JPH0534947B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 この発明は、動物細胞を大量に培養する方法に
関する。

〔背景技術〕

一般に細胞は、浮遊状で増殖する浮遊細胞以
外、基質に付着してはじめて増殖することができ
る。このため、フイブロネクチンやコラーゲンを
コーテイングしたり電荷を持つように処理したり
した、プラスチツクまたはガラスなどの基質に細
胞を付着させ、単層状態で２次元的に増殖させ培
養を行つていた。そのような細胞を大量に培養す
るには、培養面積を増大させる必要があり、次に
示すような種々の大量培養法が提案されている。

大型培養びん法 最も簡便な方法で、ルーびんまたは大型の培養
びんを必要本数だけ用いる通常の単層培養法。

ローラーボトル法 円筒状の培養びんをゆつくりと回転させながら
そのびんの内側全面に細胞を培養する方法。

ステリリン型培養法 波型のポリエステル製フイルムを同心円状に巻
き、そのフイルム両面に細胞を単層状に培養する
方法。

多層平板法 ガラス平板またはポリカーボネート平板を、間
をおいて層状に重ね、各平板上に細胞を単層状に
培養する方法。

多段単層法 多層平板法の変法で、培養面がガラス製、ポリ
エステル製またはポリスチレン製の浅い箱型の静
置培養素子を積み重ね、気相だけを共通にして各
素子の内側で細胞を培養する方法。

ガラス線維カラム法 ラセン状に巻いたガラス線維をカラムに詰め、
培養液を交換しながらそのガラス線維の表面上で
細胞を培養する方法。

ガラスビーズ充填カラム法 ガラスビーズをカラムに詰め、培養液を交換し
ながらそのガラスビーズの表面上で細胞を培養す
る方法。

ホローフアイバー法 ホローフアイバーを束ねたカラムをつくり、そ
のホローフアイバー中で細胞を培養する方法。

スーパービーズ法（「マイクロキヤリヤ法」
ともいう） 通常の浮遊培養系で単層培養を行うという培養
法で、ゆつくりとかき混ぜることにより培養液中
で浮遊状態になるビーズ（「マイクロキヤリヤ」
ともいう）上に細胞を付着させ、その表面で単層
状に増殖させる方法。

現在考えられている最も高密度な大量培養法
は、スーパービーズ法である。しかし、この方法
では、表面に細胞を付着させたビーズを培養ボト
ル内で撹拌するので、それらのビーズが衝突し、
このため、細胞の損傷が大きかつた。

また、大量培養法は、上記のものをはじめ数多
くの方法があるが、それらすべてに共通している
のは、細胞を、ビーズなどの担体またはガラスや
プラスチツクの器壁の表面に付着させて２次元的
に増殖させる単層培養であることである。単層培
養は、生体内での細胞増殖と条件が異なつている
ため、長期培養ができず、細胞分化も弱く、さら
には、全く増殖しないことがあるなどの問題があ
る。

さらに、大量培養法では培養する細胞が大量で
あるので、その細胞を培養する状態に整えて培養
液中に入れることが効率的に行えることが望まれ
る。

〔発明の目的〕

この発明は、以上のことに鑑みて、従来の方法
よりも高密度に大量培養ができ、長期培養を行う
ことが可能であり、しかも、動物細胞を培養する
状態にして培養液中に入れることが効率よく行え
る動物細胞の大量培養法を提供することを目的と
する。

〔発明の開示〕

この発明は、上記の目的を達成するために、動
物細胞を包埋させたコラーゲンゲルを培養液中に
浮遊させて動物細胞の大量培養を行う動物細胞の
大量培養法であつて、動物細胞を分散させたコラ
ーゲン系を連続的に造粒し、これを培養液へ供給
することを特徴とする動物細胞の大量培養法を要
旨としている。

以下に、この発明を詳しく説明する。

コラーゲンゲルに動物細胞を包埋させる方法と
しては、特に限定はないが、コラーゲン溶液中に
動物細胞を分散させてこのコラーゲン溶液をゲル
化させる方法がある。この方法によれば、動物細
胞をコラーゲンゲル内に均質に包埋させることが
容易にできる。

