JPH0537B2 - - Google Patents
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- JPH0537B2 JPH0537B2 JP58034699A JP3469983A JPH0537B2 JP H0537 B2 JPH0537 B2 JP H0537B2 JP 58034699 A JP58034699 A JP 58034699A JP 3469983 A JP3469983 A JP 3469983A JP H0537 B2 JPH0537 B2 JP H0537B2
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- Japan
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- cells
- epithelial cells
- lens epithelial
- lens
- antibody
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
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- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は水晶体上皮細胞に対するモノクローナ
ル抗体に係る。本発明のモノクローナル抗体は嚢
外摘出後残存する水晶体上皮細胞の増殖を防止す
る。
ル抗体に係る。本発明のモノクローナル抗体は嚢
外摘出後残存する水晶体上皮細胞の増殖を防止す
る。
（従来の技術）
白内障の嚢外摘出は、最近、一般的な白内障切
除法になつてきた。これはおそらく、嚢胞状黄斑
浮腫、網膜剥離の可能性に関して術後の併発症の
出現率が低いためであると思われる。超音波白内
障乳化吸引法（phacoemulsification）のような
改良された嚢外摘出法の開発や、種々の人工水晶
体の移植のための無疵の水晶体後嚢の必要性が、
この傾向に影響を与えた重要な要素であることは
確実である。白内障の嚢外摘出で考えられる唯一
の欠点は、水晶体後嚢の混濁化の出現率が高いこ
とである。これが起こると良好な視覚を得るため
に後切嚢法や水晶体後嚢の再研磨（repolishing）
のような外科的手法が必要になる。
除法になつてきた。これはおそらく、嚢胞状黄斑
浮腫、網膜剥離の可能性に関して術後の併発症の
出現率が低いためであると思われる。超音波白内
障乳化吸引法（phacoemulsification）のような
改良された嚢外摘出法の開発や、種々の人工水晶
体の移植のための無疵の水晶体後嚢の必要性が、
この傾向に影響を与えた重要な要素であることは
確実である。白内障の嚢外摘出で考えられる唯一
の欠点は、水晶体後嚢の混濁化の出現率が高いこ
とである。これが起こると良好な視覚を得るため
に後切嚢法や水晶体後嚢の再研磨（repolishing）
のような外科的手法が必要になる。
白内障の嚢外摘出後の水晶体後嚢の混濁化につ
いての病理発生は公知である。すなわち、残存す
る水晶体上皮細胞が水晶体後嚢上で増殖し、発育
不全な水晶体「繊維」および「小水疱
（bladder）」細胞（エルシユニツヒ真珠）を形成
する。
いての病理発生は公知である。すなわち、残存す
る水晶体上皮細胞が水晶体後嚢上で増殖し、発育
不全な水晶体「繊維」および「小水疱
（bladder）」細胞（エルシユニツヒ真珠）を形成
する。
Contact and Intraocular Lens Medical
Journal、Vol.5、No.4、 Oct.／Dec.1979、
pp.175−178、After−Cataract：Studies of
Chemical and Radiation Inhibition、by Roy
et alに報告されているように、嚢外白内障手術
に関連して術後の白内障の出現率を低下させる方
法をみつけようとして化学的および放射線的手段
が試みられている。この文献では、被膜下上皮細
胞を化学的に阻害するためにビンクリスチン
（vincristine）とビンブラスチン（vinblastine）
が使用されている。これは、これらの薬剤が細胞
の有糸分裂に対して直接的な阻害効果をもつてい
ることが分つていたからである（Goodman、L.
S.；and Gillman、Ａ：The Pharmacological
Basis of Therapeutics、Maximilan、 New
York、 1965、 pp. 1373−1376）。ビンクリス
チンとビンブランスチンは角膜の損傷を抑制し、
その結果わずかに角膜の損傷が直ることが判つて
いたが、上記文献の著者は角膜および虹彩に悪い
影響があることから、これらの薬剤を被膜下上皮
増殖の抑制を試みるための動物研究に使用すべき
でないと考えていた。さらにこの著者らは、手術
後２日目に与えた放射線が、すべての照射スケジ
ュールの中で最も効果的にみえたと述べている。
しかしながら、著者らはいくらかの損傷の危険性
も指摘しており、人間に放射線を用いた場合問題
があるかどうか言明することは難しいと結んでい
る。
Journal、Vol.5、No.4、 Oct.／Dec.1979、
pp.175−178、After−Cataract：Studies of
Chemical and Radiation Inhibition、by Roy
et alに報告されているように、嚢外白内障手術
に関連して術後の白内障の出現率を低下させる方
法をみつけようとして化学的および放射線的手段
が試みられている。この文献では、被膜下上皮細
胞を化学的に阻害するためにビンクリスチン
（vincristine）とビンブラスチン（vinblastine）
が使用されている。これは、これらの薬剤が細胞
の有糸分裂に対して直接的な阻害効果をもつてい
ることが分つていたからである（Goodman、L.
