JPH0570427B2 - - Google Patents
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- JPH0570427B2 JPH0570427B2 JP61014324A JP1432486A JPH0570427B2 JP H0570427 B2 JPH0570427 B2 JP H0570427B2 JP 61014324 A JP61014324 A JP 61014324A JP 1432486 A JP1432486 A JP 1432486A JP H0570427 B2 JPH0570427 B2 JP H0570427B2
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- JP
- Japan
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- culture
- cells
- collagen
- collagen gel
- gel
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
〔技術分野〕
この発明は、動物細胞を大量に培養する方法に
関する。
関する。
一般に細胞は、浮遊状で増殖する浮遊細胞以
外、基質に付着してはじめて増殖することができ
る。このため、フイブロネクチンやコラーゲンを
コーテイングしたり電荷を持つように処理したり
した、プラスチツクまたはガラスなどの基質に細
胞を付着させ、単層状態で２次元的に増殖させ培
養を行つていた。そのような細胞を大量に培養す
るには、培養面積を増大させる必要があり、次に
示すような種々の大量培養法が提案されている。
外、基質に付着してはじめて増殖することができ
る。このため、フイブロネクチンやコラーゲンを
コーテイングしたり電荷を持つように処理したり
した、プラスチツクまたはガラスなどの基質に細
胞を付着させ、単層状態で２次元的に増殖させ培
養を行つていた。そのような細胞を大量に培養す
るには、培養面積を増大させる必要があり、次に
示すような種々の大量培養法が提案されている。
大型培養びん法
最も簡便な方法で、ルーびんまたは大型の培養
びんを必要本数だけ用いる通常の単層培養法。
びんを必要本数だけ用いる通常の単層培養法。
ローラーボトル法
円筒状の培養びんをゆつくりと回転させながら
そのびんの内側全面に細胞を培養する方法。
そのびんの内側全面に細胞を培養する方法。
ステリリン型培養法
波型のポリエステル製フイルムを同心円状に巻
き、そのフイルム両面に細胞を単層状に培養する
方法。
き、そのフイルム両面に細胞を単層状に培養する
方法。
多層平板法
ガラス平板またはポリカーボネート平板を、間
をおいて層状に重ね、各平板上に細胞を単層状に
培養する方法。
をおいて層状に重ね、各平板上に細胞を単層状に
培養する方法。
多段単層法
多層平板法の変法で、培養面がガラス製、ポリ
エステル製またはポリスチレン製の浅い箱型の静
置培養素子を積み重ね、気相だけを共通にして各
素子の内側で細胞を培養する方法。
エステル製またはポリスチレン製の浅い箱型の静
置培養素子を積み重ね、気相だけを共通にして各
素子の内側で細胞を培養する方法。
ガラス線維カラム法
ラセン状に巻いたガラス線維をカラムに詰め、
培養液を交換しながらそのガラス線維の表面上で
細胞を培養する方法。
培養液を交換しながらそのガラス線維の表面上で
細胞を培養する方法。
ガラスビーズ充填カラム法
ガラスビーズをカラムに詰め、培養液を交換し
ながらそのガラスビーズの表面上で細胞を培養す
る方法。
ながらそのガラスビーズの表面上で細胞を培養す
る方法。
ホローフアイバー法
ホローフアイバーを束ねたカラムをつくり、そ
のホローフアイバー中で細胞を培養する方法。
のホローフアイバー中で細胞を培養する方法。
スーパービーズ法（「マイクロキヤリヤ法」
ともいう） 通常の浮遊培養系で単層培養を行うという培養
法で、ゆつくりとかき混ぜることにより培養液中
で浮遊状態になるビーズ（「マイクロキヤリヤ」
ともいう）上に細胞を付着させ、その表面で単層
状に増殖させる方法。