この発明で、動物細胞をコラーゲンゲルに包埋
させるのは、接着依存性増殖（「付着依存性増殖」
ということもある）を行う細胞が３次元的に増殖
できるようにそれらの細胞を支持し、生体内での
環境に近づけるためである。このようにすること
により、細胞を３次元的に増殖させることができ
るので、従来よりも高密度に大量培養でき、細胞
を長期にわたつて培養することができる。さらに
は、細胞分化を誘導することなども可能である。
また、細胞がコラーゲンゲルで保護されるので、
コラーゲンゲルが浮遊するときに衝突しても、細
胞が傷つきにくい。しかも、この原理は接着非依
存性増殖を行う細胞にも利用することができる。

この発明で、動物細胞を支持する基質として、
コラーゲンゲルを用いるのは、コラーゲンが動物
の体の至る所に存在する繊維性の蛋白質であり、
これをゲル化して細胞の支持基質とすることで生
体外において生体内の環境を再現できるからであ
る。コラーゲンの種類は、特に限定されず種々の
ものを用いることができる。また、ゲルであるの
で、その内部（細胞）と外部との間で物質のやり
とり（呼吸、栄養吸収、排泄、分泌物の放出な
ど）が可能である。前記のようなコラーゲンゲル
の形状は、特に限定はなく、浮遊させることがで
きれば形状でもよい。たとえば、粒子状、ヌード
ル状、、シート状などの形状がある。前記のコラ
ーゲンゲルの内部と外部との物質のやりとりをよ
り広い面積で行うという点からは、粒子状が好ま
しい。このようにすると、従来の、スーパービー
ズ法やコラーゲンゲル上培養法と比べて、細胞と
外界との物質のやりとりが飛躍的に広い面積で行
われるようになる。粒子の形状は、球、円柱、楕
円体、立方体、直方体、不定形など種々あり、特
に限定はない。

なお、この発明では、造粒するとは、粒子状に
することのみを指すのではなく、上記ヌードル
状、シート状など種々の形状にすることをも指
す。

この発明の動物細胞の大量培養法によれば、従
来のスーパービーズ法では全く増殖しない細胞で
さえも、大量培養することが可能である。その細
胞密度は、現在実施されている最も高密度の大量
培養法であるスーパービーズ法の細胞密度よりも
大きい値である。このため、この発明の大量培養
法によれば、従来のスーパービーズ法では培養で
きなかつた細胞が培養でき、しかも、小さなスペ
ースで大量培養することが可能になるので、大量
の細胞の採取を効率よく行うことができる。ま
た、細胞分化を促進させるので、大量の産生物
（分泌物）を効率よく採取することができる。

上記細胞の採取は、たとえば、つぎに示す方法
などにより行うことができる。

（細胞の採取法） 細胞を含むコラーゲンゲルをはさみなどで３mm
角ぐらいに切り、コラゲナーゼの最終濃度が0.02
％になるようにコラゲナーゼを加え、コラーゲン
ゲルを溶解させる。コラーゲンゲルが溶解した
後、細胞を溶液とともに遠心管に移し、低速の遠
心分離機で細胞を分離して採取する。

この発明の大量培養法は、動物細胞であれば、
接着依存性増殖を行うもの、接着非依存性増殖を
行うものなどあらゆるものに利用することができ
る。特に、接着依存性増殖を行う動物細胞を培養
するのに利用すると、その効果が著しい。また、
得られる産生物としては、ワクチン、酵素、ホル
モン、抗体、インターフエロン、核酸など種々の
ものがある。

動物細胞が包埋されているコラーゲンゲルを培
養液中に浮遊させる形状にする手段としては、た
とえば、マルチプレートのウエルに、動物細胞が
分散されているコラーゲン溶液を入れてゲル化さ
せ、コラーゲンゲルを取り出して培養液に入れる
方法がある。しかし、この方法では、コラーゲン
ゲルを固体中から取り出すため、この工程が手作
業になつて効率が悪くなるので、この発明では、
動物細胞を分散させたコラーゲン系を連続的に造
粒し、これを培養液へ供給する方法を採ることに
している。