S.；and Gillman、Ａ：The Pharmacological
Basis of Therapeutics、Maximilan、 New
York、 1965、 pp. 1373−1376）。ビンクリス
チンとビンブランスチンは角膜の損傷を抑制し、
その結果わずかに角膜の損傷が直ることが判つて
いたが、上記文献の著者は角膜および虹彩に悪い
影響があることから、これらの薬剤を被膜下上皮
増殖の抑制を試みるための動物研究に使用すべき
でないと考えていた。さらにこの著者らは、手術
後２日目に与えた放射線が、すべての照射スケジ
ュールの中で最も効果的にみえたと述べている。
しかしながら、著者らはいくらかの損傷の危険性
も指摘しており、人間に放射線を用いた場合問題
があるかどうか言明することは難しいと結んでい
る。
上記文献の著者はさらに、被膜下上皮細胞を選
択的に阻害する薬剤なしには化学システムが存在
し、それがみつかれば術後白内障を抑制するのに
有用な手段になり得ると指摘している。
択的に阻害する薬剤なしには化学システムが存在
し、それがみつかれば術後白内障を抑制するのに
有用な手段になり得ると指摘している。
本出願人の知るところでは、水晶体上皮細胞の
一回のサイクルの終わりに有糸分裂阻害剤、すな
わちメトトレキセート、レチノイン酸あるいはこ
れらの混合物を最小の有効投与量で点滴注入する
と、白内障の嚢外摘出の後眼に対する危険を招く
ことなく水晶体後嚢の混濁化を効果的に防止でき
る。
一回のサイクルの終わりに有糸分裂阻害剤、すな
わちメトトレキセート、レチノイン酸あるいはこ
れらの混合物を最小の有効投与量で点滴注入する
と、白内障の嚢外摘出の後眼に対する危険を招く
ことなく水晶体後嚢の混濁化を効果的に防止でき
る。
メトトレキセートは、ジヒドロ葉酸レダクター
ゼという酵素を阻害し、いたがつて還元された葉
酸の細胞内プールの維持を妨害するサイクル依存
性（cycle−dependent）の抗代謝剤である。
ゼという酵素を阻害し、いたがつて還元された葉
酸の細胞内プールの維持を妨害するサイクル依存
性（cycle−dependent）の抗代謝剤である。
レチノイン酸は、細胞分裂あるいはDNA合成
のいずれかまたはその双方を阻害するように思わ
れるが正確なメカニズムは知られていない。
のいずれかまたはその双方を阻害するように思わ
れるが正確なメカニズムは知られていない。
本発明は、残存する水晶体上皮細胞に特異的な
モノクローナル抗体の製造およびその使用によつ
て従来技術の欠点を改善するものであり、本発明
のモノクローナル抗体を使用すると、初めの白内
障除去の時点で、目の他の部分に損傷を与えるこ
となく選択的に前記残存水晶体上皮細胞を破壊す
ることができる。
モノクローナル抗体の製造およびその使用によつ
て従来技術の欠点を改善するものであり、本発明
のモノクローナル抗体を使用すると、初めの白内
障除去の時点で、目の他の部分に損傷を与えるこ
となく選択的に前記残存水晶体上皮細胞を破壊す
ることができる。
本出願人の知る限り、水晶体上皮細胞に特異的
なモノクローナル抗体の製造を教示している従来
技術はないし、ましてそのような抗体を用いるこ
とによつて目の他の部分に損傷を与えることなく
残存水晶体上皮細胞を選択的に破壊することにつ
いて教示する従来技術は存在しない。
なモノクローナル抗体の製造を教示している従来
技術はないし、ましてそのような抗体を用いるこ
とによつて目の他の部分に損傷を与えることなく
残存水晶体上皮細胞を選択的に破壊することにつ
いて教示する従来技術は存在しない。
モノクローナル抗体の製造に関する従来技術の
代表例としては次のものがある。
代表例としては次のものがある。
(1) Monoclonal Antibodies、1980、Plenum
Press、New York、edited by Roger H.
Kennett、Thomas J. McKearn and
Cathleen B. Bechtol。
Press、New York、edited by Roger H.
Kennett、Thomas J. McKearn and
Cathleen B. Bechtol。
(2) Continuous cultures of fused cells
secreting antibody of predefined
specificity、Nature、Vol.256、August ７、
1975、pp.495−497。
secreting antibody of predefined
specificity、Nature、Vol.256、August ７、
1975、pp.495−497。
また、米国特許第４，271，145号、同第４，
196，265号、同第４，172，124号、同第４，195，
125号、同第４，262，090号、同第４，294，927
号もモノクローナル抗体の製造に関するものであ
る。
196，265号、同第４，172，124号、同第４，195，
125号、同第４，262，090号、同第４，294，927
号もモノクローナル抗体の製造に関するものであ
る。
（発明の概要）
本発明は、水晶体上皮細胞に特異的なモノクロ
ーナル抗体、この抗体を産生する連続セルライン
を含むこの抗体の製造方法、および、初めの白内
障切除時に、あるいは、術後白内障の切除で、目
