JPH0751063B2 - 水晶体上皮細胞に対する抗体を産生するセルライン - Google Patents
水晶体上皮細胞に対する抗体を産生するセルラインInfo
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- JPH0751063B2 JPH0751063B2 JP4187160A JP18716092A JPH0751063B2 JP H0751063 B2 JPH0751063 B2 JP H0751063B2 JP 4187160 A JP4187160 A JP 4187160A JP 18716092 A JP18716092 A JP 18716092A JP H0751063 B2 JPH0751063 B2 JP H0751063B2
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- lens epithelial
- cells
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
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- A—HUMAN NECESSITIES
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は水晶体上皮細胞に対する
モノクローナル抗体に係る。本発明のモノクローナル抗
体は嚢外摘出後残存する水晶体上皮細胞の増殖を防止す
る。
モノクローナル抗体に係る。本発明のモノクローナル抗
体は嚢外摘出後残存する水晶体上皮細胞の増殖を防止す
る。
【０００２】
【従来の技術】白内障の嚢外摘出は、最近、一般的な白
内障切除法になってきた。これはおそらく、嚢胞状黄斑
浮腫、網膜剥離の可能性に関して術後の併発症の出現率
が低いためであると思われる。超音波白内障乳化吸引法
（phacoemulsification ）のような改良された嚢外摘出
法の開発や、種々の人工水晶体の移植のための無疵の水
晶体後嚢の必要性が、この傾向に影響を与えた重要な要
素であることは確実である。白内障の嚢外摘出で考えら
れる唯一の欠点は、水晶体後嚢の混濁化の出現率が高い
ことである。これが起こると良好な視覚を得るために後
切嚢法や水晶体後嚢の再研磨（repolishing ）のような
外科的手法が必要になる。
内障切除法になってきた。これはおそらく、嚢胞状黄斑
浮腫、網膜剥離の可能性に関して術後の併発症の出現率
が低いためであると思われる。超音波白内障乳化吸引法
（phacoemulsification ）のような改良された嚢外摘出
法の開発や、種々の人工水晶体の移植のための無疵の水
晶体後嚢の必要性が、この傾向に影響を与えた重要な要
素であることは確実である。白内障の嚢外摘出で考えら
れる唯一の欠点は、水晶体後嚢の混濁化の出現率が高い
ことである。これが起こると良好な視覚を得るために後
切嚢法や水晶体後嚢の再研磨（repolishing ）のような
外科的手法が必要になる。
【０００３】白内障の嚢外摘出後の水晶体後嚢の混濁化
についての病理発生は公知である。すなわち、残存する
水晶体上皮細胞が水晶体後嚢上で増殖し、発育不全な水
晶体「繊維」および「小水疱(bladder) 」細胞（エルシ
ュニッヒ真珠）を形成する。
についての病理発生は公知である。すなわち、残存する
水晶体上皮細胞が水晶体後嚢上で増殖し、発育不全な水
晶体「繊維」および「小水疱(bladder) 」細胞（エルシ
ュニッヒ真珠）を形成する。
【０００４】Contact and Intraocular Lens Medical J
ournal, Vol.5, No.4, Oct./Dec.1979, pp.175-178, Af
ter-Cataract：Studies of Chemical and Radiation In
hibition，by Roy et alに報告されているように、嚢外
白内障手術に関連して術後の白内障の出現率を低下させ
る方法をみつけようとして化学的および放射線的手段が
試みられている。この文献では、被膜下上皮細胞を化学
的に阻害するためにビンクリスチン（vincristine ）と
ビンブラスチン（vinblastine ）が使用されている。こ
れは、これらの薬剤が細胞の有糸分裂に対して直接的な
阻害効果をもっていることが分っていたからである（Go
odman, L. S.；and Gillman, A：The Pharmacological
Basis of Therapeutics, Maximilan, New York, 1965,
pp. 1373-1376 ）。ビンクリスチンとビンブランスチン
は角膜の損傷を抑制し、その結果わずかに角膜の損傷が
直ることが判っていたが、上記文献の著者は角膜および
虹彩に悪い影響があることから、これらの薬剤を被膜下
上皮増殖の抑制を試みるための動物研究に使用すべきで
ないと考えていた。さらにこの著者らは、手術後２日目
に与えた放射線が、すべての照射スケジュールの中で最
も効果的にみえたと述べている。しかしながら、著者ら
はいくらかの損傷の危険性も指摘しており、人間に放射
線を用いた場合問題があるかどうか言明することは難し
いと結んでいる。
ournal, Vol.5, No.4, Oct./Dec.1979, pp.175-178, Af
ter-Cataract：Studies of Chemical and Radiation In
