JPH054079B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明は、新規なビリルビン・オキシダーゼを
含有するビリルビン用試薬組成物、及びそれを用
いて、被検液例えば体液中のビリルビンを定量す
る方法、またはビリルビンの阻害効果を排除する
必要のある分析方法における該試薬組成物の使用
方法に関する。 従来技術 従来、ビリルビンの定量法としては、ジアゾス
ルフアニル酸のようなジアゾニウム塩を用いるジ
アゾ法という化学的測定法が主に用いられている
（金井泉、金井正光共著、臨床検査法提要、第28
版、ページXII−24、昭和53年、金原出版）。しか
し、化学的測定法では反応の特異性、操作の煩雑
性、試薬の刺激腐食性などの欠点があり、自動分
析装置への導入、維持、管理及び正確な測定など
の点で多くの問題があることが指摘されている。 また、最近、酵素を用いてビリルビンを定量す
る方法が開発されつつある。ビリルビンに反応す
る酵素としては、アール・ブロデルセン（R.
Brodersen）およびピー・ボルテルス（P.
Bortels）が最初に報告している〔ユアロピア
ン・ジヤーナル・オブ・バイオケミストリー
（Europ.J.Biochem.）第10巻第465頁（1969年）〕。
彼らはモルモツトの脳から単離した不溶性のビリ
ルビン・オキシダーゼがビリルビンをビリベルジ
ンへ酸化すると述べているが、過酸化水素が反応
生成物に含まれるか否かについては調べていな
い。また、アガリカス・ビスポーラス
（Agaricus bisporus）の酵素組成物がビリルビ
ンと特異的に反応して色変化を生じる作用を有す
るとの記載がある（特公昭58−11194号）。該酵素
組成物とビリルビンとの反応生成物は約510nｍ
で吸収ピークを示し、450nｍの励起波長により
約525nｍで蛍光を発する物質で、過酸化水素は
該酵素組成物の調整法により生成する場合と生成
しない場合がある。このビリルビン特異性菌性酵
素組成物により体液中のビリルビンを定量する方
法が提案されているが、該酵素組成物のビリルビ
ンに対する反応が単一の酵素によつて触媒される
のか、あるいは複数の酵素系によつて触媒される
のか非常に不明確である。またビリルビンに対す
る該酵素組成物の性質も充分に記載されていない
のでビリルビンの定量に有利な方法であるとはい
い難い。さらに該酵素は血清中のビリルビンの存
在形態の中のアルブミン結合型及びグルクロン酸
結合型ビリルビンに対する作用が全く記載されて
いない。また、最近、ミロセシウム属の生産する
ビリルビン・オキシダーゼを用いて、体液中のビ
リルビンを定量する場合、該酵素単独ではアルブ
ミン結合型ビリルビンに作用しないため反応促進
剤として界面活性剤などを添加してビリルビンを
定量する方法が提案されている（特開昭59−
17999号）。 一方、血清や尿などの体液中の各種成分を分析
する場合、体液中のビリルビンを除去する方法と
して、検体にフエロシアン化カリウムあるいはフ
エリシアン化カリウムを微量加え、酸化還元電位
を利用してビリルビンのような還元性物質の妨害
を除去して酵素的に体液中のグルコースを定量す
る方法（特公昭55−25840号）、酸化剤を用いてビ
リルビンの還元力を低下せしめ、体液成分を測定
する方法（特開昭56−107161号）、先に述べたビ
リルビン特異性菌性酵素組成物によりビリルビン
を分解しその干渉を除去して、体液中の目的成分
を測定する方法（特公昭58−11194号）などがあ
る。最後の方法に用いられるビリルビン特異性菌
性酵素組成物には過酸化水素を生成する組成物も
ある。その組成物は酸化酵素−パーオキシダーゼ
−水素供与色原体反応を用いる測定法に対しては
