の自転における回転速度
は、細胞または担体粒子の大きさおよび比重、液
体培地の粘度、容器の形状および大きさなどを勘
案して選定され、一概に規定することはできない
が、通常は５〜50r.p.m.、好ましくは10〜30r.p.
m.程度の回転速度となるように容器を回転させ
る。

また容器の形状は、既述の例におけるように、
円筒状であることが好ましいが角筒状、あるいは
球状であつても何ら支障がなく、回転方式も特に
限定されるものではなく、すなわち容器の上下が
入れ替わるように実質的に鉛直面内で回転されれ
ばよく、例えば第４図に示すように、回転軸１０
の周りに回転するアーム１１の先端に容器１２を
保持させて鉛直面内で円運動させるようにしても
よく、またあるいは第５図に示すように、円筒状
容器２０をその半径方向に伸びる軸Ｙの周りに自
転するよう回転させてもよい。

また、本発明においては、液体培地を交換しな
がら細胞の担体粒子への接着を行うこともでき
る。

第６図は本発明に係る装置の一例を示すもので
あり、この図の例においては、底板３０と有底筒
状の容器本体３１とにより容器が構成されてい
る。すなわち、容器本体３１は底板３０に固定し
て設けた押え機構３２によつて底板３０にＯ−リ
ング３３を介して押圧され、その内部空間が接着
操作領域とされる。底板３０は回転スリーブ３５
に固定され、この回転スリーブ３５は、ドライベ
アリング３６を介してスタンド３７によつて保持
された外套部材３８に回転自在に保持され、この
回転スリーブ３５の軸Ｚは、水平面(H)に対し０〜
55゜、好ましくは０〜45゜、特に好ましくは０〜5゜
の範囲の角度（α）に保持されている。底板３０
はその中央に開口を有し、この開口は、液体培地
は透過するが細胞および担体粒子を透過しないフ
イルター部材、例えばメツシユ４０により塞がれ
ており、このメツシユ４０を貫通して容器本体３
１の内部に伸びる内導管４１がメツシユ４０に固
定されている。この内導管４１は、容器本体３１
の内部に位置された一端に開口４３を有し、他端
は回転スリーブ３５内を通つて外方に伸び、その
端部が連結シール部５０において外部よりの供給
管５１に連通するようにこれに回転自在に連結さ
れている。回転スリーブ３５の内周には外導管４
２が内導管４１を囲む二重管構造となるよう固定
して設けられ、外導管４２の一端開口４４は底板
３０の開口に連通するよう連結されており、その
他端は連結シール部５０において外部よりの排出
管５２に連通するようにこれに回転自在に連結さ
れている。６０は回転スリーブ３５に固定した被
動歯車であり、この被動歯車６０はモータ（図示
せず）によつて駆動される駆動歯車６１と噛合し
ている。

以上の如き構成の装置においては、駆動歯車６
１が駆動されることによつて回転スリーブ３５が
回転し、これによつて底板３０と容器本体３１と
により構成される容器がその軸Ｚの周りに回転さ
れ、同時に内導管４１および外導管４２も共に回
転する。

しかしてこの装置においては、液体培地、細胞
および担体粒子の混合系を容器内に実質的に充満
するよう充填した状態で、容器を水平に対して０
〜55゜の範囲の角度に軸支された軸Ｚの周りに自
転するように回転させながら接着操作が行われる
ため、容器内において、実質上剪断力を与えるこ
となく高い分散度で細胞および担体粒子を分散さ
せることができ、従つて細胞および担体粒子の分
散を行いながら細胞と担体粒子との接触頻度を十
分大きくすることができ、この結果担体粒子に細
胞を効率よく接着させることができる。

さらに、この装置においては、液体培地の交換
を連続的に行うことができるために、接着に引き
続く培養を効率よく行うこともできる。

〔実施例〕

以下、本発明の実施例について説明する。

実施例１細胞：チヤイニーズハムスター肺繊維芽細胞由
来の「Ｖ−79」細胞液体培地：酸素および炭酸ガスを溶存する10％
（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清を含む「MEM」培地（粘度：0.01poise、比重：1.01）担体粒子：デキストラン粒子「Cytodex3」
（Pharmacia社製）（粒径：180μm、比重：1.03）容量300mlの筒状容器中に、乾燥重量で750mg
（約2.5×10⁶個）の上記担体粒子を入れると共に
上記液体培地を満し、これに８×10⁶個の上記細
胞を播種し、空気が入らないように密閉した後、
容器の回転軸を水平に保持した状態で、温度37℃
の環境下において４時間に亘り回転数15r.p.m.で
容器を回転させ、もつて細胞の担体粒子への接着
操作を行つた。

その結果、細胞が接着しなかつた担体粒子の割
合は約５％であり、細胞が接着した担体粒子の
個々における接着細胞数は２〜４個（平均3.2個）
であり、全担体粒子上の細胞数は7.5×10⁶個であ
つた。