の他の部分に損傷を与えることなく、残存する水
晶体上皮細胞を破壊するためにこの抗体を使用す
ることに関する。使用時には、本発明のモノクロ
ーナル抗体をヒトの目の前眼房に点滴注入し、水
晶体上皮細胞と相互作用せしめる。ついで、補体
を前眼房に点滴注入して、目の他の部分に損傷を
与えることなく、選択的に水晶体上皮細胞に溶解
やその他の損傷を生じさせる。このことは、有糸
分裂阻害剤の使用や他の方法に比べて、破壊が残
存水晶体上皮細胞にのみ特異的であるという点
で、非常に有益である。この残存水晶体上皮細胞
はもし破壊されないと増殖し移動して、目の中に
残された後嚢の表面を覆い、「後発白内障」を引
きおこす。その結果、視覚が失われ、もう一度手
術が必要となる。
ーナル抗体、この抗体を産生する連続セルライン
を含むこの抗体の製造方法、および、初めの白内
障切除時に、あるいは、術後白内障の切除で、目
の他の部分に損傷を与えることなく、残存する水
晶体上皮細胞を破壊するためにこの抗体を使用す
ることに関する。使用時には、本発明のモノクロ
ーナル抗体をヒトの目の前眼房に点滴注入し、水
晶体上皮細胞と相互作用せしめる。ついで、補体
を前眼房に点滴注入して、目の他の部分に損傷を
与えることなく、選択的に水晶体上皮細胞に溶解
やその他の損傷を生じさせる。このことは、有糸
分裂阻害剤の使用や他の方法に比べて、破壊が残
存水晶体上皮細胞にのみ特異的であるという点
で、非常に有益である。この残存水晶体上皮細胞
はもし破壊されないと増殖し移動して、目の中に
残された後嚢の表面を覆い、「後発白内障」を引
きおこす。その結果、視覚が失われ、もう一度手
術が必要となる。
（発明の目的）
すなわち、本発明は、水晶体上皮細胞に特異的
なモノクローナル抗体を提供することを目的とす
る。
なモノクローナル抗体を提供することを目的とす
る。
本発明の他の目的は、水晶体上皮細胞に特異的
なモノクローナル抗体を産生する連続セルライン
を提供することである。
なモノクローナル抗体を産生する連続セルライン
を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、白内障の最初の切
除時に水晶体上皮細胞に特異的なモノクローナル
抗体を点滴注入し、この抗体と残存水晶体上皮細
胞とを相互作用せしめ、ついで、この細胞を溶解
する補体を点滴注入することによつて、白内障の
嚢外摘出後に残存する水晶体上皮細胞が増殖し移
動して水晶体嚢表面を覆うために生じる水晶体嚢
の混濁化を防止することにある。
除時に水晶体上皮細胞に特異的なモノクローナル
抗体を点滴注入し、この抗体と残存水晶体上皮細
胞とを相互作用せしめ、ついで、この細胞を溶解
する補体を点滴注入することによつて、白内障の
嚢外摘出後に残存する水晶体上皮細胞が増殖し移
動して水晶体嚢表面を覆うために生じる水晶体嚢
の混濁化を防止することにある。
本発明のさらに他の目的は、目の前房内に前記
モノクローナル抗体を点滴注入してこの抗体と水
晶体上皮細胞とを反応せしめ、ついで、この細胞
を溶解する補体を注入することにより、水晶体上
皮細胞の生長および移動によつて引きおこされる
後発白内障を除去することにある。
モノクローナル抗体を点滴注入してこの抗体と水
晶体上皮細胞とを反応せしめ、ついで、この細胞
を溶解する補体を注入することにより、水晶体上
皮細胞の生長および移動によつて引きおこされる
後発白内障を除去することにある。
本発明のさらに他の目的、特徴、利点は明細書
全体から明らかになるであろう。
全体から明らかになるであろう。
（好ましい態様の説明）
本発明は、ヒトの目の前房内に水晶体上皮細胞
に特異的なモノクローナル抗体を点滴注入し、こ
の抗体と水晶体上皮細胞とを相互作用せしめるこ
とによつて、嚢外摘出後に残存する水晶体上皮細
胞の増殖を防止することに関するものである。通
常、約100μ1のモノクローナル抗体を点滴注入
し、このモノクローナル抗体と水晶体上皮細胞と
の相互作用が起こるまで普通は約30分を要する。
ついで、補体を約100μ1の有効量で前眼房に点滴
して、残存水晶体上皮細胞を溶解したりあるいは
他の損傷を引起こし、これにより、この細胞が増
殖し移動して、適当に残された水晶体嚢の表面を
覆う現象が防止される。これは嚢外白内障摘出と
同時に、好ましくは白内障の切除の直後に行なう
ことができ、また、水晶体嚢の表面上で上記細胞
が増殖あるいは生長することにより生じた後発白
内障の切除のために、のちに行なうこともでき
る。
に特異的なモノクローナル抗体を点滴注入し、こ
の抗体と水晶体上皮細胞とを相互作用せしめるこ
とによつて、嚢外摘出後に残存する水晶体上皮細
胞の増殖を防止することに関するものである。通
常、約100μ1のモノクローナル抗体を点滴注入
し、このモノクローナル抗体と水晶体上皮細胞と
の相互作用が起こるまで普通は約30分を要する。
ついで、補体を約100μ1の有効量で前眼房に点滴
して、残存水晶体上皮細胞を溶解したりあるいは
他の損傷を引起こし、これにより、この細胞が増
殖し移動して、適当に残された水晶体嚢の表面を
覆う現象が防止される。これは嚢外白内障摘出と
同時に、好ましくは白内障の切除の直後に行なう
ことができ、また、水晶体嚢の表面上で上記細胞
が増殖あるいは生長することにより生じた後発白
内障の切除のために、のちに行なうこともでき