hibition，by Roy et alに報告されているように、嚢外
白内障手術に関連して術後の白内障の出現率を低下させ
る方法をみつけようとして化学的および放射線的手段が
試みられている。この文献では、被膜下上皮細胞を化学
的に阻害するためにビンクリスチン（vincristine ）と
ビンブラスチン（vinblastine ）が使用されている。こ
れは、これらの薬剤が細胞の有糸分裂に対して直接的な
阻害効果をもっていることが分っていたからである（Go
odman, L. S.；and Gillman, A：The Pharmacological
Basis of Therapeutics, Maximilan, New York, 1965,
pp. 1373-1376 ）。ビンクリスチンとビンブランスチン
は角膜の損傷を抑制し、その結果わずかに角膜の損傷が
直ることが判っていたが、上記文献の著者は角膜および
虹彩に悪い影響があることから、これらの薬剤を被膜下
上皮増殖の抑制を試みるための動物研究に使用すべきで
ないと考えていた。さらにこの著者らは、手術後２日目
に与えた放射線が、すべての照射スケジュールの中で最
も効果的にみえたと述べている。しかしながら、著者ら
はいくらかの損傷の危険性も指摘しており、人間に放射
線を用いた場合問題があるかどうか言明することは難し
いと結んでいる。
【０００５】上記文献の著者はさらに、被膜下上皮細胞
を選択的に阻害する薬剤ないしは化学システムが存在
し、それがみつかれば術後白内障を抑制するのに有用な
手段になり得ると指摘している。
を選択的に阻害する薬剤ないしは化学システムが存在
し、それがみつかれば術後白内障を抑制するのに有用な
手段になり得ると指摘している。
【０００６】本出願人の知るところでは、水晶体上皮細
胞の一回のサイクルの終わりに有糸分裂阻害剤、すなわ
ちメトトレキセート、レチノイン酸あるいはこれらの混
合物を最小の有効投与量で点滴注入すると、白内障の嚢
外摘出の後眼に対する危険を招くことなく水晶体後嚢の
混濁化を効果的に防止できる。
胞の一回のサイクルの終わりに有糸分裂阻害剤、すなわ
ちメトトレキセート、レチノイン酸あるいはこれらの混
合物を最小の有効投与量で点滴注入すると、白内障の嚢
外摘出の後眼に対する危険を招くことなく水晶体後嚢の
混濁化を効果的に防止できる。
【０００７】メトトレキセートは、ジヒドロ葉酸レダク
ターゼという酵素を阻害し、したがって還元された葉酸
の細胞内プールの維持を妨害するサイクル依存性（cycl
e-dependent ）の抗代謝剤である。
ターゼという酵素を阻害し、したがって還元された葉酸
の細胞内プールの維持を妨害するサイクル依存性（cycl
e-dependent ）の抗代謝剤である。
【０００８】レチノイン酸は、細胞分裂あるいはＤＮＡ
合成のいずれかまたはその双方を阻害するように思われ
るが正確なメカニズムは知られていない。
合成のいずれかまたはその双方を阻害するように思われ
るが正確なメカニズムは知られていない。
【０００９】本発明は、残存する水晶体上皮細胞に特異
的なモノクローナル抗体の製造およびその使用によって
従来技術の欠点を改善するものであり、本発明のモノク
ローナル抗体を使用すると、初めの白内障除去の時点
で、目の他の部分に損傷を与えることなく選択的に前記
残存水晶体上皮細胞を破壊することができる。
的なモノクローナル抗体の製造およびその使用によって
従来技術の欠点を改善するものであり、本発明のモノク
ローナル抗体を使用すると、初めの白内障除去の時点
で、目の他の部分に損傷を与えることなく選択的に前記
残存水晶体上皮細胞を破壊することができる。
【００１０】本出願人の知る限り、水晶体上皮細胞に特
異的なモノクローナル抗体の製造を教示している従来技
術はないし、ましてそのような抗体を用いることによっ
て目の他の部分に損傷を与えることなく残存水晶体上皮
細胞を選択的に破壊することについて教示する従来技術
は存在しない。
異的なモノクローナル抗体の製造を教示している従来技
術はないし、ましてそのような抗体を用いることによっ
て目の他の部分に損傷を与えることなく残存水晶体上皮
細胞を選択的に破壊することについて教示する従来技術
は存在しない。
【００１１】モノクローナル抗体の製造に関する従来技
術の代表例としては次のものがある。
術の代表例としては次のものがある。
【００１２】(1) Monoclonal Antibodies, 1980, Ple
num Press ，New York，edited by Roger H. Kennett，
Thomas J. McKearn and Cathleen B. Bechtol 。
num Press ，New York，edited by Roger H. Kennett，
Thomas J. McKearn and Cathleen B. Bechtol 。
【００１３】(2) Continuous cultures of fused cel
ls secreting antibody of predefined specificity, N
ature, Vol.256, August 7, 1975, pp.495-497。
ls secreting antibody of predefined specificity, N
ature, Vol.256, August 7, 1975, pp.495-497。
【００１４】また、米国特許第4,271,145 号、同第4,19