有利な方法ではない。また最近、ビリルビンを酸
化するが過酸化水素を生成しないビリルビン・オ
キシダーゼを用いて体液中に共存するビリルビン
の妨害を除去することによる体液中のビリルビン
の測定法が知られている（特開昭59−18000号）。
この測定法の特徴はビリルビン・オキシダーゼと
同時にビリルビン・オキシダーゼの反応促進物質
（例えば界面活性剤など）や発色反応阻害物質
（例えばフツ化ナトリウムなど）を添加すること
にある。しかし、ビリルビン・オキシダーゼは過
酸化水素の検出に用いられるパーオキシダーゼ−
水素供与色原体発色法における色原体、例えば４
−アミノアンチピリンとフエノールを定量的に酸
化縮合させ赤色に発色させる作用を有している。
発色反応阻害物質を反応液に添加すれば同時にビ
リルビン・オキシダーゼも阻害される故、ビリル
ビンの除去が充分に行なえず、体液成分の正確な
測定値を得ることが困難である。 本発明者らは、先に担子菌の生産するビリルビ
ン・オキシダーゼについてスクリーニングした結
果、スエヒロタケ（Schizophyllum commune）
が培養液中にビリルビン・オキシダーゼを生産
することを見出した（特願昭58−10149号）。しか
し、この酵素はやや不安定で工業的生産には不適
当であつたので、さらに担子菌の生産するビリル
ビン・オキシダーゼについて鋭意検討を重ねた結
果、エビタケ属に属するエビタケ
（Trachyderma tsunodae）が培養液中に優れ
た性質を有するビリルビン・オキシダーゼを著量
生産することを発見し、本酵素の酵素学的性質を
明らかにした。その結果、本酵素は既に報告され
ているビリルビン・オキシダーゼとは異なる新規
ビリルビン・オキシダーゼであるという結論に至
り特願昭58−218895号（特公平３−24198号公報
参照）として特許出願した。本酵素を新規ビリル
ビン・オキシダーゼＭ−１と命名する。 発明の目的 本発明の目的は、上記の新規ビリルビン・オキ
シダーゼＭ−１を含有するビリルビン用試薬組成
物、それを用いたビリルビンの定量方法及びビリ
ルビンの妨害効果を排除する必要のある分析方法
における該組成物の使用方法を提供することにあ
る。 発明の構成 本発明を概説すれば、本発明の第１の発明はビ
リルビン用試薬組成物に関する発明であつて、該
組成物が新規ビリルビン・オキシダーゼＭ−１を
含有することを特徴とする。 また本発明の第２の発明は、ビリルビンの定量
方法に関する発明であつて、ビリルビン含有被検
液に上記新規ビリルビン・オキシダーゼＭ−１を
含有する試薬組成物を作用させ、それにより生ず
るビリルビンの変化を光学的に測定することを特
徴とする。 更に本発明の第３の発明は、分析方法に関する
発明であつて、ビリルビンが分析の阻害剤となる
ビリルビン含有被検液中のビリルビン以外の成分
を酸化酵素−パーオキシダーゼ−水素供与色原体
反応により分析する方法において、(a)被検液に上
記新規ビリルビン・オキシダーゼＭ−１を含有す
る試薬組成物を作用させて、共存するビリルビン
の阻害効果を排除する工程、及び(b)残存被検液中
の目的成分を分析する工程、の各工程を包含する
ことを特徴とする。 まず、本発明における新規ビリルビン・オキシ
ダーゼＭ−１の各性質を示す。 (1) 新規ビリルビン・オキシダーゼＭ−１の酵素
化学的及び理化学性質 (1) 作用： 本酵素は、酸素の存在下、ビリルビン（ア
ルブミン結合型、グルクロン酸結合型、遊離
型）を酸化し、ビリベルジンを生成し、さら
に淡紫色物質を経て、ほぼ無色の物質を生成
する作用を有するが、過酸化水素を生成しな
い。 (2) 基質特異性： ビリルビンに作用する。ビリルビンにも作
用するが、ビリルビンの酸化速度の約12％で
ある。またハイドロキノン、ピロカテコー