実施例２第６図に示した構成の内容積が１の容器を有
する装置を用い、実施例１におけると同様の細
胞、液体培地および担体粒子を用いて細胞の接着
操作を行なつた。すなわち液体培地１に対して
乾燥重量で３ｇ（約1.0×10⁷個）の担体粒子を用
い、３×10⁷個の細胞を播種し、容器内に空気が
入らないようにしてこれら液体培地、細胞および
担体粒子の混合系を充填し、容器の回転軸を水平
とした状態で、温度37℃の環境下において４時間
に亘り回転数12r.p.m.で容器を回転させ、もつて
細胞の担体粒子への接着操作を行つた。

その結果、細胞が接着しなかつた担体粒子の割
合は約4.8％であり、細胞が接着した担体粒子の
個々における接着細胞数は２〜５個（平均2.8個）
であり、全担体粒子上の細胞数は2.76×10⁷個で
あつた。

比較例１内容積２のスピンナービンを用い、実施例１
におけると同様の細胞、液体培地および担体粒子
を用いて細胞の接着操作を行なつた。すなわちス
ピンナービンに液体培地１に対して乾燥重量で
３ｇの担体粒子を加え、ついで３×10⁷個の細胞
を播種し、温度37℃の環境下において回転子の回
転数を30r.p.m.として４時間に亘り回転させた。

その結果、細胞が接着しなかつた担体粒子の割
合は約48.6％であり、細胞が接着した担体粒子の
個々における接着細胞数は０〜７個（平均1.4個）
であり、全担体粒子上の細胞数は1.52×10⁷個で
あつた。

実施例３第６図に示した構成の内容積が１の容器を有
する装置を用い、実施例１におけると同様の細
胞、液体培地および担体粒子を用いて細胞の接着
操作を行なつた。すなわち液体培地１に対して
乾燥重量で３ｇ（約1.0×10⁷個）の担体粒子を用
い、３×10⁷個の細胞を播種し、容器内に空気が
入らないようにしてこれらの液体培地、細胞およ
び担体粒子の混合系を充填し、容器の回転軸の角
度を水平面に対して45゜とした状態で、温度37℃
の環境下において４時間に亘り回転数15r.p.m.で
容器を回転させ、もつて細胞の担体粒子への接着
操作を行つた。

その結果、細胞が接着しなかつた担体粒子の割
合は約５％であり、細胞が接着した担体粒子の
個々における接着細胞数は２〜４個（平均2.5個）
であり、全担体粒子上の細胞数は2.4×10⁷個であ
つた。

〔発明の効果〕

以上詳細に説明したように、本発明によれば、
容器内に液体培地、細胞および担体粒子の混合系
を実質的に充満するよう充填した状態で、しかも
容器を水平に対し０〜55゜の範囲の角度に保持し
た軸の周りに自転するように回転させるので、容
器内において、実質上剪断力を与えることなく高
い分散度で細胞および担体粒子を分散させること
ができ、従つて細胞および担体粒子の分散を行い
ながら細胞と担体粒子との接触頻度を十分大きく
することができる。この結果、担体粒子に細胞を
効率よく接着させることができ、結局、細胞の担
体粒子への接着を高い効率で達成することができ
る接着方法および装置を提供することができる。
そしてこのように細胞を担体粒子に高い効率で接
着させることができるので、担体粒子の有効利用
面積が大きくなり、通常、細胞の接着操作に続い
て行われる細胞の培養工程においても効率的に細
胞の培養を行うことが可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は本発明の一例についての
説明用斜視図および断面図、第３図は液体培地中
における担体粒子の運動についての説明図、第４
図および第５図はそれぞれ本発明の他の例を示す
説明用断面図および斜視図、第６図は本発明に係
る装置の一例を示す説明用断面図である。１，１２，２０……容器、２……接着依存性細
胞および担体粒子、３……液体培地、３０……底
板、３１……容器本体、３２……押え機構、３３
……Ｏ−リング、３５……回転スリーブ、３６…
…ドライベアリング、３７……スタンド、３８…
…外套部材、４０……メツシユ、４１……内導
管、４２……外導管、５０……連結シール部、５
１……供給管、５２……排出管、６０……被動歯
車、６１……駆動歯車。

Claims

【特許請求の範囲】１液体培地、接着依存性細胞および担体粒子よ
りなる混合系を実質的に充満するように充填した
容器を水平面に対し０〜55゜の範囲の角度に保持
した軸の周りに自転するように回転させて当該混
合系を前記容器と共に定常的に回転させ、これに
より当該混合系内において担体粒子に接着依存性
細胞を接着させることを特徴とする接着依存性細
胞の担体粒子への接着方法。２水平面に対し０〜55゜の範囲の角度に軸支さ
れた回転軸を有する容器と、この容器をその回転
軸の周りに自転するよう回転させる駆動機構とを
有してなり、前記駆動機構は前記容器内に実質的
に充満するように充填された液体培地、接着依存
性細胞および担体粒子よりなる混合系を容器と共
に定常的に回転させる機能を有するものであるこ
とを特徴とする接着依存性細胞の担体粒子への接
着装置。