6,265 号、同第4,172,124 号、同第4,195,125 号、同第
4,262,090 号、同第4,294,927 号もモノクローナル抗体
の製造に関するものである。
6,265 号、同第4,172,124 号、同第4,195,125 号、同第
4,262,090 号、同第4,294,927 号もモノクローナル抗体
の製造に関するものである。
【００１５】
【発明の概要】本発明は、水晶体上皮細胞に特異的なモ
ノクローナル抗体、この抗体を産生する連続セルライン
を含むこの抗体の製造方法、および、初めの白内障切除
時に、あるいは、術後白内障の切除で、目の他の部分に
損傷を与えることなく、残存する水晶体上皮細胞を破壊
するためにこの抗体を使用することに関する。使用時に
は、本発明のモノクローナル抗体をヒトの目の前眼房に
点滴注入し、水晶体上皮細胞と相互作用せしめる。つい
で、補体を前眼房に点滴注入して、目の他の部分に損傷
を与えることなく、選択的に水晶体上皮細胞に溶解やそ
の他の損傷を生じさせる。このことは、有糸分裂阻害剤
の使用や他の方法に比べて、破壊が残存水晶体上皮細胞
にのみ特異的であるという点で、非常に有益である。こ
の残存水晶体上皮細胞はもし破壊されないと増殖し移動
して、目の中に残された後嚢の表面を覆い、「後発白内
障」を引きおこす。その結果、視覚が失われ、もう一度
手術が必要となる。
ノクローナル抗体、この抗体を産生する連続セルライン
を含むこの抗体の製造方法、および、初めの白内障切除
時に、あるいは、術後白内障の切除で、目の他の部分に
損傷を与えることなく、残存する水晶体上皮細胞を破壊
するためにこの抗体を使用することに関する。使用時に
は、本発明のモノクローナル抗体をヒトの目の前眼房に
点滴注入し、水晶体上皮細胞と相互作用せしめる。つい
で、補体を前眼房に点滴注入して、目の他の部分に損傷
を与えることなく、選択的に水晶体上皮細胞に溶解やそ
の他の損傷を生じさせる。このことは、有糸分裂阻害剤
の使用や他の方法に比べて、破壊が残存水晶体上皮細胞
にのみ特異的であるという点で、非常に有益である。こ
の残存水晶体上皮細胞はもし破壊されないと増殖し移動
して、目の中に残された後嚢の表面を覆い、「後発白内
障」を引きおこす。その結果、視覚が失われ、もう一度
手術が必要となる。
【００１６】
【発明の目的】すなわち、本発明は、水晶体上皮細胞に
特異的なモノクローナル抗体を提供することを目的とす
る。
特異的なモノクローナル抗体を提供することを目的とす
る。
【００１７】本発明の他の目的は、水晶体上皮細胞に特
異的なモノクローナル抗体を産生する連続セルラインを
提供することである。
異的なモノクローナル抗体を産生する連続セルラインを
提供することである。
【００１８】本発明のさらに他の目的は、白内障の最初
の切除時に水晶体上皮細胞に特異的なモノクローナル抗
体を点滴注入し、この抗体と残存水晶体上皮細胞とを相
互作用せしめ、ついで、この細胞を溶解する補体を点滴
注入することによって、白内障の嚢外摘出後に残存する
水晶体上皮細胞が増殖し移動して水晶体嚢表面を覆うた
めに生じる水晶体嚢の混濁化を防止することにある。
の切除時に水晶体上皮細胞に特異的なモノクローナル抗
体を点滴注入し、この抗体と残存水晶体上皮細胞とを相
互作用せしめ、ついで、この細胞を溶解する補体を点滴
注入することによって、白内障の嚢外摘出後に残存する
水晶体上皮細胞が増殖し移動して水晶体嚢表面を覆うた
めに生じる水晶体嚢の混濁化を防止することにある。
【００１９】本発明のさらに他の目的は、目の前房内に
前記モノクローナル抗体を点滴注入してこの抗体と水晶
体上皮細胞とを反応せしめ、ついで、この細胞を溶解す
る補体を注入することにより、水晶体上皮細胞の生長お
よび移動によって引きおこされる後発白内障を除去する
ことにある。
前記モノクローナル抗体を点滴注入してこの抗体と水晶
体上皮細胞とを反応せしめ、ついで、この細胞を溶解す
る補体を注入することにより、水晶体上皮細胞の生長お
よび移動によって引きおこされる後発白内障を除去する
ことにある。
【００２０】本発明のさらに他の目的、特徴、利点は明
細書全体から明らかになるであろう。
細書全体から明らかになるであろう。
【００２１】
【好ましい態様の説明】本発明は、ヒトの目の前房内に
水晶体上皮細胞に特異的なモノクローナル抗体を点滴注
入し、この抗体と水晶体上皮細胞とを相互作用せしめる
ことによって、嚢外摘出後に残存する水晶体上皮細胞の
増殖を防止することに関するものである。通常、約１０
０μｌのモノクローナル抗体を点滴注入し、このモノク
ローナル抗体と水晶体上皮細胞との相互作用が起こるま
で普通は約３０分を要する。ついで、補体を約１００μ
ｌの有効量で前眼房に点滴して、残存水晶体上皮細胞を
溶解したりあるいは他の損傷を引起こし、これにより、
この細胞が増殖し移動して、適当に残された水晶体嚢の
表面を覆う現象が防止される。これは嚢外白内障摘出と
同時に、好ましくは白内障の切除の直後に行なうことが
でき、また、水晶体嚢の表面上で上記細胞が増殖あるい
は生長することにより生じた後発白内障の切除のため
に、のちに行なうこともできる。
水晶体上皮細胞に特異的なモノクローナル抗体を点滴注
入し、この抗体と水晶体上皮細胞とを相互作用せしめる
ことによって、嚢外摘出後に残存する水晶体上皮細胞の
増殖を防止することに関するものである。通常、約１０
０μｌのモノクローナル抗体を点滴注入し、このモノク
ローナル抗体と水晶体上皮細胞との相互作用が起こるま
で普通は約３０分を要する。ついで、補体を約１００μ