ともいう） 通常の浮遊培養系で単層培養を行うという培養
法で、ゆつくりとかき混ぜることにより培養液中
で浮遊状態になるビーズ（「マイクロキヤリヤ」
ともいう）上に細胞を付着させ、その表面で単層
状に増殖させる方法。
現在考えられている最も高密度な大量培養法
は、スーパービーズ法である。しかし、この方法
では、表面に細胞を付着させたビーズを培養ボト
ル内で撹拌するので、それらのビーズが衝突し、
このため、細胞の損傷が大きかつた。
は、スーパービーズ法である。しかし、この方法
では、表面に細胞を付着させたビーズを培養ボト
ル内で撹拌するので、それらのビーズが衝突し、
このため、細胞の損傷が大きかつた。
また、大量培養法は、上記のものをはじめ数多
くの方法があるが、それらすべて共通しているの
は、細胞を、ビーズなどの担体またはガラスやプ
ラスチツクの器壁の表面に付着させて２次元的に
増殖させる単層培養であることである。単層培養
は、生体内での細胞増殖と条件が異なつているた
め、長期培養ができず、細胞分化も弱く、さらに
は、全く増殖しないことがあるなどの問題があ
る。
くの方法があるが、それらすべて共通しているの
は、細胞を、ビーズなどの担体またはガラスやプ
ラスチツクの器壁の表面に付着させて２次元的に
増殖させる単層培養であることである。単層培養
は、生体内での細胞増殖と条件が異なつているた
め、長期培養ができず、細胞分化も弱く、さらに
は、全く増殖しないことがあるなどの問題があ
る。
この発明は、以上のことに鑑みて、従来の方法
よりも高密度に大量培養ができ、長期培養を行う
ことのできる動物細胞培養法を提供することを目
的とする。
よりも高密度に大量培養ができ、長期培養を行う
ことのできる動物細胞培養法を提供することを目
的とする。
この発明は、上記の目的を達成するために、コ
ラーゲン溶液中に動物細胞を分散させて、このコ
ラーゲン溶液をゲル化させることにより、動物細
胞を包理させた、ゲル強度50ｇ以上のコラーゲン
ゲルを製造し、このコラーゲンゲルを培養液中に
浮遊させて動物細胞の大量培養を行う動物細胞培
養法を要旨としている。
ラーゲン溶液中に動物細胞を分散させて、このコ
ラーゲン溶液をゲル化させることにより、動物細
胞を包理させた、ゲル強度50ｇ以上のコラーゲン
ゲルを製造し、このコラーゲンゲルを培養液中に
浮遊させて動物細胞の大量培養を行う動物細胞培
養法を要旨としている。
以下に、この発明を詳しく説明する。
コラーゲンゲル内に動物細胞を包埋させる方法
としては、コラーゲン溶液中に、他の固形物など
は含まず、動物細胞のみを分散させた状態で、こ
のコラーゲン溶液を冷却するなどしてゲル化せ
る。この方法によれば、動物細胞をコラーゲンゲ
ル内に均質に包埋させることが容易にできる。
としては、コラーゲン溶液中に、他の固形物など
は含まず、動物細胞のみを分散させた状態で、こ
のコラーゲン溶液を冷却するなどしてゲル化せ
る。この方法によれば、動物細胞をコラーゲンゲ
ル内に均質に包埋させることが容易にできる。
この発明で、動物細胞をコラーゲンゲル内に包
埋させるのは、接着依存性増殖（「付着依存性増
殖」ということもある）を行う細胞が３次元的に
増殖できるようにそれらの細胞を支持し、生体内
での環境に近づけるためである。このようにする
ことにより、細胞を３次元的に増殖させることが
できるので、従来よりも高密度に大量培養でき、
細胞を長期にわたつて培養することができる。さ
らには、細胞分化を誘導することなども可能であ
る。また、細胞がコラーゲンゲルで保護されるの
で、コラーゲンゲルが浮遊するときに衝突して
も、細胞が傷つきにくい。
埋させるのは、接着依存性増殖（「付着依存性増
殖」ということもある）を行う細胞が３次元的に
増殖できるようにそれらの細胞を支持し、生体内
での環境に近づけるためである。このようにする
ことにより、細胞を３次元的に増殖させることが
できるので、従来よりも高密度に大量培養でき、
細胞を長期にわたつて培養することができる。さ
らには、細胞分化を誘導することなども可能であ
る。また、細胞がコラーゲンゲルで保護されるの
で、コラーゲンゲルが浮遊するときに衝突して
も、細胞が傷つきにくい。
この発明で、動物細胞を支持する基質として、
