JPH0461636B2

JPH0461636B2 -

Info

Publication number: JPH0461636B2
Application number: JP59088345A
Authority: JP
Inventors: Chikao Tozaki; Keiichi Yamada; Masao Karya
Original assignee: Japan Synthetic Rubber Co Ltd
Current assignee: JSR Corp
Priority date: 1984-05-04
Filing date: 1984-05-04
Publication date: 1992-10-01
Also published as: DE3568798D1; EP0164888B1; CA1260418A; JPS60232088A; EP0164888A1

Description

【発明の詳細な説明】本発明は細胞培養方法に関するものである。

一般に細胞の培養においては、培養対象細胞が
浮遊増殖性細胞、すなわち液体培地中に細胞自体
が浮遊した状態で増殖が可能な細胞である場合に
は、その栄養源である液体培地中に浮遊させるこ
とにより培地と接触させることが、或いは細胞が
接着依存性細胞、すなわち液体培地中における生
育および増殖において基質に対する接着が必須の
細胞である場合には、適当な基質の表面に当該細
胞を接着させた上で液体培地と接触させることが
必要である。そして接着依存性細胞を接着させる
基質としては、大きな接着面積を容易に得ること
ができることから、最近においては小径の担体粒
子が用いられるようになつてきている。

而して目的とする細胞の培養を高い効率で実行
するためには、培養対象細胞を常に新しい培地と
接触させることが肝要であり、そのためには浮遊
増殖性細胞または接着依存性細胞を接着した担体
粒子（以下これらを合せて単に「細胞」というこ
とがある。）を液体培地中に高い分散度で分散せ
しめることが必要である。

また接着依存性細胞を基質である担体粒子に接
着させる際にも、当該細胞が加えられた液体培地
中において担体粒子を高い分散度で分散せしめる
ことができれば、当該担体粒子の表面が有効に平
均して利用されるようになり、従つて結局は高い
接着率で接着を達成することができて培養効率を
高める上で極めて有利である。

従来において、細胞を常に新しい液体培地に接
触させるための方法としては、液体培地中に細胞
を加えた系を回転翼によつて撹拌する方法が一般
的であるが、この方法は液体培地と細胞とより成
る混合系に剪断力を加える方法であるため、回転
翼との衝突により或いは大きな剪断力の作用によ
り培養中の細胞が損傷されることを回避すること
ができず、従つて培養効率が低く、細胞の種類に
よつてはこの方法を用いることができない場合も
あるという欠点を有する。またこの方法による大
量培養のための大容量の細胞培養装置の場合に
は、撹拌のために大型の撹拌機が必要となり、従
つて必然的な剪断力も大きくなるために培養効率
がさらに低下するようになるという欠点をも有す
る。このような欠点を解消するために種々の方策
が研究されているが、上記欠点を本質的に解決す
る細胞培養方法が見出されていないのが現状であ
る。

本発明は、以上の如き事情に基き鋭意研究を重
ねた結果完成されたものであつて、その目的とす
るところは、液体培地と細胞とより成る混合系に
本質的に剪断力を与えることなく、液体培地中に
細胞を均一に分散させることができ、高い効率で
細胞の培養を行うことのできる方法を提供するこ
とにある。

本発明の特徴とするところは、液体培地および
接着依存性細胞を付着してなる被分散粒子もしく
は浮遊増殖性細胞より成る混合系を充填割合が98
容量％以上となるように充填した培養容器を実質
上水平な軸の周りに自転するように回転せしめる
か、または、実質上水平な軸から離れた状態で培
養容器を当該軸の周りに回転せしめることにより
当該混合系を前記培養容器と共に回転せしめ、こ
れにより、当該混合系内において前記被分散粒子
もしくは浮遊増殖性細胞を運動せしめ、以つて前
記被分散粒子もしくは浮遊増殖性細胞を前記液体
培地中に分散せしめる工程を有する点にある。