ｌの有効量で前眼房に点滴して、残存水晶体上皮細胞を
溶解したりあるいは他の損傷を引起こし、これにより、
この細胞が増殖し移動して、適当に残された水晶体嚢の
表面を覆う現象が防止される。これは嚢外白内障摘出と
同時に、好ましくは白内障の切除の直後に行なうことが
でき、また、水晶体嚢の表面上で上記細胞が増殖あるい
は生長することにより生じた後発白内障の切除のため
に、のちに行なうこともできる。
【００２２】水晶体上皮細胞に特異的なこのモノクロー
ナル抗体は、ヒトの水晶体上皮抗体産生細胞とミエロー
マ（骨髄腫）細胞とを融合させて融合ハイブリッドと
し、このハイブリッドを培養し、ついでヒト水晶体上皮
細胞に特異的な抗体を集めることにより製造される。
ナル抗体は、ヒトの水晶体上皮抗体産生細胞とミエロー
マ（骨髄腫）細胞とを融合させて融合ハイブリッドと
し、このハイブリッドを培養し、ついでヒト水晶体上皮
細胞に特異的な抗体を集めることにより製造される。
【００２３】補体は標準的な補体であり、たとえば、本
発明に有用な典型的な補体およびその調製は前記のMono
clonal Antibodies の 391〜392 頁に記載されている。
発明に有用な典型的な補体およびその調製は前記のMono
clonal Antibodies の 391〜392 頁に記載されている。
【００２４】水晶体上皮細胞に対するモノクローナル抗
体の製造の手順を次に示す。
体の製造の手順を次に示す。
【００２５】細胞培養 死後３０分以内のヒトの目、あるいは、白内障手術の間
に切除した組織からヒト水晶体上皮細胞を得る。この細
胞を、すでに充分確立されている方法を用いて組織培養
用インキュベーター中で単層培養する。
に切除した組織からヒト水晶体上皮細胞を得る。この細
胞を、すでに充分確立されている方法を用いて組織培養
用インキュベーター中で単層培養する。
【００２６】水晶体上皮細胞による免疫化 マウス（BALB／c あるいは他の適当な系統）に、５〜１
０×１０6 個の全細胞（whole cells ）を腹腔内あるい
は静脈内に注射する。２週間後に、それぞれの動物から
の血液サンプルを特異抗体に関して検定する。ついで、
最も高い力価（抗体価）をもっている動物に、再び、腹
腔内または静脈内で５〜１０×１０6 個の細胞を注射す
る。
０×１０6 個の全細胞（whole cells ）を腹腔内あるい
は静脈内に注射する。２週間後に、それぞれの動物から
の血液サンプルを特異抗体に関して検定する。ついで、
最も高い力価（抗体価）をもっている動物に、再び、腹
腔内または静脈内で５〜１０×１０6 個の細胞を注射す
る。
【００２７】免疫脾細胞とミエローマ細胞との融合 マウスを（静脈内で）免疫化した３〜４日後、マウスを
頸部脱臼により殺し、放血させ、血清を冷凍する。マウ
スを７０％エタノールで清め、脾を無菌で摘出する。消
毒した使い捨ての３ml注射器のゴム製プランジャーを用
い、脾を温いＨＢＳＳにより５０メッシュのステンレス
スチールのスクリーンに通して細かくする。懸濁液を３
mlの注射器を用いて数回ピペッティングする。この懸濁
液を２００メッシュのステンレススチールのスクリーン
に通すことにより単個細胞懸濁液を調製する。脾細胞を
１２００ rpmで１０分間遠心分離する。４０℃で５分
間、0.83％ＮＨ4 Ｃｌを用いて処理することにより、赤
血球細胞を分析する。血清を含まない培地で脾細胞を二
回洗浄する。細胞をカウントし、トリパンブルー色素排
除テストで生死を判定する。
頸部脱臼により殺し、放血させ、血清を冷凍する。マウ
スを７０％エタノールで清め、脾を無菌で摘出する。消
毒した使い捨ての３ml注射器のゴム製プランジャーを用
い、脾を温いＨＢＳＳにより５０メッシュのステンレス
スチールのスクリーンに通して細かくする。懸濁液を３
mlの注射器を用いて数回ピペッティングする。この懸濁
液を２００メッシュのステンレススチールのスクリーン
に通すことにより単個細胞懸濁液を調製する。脾細胞を
１２００ rpmで１０分間遠心分離する。４０℃で５分
間、0.83％ＮＨ4 Ｃｌを用いて処理することにより、赤
血球細胞を分析する。血清を含まない培地で脾細胞を二
回洗浄する。細胞をカウントし、トリパンブルー色素排
除テストで生死を判定する。
【００２８】ハイブリッドのフィーダー層として、免疫
化していないBALB／c マウスから脾細胞懸濁液を調製す
る。指数増殖期（細胞５×１０5 個／ml）のミエローマ
細胞を、５０mlの円錐形のポリプロピレン遠心分離チュ
ーブに移す。ミエローマおよび脾細胞懸濁液を、血清を
含まない培地で別々に２回洗う。細胞をカウントし、一
緒にし、１回洗って混合ペレット（脾細胞１０8 個およ
びミエローマ細胞１０7 個）を得る。遠心チューブを静
かにたたいて、ペレットを分散させて塊りの多い懸濁液
とする。０．８mlの５０％ＰＥＧを１分間かけて３７℃
で添加する。懸濁液を１分間静置する。１mlの無血清培
地を１分間かけて加える。２０mlの無血清培地を５分間
かけて加える。
化していないBALB／c マウスから脾細胞懸濁液を調製す
る。指数増殖期（細胞５×１０5 個／ml）のミエローマ
細胞を、５０mlの円錐形のポリプロピレン遠心分離チュ
ーブに移す。ミエローマおよび脾細胞懸濁液を、血清を
含まない培地で別々に２回洗う。細胞をカウントし、一
緒にし、１回洗って混合ペレット（脾細胞１０8 個およ
びミエローマ細胞１０7 個）を得る。遠心チューブを静
かにたたいて、ペレットを分散させて塊りの多い懸濁液