そのような方法として、たとえば、動物細胞を
分散させたコラーゲン溶液を連続的にゲル化し粒
状にカツトすることによつて連続的に造粒し、こ
れを培養液へ供給する方法がある。第１図に、こ
の発明の大量培養法を実施するのに用いる装置の
一例を示した。第１図にみるように、この装置
は、動物細胞が分散されているコラーゲン溶液４
をゲル化しないよう氷水５の中に保ち、ポンプＰ
などでこのコラーゲン溶液４を培養槽１へ送り、
その途中、適当な温度（短時間にコラーゲンがゲ
ル化し、動物細胞がダメージを受けない温度37℃
附近が好ましい。）の温水槽６を通過させて、コ
ラーゲン溶液４をゲル化させ、管７から押し出し
ながら、カツターなどの切断装置８を用いてカツ
トすることにより小片状にして培養液２の入つた
培養槽１に落下させるようにしている。このよう
にして造粒を行えば、コラーゲンゲル３の形状を
一定の形状にすることが容易である。コラーゲン
ゲル３が適当な数になつたところでコラーゲン溶
液を送るのをやめ、コラーゲンゲル３を培養液２
中に浮遊させながら培養を行う。

また、連続的造粒法としては、動物細胞を分散
させたコラーゲン溶液を液状のままで連続的に滴
下させゲル化させることによつて連続的に造粒す
る方法もある。第２図に、この発明の大量培養法
を実施するのに用いる装置の別の一例を示した。
第２図にみるように、この装置は、動物細胞が分
散されているコラーゲン溶液４をゲル化しないよ
う氷水５の中に保ち、ポンプＰなどでこのコラー
ゲン溶液４を培養槽１へ送り、適当な温度（コラ
ーゲンのゲル化と培養条件から37℃が望ましい。）
に加温され撹拌されている培養液２に管７から滴
下させるようになつている。または、コラーゲン
溶液４を切断しつつ培養液２へ入れてもよい。そ
うすると、培養液２によりコラーゲンがゲル化す
るとともに、培養液２中にコラーゲンゲル３が浮
遊するようになつている。コラーゲンゲル３が適
当な数になつたところでコラーゲン溶液を送るの
をやめ、コラーゲンゲル３を培養液２中に浮遊さ
せながら、培養を行う。

上記の方法において、ゲル化能力を高め均一な
形状に造粒するために、培養液の温度、粘度、比
重、浸透圧、界面張力などを適当に調整すること
がある。その場合の調製法としては、特に限定は
ないが、培養液と糖類および／または多糖類の誘
導体の溶液とを混合したものまたはそのような組
成をもつ溶液を用いるのが好ましく、たとえば、
培養液と0.25Mしよ糖を１：１に混合したもの、
培養液にメチルセルロースを0.3％濃度になるよ
う溶解させたものなどがあげられる。ゲル化した
後に交換する培養液は上記調整を行わない元のも
のに戻す。

第２図の装置において、培養槽１の液を最初は
ゲル作製能力のみを有し、培養能力を有しないコ
ラーゲンゲル作製液にしておき、まず、滴下液を
ゲル化してコラーゲンゲルにかえて造粒したの
ち、この槽１からコラーゲンゲル作製液を除き、
かわりに培養液を仕込んで培養に入るというよう
にしてもよい。この方法によれば、当初、コラー
ゲンゲル作製能力にすぐれた液中でまずコラーゲ
ンをゲル化させるため、形状の均一性等にすぐれ
たコラーゲンゲルを得ることができる。なお、コ
ラーゲンゲル作製液中で得たコラーゲンゲルを別
の培養槽に移しかえて培養に入るようにしてもよ
い。

これらの例のように、動物細胞が分散されてい
るコラーゲン系を管などの密閉物中を通して培養
液またはコラーゲンゲル作製液へ送るようにする
と、そのコラーゲン系が汚染する機会が減る。ま
た、管の大きさや前記切断の間隔を種々変えるこ
とにより、コラーゲンゲルの大きさを種々変える
ことが容易である。管の断面形状を種々変えるこ
とにより、コラーゲンゲルの形状を種々変えるこ
とが容易である。多数および／または大容量の培
養装置へ前記コラーゲン系を送るときでも、短時
間で効率よく行うことができる。なお、上記供給
法は上記３つの例に限られない。

動物細胞が包埋されてるコラーゲンゲルを培養
液中に浮遊させながら培養を行う手段も特に限定
されない。たとえば、つぎに示すような方法があ
る。

(i) スピンナー法 スピンナーフラスコに、動物細胞が包埋されて
いるコラーゲンゲルおよび培養液を入れ、スター
ラーなどで培養液を撹拌し、コラーゲンゲルを浮
遊させる培養法。