コラーゲンゲルを用いるのはコラーゲンが動物の
体の至る所に存在する繊維性の蛋白質であり、こ
れをゲル化して細胞のの支持基質とすることで生
体外において生体内の環境を再現できるからであ
る。コラーゲンの種類は、特に限定されず種々の
ものを用いることができる。また、ゲルであるの
で、その内部（細胞）と外部との間で物質のやり
とり（呼級、栄養吸収、排泄、分泌物の放出な
ど）が可能である。前記のようなコラーゲンゲル
の形状は、特に限定はなく、浮遊させることがで
きればどんな形状でもよい。たとえば、粒子状、
ヌードル状、シート状などの形状がある。前記の
コラーゲンゲルの内部と外部との物質のやりとり
をより広い面積で行うという点からは、粒子状が
好ましい。このようにすると、従来の、スーパー
ビーズ法やコラーゲンゲル上培養法と比べて、細
胞と外界との物質のやりとりが飛躍的に広い面積
で行われるようになる。粒子の形状は、球、円
柱、楕円体、立方体、直方体、不定形など種々あ
り、特に限定はない。
コラーゲンゲルを用いるのはコラーゲンが動物の
体の至る所に存在する繊維性の蛋白質であり、こ
れをゲル化して細胞のの支持基質とすることで生
体外において生体内の環境を再現できるからであ
る。コラーゲンの種類は、特に限定されず種々の
ものを用いることができる。また、ゲルであるの
で、その内部（細胞）と外部との間で物質のやり
とり（呼級、栄養吸収、排泄、分泌物の放出な
ど）が可能である。前記のようなコラーゲンゲル
の形状は、特に限定はなく、浮遊させることがで
きればどんな形状でもよい。たとえば、粒子状、
ヌードル状、シート状などの形状がある。前記の
コラーゲンゲルの内部と外部との物質のやりとり
をより広い面積で行うという点からは、粒子状が
好ましい。このようにすると、従来の、スーパー
ビーズ法やコラーゲンゲル上培養法と比べて、細
胞と外界との物質のやりとりが飛躍的に広い面積
で行われるようになる。粒子の形状は、球、円
柱、楕円体、立方体、直方体、不定形など種々あ
り、特に限定はない。
この発明の動物細胞培養法によれば、従来のス
ーパービーズ法では全く増殖しない細胞でさえ
も、大量培養することが可能である。その細胞密
度は、現在実施されている最も高密度の大量培養
法であるスーパービーズ法の細胞密度（一般に、
１〜４×106cells／mlと言われている）よりも大
きい値（たとえば、２〜８×106cells／ml）であ
る。このため、この発明の動物細胞培養法によれ
ば、従来のスーパービーズ法では培養できなかつ
た細胞が培養でき、しかも、小さなスペースで大
量培養することが可能になるので、大量の細胞の
採取を効率よく行うことができる。また、細胞分
化を促進させるので、大量の産生物（分泌物）を
効率よく採取することができる。
ーパービーズ法では全く増殖しない細胞でさえ
も、大量培養することが可能である。その細胞密
度は、現在実施されている最も高密度の大量培養
法であるスーパービーズ法の細胞密度（一般に、
１〜４×106cells／mlと言われている）よりも大
きい値（たとえば、２〜８×106cells／ml）であ
る。このため、この発明の動物細胞培養法によれ
ば、従来のスーパービーズ法では培養できなかつ
た細胞が培養でき、しかも、小さなスペースで大
量培養することが可能になるので、大量の細胞の
採取を効率よく行うことができる。また、細胞分
化を促進させるので、大量の産生物（分泌物）を
効率よく採取することができる。
上記細胞の採取は、たとえば、つぎに示す方法
などにより行うことができる。
などにより行うことができる。
（細胞の採取法）
細胞を含むコラーゲンゲルをはさみなどで３mm
角ぐらいに切り、コラゲナーゼの最終濃度が0.02
％になるようにコラゲナーゼを加え、コラーゲン
ゲルを溶解させる。コラーゲンゲルが溶解した
後、細胞を溶液とともに遠心管に移し、低速の遠
心分離機で細胞を分離して採取する。
角ぐらいに切り、コラゲナーゼの最終濃度が0.02
％になるようにコラゲナーゼを加え、コラーゲン
ゲルを溶解させる。コラーゲンゲルが溶解した
後、細胞を溶液とともに遠心管に移し、低速の遠
心分離機で細胞を分離して採取する。
この発明の動物細胞培養法は、動物細胞であれ