ル、パラ−フエニレンジアミン、ピロガロー
ル、４−アミノアンチピリンおよびモノフエ
ノールに作用する。ヘミン、ビタミンB₁₂お
よびヘモグロビンには全く作用しない。 (3) 至適PH及びPH安定性： 本酵素の至適PHは5.5付近にあり、また37
℃において、それぞれのPHで60分間処理した
ときPH５〜PH９の間で安定である。 (4) 至適温度及び熱安定性： 本酵素の至適温度は50℃付近にあり、PH
7.0において、それぞれの温度で10分間処理
したとき55℃まで安定である。 (5) 分子量： 本酵素の分子量は、セフアクリルＳ−200
（フアルマシア製）によるゲル過法では約
83000である。 (6) 均一性： 7.5％ポリアクリルアミドゲル（PH9.4）を
用いてデイスク電気泳動を行ない、タンパク
染色と活性染色を行なつた。１本のタンパク
の染色帯が認められ単一であつた。また、本
酵素は４−アミノアンチピリンとフエノール
を定量的に赤色に発色させる作用を有してい
るため活性染色を行なうとタンパクの染色帯
と同じ位置に赤色のバンドが認められた。 (7) 等電点： フアルマライト（PH３〜PH10、フアルマシ
ア製）を用いた焦点電気泳動法により求める
と本酵素の等電点は3.92±0.05である。 (8) 金属イオン、阻害剤などの影響： 本酵素はＬ−アスコルビン酸、アジ化ナト
リウム、ジチオスレイトール、シアン化カリ
ウム、Ｌ−システイン、EDTA、Fe²⁺など
によつて阻害される（第１表）。

【表】

【表】 (9) 可視部吸収スペクトル： 本酵素溶液の可視部吸収スペクトルを測定
したところ、610nｍに吸収極大が認められ
ブルータンパクであつた。 (10) 糖含量： 7.5％ポリアクリルアミドゲル（PH9.4）を
用いて、デイスク電気泳動を行ない、PAS
染色〔アナリテイカル・バイオケミストリー
（Anal.Biochem.）第30巻第148頁（1969年）〕
を行なつたところ、タンパク染色位置と同一
部分が染色された。このことより、本酵素は
糖を含む糖タンパクである。糖含量をフエノ
ール硫酸法で測定すると約4.5％である。 (11) 銅含量： 原子吸光分析機を用いて、本酵素中の銅の
定量を行なつたところ、酵素１モルに対して
４モルの銅が含まれていた。 (12) 酵素活性測定法： 酵素活性の測定はビリルビンの460nｍの
吸収の減少より求めた。即ち、オメガ高ビリ
ルビンコントロール血清（米国ハイランド社
製）0.1ml、リン酸緩衝液（PH7.0）300マイ
クロモル及び適当に希釈した酵素液0.1ml、
反応液量3.0mlで37℃、10分間反応させ、ビ
リルビンに基づく460nｍの吸収減少を測定
した。新規ビリルビン・オキシダーゼＭ−１
の１単位は上記反応系で１分間に１マイクロ
モルのビリルビンを酸化する酵素量として表
示した。 以上本発明に使用する新規ビリル
ビン・オキシダーゼＭ−１を従来のビリルビ
ン・オキシダーゼと比較すると、第２表のご
とくである。

【表】

【表】 本発明によるビリルビン・オキシダーゼＭ−１
を含有する試薬組成物は上述した新規ビリルビ
ン・オキシダーゼＭ−１以外に常用の成分を含
んでいてよい。特にデオキシコール酸のアルカ
リ金属塩及びアルカリ土類金属塩、たとえばデ
オキシコール酸ナトリウムを添加すると反応が
促進される。試薬組成物に含まれる酵素量は少
なくとも0.0001単位以上、好ましくは10〜
0.001単位であり、測定時間、用途に応じて適
宜調節する。デオキシコール酸ナトリウムは
0.01〜1.0％、好ましくは0.05〜0.5％含まれる。
その他緩衝液、酵素の安定化剤など公知のもの
を必要に応じて加えればよい。試薬組成物は溶
液、凍結乾燥または担体シートへの含浸等公知