る。
水晶体上皮細胞に特異的なこのモノクローナル
抗体は、ヒトの水晶体上皮抗体産生細胞とミエロ
ーマ（骨髄腫）細胞とを融合させて融合ハイブリ
ツドとし、このハイブリツドを培養し、ついでヒ
ト水晶体上皮細胞に特異的な抗体を集めることに
より製造される。
抗体は、ヒトの水晶体上皮抗体産生細胞とミエロ
ーマ（骨髄腫）細胞とを融合させて融合ハイブリ
ツドとし、このハイブリツドを培養し、ついでヒ
ト水晶体上皮細胞に特異的な抗体を集めることに
より製造される。
補体は標準的な補体であり、たとえば、本発明
に有用な典型的な補体およびその調製は前記の
Monoclonal Antibodiesの391〜392頁に記載さ
れている。
に有用な典型的な補体およびその調製は前記の
Monoclonal Antibodiesの391〜392頁に記載さ
れている。
水晶体上皮細胞に対するモノクローナル抗体の
製造の手順を次に示す。
製造の手順を次に示す。
細胞培養
死後30分以内のヒトの目、あるいは、白内障手
術の間に切除した組織からヒト水晶体上皮細胞を
得る。この細胞を、すでに充分確立されている方
法を用いて組織培養用インキユベーター中で単層
培養する。
術の間に切除した組織からヒト水晶体上皮細胞を
得る。この細胞を、すでに充分確立されている方
法を用いて組織培養用インキユベーター中で単層
培養する。
水晶体上皮細胞による免疫化
マウス（BALB／ｃあるいは他の適当な系統）
に、５〜10×106個の全細胞（whole cells）を腹
腔内あるいは静脈内に注射する。２週間後に、そ
れぞれの動物からの血液サンプルを特異抗体に関
して検定する。ついで、最も高い力価（抗体価）
をもつている動物に、再び、腹腔内または静脈内
で５〜10×106個の細胞を注射する。
に、５〜10×106個の全細胞（whole cells）を腹
腔内あるいは静脈内に注射する。２週間後に、そ
れぞれの動物からの血液サンプルを特異抗体に関
して検定する。ついで、最も高い力価（抗体価）
をもつている動物に、再び、腹腔内または静脈内
で５〜10×106個の細胞を注射する。
免疫脾細胞とミエローマ細胞との融合
マウスを（静脈内で）免疫化した３〜４日後、
マウスを頸部脱臼により殺し、放血させ、血清を
冷凍する。マウスを70％エタノールで清め、脾を
無菌で摘出する。消毒した使い捨ての3ml注射器
のゴム製プランジヤーを用い、脾を温いHBSSに
より50メツシユのステンレススチールのスクリー
ンに通して細かくする。懸濁液を3mlの注射器を
用いて数回ピペツテイングする。この懸濁液を
200メツシユのステンレススチールのスクリーン
に通すことにより単個細胞懸濁液を調製する。脾
細胞を1200rpmで10分間遠心分離する。40℃で５
分間、0.83％NH4C1を用いて処理することによ
り、赤血球細胞を分析する。血清を含まない培地
で脾細胞を二回洗浄する。細胞をカウントし、ト
リパンブルー色素排除テストで生死を判定する。
マウスを頸部脱臼により殺し、放血させ、血清を
冷凍する。マウスを70％エタノールで清め、脾を
無菌で摘出する。消毒した使い捨ての3ml注射器
のゴム製プランジヤーを用い、脾を温いHBSSに
より50メツシユのステンレススチールのスクリー
ンに通して細かくする。懸濁液を3mlの注射器を
用いて数回ピペツテイングする。この懸濁液を
200メツシユのステンレススチールのスクリーン
に通すことにより単個細胞懸濁液を調製する。脾
細胞を1200rpmで10分間遠心分離する。40℃で５
分間、0.83％NH4C1を用いて処理することによ
り、赤血球細胞を分析する。血清を含まない培地
で脾細胞を二回洗浄する。細胞をカウントし、ト
リパンブルー色素排除テストで生死を判定する。
ハイブリツドのフイーダー層として、免疫化し
ていないBALB／ｃマウスから脾細胞懸濁液を
調製する。指数増殖期（細胞５×105個／ml）の
ミエローマ細胞を、50mlの円錐形のポリプロピ
レン遠心分離チユーブに移す。ミエローマおよび
脾細胞懸濁液を、血清を含まない培地で別々に２
回洗う。細胞をカウントし、一緒にし、１回洗つ
て混合ペレツト（脾細胞108個およびミエローマ
細胞107個）を得る。遠心チユーブを静かにたた
いて、ペレツトを分散させて塊りの多い懸濁液と
する。0.8mlの50％PEGを１分間かけて37℃で添
加する。懸濁液を１分間静置する。1mlの無血清
培地を１分間かけて加える。20mlの無血清培地
を５分間かけて加える。
ていないBALB／ｃマウスから脾細胞懸濁液を
調製する。指数増殖期（細胞５×105個／ml）の
ミエローマ細胞を、50mlの円錐形のポリプロピ
レン遠心分離チユーブに移す。ミエローマおよび
脾細胞懸濁液を、血清を含まない培地で別々に２
回洗う。細胞をカウントし、一緒にし、１回洗つ
て混合ペレツト（脾細胞108個およびミエローマ
細胞107個）を得る。遠心チユーブを静かにたた
いて、ペレツトを分散させて塊りの多い懸濁液と
する。0.8mlの50％PEGを１分間かけて37℃で添
加する。懸濁液を１分間静置する。1mlの無血清
培地を１分間かけて加える。20mlの無血清培地
を５分間かけて加える。
細胞を遠心分離し、HATおよび正常の
BALB／ｃマウスから得た２〜４×107個の脾細
胞を含むハイブリドーマ培地に再び分散させる。