ば、接着依存性増殖を行うもの、接着非依存性増
殖を行うものなどあらゆるものに利用することが
できる。特に、接着依存性増殖を行う動物細胞を
培養するのに利用すると、その効果が著しい。ま
た、得られる産生物としては、ワクチン、酵素、
ホルモン、抗体、インターフエロン、核酸など
種々のものがある。
ば、接着依存性増殖を行うもの、接着非依存性増
殖を行うものなどあらゆるものに利用することが
できる。特に、接着依存性増殖を行う動物細胞を
培養するのに利用すると、その効果が著しい。ま
た、得られる産生物としては、ワクチン、酵素、
ホルモン、抗体、インターフエロン、核酸など
種々のものがある。
動物細胞が包埋されているコラーゲンゲルを培
養液中に浮遊させる形状にする手段としては特に
限定はない。たとえば、マルチプレートのウエル
に、動物細胞が分散されているコラーゲン溶液を
入れてゲル化させ、コラーゲンゲルを取り出して
培養液に入れる方法、動物細胞が分散されている
コラーゲン溶液を適当な温度に加温されている培
養液に入れ、ゲル化させてからコラーゲンゲルを
破砕して分散させる方法などがある。
養液中に浮遊させる形状にする手段としては特に
限定はない。たとえば、マルチプレートのウエル
に、動物細胞が分散されているコラーゲン溶液を
入れてゲル化させ、コラーゲンゲルを取り出して
培養液に入れる方法、動物細胞が分散されている
コラーゲン溶液を適当な温度に加温されている培
養液に入れ、ゲル化させてからコラーゲンゲルを
破砕して分散させる方法などがある。
動物細胞が包埋されているコラーゲンゲルを培
養液中に浮遊させながら培養を行う手段も特に限
定されない。たとえば、つぎに示すような方法が
ある。
養液中に浮遊させながら培養を行う手段も特に限
定されない。たとえば、つぎに示すような方法が
ある。
(i) スピンナー法
スピンナーフラスコに、動物細胞が包埋されて
いるコラーゲンゲルおよび培養液を入れ、スター
ラーなどで培養液を撹拌し、コラーゲンゲルを浮
遊させる培養法。
いるコラーゲンゲルおよび培養液を入れ、スター
ラーなどで培養液を撹拌し、コラーゲンゲルを浮
遊させる培養法。
(ii) 振とう培養フラスコ法
振とう培養フラスコに、動物細胞が包埋されて
いるコラーゲンゲルおよび培養液を入れ、そのフ
ラスコを振とうさせて培養液を撹拌し、コラーゲ
ンゲルを浮遊させる培養法。
いるコラーゲンゲルおよび培養液を入れ、そのフ
ラスコを振とうさせて培養液を撹拌し、コラーゲ
ンゲルを浮遊させる培養法。
(iii) ローラーボトル法
ローラーボトルに、動物細胞が包埋されている
コラーゲンゲルおよび培養液を入れ、ローラーボ
トルを回転させて培養液を撹拌し、コラーゲンゲ
ルを浮遊させる培養法。
コラーゲンゲルおよび培養液を入れ、ローラーボ
トルを回転させて培養液を撹拌し、コラーゲンゲ
ルを浮遊させる培養法。
(iv) 潅流培養法
カラム中に、動物細胞が包埋されているコラー
ゲンゲルを入れ、このカラムに培養液を潅流させ
てコラーゲンゲルを浮遊させる培養法。
ゲンゲルを入れ、このカラムに培養液を潅流させ
てコラーゲンゲルを浮遊させる培養法。
(v) エアー撹拌法
エアー撹拌器に、動物細胞が包埋されているコ
ラーゲンゲルおよび培養液を入れ、気流を送つて
培養液を撹拌し、コラーゲンゲルを浮遊させる培
養法。
ラーゲンゲルおよび培養液を入れ、気流を送つて
培養液を撹拌し、コラーゲンゲルを浮遊させる培
養法。
なお、動物細胞が包埋されているコラーゲンゲ
ルを浮遊させるのにともなつて、培養液も撹拌す
るようにすれば、より培養条件が良くなる。
ルを浮遊させるのにともなつて、培養液も撹拌す
るようにすれば、より培養条件が良くなる。
この発明では、動物細胞をコラーゲンゲル内に
包埋させて培養するようにしているが、このよう
にすると、通常のゲル強度のコラーゲンを用いた
場合、コラーゲンゲルが収縮してしまうことがあ
る。このコラーゲンゲルの収縮は、細胞の形態変
化によるものと考えられるが、これが発生する
と、細胞増殖を促すことができないことがある。
このため、この発明では、高ゲル強度（50ｇ以
上）のコラーゲンを用いてコラーゲンゲルの収縮
を防ぐ。なお、この明細書でゲル強度とは、以下
の測定法によるものを指す。