の方法で提供される。また酵素は公知の方法に
従つて不溶性担体に結合させ使用することもで
きる。 (2) ビリルビン定量法 本発明に従えば、上記した新規ビリルビン・
オキシダーゼＭ−１の性質〔(1)作用〕を利用し
てビリルビン含有被検液、例えば血清及び尿な
ど体液またはその前処理液中のビリルビンを定
量することができる。本発明で使用する上記新
規ビリルビン・オキシダーゼＭ−１は酸素の存
在下、ビリルビンを酸化し、ビリベルジンを生
成し、さらに淡紫色物質を経てほぼ無色の物質
を生成するから、血清や尿など体液中のビリル
ビンの定量には新規ビリルビン・オキシダーゼ
Ｍ−１を作用させた後の460nｍにおける吸光
度減少率より測定可能である。例えば血清など
の検体10〜100μに新規ビリルビン・オキシ
ダーゼＭ−１の0.1〜2.0単位をPH5.5〜7.0の緩
衝液とともに20〜40℃、好ましくは37℃で１〜
30分間好ましくは５〜10分間反応させ、新規ビ
リルビン・オキシダーゼＭ−１添加前の460n
ｍの吸光度と反応後の吸光度の差を得ることに
より検体中のビリルビン濃度の測定ができる。
また、本発明で使用する新規ビリルビン・オキ
シダーゼＭ−１は従来報告されているビリルビ
ン・オキシダーゼの反応促進剤、コール酸ナト
リウムに比べてデオキシコール酸ナトリウムで
は著しい反応促進効果を有する（第３表）。 第３表 添加物（最終濃度0.167％） 相対活性（％） 無添加 100 コール酸ナトリウム 120 デオキシコール酸ナトリウム 1650 本発明で使用する新規ビリルビン・オキシダー
ゼＭ−１は既述のように血清中のビリルビン存
在形態であるアルブミン結合型、グルクロ
ン酸結合型及び遊離型のいずれにも酵素単独
で作用する。このような性質を持つ酵素は従来
知られていない。そしてこのような性質は、ビ
リルビンの定量及び後述するビリルビン効果の
排除において、既知酵素より優れている。 (3) 体液成分の分析におけるビリルビン効果の排
除方法 次に酸化酵素−パーオキシダーゼ−水素供与
色原体反応で血清や尿など体液中の各種成分を
分析する場合、共存するビリルビンを新規ビリ
ルビン・オキシダーゼＭ−１で除去する方法に
ついて述べる。本酵素は上記の性質〔(6)均一
性〕で記載しているごとく、過酸化水素の検出
に用いられるパーオキシダーゼ−水素供与色原
体発色法における色原体、例えば４−アミノア
ンチピリン−フエノール系を定量的に酸化結合
させ赤色に発色させる作用を有している。その
ため、例えばグルコース、総コレステロールな
ど各種成分を測定する方法においてはあらかじ
め検体を新規ビリルビン・オキシダーゼＭ−１
で処理しておき、還元性物質であるビリルビン
効果の除去後、適当な阻害剤、例えばアジ化ナ
トリウム〔上記の性質(8)金属イオン、阻害剤な
どの影響〕を添加することにより、新規ビリル
ビン・オキシダーゼＭ−１の水素供与色原体に
対する作用を完全に阻害させ、その結果、グル
コース、総コレステロールなどの各種成分の正
確な測定値を得ることが可能である。 新規ビリルビン・オキシダーゼＭ−１と検体
との反応は、定量すべき体液成分採用する定量
法などに応じて適当な条件下で行なうことがで
きるが、通常血清あるいは尿などの検体試料10
〜100μに新規ビリルビン・オキシダーゼＭ
−１の0.01〜0.20単位をPH5.5〜7.0の緩衝液と
ともに20〜40℃好ましくは37℃で１〜30分間好
ましくは10〜20分間反応させた後、新規ビリル
ビン・オキシダーゼＭ−１の阻害剤を最終濃度
１〜50ｍＭ好ましくはアジ化ナトリウムを５ｍ
Ｍになるように加え、これ以後は通常の各種成
分の測定方法を行なうことができる。また、上
記の処理方法において、新規ビリルビン・オキ
シダーゼＭ−１阻害剤を各種成分の測定試薬に