0.1mlのサンプルを96穴マイクロテストプレート
に分配し、37℃の10％CO2中でインキユベートす
る。活発な生長が観察される７日目にさらに
0.1mlのHT生長培地を加える。継代培養するま
でHY培地を使用する。３〜４日毎に培地交換を
繰り返す。コロニーが目視できるようになつたら
（12〜20日）、コロニーをスクリーニングする。抗
体活性の初期スクリーニング用に100mlの培養上
清を集める。
BALB／ｃマウスから得た２〜４×107個の脾細
胞を含むハイブリドーマ培地に再び分散させる。
0.1mlのサンプルを96穴マイクロテストプレート
に分配し、37℃の10％CO2中でインキユベートす
る。活発な生長が観察される７日目にさらに
0.1mlのHT生長培地を加える。継代培養するま
でHY培地を使用する。３〜４日毎に培地交換を
繰り返す。コロニーが目視できるようになつたら
（12〜20日）、コロニーをスクリーニングする。抗
体活性の初期スクリーニング用に100mlの培養上
清を集める。
免疫脾細胞とミエローマ細胞との融合に用いた
材料を次に示す。
材料を次に示す。
(1) 50％ポリエチレングリコール（PEG）1540
（Polysciences）。1ml細菌PEG 1540＋1ml無血
清培地（SF−DMEM）。
（Polysciences）。1ml細菌PEG 1540＋1ml無血
清培地（SF−DMEM）。
(2) チミジン（Ｔ）1.6×10-5Ｍ、ヒポキサンチ
ン1.0×10-4Ｍ、アミノプテリン４×10-7Ｍの
Littlefields濃縮液。
ン1.0×10-4Ｍ、アミノプテリン４×10-7Ｍの
Littlefields濃縮液。
(a) 100倍HTストツク溶液
0.01361gのヒポキサンチン、0.0388gのチミジ
ンを70〜80℃の100ml再蒸留水に溶解し、濾過滅
菌し、サンプルに小分けし、−70℃で冷凍保存す
る。
ンを70〜80℃の100ml再蒸留水に溶解し、濾過滅
菌し、サンプルに小分けし、−70℃で冷凍保存す
る。
(b) 100倍アミノプテリンストツク溶液
0.018gを再蒸留水に溶かし、アミノプテリンが
すみやかに溶解しない場合は0.1NのNaOHを滴
下し、pHを7.8に調整し、濾過滅菌し、−70℃で
冷凍保存する。
すみやかに溶解しない場合は0.1NのNaOHを滴
下し、pHを7.8に調整し、濾過滅菌し、−70℃で
冷凍保存する。
(c) ハイブリドーマ培地
高グルコース（4.5g／１）のダルベコMEM、
Ｌ−グルタミンを添加した4mMの２％タイプ100
ラビツト血清（Kappa Scientific）、1mMピルビ
ン酸ナトリウム（Gibco）、100MのMEM、非必
須アミノ酸（Gibco）、50Mのβ−メルカプトエ
タノール、10mMのHEPES緩衝液、5mlHAT培
地。
Ｌ−グルタミンを添加した4mMの２％タイプ100
ラビツト血清（Kappa Scientific）、1mMピルビ
ン酸ナトリウム（Gibco）、100MのMEM、非必
須アミノ酸（Gibco）、50Mのβ−メルカプトエ
タノール、10mMのHEPES緩衝液、5mlHAT培
地。
細胞の酵素免疫定量法（ELISA）
0.1MのNaHCO3中のグルタルアルデヒド液
（５％）を、96穴ポリスチレンマイクロタイター
プレートの各ウエル（50μ1）に加え、少なくと
も30分間室温に放置する。洗浄した標的細胞を
HEPES−緩衝ハンク平衡塩溶液（HHBSS）に
懸濁させて細胞懸濁液（107個／ml）を調製す
る。蒸留水をウエルに満たしてからその水をはじ
き飛ばすことによつて３回プレートを洗う。さら
に、プレートを、0.01MのNa2HPO4を含む
0.15MのNaC1（PBS−Ｏ）で一度洗い、液を除
く。各ウエルに50μ1の細胞懸濁液を加え、プレ
ートを３分間1500RPMで遠心分離する。各ウエ
ルに200μ1の割合で１％ホルムアルデヒドの
HHBSS溶液を加え、15分間室温に放置する。プ
レートを遠心分離し、液をすてる。ついで、ウエ
ルにPBS−９を注いでから液体を捨てることに
よつて、プレートを３回洗う。ウエル当たり
50μ1の割合で１％BSAのPBS−９溶液を各プレ
ートに加え、室温で10分間放置する。２組のウエ
ルに50μ1のハイブリドーマ培地試料を加え、各
プレートの列１にSDMEM＋２％RSを加え、室
温で90分インキユベートするか、あるいは冷蔵庫
で１晩インキユベートする。プレートを0.05％ト
リトンＸ−100の蒸留水溶液で10回洗う。冷凍ス
トツクからの１：30に希釈したヤギ抗マウスイム
ノグロブリンのホースラデイツシユペルオキシダ
ーゼ抱合IgGフラクシヨンを、ウエル当たり50μ1
の割合で、0.5MのNaC1、0.5％トリトンＸ−
100、0.01MのNa2PO4に加え、室温で10分間放置
する。ウエルを0.05％トリトンＸ−100で10回洗
う。基質：１／100容の40mM2，2′−アジノージ
−（３−エチルベンゾチアゾリンスルホン酸）ジ
アンモニウム塩（ABTS）および１／100の30％
過酸化水素を含む0.1Mクエン酸ナトリウムを各
ウエルに100μ1ずつ加える。ブランクプレートの
列１に基質を加える。タイターテツク分光光度計
のスイツチを入れる。30分後、プレートのOD414
を読み取る。培地のみ（列１）の読みを各プレー
トについて平均する。平均および標準偏差（S.