包埋させて培養するようにしているが、このよう
にすると、通常のゲル強度のコラーゲンを用いた
場合、コラーゲンゲルが収縮してしまうことがあ
る。このコラーゲンゲルの収縮は、細胞の形態変
化によるものと考えられるが、これが発生する
と、細胞増殖を促すことができないことがある。
このため、この発明では、高ゲル強度（50ｇ以
上）のコラーゲンを用いてコラーゲンゲルの収縮
を防ぐ。なお、この明細書でゲル強度とは、以下
の測定法によるものを指す。
（ゲル強度の測定法）
コラーゲン溶液24mlに、冷却下で、1.4M食塩
を含む0.1M−リン酸緩衝液（PH7.4）３mlおよび
カ性ソーダ溶液３mlを加え、よく混合して最終PH
を7.4に調整した後、37℃で１時間加熱してゲル
を形成させる。得られたゲルをレオメーター
（LRM−2002D；不動工業社製）で、0.5インチプ
ランジヤーを用い、挿入深度10mm、挿入速度20
mm／minの条件でゲル強度を測定する。
を含む0.1M−リン酸緩衝液（PH7.4）３mlおよび
カ性ソーダ溶液３mlを加え、よく混合して最終PH
を7.4に調整した後、37℃で１時間加熱してゲル
を形成させる。得られたゲルをレオメーター
（LRM−2002D；不動工業社製）で、0.5インチプ
ランジヤーを用い、挿入深度10mm、挿入速度20
mm／minの条件でゲル強度を測定する。
以下、実施例および比較例を示す。
なお、実施例および比較例では、生細胞数の測
定はつぎに示す方法で行つた。
定はつぎに示す方法で行つた。
（生細胞数の測定法）
細胞を含むコラーゲンゲルをコラゲナーゼで溶
解させた後、細胞を溶液とともに遠心管に移し、
低速の遠心分離機で細胞を集める。そのようにし
て得た細胞をリン酸緩衝液に分散させた後、0.5
％トリパンブルー液と１：２の割合で混合する。
死細胞はトリパンブルー液により青色に染色され
るので染色されない細胞を生細胞として血球計算
板で常法通りの方法で計算する。
解させた後、細胞を溶液とともに遠心管に移し、
低速の遠心分離機で細胞を集める。そのようにし
て得た細胞をリン酸緩衝液に分散させた後、0.5
％トリパンブルー液と１：２の割合で混合する。
死細胞はトリパンブルー液により青色に染色され
るので染色されない細胞を生細胞として血球計算
板で常法通りの方法で計算する。
（実施例 １）
よく洗浄、脱脂、脱灰したラツト尾腱を塩酸溶
液（PH2.5）中で、24時間冷却下に撹拌してコラ
ーゲンを抽出した。この抽出液を遠心分離して不
溶物を除いた後、カ性ソーダ（水酸化ナトリウ
ム）溶液を加えて、PH７に調整し、一夜放置して
生じた沈澱を遠心分離して進集めた。これを塩酸
溶液（PH3.0）に再溶解し、再び同様に沈澱処理
して精製を行つた。得られた沈澱を充分に水洗し
た後、PH３の塩酸溶液に溶解し、濃度3.0mg／ml
の精製酸可溶性ラツト尾腱コラーゲン溶液を得
た。また、このコラーゲン溶液は、紫外線照射に
より滅菌した。
液（PH2.5）中で、24時間冷却下に撹拌してコラ
ーゲンを抽出した。この抽出液を遠心分離して不
溶物を除いた後、カ性ソーダ（水酸化ナトリウ
ム）溶液を加えて、PH７に調整し、一夜放置して
生じた沈澱を遠心分離して進集めた。これを塩酸
溶液（PH3.0）に再溶解し、再び同様に沈澱処理
して精製を行つた。得られた沈澱を充分に水洗し
た後、PH３の塩酸溶液に溶解し、濃度3.0mg／ml
の精製酸可溶性ラツト尾腱コラーゲン溶液を得
た。また、このコラーゲン溶液は、紫外線照射に
より滅菌した。
この3.0mg／ml酸可溶性コラーゲン溶液８容量
部に対して、通常の10倍の濃度のHam F12培地
（NaHCO3不含）を１容量部、NaHCO3が2.2％
NaOHが0.05N，HEPESが0.2Mである混合液を
一容量部加え、さらに、硬膜肉腫由来の移植腫瘍
細胞を加えてよく混合し、コラーゲン混合液を調
製した。このコラーゲン混合液は、ゲル化が生じ
ないように氷中に保存した。
部に対して、通常の10倍の濃度のHam F12培地
（NaHCO3不含）を１容量部、NaHCO3が2.2％
NaOHが0.05N，HEPESが0.2Mである混合液を
一容量部加え、さらに、硬膜肉腫由来の移植腫瘍
細胞を加えてよく混合し、コラーゲン混合液を調