とする。０．８mlの５０％ＰＥＧを１分間かけて３７℃
で添加する。懸濁液を１分間静置する。１mlの無血清培
地を１分間かけて加える。２０mlの無血清培地を５分間
かけて加える。
【００２９】細胞を遠心分離し、ＨＡＴおよび正常のBA
LB／c マウスから得た２〜４×１０7 個の脾細胞を含む
ハイブリドーマ培地に再び分散させる。０．１mlのサン
プルを９６穴マイクロテストプレートに分配し、３７℃
の１０％ＣＯ2 中でインキュベートする。活発な生長が
観察される７日目にさらに０．１mlのＨＴ生長培地を加
える。継代培養するまでＨＹ培地を使用する。３〜４日
毎に培地交換を繰り返す。コロニーが目視できるように
なったら（１２〜２０日）、コロニーをスクリーニング
する。抗体活性の初期スクリーニング用に１００mlの培
養上清を集める。
LB／c マウスから得た２〜４×１０7 個の脾細胞を含む
ハイブリドーマ培地に再び分散させる。０．１mlのサン
プルを９６穴マイクロテストプレートに分配し、３７℃
の１０％ＣＯ2 中でインキュベートする。活発な生長が
観察される７日目にさらに０．１mlのＨＴ生長培地を加
える。継代培養するまでＨＹ培地を使用する。３〜４日
毎に培地交換を繰り返す。コロニーが目視できるように
なったら（１２〜２０日）、コロニーをスクリーニング
する。抗体活性の初期スクリーニング用に１００mlの培
養上清を集める。
【００３０】免疫脾細胞とミエローマ細胞との融合に用
いた材料を次に示す。
いた材料を次に示す。
【００３１】(1) ５０％ポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）１５４０(Polysciences)。１ml殺菌ＰＥＧ 1540
＋１ml無血清培地（ＳＦ−ＤＭＥＭ）。
ＥＧ）１５４０(Polysciences)。１ml殺菌ＰＥＧ 1540
＋１ml無血清培地（ＳＦ−ＤＭＥＭ）。
【００３２】(2) チミジン（Ｔ） 1.6×10-5Ｍ、ヒポ
キサンチン 1.0×10-4Ｍ、アミノプテリン４×10-7Ｍの
Littlefields濃縮液。
キサンチン 1.0×10-4Ｍ、アミノプテリン４×10-7Ｍの
Littlefields濃縮液。
【００３３】(a) １００倍ＨＴストック溶液 0.01361 ｇのヒポキサンチン、0.0388ｇのチミジンを７
０〜８０℃の１００ml再蒸留水に溶解し、濾過滅菌し、
サンプルに小分けし、−７０℃で冷凍保存する。
０〜８０℃の１００ml再蒸留水に溶解し、濾過滅菌し、
サンプルに小分けし、−７０℃で冷凍保存する。
【００３４】(b) １００倍アミノプテリンストック溶
液 0.018 ｇを再蒸留水に溶かし、アミノプテリンがすみや
かに溶解しない場合は０．１ＮのＮａＯＨを滴下し、ｐ
Ｈを 7.8に調整し、濾過滅菌し、−７０℃で冷凍保存す
る。
液 0.018 ｇを再蒸留水に溶かし、アミノプテリンがすみや
かに溶解しない場合は０．１ＮのＮａＯＨを滴下し、ｐ
Ｈを 7.8に調整し、濾過滅菌し、−７０℃で冷凍保存す
る。
【００３５】(c) ハイブリドーマ培地 高グルコース（4.5 ｇ／ｌ）のダルベコＭＥＭ、Ｌ−グ
ルタミンを添加した４mMの２％タイプ１００ラビット血
清（Kappa Scientific）、１mMピルビン酸ナトリウム
（Gibco ）、１００ＭのＭＥＭ、非必須アミノ酸（Gibc
o ）、５０Ｍのβ−メルカプトエタノール、１０mMのＨ
ＥＰＥＳ緩衝液、５mlＨＡＴ培地。
ルタミンを添加した４mMの２％タイプ１００ラビット血
清（Kappa Scientific）、１mMピルビン酸ナトリウム
（Gibco ）、１００ＭのＭＥＭ、非必須アミノ酸（Gibc
o ）、５０Ｍのβ−メルカプトエタノール、１０mMのＨ
ＥＰＥＳ緩衝液、５mlＨＡＴ培地。
【００３６】細胞の酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ） ０．１ＭのＮａＨＣＯ3 中のグルタルアルデヒド液（５
％）を、９６穴ポリスチレンマイクロタイタープレート
の各ウエル（５０μｌ）に加え、少なくとも３０分間室
温に放置する。洗浄した標的細胞をＨＥＰＥＳ−緩衝ハ
ンク平衡塩溶液（ＨＨＢＳＳ）に懸濁させて細胞懸濁液
（１０7 個／ml）を調製する。蒸留水をウエルに満たし
てからその水をはじき飛ばすことによって３回プレート
を洗う。さらに、プレートを、0.01ＭのＮａ2 ＨＰＯ4
を含む0.15ＭのＮａＣｌ（ＰＢＳ−Ｏ）で一度洗い、液
を除く。各ウエルに５０μｌの細胞懸濁液を加え、プレ
ートを３分間1500ＲＰＭで遠心分離する。各ウエルに２
００μｌの割合で１％ホルムアルデヒドのＨＨＢＳＳ溶
液を加え、１５分間室温に放置する。プレートを遠心分
離し、液をすてる。ついで、ウエルにＰＢＳ−９を注い
でから液体を捨てることによって、プレートを３回洗
う。ウエル当たり５０μｌの割合で１％ＢＳＡのＰＢＳ
−９溶液を各プレートに加え、室温で１０分間放置す
る。２組のウエルに５０μｌのハイブリドーマ培地試料
を加え、各プレートの列１にＳＤＭＥＭ＋２％ＲＳを加
え、室温で９０分インキュベートするか、あるいは冷蔵
庫で１晩インキュベートする。プレートを0.05％トリト
ンＸ−１００の蒸留水溶液で１０回洗う。冷凍ストック
からの１：３０に希釈したヤギ抗マウスイムノグロブリ
ンのホースラディッシュペルオキシダーゼ抱合ＩｇＧフ
ラクションを、ウエル当たり５０μｌの割合で、 0.5Ｍ
のＮａＣｌ、 0.5％トリトンＸ−１００、0.01ＭのＮａ
2 ＰＯ4 に加え、室温で１０分間放置する。ウエルを0.
