JPS6030696A - クレアチニン及びクレアチンの定量方法及び定量用試薬 - Google Patents
クレアチニン及びクレアチンの定量方法及び定量用試薬Info
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、酵素法による体液中のクレアチニン及びクレ
アチンの定量方法及び定量用試薬に関するものである。
アチンの定量方法及び定量用試薬に関するものである。
血清及び尿中のクレアチニン及びクレアチンの測定は、
腎臓疾患、筋肉疾患等の診断に有用な情報をもたらす。
腎臓疾患、筋肉疾患等の診断に有用な情報をもたらす。
従来、クレアチニン及びクレアチン全定量するにあたり
、アルカリ性ピクリン酸を用いるヤッフェ法が用いられ
ていたが、この方法は非特異的発色があるため測定誤差
が大きく、又強アルカリ及びピクリン酸を用いるため検
査器具、機器等を汚染したり、損傷するなどの欠点を有
していた。
、アルカリ性ピクリン酸を用いるヤッフェ法が用いられ
ていたが、この方法は非特異的発色があるため測定誤差
が大きく、又強アルカリ及びピクリン酸を用いるため検
査器具、機器等を汚染したり、損傷するなどの欠点を有
していた。
そこで、このような欠点を解決するため、特異性が高く
、測定条件の温和な酵素を利用するクレアチニン及びク
レアチンの定量方法が、ｊυ１業界に於て強く要望され
るようになり、種々提案されてきている。それらの主な
定量方法を挙げると下記の通りである。
、測定条件の温和な酵素を利用するクレアチニン及びク
レアチンの定量方法が、ｊυ１業界に於て強く要望され
るようになり、種々提案されてきている。それらの主な
定量方法を挙げると下記の通りである。
ａ）生成する過酸化水素量全定量する方法（特開昭５７
−８３２９７号公報） ＋グリシン 上記反応により生成する発色体を測定する。
−８３２９７号公報） ＋グリシン 上記反応により生成する発色体を測定する。
ｂ）生成するホルムアルデヒドを定量する方法（臨床検
査 ２２巻、１３３１−１３３８ （１９７８年））−
ｘＡＨＭ’ｌ”：４−７ミ／ −３−ヒドラシノー５−
メルカプト−１，２，４−）リアゾール上記反応により
生成する赤紫色テトラジンを測定する。
査 ２２巻、１３３１−１３３８ （１９７８年））−
ｘＡＨＭ’ｌ”：４−７ミ／ −３−ヒドラシノー５−
メルカプト−１，２，４−）リアゾール上記反応により
生成する赤紫色テトラジンを測定する。
これらの酵素を用いるクレアチニン及びクレアチンの定
量方法は、特異性が高いため正確度の高い定量ができ、
又測定条件も温和であり、すぐれた定量方法であるが、
しかし、測定法ａ）では、生じた過酸化水素をペルオキ
シダーゼの作用下、レドックス反応を用いて測定するた
め、検体中にアスコルビン酸、還元型グルクチオン等の
還元性物質が共存すると、測定直が負の影響を受けると
いう欠点がある。また、測定法ｂ）では、操作が４ステ
ツプとなり繁雑であり、文月いる各酵素にホルムアルデ
ヒドデヒドロゲナーゼの混入があると負の影響を受幻る
等の欠点がある。
量方法は、特異性が高いため正確度の高い定量ができ、
又測定条件も温和であり、すぐれた定量方法であるが、
しかし、測定法ａ）では、生じた過酸化水素をペルオキ
シダーゼの作用下、レドックス反応を用いて測定するた
め、検体中にアスコルビン酸、還元型グルクチオン等の
還元性物質が共存すると、測定直が負の影響を受けると
いう欠点がある。また、測定法ｂ）では、操作が４ステ
ツプとなり繁雑であり、文月いる各酵素にホルムアルデ
ヒドデヒドロゲナーゼの混入があると負の影響を受幻る
等の欠点がある。
更に、これらの欠点を有していない、酵素を利用する定
量方法として下記の方法が提案されている。
量方法として下記の方法が提案されている。