製した。このコラーゲン混合液は、ゲル化が生じ
ないように氷中に保存した。
このコラーゲン混合液を、マルチプレート（24
ウエル）に１ウエルあたり３mlずつ入れて37℃に
加温すると、数分間でコラーゲンがゲル化し、動
物細胞がコラーゲンゲル内に包埋されたものが得
られた。各コラーゲンゲルの形状は、直径1.6cm、
高さ1.5cmの円柱状であり、コラーゲンのゲル強
度は、200ｇであつた。コラーゲンゲルをマルチ
プレートから取り出して、１のスピンナーフラ
スコにコラーゲンゲルを100個（300ml）入れ、さ
らに培養液を300ml入れた。スターラーを回転さ
せて培養液を撹拌し、コラーゲンゲルを浮遊させ
て培養を行つた。なお、24時間おきに培養液の交
換をおこなつた。
ウエル）に１ウエルあたり３mlずつ入れて37℃に
加温すると、数分間でコラーゲンがゲル化し、動
物細胞がコラーゲンゲル内に包埋されたものが得
られた。各コラーゲンゲルの形状は、直径1.6cm、
高さ1.5cmの円柱状であり、コラーゲンのゲル強
度は、200ｇであつた。コラーゲンゲルをマルチ
プレートから取り出して、１のスピンナーフラ
スコにコラーゲンゲルを100個（300ml）入れ、さ
らに培養液を300ml入れた。スターラーを回転さ
せて培養液を撹拌し、コラーゲンゲルを浮遊させ
て培養を行つた。なお、24時間おきに培養液の交
換をおこなつた。
このときの、培養日数の経過による生細胞数の
変化を第１図のグラフに曲線Ａで示した。
変化を第１図のグラフに曲線Ａで示した。
（比較例 １）
実施例１で用いたのと同じ動物細胞を、平均直
径が100〜200μmのマイクロキヤリア
（Cytodex3；Pharmacia Fine Chemicals社製）
の表面に、マイクロキヤリヤ１個あたり５〜10個
ずつ付着させ、このマイクロキヤリヤ1.5ｇを１
のスピンナーフラスコに入れ、さらに、実施例
１で用いたのと同じ培養液を300ml入れて培養を
行つたが、１日以内で細胞が死滅してしまい培養
できなかつた。
径が100〜200μmのマイクロキヤリア
（Cytodex3；Pharmacia Fine Chemicals社製）
の表面に、マイクロキヤリヤ１個あたり５〜10個
ずつ付着させ、このマイクロキヤリヤ1.5ｇを１
のスピンナーフラスコに入れ、さらに、実施例
１で用いたのと同じ培養液を300ml入れて培養を
行つたが、１日以内で細胞が死滅してしまい培養
できなかつた。
このときの、培養日数の経過による生細胞数の
変化を第１図のグラフに曲線Ｂで示した。
変化を第１図のグラフに曲線Ｂで示した。
（比較例 ２）
実施例１で調製したコラーゲン混合液を、マル
チプレート（24ウエル）に１ウエル（直径1.6cm）
あたり１mlずつ高さ５mmとなるように入れ、実施
例１と同様にしてゲル化させた。このコラーゲン
ゲルの上に実施例１で用いたのと同じ培養液を１
ウエルあたり１mlずつ満たして培養を行つた。な
お、24時間おきに培養液の交換をおこなつた。
チプレート（24ウエル）に１ウエル（直径1.6cm）
あたり１mlずつ高さ５mmとなるように入れ、実施
例１と同様にしてゲル化させた。このコラーゲン
ゲルの上に実施例１で用いたのと同じ培養液を１
ウエルあたり１mlずつ満たして培養を行つた。な
お、24時間おきに培養液の交換をおこなつた。
このときの、培養日数による生細胞数の変化を
第１図のグラフに曲線Ｃで示した。
第１図のグラフに曲線Ｃで示した。
実施例１および比較例１の結果から、従来の大
量培養法の中でも最も高密度で細胞の培養を行え
るスーパービーズ法では培養できない細胞でも、
この発明の動物細胞培養法によれば、非常に高密
度でしかも長期間培養することができるのがわか
る。
量培養法の中でも最も高密度で細胞の培養を行え
るスーパービーズ法では培養できない細胞でも、
この発明の動物細胞培養法によれば、非常に高密
度でしかも長期間培養することができるのがわか
る。
また、第１図にみるように、動物細胞が包埋さ
れているコラーゲンゲルを培養皿に入れてその上
に培養液を満たすコラーゲンゲル内培養法では、
この発明の動物細胞培養法ほど細胞密度が大きく
なく、また、長期培養を行うと細胞数が低下して