加えておいてから、新規ビリルビン・オキシダ
ーゼＭ−１で処理した検体に加えてもよい。ま
た、検体を新規ビリルビン・オキシダーゼＭ−
１で前処理する場合、反応促進物質であるデオ
キシコール酸ナトリウム（最終濃度0.05〜0.5
％）を添加すれば、前処理に用いる酵素量を少
なくすることができ、また前処理時間も短縮す
ることが可能である。 実施例の説明 以下に本発明による新規ビリルビン・オキシダ
ーゼの使用方法を実施例をもつて示すが、本発明
が以下の実施例の範囲のみに限定されるものでは
ない。 実施例 １ 460nｍにおける吸光度減少法によるビリルビ
ンの定量法 ５mg／dl、10mg／dl、15mg／dl、20mg／dl、25
mg／dl、30mg／dlの各ビリルビン溶液〔アルブミ
ン結合型、第一化学薬品(株)製〕を調製し、この各
溶液0.1mlに、0.3Mリン酸カリウム緩衝液（PH
7.0）1.0ml、新規ビリルビン・オキシダーゼＭ−
１の0.5単位を加え、各々総液量を3.0mlとし、37
℃、10分間反応させ、460nｍの吸光度（OD サン
プル）を測定する。別に対照として各ビリルビン溶
液で新規ビリルビン・オキシダーゼＭ−１無添加
の場合の460nｍの吸光度（OD ブランク）を測定
し、ΔOD₄₆₀（OD ブランク−OD サンプル）を求め
た。結果を第１図に示す。すなわち第１図は、検
量線をビリルビン濃度（mg／dl）（横軸）と吸光
度差（ΔOD₄₆₀）（縦軸）との関係で示したグラフ
である。 第１図から明らかなように本発明に使用される
新規ビリルビン・オキシダーゼＭ−１を用いれば
体液中のビリルビンを460nｍにおける吸光度変
化から正確に測定することが可能である。 実施例 ２ 460nｍにおける吸光度減少法によるビリルビ
ンの定量（デオキシコール酸ナトリウムの効
果） 実施例１と同様に各ビリルビン溶液を調整し、
この溶液0.1mlに0.3Mリン酸カリウム緩衝液（PH
7.0）1.0ml、1.2％デオキコール酸ナトリウム0.5
ml、新規ビリルビン・オキシダーゼＭ−１の0.05
単位を加え、各々総液量を3.0mlとし37℃、10分
間反応させ、460nｍの吸光度（OD サンプル）を
測定する。別に対照として各ビリルビン溶液で新
規ビリルビン・オキシダーゼＭ−１無添加の場合
の460nｍの吸光度（OD ブランク）を測定し、
ΔOD₄₆₀（OD ブランク−OD サンプル）を求めた。
結果を第２図に示す。 第２図から明らかなように、ビリルビンの定量
に新規ビリルビン・オキシダーゼＭ−１の反応促
進物質であるデオキシコール酸ナトリウムを添加
すれば、デオキシコール酸ナトリウム無添加の場
合に比べて使用する酵素量を大幅に約10の１に減
らすことが可能である。 実施例 ３ 血清総コレステロール測定系でのビリルビンに
よる妨害の除去 (1) 発色試薬：４−アミノアンチピリン167mg、
フエノール1.32ｇ及び西洋ワサビパーオキシダ
ーゼ〔シグマケミカル社（米国）製、タイプ
〕80mg（100単位／mg）を100mlの0.1Mリン
酸カリウム緩衝液（PH7.0）に溶解した。 (2) コレステロール・エステラーゼ溶液：カワラ
タケ（Coriolus versicolor Ｋ−1213、FERM
−ＰNo.4820として寄託）を綿実油、ペプトン、
コーンステイプリカーなどを含む培地に培養
し、コレステロール・エステラーゼ活性を含む
培養液を得た。該培養液を順次、アンバーラ
イトCG−50カラムクロマトグラフイー、限外
過、DEAE−セフアデツクスカラムクロマト
グラフイー、SP−セフアデツクスロマトグラ
フイー、セフアデツクスＧ−150カラムクロマ
トグラフイーを行ない精製酵素標品（70単位／
mg）を得た（日本農芸化学会、昭和57年度大会