以下本発明について具体的に説明する。

本発明においては、第１図および第２図に示す
ように、例えば円筒状の密閉された培養容器１内
に、細胞２を加えた液体培地３を、培養容器１の
内部空間に実質的に充填されるよう充填し、培養
容器１の軸Ｘを実質上水平に保つてこの軸Ｘの周
りに培養容器１を一定の回転速度で自転せしめ
る。そして培養容器１を自転させることによつ
て、自転開始直後の初期期間を経過した後は、内
部の液体培地３と細胞２との混合系が液体培地３
の粘性により培養容器１と共にいわば一体的に機
械的な流れのない状態で軸Ｘの周りに定常的に回
転するようにする。

このように培養容器１と共に回転する混合系内
において、細胞２は液体培地３の粘性により液体
培地３中の相対的位置をほとんど変えずに培養容
器外に対する存在位置を変えることとなり、従つ
て細胞２は実質上順次異なる方向から重力が作用
する状態とすることが可能であり、これは細胞２
の比重および大きさ、液体培地３の比重および粘
性、培養容器１の回転速度などを適宜に選定する
ことによつて実現することができる。

斯かる状態において、前記混合系内の細胞２に
ついて見ると、１個の細胞２は、第３図に模式的
に示すように、液体培地３内において、相対的に
矢印Ａに示すような円運動をすることとなり、こ
の運動力により細胞２が液体培地３内において均
一に分散するようになるものと推考される。この
分散は、条件にもよるが極めて速やかに生ずるも
のであり、細胞２は軸Ｘ方向にも均一に分散する
ようになるため、極めて高い分散度で細胞２を液
体培地３内に分散せしめることができる。この軸
Ｘ方向の分散は、その理由は十分に解明されてい
ないが、液体培地３内に拡散するよう動く対流が
生ずるからであるとも推考され、更に、これには
回転開始直後の初期期間における細胞２の軸Ｘ方
向における分布状態の熱力学的不均一さが関与し
ているとも推考される。

本発明において、培養容器の自転の軸が実質上
水平なものであることを必要とする理由は、軸が
水平に対して角度を有すると培養容器内で液体培
地中の細胞が均一に分散しなくなるためである。
ここにおいて、軸が実質的に水平であるとして許
容される軸の傾きは、培養容器の形状によつて異
なる場合があるが、例えば水平に対して5°程度ま
での傾きは実質上水平であるとして許容すること
ができ、好ましくは水平に対して3°以内の傾きで
ある。

何れにせよ、本発明は以上のように、液体培地
を相対的に撹乱させることなく、液体培地の内部
において細胞を運動させて均一に分散させるよう
にしているため、常に細胞を新しい液体培地と接
触せしめることができて所要の培養を高い高率で
達成することができ、細胞には剪断力や大きな衝
撃を伴うような力が作用することがなく、従つて
細胞が損傷されるようなことがないので、そのよ
うな損傷を受け易い弱い細胞であつてもこれを十
分に培養することができる。

なお本発明において、培養容器に液体培地と細
胞とを充填するためには特殊な方法を必要とする
ものではなく、事前に混合された液体培地と細胞
を充填すればよい。しかし接着依存性細胞の場合
には、事前に接着依存性細胞を接着した担体粒子
を培養容器に充填するよりも、担体粒子に接着依
存性細胞を接着させる工程についても本発明にお
おける培養容器を用いて同様の操作により、液体
培地中に担体粒子および接着依存性細胞を剪断力
を与えることなく均一に分散させることによつ
て、担体粒子の表面に対して細胞を各担体粒子に
おいて平均にかつ効果的に接着させることが望ま
しく、この場合はこの接着工程に引き続き本発明
を実施することができる。