05％トリトンＸ−１００で１０回洗う。基質： 1／100
容の４０mM２，２′−アジノ−ジ−（３−エチルベンゾ
チアゾリンスルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）
および 1／１００の３０％過酸化水素を含む ０．１Ｍ
クエン酸ナトリウムを各ウエルに１００μｌずつ加え
る。ブランクプレートの列１に基質を加える。タイター
テック分光光度計のスイッチを入れる。３０分後、プレ
ートのＯＤ414 を読み取る。培地のみ（列１）の読みを
各プレートについて平均する。平均および標準偏差
（Ｓ．Ｄ．）を計算し、平均±２Ｓ．Ｄ．であれば、試
料を陽性とする。各々の陽性試料から対照の平均をひ
き、特性Ｏ．Ｄ．を記録する。
％）を、９６穴ポリスチレンマイクロタイタープレート
の各ウエル（５０μｌ）に加え、少なくとも３０分間室
温に放置する。洗浄した標的細胞をＨＥＰＥＳ−緩衝ハ
ンク平衡塩溶液（ＨＨＢＳＳ）に懸濁させて細胞懸濁液
（１０7 個／ml）を調製する。蒸留水をウエルに満たし
てからその水をはじき飛ばすことによって３回プレート
を洗う。さらに、プレートを、0.01ＭのＮａ2 ＨＰＯ4
を含む0.15ＭのＮａＣｌ（ＰＢＳ−Ｏ）で一度洗い、液
を除く。各ウエルに５０μｌの細胞懸濁液を加え、プレ
ートを３分間1500ＲＰＭで遠心分離する。各ウエルに２
００μｌの割合で１％ホルムアルデヒドのＨＨＢＳＳ溶
液を加え、１５分間室温に放置する。プレートを遠心分
離し、液をすてる。ついで、ウエルにＰＢＳ−９を注い
でから液体を捨てることによって、プレートを３回洗
う。ウエル当たり５０μｌの割合で１％ＢＳＡのＰＢＳ
−９溶液を各プレートに加え、室温で１０分間放置す
る。２組のウエルに５０μｌのハイブリドーマ培地試料
を加え、各プレートの列１にＳＤＭＥＭ＋２％ＲＳを加
え、室温で９０分インキュベートするか、あるいは冷蔵
庫で１晩インキュベートする。プレートを0.05％トリト
ンＸ−１００の蒸留水溶液で１０回洗う。冷凍ストック
からの１：３０に希釈したヤギ抗マウスイムノグロブリ
ンのホースラディッシュペルオキシダーゼ抱合ＩｇＧフ
ラクションを、ウエル当たり５０μｌの割合で、 0.5Ｍ
のＮａＣｌ、 0.5％トリトンＸ−１００、0.01ＭのＮａ
2 ＰＯ4 に加え、室温で１０分間放置する。ウエルを0.
05％トリトンＸ−１００で１０回洗う。基質： 1／100
容の４０mM２，２′−アジノ−ジ−（３−エチルベンゾ
チアゾリンスルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）
および 1／１００の３０％過酸化水素を含む ０．１Ｍ
クエン酸ナトリウムを各ウエルに１００μｌずつ加え
る。ブランクプレートの列１に基質を加える。タイター
テック分光光度計のスイッチを入れる。３０分後、プレ
ートのＯＤ414 を読み取る。培地のみ（列１）の読みを
各プレートについて平均する。平均および標準偏差
（Ｓ．Ｄ．）を計算し、平均±２Ｓ．Ｄ．であれば、試
料を陽性とする。各々の陽性試料から対照の平均をひ
き、特性Ｏ．Ｄ．を記録する。
【００３７】水晶体上皮細胞の細胞溶解 テストすべき上清をマイクロウエルに１〜５μｌずつ分
配する。細胞を 0.1％ＢＳＡで洗い、約２０００個／μ
ｌに懸濁させる。１μｌのテストすべき細胞を各ウエル
に加え、室温で 1/2時間抗体と共にインキュベートす
る。対照抗体によって最適の溶解を示し、抗体を添加し
ないと溶解しないウサギ血清を５μｌ加え、１時間室温
でインキュベートする。殺傷された水晶体上皮細胞の割
合（％）を顕微鏡で読む。
配する。細胞を 0.1％ＢＳＡで洗い、約２０００個／μ
ｌに懸濁させる。１μｌのテストすべき細胞を各ウエル
に加え、室温で 1/2時間抗体と共にインキュベートす
る。対照抗体によって最適の溶解を示し、抗体を添加し
ないと溶解しないウサギ血清を５μｌ加え、１時間室温
でインキュベートする。殺傷された水晶体上皮細胞の割
合（％）を顕微鏡で読む。
【００３８】抗体特異性に関する組織学的評価及び細胞
毒性 水晶体上皮細胞の単層培養物を、まず抗体で処理し、つ
いで補体で処理する（前段で説明した通り）。ついで顕
微鏡で観察し、すべての水晶体上皮細胞が溶解したかど
うか決定する。前のテストで最も有望であったクローン
からの抗体を用い、正常なヒトの目あるいは前眼房を使
用して結果を組織学的に観察することによって、抗体が
実際に水晶体上皮細胞のみを破壊し、他の目の組織を破
壊しないかどうかテストする。長期細胞毒性および抗体
の有効性をみるために、モンキーの前眼房にin situ で
抗体および補体を注入し、ついで嚢外水晶体切除を行な
う。処置された目の状態を、長期間にわたり、眼科的観
察および組織学的研究によって、処置しない目の状態と
比較する。
毒性 水晶体上皮細胞の単層培養物を、まず抗体で処理し、つ
いで補体で処理する（前段で説明した通り）。ついで顕
微鏡で観察し、すべての水晶体上皮細胞が溶解したかど
うか決定する。前のテストで最も有望であったクローン
からの抗体を用い、正常なヒトの目あるいは前眼房を使
用して結果を組織学的に観察することによって、抗体が
実際に水晶体上皮細胞のみを破壊し、他の目の組織を破
壊しないかどうかテストする。長期細胞毒性および抗体
の有効性をみるために、モンキーの前眼房にin situ で
抗体および補体を注入し、ついで嚢外水晶体切除を行な
う。処置された目の状態を、長期間にわたり、眼科的観
察および組織学的研究によって、処置しない目の状態と
比較する。
【００３９】抗体の大量生産 単一のモノクローナル抗体の大量生産は以下のようにし
て実施することができる。約１０7 個のハイブリッド細
胞を適当なＨ−２系の適合性マウスに注射し、次の方法
により腹水腫瘍を誘発する。腹水産生のためには、０．
５mlのプリスタン（2,6,10,14 −テトラメチルペンタデ
カン，Aldrich ）をマウスの腹腔内に注射し、１〜２ケ
月放置する。種間ハイブリドーマの転移の３〜４日前、
各々のマウスに５０μｌの抗リンパ球血清を注射する。
腫瘍転移の日、個々のマウスに全身照射（ 600〜800 ラ
ド）を与えてから６〜８時間後に同系骨髄を移植する
（１０7 個／マウス）。ついで、ダルベコ変性イーグル
培地に懸濁したハイブリドーマ細胞（１０6 〜１０7 ）
を腹腔内に注射する。腫瘍が現われはじめたら（注射後
１０〜３０日）、マウスを放血し、血清中の抗体の存在
および濃度を連続的にテストする。適当な抗体を集め、
精製し、貯蔵する。
て実施することができる。約１０7 個のハイブリッド細
胞を適当なＨ−２系の適合性マウスに注射し、次の方法
により腹水腫瘍を誘発する。腹水産生のためには、０．
５mlのプリスタン（2,6,10,14 −テトラメチルペンタデ
カン，Aldrich ）をマウスの腹腔内に注射し、１〜２ケ
月放置する。種間ハイブリドーマの転移の３〜４日前、
各々のマウスに５０μｌの抗リンパ球血清を注射する。
腫瘍転移の日、個々のマウスに全身照射（ 600〜800 ラ
ド）を与えてから６〜８時間後に同系骨髄を移植する
（１０7 個／マウス）。ついで、ダルベコ変性イーグル
培地に懸濁したハイブリドーマ細胞（１０6 〜１０7 ）
を腹腔内に注射する。腫瘍が現われはじめたら（注射後
１０〜３０日）、マウスを放血し、血清中の抗体の存在
および濃度を連続的にテストする。適当な抗体を集め、
精製し、貯蔵する。
【００４０】抗体の大量生産を行なう他の方法として
は、上記した方法を用い、皮下腫瘍を誘発させる方法も
ある。ハイブリドーマ細胞を組織培養で増殖させ、抗体
を含む培地を連続的に集める。
は、上記した方法を用い、皮下腫瘍を誘発させる方法も
ある。ハイブリドーマ細胞を組織培養で増殖させ、抗体
を含む培地を連続的に集める。
【００４１】本発明は、その目的を達成するのに極めて
良く適合しており、上記およびその他の固有の利点およ
び特徴を有する。
良く適合しており、上記およびその他の固有の利点およ
び特徴を有する。
【００４２】上記した本発明の実施の態様は例示を目的