講演要旨集、第93頁記載の方法による）。の標
品５mgを10mlの0.1Mリン酸カリウム緩衝液
（PH7.0）に溶解した（35単位／ml）。 (3) コレステロール・オキシダーゼ溶液：ハタケ
キノコ（Agrocybe pediades Ｋ−１、FERM
−ＰNo.4343として寄託）を可溶性デンプン、大
豆油、ペプトンなどを含む培地に培養し、コレ
ステロール・オキシダーゼ活性を含む培養液
を得た。該培養液を順次、アンバーライトCG
−50カラムクロマトグラフイー、限外過、
DEAE−セフアデツクスカラムクロマトグラフ
イー、SP−セフアデツクスカラムクロマトグ
ラフイー、セフアデツクスＧ−100カラムクロ
マトグラフイーを行ない精製酵素標品（15単
位／mg）を得た（日本農芸化学会、昭和53年度
大会講演要旨集、第99頁に記載の方法による）。
この標品10mgを５mlの0.1Mリン酸カリウム緩
衝液（PH7.0）に溶解した（30単位／ml）。 (4) 操作法：試験管に新規ビリルビン・オキシダ
ーゼＭ−１の0.1ml（0.02単位）0.3Mリン酸カ
リウム緩衝液（PH7.0）１ml、３％トライトン
Ｘ−100溶液0.3ml、コントロール血清〔ハイラ
ンド社（米国）製〕0.02ml、20mg／dlアルブミ
ン結合型ビリルビン〔第一化学薬品(株)製〕0.02
mlを添加し、37℃の恒温槽で20分間振とうしな
がら反応させた後、50ｍＭアジ化ナトリウム
0.3ml、発色試薬0.3ml、コレステロール・エス
テラーゼ溶液0.1ml、コレステロール・オキシ
ダーゼ溶液0.1ml、蒸留水0.76mlを加えて、５
分間反応後、500nｍの吸光度を測定した。別
に対照として新規ビリルビン・オキシダーゼＭ
−１で無処理の場合及びアルブミン結合型ビリ
ルビン無添加の場合の吸光度を測定し、血清総
コレステロール測定系におけるビリルビンの発
色阻害の除去を本酵素を用いて検討した。結果
を第４表に示す。

【表】 第４表より明らかなように、本発明方法を用
いればビリルビンの妨害を除去して、正確な血
清総コレステロール値を得ることが可能になつ
た。 実施例 ４ 血清総コレステロール測定系でのビリルビンに
よる妨害の除去（デオキシコール酸ナトリウム
の効果） (1) 発色試薬：実施例３の発色試薬を用いた。 (2) コレステロール・エステラーゼ溶液及びコレ
ステロール・オキシダーゼ溶液：実施例３の酵
素液をそれぞれ用いた。 (3) 操作法：試験管に新規ビリルビン・オキシダ
ーゼＭ−１の0.1ml（0.002単位）、0.3Mリン酸
カリウム緩衝液（PH7.0）1.0ml、コントロール
血清〔ハイランド社（米国）製〕0.02ml、20
mg／dlアルブミン結合型ビリルビン〔第一化学
薬品(株)製〕0.02ml、1.2％デオキコール酸ナト
リウム0.25ml、蒸留水0.11mlを添加し、37℃の
恒温槽で10分間振とうしながら反応した後、３
％トリトンＸ−100溶液0.3ml、50ｍＭアジ化ナ
トリウム0.3ml、発色試薬0.3ml、コレステロー
ル・エステラーゼ溶液0.1ml、コレステロー
ル・オキシダーゼ溶液0.1ml、蒸留水0.4mlを加
えて、５分間反応後、500nｍの吸光度を測定
した。別に対照として新規ビリルビン・オキシ
ダーゼＭ−１で無処理の場合及びアルブミン結
合型ビリルビン無添加の場合の吸光度を測定
し、血清総コレステロール測定系におけるビリ
ルビンの発色阻害の除去に対するデオキシコー
ル酸ナトリウムの効果について検討した。結果
を第５表に示す。

【表】 第５表より明らかなように、ビリルビンの妨害
除去にデオキシコール酸ナトリウムを用いれば
前処理に用いる酵素量を少なくできるとともに
前処理時間も短縮することが可能になつた。 実施例 ５ 血清グルコース測定系でのビリルビンによる妨