D.）を計算し、平均±2S.D.であれば、試料を陽
性とする。各々の陽性試料から対照の平均をひ
き、特性O.D.を記録する。
（５％）を、96穴ポリスチレンマイクロタイター
プレートの各ウエル（50μ1）に加え、少なくと
も30分間室温に放置する。洗浄した標的細胞を
HEPES−緩衝ハンク平衡塩溶液（HHBSS）に
懸濁させて細胞懸濁液（107個／ml）を調製す
る。蒸留水をウエルに満たしてからその水をはじ
き飛ばすことによつて３回プレートを洗う。さら
に、プレートを、0.01MのNa2HPO4を含む
0.15MのNaC1（PBS−Ｏ）で一度洗い、液を除
く。各ウエルに50μ1の細胞懸濁液を加え、プレ
ートを３分間1500RPMで遠心分離する。各ウエ
ルに200μ1の割合で１％ホルムアルデヒドの
HHBSS溶液を加え、15分間室温に放置する。プ
レートを遠心分離し、液をすてる。ついで、ウエ
ルにPBS−９を注いでから液体を捨てることに
よつて、プレートを３回洗う。ウエル当たり
50μ1の割合で１％BSAのPBS−９溶液を各プレ
ートに加え、室温で10分間放置する。２組のウエ
ルに50μ1のハイブリドーマ培地試料を加え、各
プレートの列１にSDMEM＋２％RSを加え、室
温で90分インキユベートするか、あるいは冷蔵庫
で１晩インキユベートする。プレートを0.05％ト
リトンＸ−100の蒸留水溶液で10回洗う。冷凍ス
トツクからの１：30に希釈したヤギ抗マウスイム
ノグロブリンのホースラデイツシユペルオキシダ
ーゼ抱合IgGフラクシヨンを、ウエル当たり50μ1
の割合で、0.5MのNaC1、0.5％トリトンＸ−
100、0.01MのNa2PO4に加え、室温で10分間放置
する。ウエルを0.05％トリトンＸ−100で10回洗
う。基質：１／100容の40mM2，2′−アジノージ
−（３−エチルベンゾチアゾリンスルホン酸）ジ
アンモニウム塩（ABTS）および１／100の30％
過酸化水素を含む0.1Mクエン酸ナトリウムを各
ウエルに100μ1ずつ加える。ブランクプレートの
列１に基質を加える。タイターテツク分光光度計
のスイツチを入れる。30分後、プレートのOD414
を読み取る。培地のみ（列１）の読みを各プレー
トについて平均する。平均および標準偏差（S.
D.）を計算し、平均±2S.D.であれば、試料を陽
性とする。各々の陽性試料から対照の平均をひ
き、特性O.D.を記録する。
水晶体上皮細胞の細胞溶解
テストすべき上清をマイクロウエルに１〜5μl
ずつ分配する。細胞を0.1％BSAで洗い、約2000
個／μlに懸濁させる。1μlのテストすべき細胞を
各ウエルに加え、室温で１／２時間抗体と共にイ
ンキユベートする。対照抗体によつて最適の溶解
を示し、抗体を添加しないと溶解しないウサギ血
清を5μl加え、１時間室温でインキユベートする。
殺傷された水晶体上皮細胞の割合（％）を顕微鏡
で読む。
ずつ分配する。細胞を0.1％BSAで洗い、約2000
個／μlに懸濁させる。1μlのテストすべき細胞を
各ウエルに加え、室温で１／２時間抗体と共にイ
ンキユベートする。対照抗体によつて最適の溶解
を示し、抗体を添加しないと溶解しないウサギ血
清を5μl加え、１時間室温でインキユベートする。
殺傷された水晶体上皮細胞の割合（％）を顕微鏡
で読む。
抗体特異性に関する組織学的評価及び細胞毒性
水晶体上皮細胞の単層培養物を、まず抗体で処
理し、ついで補体で処理する（前段で説明した通
り）。ついで顕微鏡で観察し、すべての水晶体上
皮細胞が溶解したかどうか決定する。前のテスト
で最も有望であつたクローンからの抗体を用い、
正常なヒトの目あるいは前眼房を使用して結果を
組織学的に観察することによつて、抗体が実際に
水晶体上皮細胞のみを破壊し、他の目の組織を破
壊しないかどうかテストする。長期細胞毒性およ
び抗体の有効性をみるために、モンキーの前眼房
にin situ で抗体および補体を注入し、ついで
嚢外水晶体切除を行なう。処置された目の状態
を、長期間にわたり、眼科的観察および組織学的
研究によつて、処置しない目の状態と比較する。
理し、ついで補体で処理する（前段で説明した通
り）。ついで顕微鏡で観察し、すべての水晶体上
皮細胞が溶解したかどうか決定する。前のテスト
で最も有望であつたクローンからの抗体を用い、
正常なヒトの目あるいは前眼房を使用して結果を
組織学的に観察することによつて、抗体が実際に
水晶体上皮細胞のみを破壊し、他の目の組織を破
壊しないかどうかテストする。長期細胞毒性およ
び抗体の有効性をみるために、モンキーの前眼房
にin situ で抗体および補体を注入し、ついで
嚢外水晶体切除を行なう。処置された目の状態
を、長期間にわたり、眼科的観察および組織学的
研究によつて、処置しない目の状態と比較する。
抗体の大量生産
単一のモノクローナル抗体の大量生産は以下の
ようにして実施することができる。約107個のハ
イブリツド細胞を適当なＨ−２系の適合性マウス
に注射し、次の方法により腹水腫瘍を誘発する。
腹水産生のためには、0.5mlのプリスタン（２，
６，10，14−テトラメチルペンタデカン、
Aldrich）をマウスの腹腔内に注射し、１〜２ヶ
月放置する。種間ハイブリドーマの転移の３〜４
日前、各々のマウスに50μlの抗リンパ球血清を注
射する。腫瘍転移の日、個々のマウスに全身照射
（600〜800ラド）を与えてから６〜８時間後に同
系骨髄を移植する（107個／マウス）。ついで、ダ
ルベコ変性イーグル培地に懸濁したハイブリドー
マ細胞（106〜107）を腹腔内に注射する。腫瘍が
現われはじめたら（注射後10〜30日）、マウスを
放血し、血清中の抗体の存在および濃度を連続的
にテストする。適当な抗体を集め、精製し、貯蔵
する。
ようにして実施することができる。約107個のハ
イブリツド細胞を適当なＨ−２系の適合性マウス
に注射し、次の方法により腹水腫瘍を誘発する。
腹水産生のためには、0.5mlのプリスタン（２，
６，10，14−テトラメチルペンタデカン、
Aldrich）をマウスの腹腔内に注射し、１〜２ヶ
月放置する。種間ハイブリドーマの転移の３〜４
日前、各々のマウスに50μlの抗リンパ球血清を注
射する。腫瘍転移の日、個々のマウスに全身照射
（600〜800ラド）を与えてから６〜８時間後に同
系骨髄を移植する（107個／マウス）。ついで、ダ
ルベコ変性イーグル培地に懸濁したハイブリドー
マ細胞（106〜107）を腹腔内に注射する。腫瘍が
現われはじめたら（注射後10〜30日）、マウスを
放血し、血清中の抗体の存在および濃度を連続的
にテストする。適当な抗体を集め、精製し、貯蔵
する。
抗体の大量生産を行なう他の方法としては、上
記した方法を用い、皮下腫瘍を誘発させる方法も
ある。ハイブリドーマ細胞を組織培養で増殖さ
せ、抗体を含む培地を連続的に集める。
記した方法を用い、皮下腫瘍を誘発させる方法も
ある。ハイブリドーマ細胞を組織培養で増殖さ
せ、抗体を含む培地を連続的に集める。
本発明は、その目的を達成するのに極めて良く
適合しており、上記およびその他の固有の利点お
よび特徴を有する。
適合しており、上記およびその他の固有の利点お
よび特徴を有する。
上記した本発明の実施の態様は例示を目的とす
るものであつて、本発明の技術思想に反しない限
り変更および修正は当然に可能である。
るものであつて、本発明の技術思想に反しない限
り変更および修正は当然に可能である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 水晶体上皮細胞に対するモノクローナル抗
体。 ２ 水晶体上皮細胞に対する抗体を産生し得るマ
ウス脾細胞とマウスミエローマ細胞とを融合させ
て融合ハイブリツド細胞とし、このハイブリツド
細胞を培養し、水晶体上皮細胞に対するモノクロ