(ii) 振とう培養フラスコ法 振とう培養フラスコに、動物細胞が包埋されて
いるコラーゲンゲルおよび培養液を入れ、そのフ
ラスコを振とうさせて培養液を撹拌し、コラーゲ
ンゲルを浮遊させる培養法。

(iii) ローラーボトル法 ローラーボトルに、動物細胞が包埋されている
コラーゲンゲルおよび培養液を入れ、ローラーボ
トルを回転させて培養液を撹拌し、コラーゲンゲ
ルを浮遊させる培養法。

(iv) 潅流培養法 カラム中に、動物細胞が包埋されているコラー
ゲンゲルを入れ、このカラムに培養を潅流させて
コラーゲンゲルを浮遊させる培養法。

(v) エアー撹拌法 エアー撹拌器に、動物細胞が包埋されているコ
ラーゲンゲルおよび培養液を入れ、気流を送つて
培養液を撹拌し、コラーゲンゲルを浮遊させる培
養法。

上記いずれの方法も、動物細胞が包埋されてい
るコラーゲンゲルを得る方法とコラーゲンゲルを
浮遊させる方法とが連続的に行えるようにすれ
ば、効率が上がる。

なお、動物細胞が包埋されているコラーゲンゲ
ルを浮遊させるのにともなつて、培養液も撹拌す
るようにすれば、より培養条件が良くなる。

この発明では、動物細胞をコラーゲンゲル内に
包埋させて培養するようにしているが、このよう
にすると、通常のゲル強度のコラーゲンを用いた
場合、コラーゲンゲルが収縮してしまうことがあ
る。このコラーゲンゲルの収縮は、細胞の形態変
化によるものと考えられるが、これが発生する
と、細胞増殖を促すことができないことがある。
このため、この発明では、高ゲル強度（50ｇ以
上）のコラーゲンを用いてコラーゲンゲルの収縮
を防ぐようにするのが好ましい。なお、この明細
書でゲル強度とは、以下の測定法によるものを指
す。

（ゲル強度の測定法） コラーゲン溶液24mlに、冷却下で、1.4M食塩
を含む0.1M−リン酸緩衝液（PH7.4）３mlおよび
カ性ソーダ溶液３mlを加え、よく混合して最終PH
を7.4に調整した後、37℃で１時間加熱してゲル
を形成させる。得られたゲルをレオメーター
（LRM−2002D；不動工業社製）で、0.5インチプ
ランジヤーを用い、挿入深度10mm、挿入速度20
mm／minの条件でゲル強度を測定する。

以下、実施例および比較例を示す。

なお、実施例および比較例では、生細胞数の測
定はつぎに示す方法で行つた。

（生細胞数の測定法） 細胞を含むコラーゲンゲルをコラゲナーゼで溶
解させた後、細胞を溶液とともに遠心管に移し低
速の遠心分離機で細胞を集める。そのようにして
得た細胞をリン酸緩衝液に分散させた後、0.5％
トリパンブルー液と１：２の割合で混合する。死
細胞はトリパンブルー液により青色に染色される
ので染色されない細胞を生細胞として血球計算板
で常法通りの方法で計算する。

（実施例 １） よく洗浄、脱脂、脱灰したラツト尾腱を塩酸溶
液（PH2.5）中で、24時間冷却下に撹拌してコラ
ーゲンを抽出した。この抽出液を遠心分離して不
溶物を除いた後、カ性ソーダ（水酸化ナトリウ
ム）溶液を加えて、PH７に調整し、一夜放置して
生じた沈澱を遠心分離して集めた。これを塩酸溶
液（PH3.0）に再溶解し、再び同様に沈澱処理し
て精製を行つた。得られた沈澱を充分に水洗した
後、PH３の塩酸溶液に溶解し、濃度3.0mg／mlの
精製酸可溶性ラツト尾腱コラーゲン溶液を得た。
また、このコラーゲン溶液は、紫外線照射により
滅菌した。

この3.0mg／ml酸可溶性コラーゲン溶液８容量
部に対して、通常の10倍の濃度のHam F12培地
（NaHCO₃不含）を１容量部、NaHCO₃が2.2％、
NaOHが0.05N、HEPESが0.2Mである混合液を
１容量部加え、さらに、硬膜肉腫由来の移植腫瘍
細胞を加えてよく混合し、動物細胞を分散させた
コラーゲン溶液（混合液）を調製した。このコラ
ーゲン溶液は、ゲル化が生じないように氷水中
（４℃）に保存した。