くることがわかる。
れているコラーゲンゲルを培養皿に入れてその上
に培養液を満たすコラーゲンゲル内培養法では、
この発明の動物細胞培養法ほど細胞密度が大きく
なく、また、長期培養を行うと細胞数が低下して
くることがわかる。
（実施例 ２）
実施例１で調製したコラーゲン混合液300mlを、
37℃に加温されている、実施例１で用いたのと同
じ培養液が300ml中に流し込んでゲル化させたの
ち、プロペラ型撹拌機の回転翼を回転させてコラ
ーゲンゲルを破砕した。破砕したコラーゲンゲル
は、最小３mmから最大30mmの大きさであり、不定
形であつた。スターラーを回転させて培養液を撹
拌し、破砕したコラーゲンゲルを浮遊させて動物
細胞の培養を行つた。なお、24時間おきに培養液
の交換を行つた。
37℃に加温されている、実施例１で用いたのと同
じ培養液が300ml中に流し込んでゲル化させたの
ち、プロペラ型撹拌機の回転翼を回転させてコラ
ーゲンゲルを破砕した。破砕したコラーゲンゲル
は、最小３mmから最大30mmの大きさであり、不定
形であつた。スターラーを回転させて培養液を撹
拌し、破砕したコラーゲンゲルを浮遊させて動物
細胞の培養を行つた。なお、24時間おきに培養液
の交換を行つた。
このようにして大量培養を行つたときの、培養
21日目の生細胞数は２×106cells／mlであつた。
21日目の生細胞数は２×106cells／mlであつた。
以上の結果から、この発明の動物細胞培養法に
よれば、従来の大量培養法に比べ非常に長期間の
培養を行うことができ、従来の大量培養法では不
可能であつた細胞増殖を行うことができるのがわ
かる。
よれば、従来の大量培養法に比べ非常に長期間の
培養を行うことができ、従来の大量培養法では不
可能であつた細胞増殖を行うことができるのがわ
かる。
なお、この発明の動物細胞培養法は、上記の実
施例に限られない。
施例に限られない。
この発明の動物細胞培養法は、動物細胞を包埋
させたコラーゲンゲルを培養液中で浮遊させて動
物細胞の大量培養を行うので、非常に高密度な大
量培養が可能であり、長期培養を行うことができ
る。
させたコラーゲンゲルを培養液中で浮遊させて動
物細胞の大量培養を行うので、非常に高密度な大
量培養が可能であり、長期培養を行うことができ
る。
特に、ゲル強度50ｇ以上のコラーゲンゲルに動
物細胞を包理させておくと、細胞培養中における
コラーゲンゲルの収縮を防ぐことができる。
物細胞を包理させておくと、細胞培養中における
コラーゲンゲルの収縮を防ぐことができる。
コラーゲンゲルが収縮を起こすと、細胞増殖が
抑制されてしまい、細胞培養が困難になる。
抑制されてしまい、細胞培養が困難になる。
コラーゲン溶液に、合成高分子固体などからな
る非収縮性の支持体を混合しておけば、コラーゲ
ンゲルの収縮をある程度は防止できるが、このよ
うな支持体の存在は細胞増殖の障害となる。
る非収縮性の支持体を混合しておけば、コラーゲ
ンゲルの収縮をある程度は防止できるが、このよ
うな支持体の存在は細胞増殖の障害となる。
したがつて、細胞増殖に最も適した環境である
コラーゲンゲルのみで動物細胞を包理しておける
とともに、この状態でコラーゲンゲルの収縮を確
実に防ぐことができる、この発明の方法は、細胞
培養の効率を格段に向上させることができる。
コラーゲンゲルのみで動物細胞を包理しておける
とともに、この状態でコラーゲンゲルの収縮を確
実に防ぐことができる、この発明の方法は、細胞
培養の効率を格段に向上させることができる。
第１図は培養日数の経過による生細胞数の変化
をあらわすグラフである。
をあらわすグラフである。
Claims (1)
- １ コラーゲン溶液中に動物細胞を分散させて、
このコラーゲン溶液をゲル化させることにより、
動物細胞を包理させた、ゲル強度50ｇ以上のコラ
ーゲンゲルを製造し、このコラーゲンゲルを培養
液中に浮遊させて動物細胞の大量培養を行う動物
細胞培養法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1432486A JPS62171680A (ja) | 1986-01-25 | 1986-01-25 | 動物細胞培養法 |