ーナル抗体を収集することからなる、水晶体上皮
細胞に対するモノクローナル抗体の製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/355,081 US4432751A (en) | 1982-03-05 | 1982-03-05 | Monoclonal antibodies against lens epithelial cells and preventing proliferation of remnant lens epithelial cells after extracapsular extraction |
| US355081 | 1982-03-05 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4187160A Division JPH0751063B2 (ja) | 1982-03-05 | 1992-07-14 | 水晶体上皮細胞に対する抗体を産生するセルライン |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58192831A JPS58192831A (ja) | 1983-11-10 |
| JPH0537B2 true JPH0537B2 (ja) | 1993-01-05 |
Family
ID=23396159
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58034699A Granted JPS58192831A (ja) | 1982-03-05 | 1983-03-04 | 水晶体上皮細胞に対するモノクローナル抗体およびその製造方法 |
| JP4187160A Expired - Lifetime JPH0751063B2 (ja) | 1982-03-05 | 1992-07-14 | 水晶体上皮細胞に対する抗体を産生するセルライン |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4187160A Expired - Lifetime JPH0751063B2 (ja) | 1982-03-05 | 1992-07-14 | 水晶体上皮細胞に対する抗体を産生するセルライン |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4432751A (ja) |
| EP (1) | EP0088606B1 (ja) |
| JP (2) | JPS58192831A (ja) |
| CA (1) | CA1209500A (ja) |
| DE (1) | DE3372785D1 (ja) |
| DK (1) | DK160562C (ja) |
| GR (1) | GR77941B (ja) |
| IE (1) | IE54702B1 (ja) |
| IL (1) | IL69715A (ja) |
| ZA (1) | ZA831168B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0555847U (ja) * | 1992-01-13 | 1993-07-27 | 三菱農機株式会社 | 脱穀機の受網目詰まり防止装置 |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5202252A (en) * | 1982-03-05 | 1993-04-13 | Houston Biotechnology Inc. | Monoclonal antibodies against lens epithelial cells and methods for preventing proliferation of remnant lens epithelial cells after extracapsular extraction |
| DE3778446D1 (de) * | 1986-08-18 | 1992-05-27 | Mueller Lierheim Wolfgang G K | Kontaktlinse. |
| US5055291A (en) * | 1986-11-04 | 1991-10-08 | Baylor College Of Medicine | Compositions for preventing secondary cataracts |
| EP0267005B1 (en) * | 1986-11-04 | 1992-12-23 | Baylor College Of Medicine | Compositions for preventing secondary cataracts |
| US5616122A (en) * | 1986-11-04 | 1997-04-01 | Baylor College Of Medicine | Methods and compositions for preventing secondary cataracts |
| US4871350A (en) * | 1986-11-04 | 1989-10-03 | Baylor College Of Medicine | Methods and compositions for preventing secondary cataracts |
| US4918165A (en) * | 1987-07-16 | 1990-04-17 | Ophthalmic Research Corporation | Mitotic inhibitor and method for preventing posterior lens capsule opacification after extracapsular extraction |
| US4966577A (en) * | 1988-03-16 | 1990-10-30 | Allergan, Inc. | Prevention of lens-related tissue growth in the eye |
| US4909784A (en) * | 1988-03-25 | 1990-03-20 | Seymour Dubroff | Method for preventing clouding of posterior capsule after extracapsular cataract eye surgery |
| DE68923852T2 (de) * | 1988-06-08 | 1995-12-21 | Baylor College Of Medicine, Houston, Tex. | Monoklonale antikörper gegen linsenepithelzellen und methoden zur verhinderung des vermehrung übriggebliebener linsenepithelzellen nach extrakapsuläres extraktion. |
| DE3826399C2 (de) * | 1988-08-03 | 2001-08-30 | Wilhelm Ludwig Kraemer | Reinigungsanlage für Waagen, insbesondere Kombinationswaagen |
| US5627162A (en) * | 1990-01-11 | 1997-05-06 | Gwon; Arlene E. | Methods and means for control of proliferation of remnant cells following surgery |