Ｃ）消失するＮＡＤＬ−Ｉ （還元型ニコチンアミドア
テニンジヌクレオチド）量を定量する方法（ベルグマイ
ヤー、″メリーズ・オブ・エンザイマティク・アナリシ
ス”第２版、１７８７〜１７９０貞（１９７４年）） ＋ ＤＰ ＋ ピルビン酸 上記反応により消失するＮＡＤＨ量を測定する。
テニンジヌクレオチド）量を定量する方法（ベルグマイ
ヤー、″メリーズ・オブ・エンザイマティク・アナリシ
ス”第２版、１７８７〜１７９０貞（１９７４年）） ＋ ＤＰ ＋ ピルビン酸 上記反応により消失するＮＡＤＨ量を測定する。
ｄ）生成するＮＡＤＨｔ’に定量する方法（日本臨床検
査自動化研究会会誌、第５巻補冊、１１９頁（１９８０
年）） ＋、 Ｈ２Ｏ２ ホルムアルテヒドテヒドロケナーゼ ホルムアルテヒド＋ＮＡＤ ’ 。
査自動化研究会会誌、第５巻補冊、１１９頁（１９８０
年）） ＋、 Ｈ２Ｏ２ ホルムアルテヒドテヒドロケナーゼ ホルムアルテヒド＋ＮＡＤ ’ 。
ＮＡＤＨ＋ギ酸
上記反応により生成するＮＡＤＨ量を測定する。
測定法Ｃ）及び測定法ｄ）は、特異性が高く、操作が簡
単で、しかも試料中の共存物質の影響？受けないため非
常にすぐれた定量方法であるが、しかし、これらの測定
法では、１分子のクレアチンから消失するＮ ＡＤ １
１又は生成するＮＡＤＨは１分子であるため、測定感度
が低くなってしまう。このため低濃度検体を測定した場
合、正確度の高い測定ができない。一方、血清中のクレ
アチニン正常１直は０．９〜１．５ｍｇ／ｄｉｓまたク
レアチン正常１直は０．３〜０．９１％ｌ／ｄｉてあり
、低濃度のりＶアチ二ン又はクレアチンを正確に定量す
る方法の確立が要望されていた。
単で、しかも試料中の共存物質の影響？受けないため非
常にすぐれた定量方法であるが、しかし、これらの測定
法では、１分子のクレアチンから消失するＮ ＡＤ １
１又は生成するＮＡＤＨは１分子であるため、測定感度
が低くなってしまう。このため低濃度検体を測定した場
合、正確度の高い測定ができない。一方、血清中のクレ
アチニン正常１直は０．９〜１．５ｍｇ／ｄｉｓまたク
レアチン正常１直は０．３〜０．９１％ｌ／ｄｉてあり
、低濃度のりＶアチ二ン又はクレアチンを正確に定量す
る方法の確立が要望されていた。
本発明者らは、これらａ）、ｂ）、Ｃ）、ｄ）の方法の
欠点全解決すべく鋭意研究を重ねた結果、特異性が高く
、操作が簡単で、試料中の共存物質の影響を受けない、
しかも測定感度が高く、正確度の高いクレアチニン及び
クレアチンの定量方法を見出し、本発明を完成するに到
った。
欠点全解決すべく鋭意研究を重ねた結果、特異性が高く
、操作が簡単で、試料中の共存物質の影響を受けない、
しかも測定感度が高く、正確度の高いクレアチニン及び
クレアチンの定量方法を見出し、本発明を完成するに到
った。
即ち、本発明は、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、ク
レアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダー
ゼ、ホルムアルデヒドテヒドロゲが達成されるもので、
本発明者らの独自の知見に基き、独自の構成により完成
された顕著な効果を有する発明である。
レアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダー
ゼ、ホルムアルデヒドテヒドロゲが達成されるもので、
本発明者らの独自の知見に基き、独自の構成により完成
された顕著な効果を有する発明である。
更に本発明の詳細を以下に説明する。
本発明の測定原理は下記の通りである。
クレアチニンアミドヒドロラーゼ
（１）クレアチニン＋Ｈ２０クレアチン＋尿素
＋グリシン＋Ｈ２Ｏ２
ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ
（４）ホルムアルデヒド＋ＮＡＤ
１−ＮＡＤＨ＋ギ醒
上記反応（４）及び（５）で生じたＮＡＤＨの紫外部吸
光度を測定することにより、クレアチニン又はクレアチ
ンを定量することができる。本発明によれば、１分子の
フレつ′チニン又は１分子のクレアチンから生成するＮ
ＡＤＨは２分子であるため、測定感度が高く、血清等の
低濃度検体を測定した場合も、正確度の高い定量が可能
である。
光度を測定することにより、クレアチニン又はクレアチ
ンを定量することができる。本発明によれば、１分子の
フレつ′チニン又は１分子のクレアチンから生成するＮ
ＡＤＨは２分子であるため、測定感度が高く、血清等の
低濃度検体を測定した場合も、正確度の高い定量が可能
である。
更に本発明による優れた効果を列挙すると、（１）反応
が早いため短時間に定量できる。（２）５段階の反応を
同時に進行させることができるため操作が簡単である、
（３）テトラゾリウム塩を用いる又は過酸化水素にペル
オキシダーゼを作用させるといったレドックス反応を用
いないため、検体中のアスコルビン酸などの還元性物質
の影響を受けないで定量できる、等が挙げられる。
が早いため短時間に定量できる。（２）５段階の反応を
同時に進行させることができるため操作が簡単である、
（３）テトラゾリウム塩を用いる又は過酸化水素にペル
オキシダーゼを作用させるといったレドックス反応を用
いないため、検体中のアスコルビン酸などの還元性物質
の影響を受けないで定量できる、等が挙げられる。
なお、クレアチン量を測定する場合は、クレアチニンア
ミドヒドロラーゼを用いないで、上記反応全進行させれ
ば測定することができる。また、腫体中にクレアチニン
及びクレアチンが共に存在する場合、クレアチニンアミ
ドヒドロラーゼｔ［いて反応を進行させて得られるクレ
アチニン及びクレアチンの総量から、クレアチニンアミ
ドヒドロラーゼを用いないで反応全進行させて得られる
クレアチン量を差し引くことにより、真のクレアチニン
量を定量することができるし、逆に、先にクレアチニン
アミドヒドロラーゼ？用いないで反応を進行させ生じた
ＮＡＤ、Ｈの吸光度を測定することによりクレアチン量
を定量した後、その同一試験液にクレアチニンアミドヒ
ドロラーゼを作用させ再度Ｎ Ａ Ｄ １４の吸光度を
測定し、この肱からはじめの反応によって得られたＮＡ
ＤＨの吸光度の匝ヲ差し引くことにより一液法でクレア
チニン量を定量することもできる。
ミドヒドロラーゼを用いないで、上記反応全進行させれ
ば測定することができる。また、腫体中にクレアチニン
及びクレアチンが共に存在する場合、クレアチニンアミ
ドヒドロラーゼｔ［いて反応を進行させて得られるクレ
アチニン及びクレアチンの総量から、クレアチニンアミ
ドヒドロラーゼを用いないで反応全進行させて得られる
クレアチン量を差し引くことにより、真のクレアチニン
量を定量することができるし、逆に、先にクレアチニン
アミドヒドロラーゼ？用いないで反応を進行させ生じた
ＮＡＤ、Ｈの吸光度を測定することによりクレアチン量
を定量した後、その同一試験液にクレアチニンアミドヒ
ドロラーゼを作用させ再度Ｎ Ａ Ｄ １４の吸光度を
測定し、この肱からはじめの反応によって得られたＮＡ
ＤＨの吸光度の匝ヲ差し引くことにより一液法でクレア
チニン量を定量することもできる。
本発明に用いるギ酸デヒドロゲナーゼについて、ベルブ
マイヤー、°“メリーズ・オブ・エンザイマティク・ア
ナリシス″、第２版、１５５１−１５５４頁（１９７４
年）にギ酸デヒドロゲナーゼによるギ酸定量法が開示さ
れている。しかしながら、この開示からは、本発明の方
法が容易に類推されるものではないことは、以下に示す
通りである。
