JPH054047B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はダイス完熟種子からの不定胚の誘導法
に関するものであり、組織培養・細胞培養を利用
した種苗の大量増殖に関するものである。

従来の技術 ここに言う不定胚（adventitious embryo）と
は、植物の組織培養中にある一定の条件下で、体
細胞の一部が受精卵由来の胚（embryo）と同様
の構造を持つたものに発育した場合に使われる言
葉であり、アメルカのStewardら（1958）がニン
ジンの胚軸の組織培養で観察、報告したのが最初
である。その後我が国の中田ら（1968）がタバコ
の葯培養で花粉粒からの不定胚誘導を報告して、
雄性生殖器官（花粉粒）からの不定胚発生も知ら
れるようになり、Ammirato（1983）によれば現
在までにすでに60数種の植物で不定胚誘導の報告
が知られている。

ダイズは、主要な植物タンパク資源として、遺
伝子組換えや細胞融合の重要なターゲツトとなつ
ている。多くの研究グループが組織や細胞からの
不定胚誘導の研究に取り組んで来たにもかかわら
ず、長年にわたつて成功しなかつたが、1985年12
月にアメリカにおける３つの研究グループ（コー
ネル大学、ケンタツキー大学、アグリシーズ社）
が相次いでダイズの未熟胚を材料に用いることに
よつて、そのカルスから不定胚を誘導しうること
を示した。

発明が解決しようとする問題点 上述の３つのグループの研究発表はいずれも培
養の出発点に受粉後20〜25日のダイズ未熟胚
（immature embryo）を用いたときにのみ成功
しており、材料の供給が限定される困難を伴つて
いた。また、培養に用いている培地組成も複雑で
単純化される必要があつた。

問題点を解決するための手段 本発明者らは、これらアメリカのグループとは
全く独自にダイズの細胞培養による効率の良い不
定胚誘導条件の検討を重ねていたが、従来の方法
とは異なる手法で、効率的で再現性の高い方法の
実現に成功した。

すなわち、本発明の方法は供試材料には誰で
も容易に入手できる完熟種子を用い、カルス形
成用、不定胚誘導用培地とも単純な培地を用い、
液体振盪培養、液体旋回、液体回転培養法等の
液体培養法を用いるものである。

作 用 本発明者らの用いた手法は以下の通りである。

(1) 不定胚誘導のための培養部位に完熟種子を用
いた。完熟種子を表面殺菌後、種皮を除去して
内部の子葉を切断し、所定の寒天培地で培養し
てカルス（Callus；不定形細胞塊）を形成さ
せ、そのカルスを所定の液体培地に移植して振
盪または回転培養に移すと不定胚が誘導され
る。ダイズの完熟種子を出発点にした不定胚誘
導法は他に前例がなく、本発明者が最初であ
る。

(2) 最初のカルス形成用培地にはMS無機養分
（Murashigeら、1962）＋２，４−Ｄ ２mg／
の寒天培地が適当で、その培地で形成されたカ
ルス20mgをMS無機養分だけのホルモンフリー
の液体培地に移して振盪及び回転培養すると培
養３〜４週間後には多数の不定胚が誘導され
た。この培地組成は現在までに知られている不
定胚誘導用培地のどの培地よりもシンプルであ
る。

(3) カルスの液体振盪培養及び液体回転培養のい
ずれからも多数の不定胚の誘導が認められた。
振盪培養は往復振盪、旋回振盪（いずれも60〜
115r.p.m.）とも認められ、回転培養でも1r.p.
m.（１分間１回転）5r.p.m.（１分間５回転）と
も認められた。本発明者らの用いた回転培養器
は直径45cmのドラムが回転する方式のもので、
23mmφの試験管100本架のものである。回転培
養法による不定胚誘導の報告例はダイズについ
てはもちろん、他のすべての作用についても前
例が無く、本発明者が最初である。

実施例 (1) ダイズの保存品種“ダンフイールド”と“デ
アー”の２品種の種子を中性洗剤で良くすすい
でから、３％アンチホルモン液に10分間浸漬し
て滅菌する。滅菌の終了した種子は胎座の部分
から慎重に種皮を除去し、種子の内部の子葉と
胚軸を摘出する。子葉と胚軸はそれぞれ区別し
て細断し（２mm巾）、カルス形成用培地に置床
する。

(2) カルス形成用培地にはMS＋２，４−Ｄ ２
mg／添加の寒天培地を用い、25℃12時間照明
（照度約2000lux）の培養室で培養すると１〜２
週間後にはカルス形成が始まる。

(3) 形成後２〜３週間のカルスを20〜30mg程度に
分割しMS無機養分＋シヨ糖30ｇ／のホルモ
ンフリーの液体培地に移植し液体振盪培養（60
〜115r.p.m.、往復、旋回とも）、及び液体回転
培養（1r.p.m.及び5r.p.m.）を行う。培養開始
２週間目ごろから遊離細胞の胚的生長が認めら
れるようになり、３〜４週間目には各ステージ
の胚が多数認められた。最も早く認められたの
は、60〜115r.p.m.往復振盪培養の三角フラス
コ中であり、次いで60〜115r.p.m.旋回振盪、
5r.p.m.回転の順で最後は1r.p.m.回転であつた。
誘導された不定胚の形状についてみると、最も
正常で同調的な発育を示したのは1r.p.m.及び
5r.p.m.回転培養の試験管中であり、往復及び
旋回振盪培養の不定胚は発根が先行して奇形的
な発育を示すものもあつた。

(4) 不定胚の誘導は供試した２品種“ダンフイー
ルド”と“デアー”の両者で認められたが、
“ダンフイールド”が特に高率であつた。完熟
種子中の子葉と胚軸では子葉起源のカルスから
高率に認められた。

発明の効果 本発明者らによるダイズの不定胚誘導法の開発
によつて、従来の未熟胚を利用した方法に比べ、 完熟種子を用いるので、市販の種子、貯蔵中
の種子など、いつでも供試材料が用意できる、 供試する培地が極めてシンプルで良く、それ
だけ再現性も高い、 振盪培養でも回転培養でも不定胚が誘導でき
る、 という利点がある。これらの利点によつて今後ダ
イズの細胞培養による不定胚誘導法として本法の
利用価値は極めて高いと考えられる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ダイズの完熟種子中の子葉を材料に、カルス
   を形成させ、そのカルスを液体培養することによ
   つて、多数の不定胚を誘導する方法。 ２ カルス形成を２，４−Ｄの存在下で行い、不
   定胚の誘導を２，４−Ｄの不存在下で行う特許請
   求の範囲第１項に記載の方法。 ３ カルス形成用及び不定胚誘導用培地がMS無
   機養分培地である特許請求の範囲第１項または第
   ２項に記載の方法。 ４ 不定胚誘導を液体回転培養で行い、その回転
   直径が約45cmであり、そして、その回転数が１−
   5r.p.m.である特許請求の範囲第１項、第２項ま
   たは第３項に記載の方法。