細胞を培養する場合には、液体培地の交換が必
要となる。本発明においても長期間にわたる培養
においては、液体培地の交換が必要である。液体
培地の交換方法としては、例えば培養容器の回転
を止めて液体培地の一部または全部を交換する方
法、培養容器に液体培地の供給管および排出管を
設置し、培養中に連続的に新しい液体培地を供給
すると共に古い液体培地を排出する方法を挙げる
ことができる。このようにして新しい液体培地を
供給することによつて、通常数日以上の時間を必
要とする培養を十分に行なうことができる。新し
い液体培地の供給は、これを上記のように供給管
を通じて常時行なうようにすれば、単位時間当り
の供給量および排出量は僅かでよいから、培養容
器内の液体に層流、乱流などの機械的な流れを実
質上生ぜしめない状態とすることが可能であり、
これによつて、細胞の所期の分散を妨げることが
防止される。培養効率を高めるためにも、液体培
地の供給を供給管を通じて常時行うことが好まし
い。

また本発明により接着依存性細胞を培養する場
合に、供給管を通じて常時培養容器に液体培地を
供給し、排出管を通して常時排出する方法を適用
するときに、供給する液体培地と共に担体粒子お
よび接着依存性細胞を培養容器に供給し、培養容
器から排出する液体培地と共に増殖した接着依存
性細胞をその表面に接着している担体粒子の一部
を抜け出す方法を用いれば、液体培地の交換、担
体粒子への接着依存性細胞の接着、培養および増
殖した接着依存性細胞の抜出しを連続的に行うこ
とができる。

本発明の適用においては、培養されるべき細胞
は何ら制限されるものではなく、浮遊増殖性細胞
としては、例えばリンパ球、リンパ芽球、バーキ
ツトリンパ腫、急性リンパ芽球性白血病細胞、骨
髄腫などのミエローマ細胞またはこれらによるハ
イブリドーマ細胞を、また接着依存性細胞として
は、ヒト子宮ガン細胞HeLa、チヤイニーズ−ハ
ムスター肺細胞Ｖ−79、ヒト胎児肺細胞MRC−
５、チンパンジー肝繊維芽細胞、ヒト包皮細胞、
ニワトリ胎児繊維芽細胞、初代サル腎細胞、マウ
ス転移繊維芽細胞、脳下垂体腫瘍細胞、アフリカ
ミドリザル腎細胞Vero、副腎腫瘍細胞などを挙
げることができる。

また本発明の適用における液体培地も特に限定
されるものではなく、１〜30％（Ｖ／Ｖ）の子牛
血清または牛胎児血清を含むミニマル−エツセン
シヤル培地（minimal essential medium：汎用
細胞培養用基礎培地）や１〜30％（Ｖ／Ｖ）の子
牛血清または牛胎児血清を含むダルベツコ変法イ
ーグル培地などを例示することができ、液体培地
の比重としては1.00〜1.05のものが一般的であ
る。なお液体培地には、酸素および炭酸ガスを溶
存させることが必要である。なお培養時の液体培
地の温度は、通常30〜40℃であり、好ましくは37
℃である。

さらに接着依存性細胞を培養する場合に用いる
単体粒子も特に制限があるものではなく、接着依
存性細胞の接着性および増殖性に適したものであ
ればよく、例えばポリスチレンなどの合成高分
子、タン白質や多糖類などの天然高分子により表
面が形成された粒子を挙げることができるが、担
体粒子は磁性を有するものであることが便利であ
り、これによつて磁石を用いて担体粒子の捕集、
移動、処理、その他の取扱いを簡便に且つ迅速に
行なうことが可能となる。磁性を有する担体粒子
としては、磁性体粉を高分子材料により結着して
成るもの、磁性を有するコアを高分子材料により
被覆して成るものであり、磁性体の具体例として
は、鉄、コバルト、ニツケル、これらの合金、低
炭素鋼、ケイ素鋼、γ−酸化鉄、フエライト、マ
グネタイト、その他を挙げることができる。担体
粒子の比重は、液体培地の粘性および比重などに
よつても異なるが、一般的に1.0〜1.5の範囲内の
ものとされる。また担体粒子の粒径は40〜500μ
ｍ程度が好ましく、形状は球形が望ましいが、顆
粒状、円筒状などであつてもよく、不定形のもの
であつても差支えない。