このコラーゲン溶液を、第１図に示すようにし
てポンプＰで培養槽（容量３；Techne社製）
１へ送り、その途中、37℃の温水槽６を通過させ
て、コラーゲン混合液４をゲル化させ、管７から
押し出しながらカツター８を用いて円柱状（直径
８mm×長さ10mm）にして、１の培養液２が入つ
ている培養槽１に落下させた。コラーゲンゲルの
ゲル強度は200ｇであつた。ポンプは、ローラー
ポンプRP（東京理化社製）を用い、送液速度は
1.5ml／minであつた。コラーゲン溶液を送るの
に用いた管は、内径８mmのシリコンチユーブであ
つた。培養液中のコラーゲンゲルが合計１にな
つたところでポンプを止めてコラーゲン溶液を送
るのをやめた。スターラーを回転させて培養液を
撹拌し、コラーゲンゲルを浮遊させて培養を行つ
た。なお、24時間おきに培養液の交換を行つた。

このときの、培養日数の経過による生細胞数の
変化を第３図のグラフに曲線Ａで示した。

（実施例 ２） 実施例１で調製したコラーゲン溶液（混合液）
４を、第２図に示すようにして４℃に保ちながら
実施例１と同じポンプＰ、シリコンチユーブ７を
用い、フツトスイツチを使つて間欠的に培養槽
（容量３；Techne社製）１へ送り、37℃に加温
されている培養液２に、合計１を管７の先端を
細くし、カツター８を用いて間欠的に滴下してコ
ラーゲン溶液を楕円球状（直径５〜15mm）にゲル
化させた。このときの培養液２は、実施例１で用
いたのと同じ培養液と0.25M−シヨ糖を１：１に
混合したものを用いた。また、実施例１で用いた
のと同じ培養液にメチルセルロースを0.3％濃度
になるように溶解させたものを用いても同様にコ
ラーゲンゲルを成形することができた。ついで吸
引ポンプで培養液２を除去したのち実施例１で用
いたのと同じ培養液１を培養槽１に入れ、コラ
ーゲンゲル３を培養液中に浮遊させて培養を行つ
た。なお、その後は24時間おきに培養液の交換を
行つた。

このときの、培養日数の経過による生細胞数の
変化を第３図のグラフに曲線Ｂで示した。

（従来例 １） 実施例１で用いたのと同じ動物細胞を、平均直
径が100〜200μmのマイクロキヤリア
（Cytodex3；Pharmacia Fine Chemicals社製）
の表面に、マイクロキヤリヤ１個あたり５〜10個
ずつ付着させ、このマイクロキヤリヤ1.5ｇを３
の実施例１で用いたのと同じ培養槽に入れ、さ
らに、実施例１で用いたのと同じ培養液を１入
れて培養を行つたが、１日以内で細胞が死滅して
しまい培養できなかつた。

このときの、培養日数の経過による生細胞数の
変化を第３図のグラフに曲線Ｃで示した。

（従来例 ２） 実施例１で調製したコラーゲン溶液（混合液）
を、マルチプレート（24ウエル）に１ウエル（直
径1.6cm）あたり１mlずつたかさ５mmとなるよう
に入れ、37℃に加温してゲル化させた。このコラ
ーゲンゲルの上に実施例１で用いたのと同じ培養
液を１ウエルあたり１mlずつ満たして培養を行つ
た。なお、24時間おきに培養液の交換を行つた。

このときの、培養日数の経過による生細胞数の
変化を第３図のグラフに曲線Ｄで示した。

（比較例） 実施例１で調製したコラーゲン混合液を、マル
チプレート（24ウエル）に１ウエルあたり３mlず
つ入れて37℃に加温すると、数分間でコラーゲン
がゲル化し、動物細胞がコラーゲンゲル内に包埋
されたものが得られた。各コラーゲンゲルの形状
は、直径1.6cm、高さ1.5cmの円柱状であり、コラ
ーゲンのゲル強度は、200ｇであつた。コラーゲ
ンゲルを１つずつピンセツトでつまんでマルチプ
レートから取り出して、１のスピンナ−フラス
コにコラーゲンゲルを100個（300ml）入れ、さら
に実施例１で用いたのと同じ培養液を300ml入れ
た。スターラーを回転させて培養液を撹拌し、コ
ラーゲンゲルを浮遊させて培養を行つた。なお、
24時間おきに培養液の交換をおこなつた。