マイヤー、°“メリーズ・オブ・エンザイマティク・ア
ナリシス″、第２版、１５５１−１５５４頁（１９７４
年）にギ酸デヒドロゲナーゼによるギ酸定量法が開示さ
れている。しかしながら、この開示からは、本発明の方
法が容易に類推されるものではないことは、以下に示す
通りである。
即ち、本発明の方法は、ホルムアルデヒドの作用により
生じる生成物ＮＡＤＨとギ酸のうちの一方の生成物であ
るギ酸にギ酸デヒドロゲナーｖ２作用させるわけである
が、この際、もう一方の生成物であるＮＡＤＨによる障
害に関して、ヘノブナ−（Ｈ６ＰＮＥＲ）らによる１ヨ
ーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー”
、第８３巻、４８５−４９８貞（１９７８年）に、ＮＡ
ＤＨがギ酸デヒドロゲナーゼの阻害剤であることが明記
されている。従って、ギ酸デヒドロゲナーゼの阻害剤で
あるＮＡＤＨがギ酸と尚量共存している状態に於て、ギ
酸にギ酸デヒドロゲナーゼを作用させても、反応が速か
に進行するとは考えられず、また、ギ酸デヒドロゲナー
ゼの自らによる反応によってもＮＡＤＨが生成してくる
ため、系内に於けるＮＡＤＨの割合は更に増加してくる
ので、ＮＡＤＨによる反応阻害の可能性は更に高くなる
ことが予想され、定量的に反応が進行するとは列置考え
られなかった。ところが驚くべきことに、本発明法によ
る酵素反応の組合せによりクレアチニン及びクレアチン
を測定したところ、ギ酸デヒドロゲナーゼの反応も速か
に進行して短時間に反応が完結し、しかも定量的にＮＡ
ＤＨが生成することが確認され、高感度で且つ正確度の
高いクレアチニン及びクレアチンの定量ができることを
見出し本発明全完成した。
生じる生成物ＮＡＤＨとギ酸のうちの一方の生成物であ
るギ酸にギ酸デヒドロゲナーｖ２作用させるわけである
が、この際、もう一方の生成物であるＮＡＤＨによる障
害に関して、ヘノブナ−（Ｈ６ＰＮＥＲ）らによる１ヨ
ーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー”
、第８３巻、４８５−４９８貞（１９７８年）に、ＮＡ
ＤＨがギ酸デヒドロゲナーゼの阻害剤であることが明記
されている。従って、ギ酸デヒドロゲナーゼの阻害剤で
あるＮＡＤＨがギ酸と尚量共存している状態に於て、ギ
酸にギ酸デヒドロゲナーゼを作用させても、反応が速か
に進行するとは考えられず、また、ギ酸デヒドロゲナー
ゼの自らによる反応によってもＮＡＤＨが生成してくる
ため、系内に於けるＮＡＤＨの割合は更に増加してくる
ので、ＮＡＤＨによる反応阻害の可能性は更に高くなる
ことが予想され、定量的に反応が進行するとは列置考え
られなかった。ところが驚くべきことに、本発明法によ
る酵素反応の組合せによりクレアチニン及びクレアチン
を測定したところ、ギ酸デヒドロゲナーゼの反応も速か
に進行して短時間に反応が完結し、しかも定量的にＮＡ
ＤＨが生成することが確認され、高感度で且つ正確度の
高いクレアチニン及びクレアチンの定量ができることを
見出し本発明全完成した。
本発明は、被検試料中のクレアチニンを定量するにあた
り、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミ
ジノヒドロラーゼ、サルコシンオキシダーゼ、ホルムア
ルデヒドデヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ及び
補酵素ＮＡＤｔ組合せて作用させ、生成するＮＡＤＨ’
ｅ測定することにより容易に実施？することができ、ま
た、被検試料中ノクレアナンを定量するにあたり、クレ
アチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼ
、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲ
ナーゼ及び補酵素ＮＡＤｋ組合せて作用させ、生成する
Ｎ、ＡＤＨ’に測定することにより容易に実施すること
ができる。
り、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミ
ジノヒドロラーゼ、サルコシンオキシダーゼ、ホルムア
ルデヒドデヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ及び
補酵素ＮＡＤｔ組合せて作用させ、生成するＮＡＤＨ’
ｅ測定することにより容易に実施？することができ、ま
た、被検試料中ノクレアナンを定量するにあたり、クレ
アチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼ
、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲ
ナーゼ及び補酵素ＮＡＤｋ組合せて作用させ、生成する
Ｎ、ＡＤＨ’に測定することにより容易に実施すること
ができる。
更に本発明の実施態様について詳細に述べると、本発明
は、被検試別中のクレアチニンヲ定量するにあたり、例
えばクレアチニンアミドヒ自−ゼを含む液を第１液とし
、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、サルコシンオキシ
ダーゼ、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒ
ドロゲナーゼ及びＮＡＤｋ含む液を第２液として、先ず
被検試料にａｌ液及び第２液を加えてインキュベートし
、生ずる呈色を測定しくこの吸光廉直１ｒＥＳとする。
は、被検試別中のクレアチニンヲ定量するにあたり、例
えばクレアチニンアミドヒ自−ゼを含む液を第１液とし
、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、サルコシンオキシ
ダーゼ、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒ
ドロゲナーゼ及びＮＡＤｋ含む液を第２液として、先ず
被検試料にａｌ液及び第２液を加えてインキュベートし
、生ずる呈色を測定しくこの吸光廉直１ｒＥＳとする。
）、これとは別に、被検試料に第２液を加えてインキュ
ベートし、生ずる呈色を測定しく、りの吸゛光度値をＥ
Ｂとする。）、（ＥＳ −ＥＢ ’）よりクレアチニン
量をめることによって容易に実施することができる。
ベートし、生ずる呈色を測定しく、りの吸゛光度値をＥ
Ｂとする。）、（ＥＳ −ＥＢ ’）よりクレアチニン
量をめることによって容易に実施することができる。
また、本発明は、被検試料中のクレアチンを定量するに
あたり、例えばクレアチンアミジノヒドロラーゼを含む
液を第１液とし、ザルコシンオキシダーゼ、ホルムアル
デヒドデヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ及びＮ
ＡＤ’に含む液を第２液として、先ず被検試料に第１液
及び第２液を加えてインキュベートし、生ずる呈色’ｋ
ｉｌｌ！Ｉ定しくこの吸光廉直″ｆ：Ｅｓとする。）
、これとは別に、被検試料に第２液を加えてインキュベ
ートし、牛する呈色を測定し、（この吸光度１［ｉ ’
ｋ ＥＢとする。）、（ＥＳ −ＥＢ ）よりクレアチ
ン量？求めることによって容易に実施することができる
。
あたり、例えばクレアチンアミジノヒドロラーゼを含む
液を第１液とし、ザルコシンオキシダーゼ、ホルムアル
デヒドデヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ及びＮ
ＡＤ’に含む液を第２液として、先ず被検試料に第１液