液体培地１ml当りの浮遊増殖性細胞または接着
依存性細胞の播種量は、一般的には１×10⁴〜１
×10⁶個であり、接着依存性細胞を培養するため
に使用する担体粒子の数は、通常液体培地１ml当
り１×10⁴〜１×10⁷個程度である。

なお上記条件などにおいて、細胞は液体培地よ
りも比重が小さくてもよく、液体培地より比重が
小さい細胞は、重力によらず浮力によつて、比重
が大きい細胞の場合と同様に液体培地中において
運動し均一に分散するようになる。

本発明において、培養容器内には液体培地と細
胞との混合系が、空間が存在しないように充満状
態に充填されていることが望ましく、これによつ
て当該混合系を確実に培養容器と共に回転させる
ことが容易となり、空間が存在するときにもそれ
が僅かであればその空間が存在することによる液
体培地における撹乱は培養容器内の混合系の上部
部分の僅かな領域に限定されるので、事実上本発
明による効果を無効とするものではない。しかし
培養容器内の空間の割合が多くなると混合系を撹
乱することなく培養容器と共に回転させることが
できず、本発明の目的を達成することができな
い。このために本発明においては、培養容器内に
おける混合系の充填割合は98容量％以上とされ
る。

本発明において、培養容器の自転における回転
速度は、細胞の大きさおよび比重、液体培地の粘
度、培養容器の形状および大きさなどによつて一
概に規定することができないが、通常は５〜50r.
p.m.、好ましくは10〜30r.p.m.程度となるように
回転速度を調整する。

更に培養容器の形状は、既述の例におけるよう
に、円筒状であることが好ましいが角筒状、或い
は球状であつても何ら支障がなく、回転方式も、
要するに容器の上下が入れ替わるように実質的に
鉛直面内で回転されればよく、例えば第４図に示
すように水平な回転軸１０の周りに回転するアー
ム１１の先端に容器１２を保持させて鉛直面内で
円運動するようにしてもよい。この場合には、水
平な回転軸１０から離れた状態で容器１２が当該
水平な回転軸１０の周りに回転されることとなる
が、上記と同様の作用効果が得られる。更に第５
図に示すように円筒状培養容器２０をその半径方
向に伸びる水平な軸Ｙの周りに自転するよう回転
させてもよい。

第６図は本発明の一例を示すものであり、この
図の例においては、底板３０と有底筒状の容器本
体３１とにより培養容器が構成されている。即
ち、容器本体３１は底板３０に固定して設けた押
え機構３２によつて底板３０に大リング３３を介
して押圧され、その内部空間が培養領域とされ
る。底板３０は回転スリーブ３５に固定され、回
転スリーブ３５はドライベアリング３６を介し
て、スタンド３７によつて保持された外套部材３
８に回転自在にかつ水平方向に保持されている。
底板３０は中央に開口を有し、この開口は、液体
は通過するが担体粒子を通過させないメツシユ４
０により塞がれており、このメツシユ４０を貫通
する内導管４１がメツシユに固定されている。こ
の内導管４１はその先端に開口を有し、回転スリ
ープ３５内を通つて伸び、その後端は連結シール
部５０において外部よりの供給管５１に連通する
ようにこれに回転自在に連結されている。回転ス
リーブ３５の内周には外導管４２が内導管４１に
対して二重管構造となるよう固定され、その先端
は底板３０の開口に連通するように連結されてお
り、その後端は連結シール部５０において回転自
在であつてしかも外部に伸びる排出管５２と連通
されている。６０は回転スリーブ３５に固定して
被動歯車であり、モータ（図示せず）によつて駆
動される駆動歯車６１と噛合している。