| PCT/JP1987/000038 WO1987004458A1 (fr) | 1986-01-25 | 1987-01-22 | Procede de culture de cellules animales a grande echelle |
| EP19870900884 EP0258441A4 (en) | 1986-01-25 | 1987-01-22 | LARGE SCALE ANIMAL CELL CULTURE PROCESS. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1432486A JPS62171680A (ja) | 1986-01-25 | 1986-01-25 | 動物細胞培養法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62171680A JPS62171680A (ja) | 1987-07-28 |
| JPH0570427B2 true JPH0570427B2 (ja) | 1993-10-05 |
Family
ID=11857892
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1432486A Granted JPS62171680A (ja) | 1986-01-25 | 1986-01-25 | 動物細胞培養法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62171680A (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007032292A (ja) * | 2005-07-22 | 2007-02-08 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | スクロール流体機械 |
| US9664671B2 (en) | 2012-07-24 | 2017-05-30 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Culture medium composition and method of culturing cell or tissue using thereof |
| WO2014017513A1 (ja) | 2012-07-24 | 2014-01-30 | 日産化学工業株式会社 | 培地組成物及び当該組成物を用いた細胞又は組織の培養方法 |
| US10017805B2 (en) | 2012-08-23 | 2018-07-10 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Enhancing ingredients for protein production from various cells |
| KR102539240B1 (ko) | 2014-01-23 | 2023-06-01 | 닛산 가가쿠 가부시키가이샤 | 배양 배지 조성물 |
| EP3098299A4 (en) | 2014-01-23 | 2017-10-25 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Method for producing culture medium composition |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6225974A (ja) * | 1985-07-25 | 1987-02-03 | Asahi Chem Ind Co Ltd | コラ−ゲンよりなるゲル状組成物 |
-
1986
- 1986-01-25 JP JP1432486A patent/JPS62171680A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62171680A (ja) | 1987-07-28 |
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