| US5375611A (en) * | 1993-01-26 | 1994-12-27 | Pharmacia Ab | Method for preventing secondary cataract |
| US5876438A (en) * | 1993-08-02 | 1999-03-02 | Houston Biotechnology Incorporated | Polymeric device for the delivery of immunotoxins for the prevention of secondary cataract |
| US5620013A (en) * | 1994-10-21 | 1997-04-15 | American Cyanamid Company | Method for destroying residual lens epithelial cells |
| CA2187482A1 (en) * | 1995-10-13 | 1997-04-14 | Eri Inoue | Pharmaceutical composition |
| US6106554A (en) * | 1999-02-25 | 2000-08-22 | Bausch & Lomb Surgical, Inc. | Intraocular lens implants for the prevention of secondary cataracts |
| US6454802B1 (en) | 2000-08-21 | 2002-09-24 | Bausch & Lomb Incorporated | Intraocular lens implant for the prevention of secondary cataracts |
| US6945971B1 (en) * | 2004-07-19 | 2005-09-20 | Gwon Arlene E | Controlled ocular lens regeneration |
| US7252662B2 (en) * | 2004-11-02 | 2007-08-07 | Lenticular Research Group Llc | Apparatus and processes for preventing or delaying one or more symptoms of presbyopia |
| AU2006213997A1 (en) | 2005-02-19 | 2006-08-24 | Lenticular Research Group Llc | Apparatus and processes for preventing or delaying onset or progression of age-related cataract |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4307082A (en) * | 1979-07-10 | 1981-12-22 | New York University | Method for the extraction of a factor that mediates contact inhibition of cell growth |
| US4342828A (en) * | 1979-07-20 | 1982-08-03 | Morinaga Milk Industry Co., Ltd. | Method for producing substance capable of stimulating differentiation and proliferation of human granulopoietic stem cells |
| US4349528A (en) * | 1979-11-21 | 1982-09-14 | The Wistar Institute | Monocolonal hybridoma antibody specific for high molecular weight carcinoembryonic antigen |
-
1982
- 1982-03-05 US US06/355,081 patent/US4432751A/en not_active Expired - Lifetime
-
1983
- 1983-02-22 ZA ZA831168A patent/ZA831168B/xx unknown
- 1983-02-24 DK DK084783A patent/DK160562C/da not_active IP Right Cessation
- 1983-03-04 EP EP83301176A patent/EP0088606B1/en not_active Expired
- 1983-03-04 IE IE467/83A patent/IE54702B1/en not_active IP Right Cessation
- 1983-03-04 DE DE8383301176T patent/DE3372785D1/de not_active Expired
- 1983-03-04 GR GR70670A patent/GR77941B/el unknown
- 1983-03-04 JP JP58034699A patent/JPS58192831A/ja active Granted
- 1983-03-04 CA CA000422956A patent/CA1209500A/en not_active Expired
- 1983-09-13 IL IL69715A patent/IL69715A/xx not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-07-14 JP JP4187160A patent/JPH0751063B2/ja not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0555847U (ja) * | 1992-01-13 | 1993-07-27 | 三菱農機株式会社 | 脱穀機の受網目詰まり防止装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA1209500A (en) | 1986-08-12 |
| DE3372785D1 (en) | 1987-09-03 |
| EP0088606A2 (en) | 1983-09-14 |
| DK160562C (da) | 1991-09-02 |
| EP0088606B1 (en) | 1987-07-29 |
| IE54702B1 (en) | 1990-01-17 |
| JPS58192831A (ja) | 1983-11-10 |
| DK160562B (da) | 1991-03-25 |
| EP0088606A3 (en) | 1984-03-28 |
| GR77941B (ja) | 1984-09-25 |
| IL69715A (en) | 1988-06-30 |
| DK84783D0 (da) | 1983-02-24 |
| IE830467L (en) | 1983-09-05 |
| DK84783A (da) | 1983-09-06 |
| ZA831168B (en) | 1983-11-30 |
| JPH05184358A (ja) | 1993-07-27 |
| JPH0751063B2 (ja) | 1995-06-05 |
| US4432751A (en) | 1984-02-21 |
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