以上に如き構成においては、駆動歯車６１が駆
動されることによつて回転スリーブ３５が回転
し、これによつて底板３０と容器本体３１とによ
り構成される培養容器が水平な軸の周りに回転さ
れ、同時に内導管４１をおよび外導管４２も共に
回転する。そして、液体培地および細胞を培養容
器内に充填しておくことにより、この培養容器の
中で既に述べたところに従つて細胞が均一に分散
される。

而してこの装置においては供給管５１が内導管
４１に連通し、外導管４２が排出管５２に連通し
ているので、これらにより、培養容器を回転させ
て細胞の分散を図りながら、当該培養容器内に新
たな液体培地を供給することおよび対応する量の
使用されて栄養分の失われた古い液体培地を外部
に排出することができ、しかもメツシユ４０によ
つて細胞の排出が防止されるので、結局長期間に
亘つて細胞培養を行なうことができる。

第７図は本発明の細胞培養方法におけるシステ
ムチヤートの一例であつて、７０は液体培地タン
ク、７１は培養容器、７２は液体培地排出タンク
を示し、モニター機構７３によつて培養容器７１
よりの排出直後の液体培地について例えばPHセン
サー７４によりPHを、並びにDOセンサー７５に
より溶存酸素量を検出し、その結果に従つて培養
容器７１に供給される新たな培地の量が制御弁７
６により規制される。７７および７８はそれぞれ
液体培地タンク７０に設けたPHセンサーおよび
DOセンサーであつて、PHセンサー７７により測
定された液体培地のPHに応じてアルカリタンク８
０よりアルカリが制御された割合で添加されてPH
の調整が行なわれ、当該液体培地タンク７０内に
伸びる、例えば５％の炭酸ガスを含む空気を送気
する送気管８１に介挿した制御弁８２を介して、
DOセンサー７８の検出結果に従つた送気量の制
御がなされる。

このようなシステムによれば、常に培養条件を
良好に維持することができ、細胞が液体培地中に
高い分散度で均一に分散させることができること
と相俟つて工業的規模において高い高率で所期の
培養を行なうことができる。

第８図および第９図は本発明の細胞培養方法に
用いられる装置の他の例を示し、この例において
は、断熱材層を有する外匣１０１内に水平方向に
伸びる回転軸１０２が設けられ、その一端は外匣
１０１の外部に配置したモータ１０３に動力伝達
機構１０４を介して連結されている。回転軸１０
２には、放射状に突出する複数（図示の例では４
本）のアーム１０５が固定され、各アーム１０５
の先端には円筒状の培養容器１０６を着脱自在に
保持する保持具１０７が設けられている。そして
外匣１０１内にはヒーター（図示せず）が設けら
れている。

このような構成の装置によれば、複数の培養容
器１０６内に液体培地および細胞を充満させてお
くことにより、回転軸１０２を回転させることに
よつて既述と同様に培養容器１０６内において液
体培地中に細胞を好適に均一に分散させることが
できる。

次に本発明の実施例について説明する。

実施例１培養細胞：チヤイニーズハムスター肺繊維芽細胞
由来の「Ｖ−79」液体培地：酸素および炭酸ガスを溶存する10％牛
胎児血清を含む「Eagle−MEM」（粘度：
0.01poise、比重：1.01）担体粒子：「Cytodex」（Pharmacia社）（粒
径：180μｍ、比重：1.03）容量300mlの筒状培養容器中に乾燥重量で750mg
（約３×10⁵個）の担体粒子を入れて液体培地を満
し、これに２×10⁷個の培養細胞に播種し、空気
が入らないように密閉した後、温度37℃の環境
下、４時間に亘り、回転数15r.p.m.で培養容器を
回転させた。