とするものであって、本発明の技術思想に反しない限り
変更および修正は当然に可能である。
とするものであって、本発明の技術思想に反しない限り
変更および修正は当然に可能である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 16/28 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｙ 33/577 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (1)
- 【請求項１】 水晶体上皮細胞で免疫化したマウスの脾
細胞とマウスミエローマ細胞とを融合することによって
得ることができ、水晶体上皮細胞上のエピトープを認識
する抗体を産生し得るハイブリドーマセルライン。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US355081 | 1982-03-05 | ||
| US06/355,081 US4432751A (en) | 1982-03-05 | 1982-03-05 | Monoclonal antibodies against lens epithelial cells and preventing proliferation of remnant lens epithelial cells after extracapsular extraction |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58034699A Division JPS58192831A (ja) | 1982-03-05 | 1983-03-04 | 水晶体上皮細胞に対するモノクローナル抗体およびその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05184358A JPH05184358A (ja) | 1993-07-27 |
| JPH0751063B2 true JPH0751063B2 (ja) | 1995-06-05 |
Family
ID=23396159
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58034699A Granted JPS58192831A (ja) | 1982-03-05 | 1983-03-04 | 水晶体上皮細胞に対するモノクローナル抗体およびその製造方法 |
| JP4187160A Expired - Lifetime JPH0751063B2 (ja) | 1982-03-05 | 1992-07-14 | 水晶体上皮細胞に対する抗体を産生するセルライン |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58034699A Granted JPS58192831A (ja) | 1982-03-05 | 1983-03-04 | 水晶体上皮細胞に対するモノクローナル抗体およびその製造方法 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4432751A (ja) |
| EP (1) | EP0088606B1 (ja) |
| JP (2) | JPS58192831A (ja) |
| CA (1) | CA1209500A (ja) |
| DE (1) | DE3372785D1 (ja) |
| DK (1) | DK160562C (ja) |
| GR (1) | GR77941B (ja) |
| IE (1) | IE54702B1 (ja) |
| IL (1) | IL69715A (ja) |
| ZA (1) | ZA831168B (ja) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5202252A (en) * | 1982-03-05 | 1993-04-13 | Houston Biotechnology Inc. | Monoclonal antibodies against lens epithelial cells and methods for preventing proliferation of remnant lens epithelial cells after extracapsular extraction |
| EP0256344B1 (de) * | 1986-08-18 | 1992-04-22 | Wolfgang G.K. Dr. Müller-Lierheim | Kontaktlinse |
| US5616122A (en) * | 1986-11-04 | 1997-04-01 | Baylor College Of Medicine | Methods and compositions for preventing secondary cataracts |
| US5055291A (en) * | 1986-11-04 | 1991-10-08 | Baylor College Of Medicine | Compositions for preventing secondary cataracts |
| DE3783211T2 (de) * | 1986-11-04 | 1993-04-29 | Baylor College Medicine | Zusammensetzungen zur verhuetung sekundaeren grauen stars. |
| US4871350A (en) * | 1986-11-04 | 1989-10-03 | Baylor College Of Medicine | Methods and compositions for preventing secondary cataracts |
| US4918165A (en) * | 1987-07-16 | 1990-04-17 | Ophthalmic Research Corporation | Mitotic inhibitor and method for preventing posterior lens capsule opacification after extracapsular extraction |
| US4966577A (en) * | 1988-03-16 | 1990-10-30 | Allergan, Inc. | Prevention of lens-related tissue growth in the eye |
| US4909784A (en) * | 1988-03-25 | 1990-03-20 | Seymour Dubroff | Method for preventing clouding of posterior capsule after extracapsular cataract eye surgery |
| ATE126530T1 (de) * | 1988-06-08 | 1995-09-15 | Baylor College Medicine | Monoklonale antikörper gegen linsenepithelzellen und methoden zur verhinderung des vermehrung übriggebliebener linsenepithelzellen nach extrakapsuläres extraktion. |
| DE3826399C2 (de) * | 1988-08-03 | 2001-08-30 | Wilhelm Ludwig Kraemer | Reinigungsanlage für Waagen, insbesondere Kombinationswaagen |