害の除去 (1) 発色試薬：実施例３の発色試薬を用いた。 (2) グルコース・オキシダーゼ溶液：グルコー
ス・オキシダーゼ〔東洋紡(株)製、100単位／mg〕
20mgを0.1Mリン酸カリウム緩衝液（PH7.0）２
mlに溶解した（1000単位／ml）。 (3) 操作法：試験管に新規ビリルビン・オキシダ
ーゼＭ−１の0.1ml（0.002単位）、0.3Mリン酸
カリウム緩衝液（PH7.0）１ml、コントロール
血清〔ハイランド社（米国）製〕0.02ml、20
mg／dlアルブミン結合型ビリルビン〔第一化学
薬品(株)製〕0.02mlを添加し、37℃の恒温槽で20
分間振とうしながら反応させた後、50ｍＭアジ
化ナトリウム0.3ml、発色試薬0.3ml、グルコー
ス・オキシダーゼ溶液0.1ml蒸留水1.16mlを加
えて、10分間反応後、500nｍの吸光度を測定
した。別に対照として新規ビリルビン・オキシ
ダーゼＭ−１で無処理の場合及びアルブミン結
合型ビリルビン無添加の場合の吸光度を測定
し、血清グルコース測定系におけるビリルビン
の発色阻害の除去を本酵素を用いて検討した。
結果を第６表に示す。

【表】 第６表より明らかなように、本発明方法を用い
ればビリルビンの妨害を除去して、正確な血清
グルコース値を得ることが可能になつた。 発明の効果 本発明の試薬組成物において、使用する新規ビ
リルビン・オキシダーゼＭ−１は血清や尿など体
液中のビリルビンを酸化するので、460nｍにお
ける吸光度変化から体液中のビリルビンを簡単か
つ正確に定量することができる。また、酸化酵素
−パーオキシダーゼ−水素供与色原体反応を用い
る体液中の各種成分の分析において、体液中に共
存するビリルビンの妨害効果を新規ビリルビン・
オキシダーゼＭ−１で除去することもできるとい
う顕著な効果が奏せられる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の定量方法の実施例１における
検量線をビリルビン濃度と吸光度差との関係で示
したグラフである。第２図は本発明の定量方法の
実施例２における検量線をビリルビン濃度と吸光
度差との関係で示したグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 新規ビリルビン・オキシダーゼＭ−１を含有
   することを特徴とするビリルビン用試薬組成物。 ２ 組成物がデオキシコール酸塩を含有する特許
   請求の範囲第１項記載のビリルビン用試薬組成
   物。 ３ ビリルビン含有被検液に、新規ビリルビン・
   オキシダーゼＭ−１を含有するビリルビン用試薬
   組成物を作用させ、それにより生ずるビリルビン
   の変化を光学的に測定することを特徴とするビリ
   ルビンの定量方法。 ４ 組成物がデオキシコール酸塩を含有する特許
   請求の範囲第３項記載の定量方法。 ５ ビリルビンが分析の阻害剤となるビリルビン
   含有被検液中のビリルビン以外の成分を酸化酵素
   −パーオキシダーゼ−水素供与色原体反応により
   分析する方法において、(a)被検液に新規ビリルビ
   ン・オキシダーゼＭ−１を含有するビリルビン用
   試薬組成物を作用させて、共存するビリルビンの
   阻害効果を排除する工程、及び(b)残存被検液中の
   目的成分を分析する工程、の各工程を包含するこ
   とを特徴とする分析方法。 ６ (a)工程の後に新規ビリルビン・オキシダーゼ
   Ｍ−１阻害物質を添加し、次いで該(b)工程を行な
   う特許請求の範囲第５項記載の分析方法。 ７ 組成物がデオキシコール酸塩を含有するもの
   である特許請求の範囲第５項または第６項記載の
   分析方法。