その結果、細胞が接着しなかつた担体粒子の割
合は約５％であり、細胞接着のあつた担体粒子に
おける細胞数は２〜４個で平均3.2個であり、全
担体粒子上の細胞数は1.6×10⁷個であつた。上記
とは別に、上記と同様に培養細胞を播種した培養
容器を72時間に亘り回転させた。この間において
24時間毎に培養容器の回転を止めて液体培地を全
量交換した。この結果、全担体粒子上の細胞は３
×10⁸個に増殖していた。

実施例２第６図に示した構成の内容積が１の培養容器
を有する培養装置を用い、実施例１におけると同
様の培養細胞、液体培地および担体粒子を用いて
細胞の培養を行なつた。即ち液体培地１に対し
て乾燥重量で３ｇ（約1.2×10⁷個）の担体粒子を
用い、液体培地１ml当り１×10⁴個の培養細胞を
播種し、培養容器内に空気が入らないようにこの
混合系を充填し、温度37℃の環境下において、
144時間に亘り、培養容器を回転数12r.p.m.で回
転せしめながら液体培地を80ml／hrの割合で供給
し、また同量の液体培地を排出させた。その結
果、担体粒子上の細胞数は液体培地１ml当り平均
3.7×10⁶個であつた。

比較例１内容積２のスピンナービンを用い、実施例１
におけると同様の培養細胞、液体培地および担体
粒子を用いて細胞の培養を行なつた。即ちスピン
ナービンに液体培地１に対して乾燥重量で３ｇ
の担体粒子を加え、次いで１×10⁴個の培養細胞
を播種し、温度37℃の環境下において、回転子の
回転数を30r.p.m.で回転せしめ144時間に亘り培
養を行つた。このときに５％の炭酸ガスを含む空
気をスピンナービンの上部に供給し続け、液体培
地が常に該空気に接触するようにした。その結
果、担体粒子上の細胞数は、液体培地１ml当り平
均5.1×10⁵個であつた。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は本発明の一例についての
説明用斜視図および断面図、第３図は液体培地中
における粒子の運動についての説明図、第４図お
よび第５図はそれぞれ本発明の他の例を示す説明
用断面図および斜視図、第６図は本発明細胞培養
方法を実施するための装置の一例を示す断面図、
第７図は本発明細胞培養方法におけるシステムチ
ヤートの一例、第８図および第９図は本発明の細
胞培養方法に用いられる装置の他の例を示す説明
用縦断側面図および正面図である。１，１２，２０……培養容器、２……細胞、３
……液体培地、３０……底板、３１……容器本
体、３２……押え機構、３５……回転スリーブ、
３６……ドライベアリング、３７……スタンド、
３８……外套部材、４０……メツシユ、４１……
内導管、４２……外導管、５０……連結シール
部、５１……供給管、５２……排出管、６０……
被動歯車、６１……駆動歯車、７０……液体培地
タンク、７１……培養容器、７２……排出タン
ク、７３……モニター機構、７４，７７……PHセ
ンサー、７５，７８……DOセンサー、８０……
アルカリタンク、８１……送気管、１０１……外
匣、１０２……回転軸、１０３……モーター、１
０４……動力伝達機構、１０５……アーム、１０
７……保持具。

Claims

【特許請求の範囲】

１液体培地および接着依存性細胞を付着してな
る被分散粒子もしくは浮遊増殖性細胞より成る混
合系を充填割合が98容量％以上となるように充填
した培養容器を実質上水平な軸の周りに自転する
ように回転せしめるか、または、実質上水平な軸
から離れた状態で培養容器を当該軸の周りに回転
せしめることにより当該混合系を前記培養容器と
共に回転せしめ、これにより、当該混合系内にお
いて前記被分散粒子もしくは浮遊増殖性細胞を運
動せしめ、以つて前記被分散粒子もしくは浮遊増
殖性細胞を前記液体培地中に分散せしめる工程を
有することを特徴とする細胞培養方法。