| US5627162A (en) * | 1990-01-11 | 1997-05-06 | Gwon; Arlene E. | Methods and means for control of proliferation of remnant cells following surgery |
| JPH0555847U (ja) * | 1992-01-13 | 1993-07-27 | 三菱農機株式会社 | 脱穀機の受網目詰まり防止装置 |
| US5375611A (en) * | 1993-01-26 | 1994-12-27 | Pharmacia Ab | Method for preventing secondary cataract |
| US5876438A (en) * | 1993-08-02 | 1999-03-02 | Houston Biotechnology Incorporated | Polymeric device for the delivery of immunotoxins for the prevention of secondary cataract |
| US5620013A (en) * | 1994-10-21 | 1997-04-15 | American Cyanamid Company | Method for destroying residual lens epithelial cells |
| CA2187482A1 (en) * | 1995-10-13 | 1997-04-14 | Eri Inoue | Pharmaceutical composition |
| US6106554A (en) * | 1999-02-25 | 2000-08-22 | Bausch & Lomb Surgical, Inc. | Intraocular lens implants for the prevention of secondary cataracts |
| US6454802B1 (en) | 2000-08-21 | 2002-09-24 | Bausch & Lomb Incorporated | Intraocular lens implant for the prevention of secondary cataracts |
| US6945971B1 (en) * | 2004-07-19 | 2005-09-20 | Gwon Arlene E | Controlled ocular lens regeneration |
| US7252662B2 (en) * | 2004-11-02 | 2007-08-07 | Lenticular Research Group Llc | Apparatus and processes for preventing or delaying one or more symptoms of presbyopia |
| AU2006213997A1 (en) | 2005-02-19 | 2006-08-24 | Lenticular Research Group Llc | Apparatus and processes for preventing or delaying onset or progression of age-related cataract |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4307082A (en) * | 1979-07-10 | 1981-12-22 | New York University | Method for the extraction of a factor that mediates contact inhibition of cell growth |
| US4342828A (en) * | 1979-07-20 | 1982-08-03 | Morinaga Milk Industry Co., Ltd. | Method for producing substance capable of stimulating differentiation and proliferation of human granulopoietic stem cells |
| US4349528A (en) * | 1979-11-21 | 1982-09-14 | The Wistar Institute | Monocolonal hybridoma antibody specific for high molecular weight carcinoembryonic antigen |
-
1982
- 1982-03-05 US US06/355,081 patent/US4432751A/en not_active Expired - Lifetime
-
1983
- 1983-02-22 ZA ZA831168A patent/ZA831168B/xx unknown
- 1983-02-24 DK DK084783A patent/DK160562C/da not_active IP Right Cessation
- 1983-03-04 EP EP83301176A patent/EP0088606B1/en not_active Expired
- 1983-03-04 GR GR70670A patent/GR77941B/el unknown
- 1983-03-04 IE IE467/83A patent/IE54702B1/en not_active IP Right Cessation
- 1983-03-04 DE DE8383301176T patent/DE3372785D1/de not_active Expired
- 1983-03-04 JP JP58034699A patent/JPS58192831A/ja active Granted
- 1983-03-04 CA CA000422956A patent/CA1209500A/en not_active Expired
- 1983-09-13 IL IL69715A patent/IL69715A/xx not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-07-14 JP JP4187160A patent/JPH0751063B2/ja not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Publication date |
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| ZA831168B (en) | 1983-11-30 |
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| CA1209500A (en) | 1986-08-12 |
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| GR77941B (ja) | 1984-09-25 |
| IL69715A (en) | 1988-06-30 |
| DE3372785D1 (en) | 1987-09-03 |
| IE54702B1 (en) | 1990-01-17 |
| DK160562C (da) | 1991-09-02 |
| DK84783A (da) | 1983-09-06 |
| IE830467L (en) | 1983-09-05 |
| EP0088606B1 (en) | 1987-07-29 |
| US4432751A (en) | 1984-02-21 |
| DK84783D0 (da) | 1983-02-24 |
| JPH0537B2 (ja) | 1993-01-05 |
| DK160562B (da) | 1991-03-25 |
| JPS58192831A (ja) | 1983-11-10 |
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