このときの、培養日数の経過による生細胞数の
変化を第３図のグラフに曲線Ｅで示した。

実施例１，２および従来例１の結果から、従来
の大量培養法の中でも最も高密度で細胞の培養を
行えるスーパービーズ法では培養できない細胞で
も、この発明の大量培養法によれば、高密度でし
かも長期間培養することができるのがわかる。第
３図にみるように、動物細胞が包埋されているコ
ラーゲンゲルを培養皿に入れてその上に培養液を
満たすコラーゲンゲル内培養法（従来例２）で
は、この発明の大量培養法ほど細胞密度が大きく
なく、また、長期培養を行うと細胞数が低下して
くることがわかる。

また、実施例１，２では、コラーゲンゲルを培
養液中に入れるのに、ポンプを動かすだけでよ
く、コラーゲンゲルの量はポンプを止める時機ま
たは管をはずす時機をずらすことで調整できた。
実施例１では、コラーゲンゲルを供給してそのま
ま培養できた。実施例２では吸引ポンプでゲル化
能力を調整した培養液を除き、もとの培養液と入
れ替えることによりそのまま培養できた。しか
し、比較例では、コラーゲンゲルをマルチプレー
トから取出し、培養液中に入れるのに手作業でし
なければならなかつた。このため、作業時間がか
かり、効率が悪かつた。

以上の結果から、この発明の動物細胞の大量培
養法によれば、従来の大量培養法に比べ非常に長
期間の培養を行うことができ、従来の大量培養法
では不可能であつた細胞増殖を行うことができる
のがわかる。動物細胞を包埋させたコラーゲンゲ
ルを培養液へ入れることが連続的に行うことがで
きるので、この発明の方法は、効率が良いことが
わかる。また、動物細胞を分散させたコラーゲン
系を培養液へ送ることが管の中など密閉した部分
を通して行うことができるので、汚染の機会が減
つた。管の大きさや切断間隔を適宜変えることに
より、動物細胞を包埋させたコラーゲンゲルの大
きさを容易に変えることができる。

なお、この発明は、上記の実施例に限られな
い。

〔発明の効果〕

この発明の動物細胞の大量培養法は、動物細胞
を包埋させたコラーゲンゲルを培養液中で浮遊さ
せて培養を行うので、非常に高密度な大量培養が
可能であり、長期培養を行うことができる。しか
も、動物細胞を分散させたコラーゲン系を連続的
に造粒し、これを培養液へ供給するようにしてい
るので、効率よく前記コラーゲンゲルを培養液に
入れることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図は動物細胞を含むコラーゲン溶
液をゲル化させ培養液中に浮遊させて培養を行
う、この発明の方法の実施に用いる装置の例の概
略説明図、第３図は、培養日数の経過による生細
胞数の変化をあらわすグラフである。 ２……培養液、３……コラーゲンゲル、４……
動物細胞が分散されたコラーゲン溶液。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 動物細胞を包埋させたコラーゲンゲルを培養
   液中に浮遊させて動物細胞の大量培養を行う動物
   細胞の大量培養法であつて、動物細胞を分散させ
   たコラーゲン系を連続的に造粒し、これを培養液
   へ供給することを特徴とする動物細胞の大量培養
   法。 ２ 動物細胞をコラーゲンゲルに包埋させること
   が、コラーゲン溶液中に動物細胞を分散させてこ
   のコラーゲン溶液をゲル化させることにより行わ
   れる特許請求の範囲第１項記載の動物細胞の大量
   培養法。 ３ 動物細胞を分散させたコラーゲン系を連続的
   に造粒することが、動物細胞を分散させたコラー
   ゲン溶液を連続的にゲル化し粒状にカツトするこ
   とによつて行われる特許請求の範囲第２項記載の
   動物細胞の大量培養法。 ４ 動物細胞を分散させたコラーゲン系を連続的
   に造粒することが、動物細胞を分散させたコラー
   ゲン溶液を液状のままで連続的に滴下させゲル化
   させることによつて行われる特許請求の範囲第２
   項記載の動物細胞の大量培養法。 ５ ゲル化が培養液中で行われる特許請求の範囲
   第４項記載の動物細胞の大量培養法。 ６ ゲル化がコラーゲンゲル作製液中で行われる
   特許請求の範囲第４項記載の動物細胞の大量培養
   法。