及び第２液を加えてインキュベートし、生ずる呈色’ｋ
ｉｌｌ！Ｉ定しくこの吸光廉直″ｆ：Ｅｓとする。）
、これとは別に、被検試料に第２液を加えてインキュベ
ートし、牛する呈色を測定し、（この吸光度１［ｉ ’
ｋ ＥＢとする。）、（ＥＳ −ＥＢ ）よりクレアチ
ン量？求めることによって容易に実施することができる
。
本発明に用いる酵素は、いかなる起源、由来のものでも
よく、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンア
ミジノヒドロラーゼ、サルコシンオと・′ノ々゛−ゼ、
ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼに関しては、通常の
クレアチニン及びクレアチンの測定に於て用いられてい
る酵素は例外なく用いられるが、それらの内の数例？挙
げれば、フレア。
よく、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンア
ミジノヒドロラーゼ、サルコシンオと・′ノ々゛−ゼ、
ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼに関しては、通常の
クレアチニン及びクレアチンの測定に於て用いられてい
る酵素は例外なく用いられるが、それらの内の数例？挙
げれば、フレア。
チニンアミドヒドロラーゼに於ては、例えば、アルカリ
土類金属、ぺ、；シリュウム属、シュードモナス属など
の微生物が産生するクレアチニンアミドヒドロラーゼが
あり、クレアチンアミジノヒドロラーゼに於ては、例え
ば、シュードモナス属、バチルス属、アルカリ土類金属
などの微生物が産生ずるクレアチンアミジノヒドロラー
ゼがある。
土類金属、ぺ、；シリュウム属、シュードモナス属など
の微生物が産生するクレアチニンアミドヒドロラーゼが
あり、クレアチンアミジノヒドロラーゼに於ては、例え
ば、シュードモナス属、バチルス属、アルカリ土類金属
などの微生物が産生ずるクレアチンアミジノヒドロラー
ゼがある。
また、ザルコシンオキシダーゼに於ては、例えば、コリ
ネバクテリウム属、バチルス属、アルスロバクタ−属な
どの微生物が産生ずるサルコシンオキシダーゼがあり、
ポルムアルデヒドデヒドロゲナーゼに於ては、例えば、
シュードモナス属、アルスロバククー属、シクロコツカ
ス属などの微生物が産生ずるホルムアルデヒドデヒドロ
ゲナーゼがある。一方、ギ酸デヒドロゲナーゼに於ても
、その起源、由来については何ら制約を受けるものでは
なく、例えば、シュードモナス属、カンディダ属、クロ
エソケラ属などの微生物が産出するギ酸デヒドロゲナτ
ゼが挙げられるが、これらに限定されるものではないこ
とはいうまでもない。
ネバクテリウム属、バチルス属、アルスロバクタ−属な
どの微生物が産生ずるサルコシンオキシダーゼがあり、
ポルムアルデヒドデヒドロゲナーゼに於ては、例えば、
シュードモナス属、アルスロバククー属、シクロコツカ
ス属などの微生物が産生ずるホルムアルデヒドデヒドロ
ゲナーゼがある。一方、ギ酸デヒドロゲナーゼに於ても
、その起源、由来については何ら制約を受けるものでは
なく、例えば、シュードモナス属、カンディダ属、クロ
エソケラ属などの微生物が産出するギ酸デヒドロゲナτ
ゼが挙げられるが、これらに限定されるものではないこ
とはいうまでもない。
本発明に於けるクレアチニン及び（又は）クレアチン測
定時のｐＨは、一般には６．５〜８．５の範囲、好まし
くはｐＨ８付近で行われ、又その為の緩衝剤としては自
体公知の緩衝剤、例えばリン酸緩衝液、トリス緩衝液、
グツドバッファーなどが例外なく用いられるが、通常リ
ン酸緩衝ｅ、がよく用いられる。
定時のｐＨは、一般には６．５〜８．５の範囲、好まし
くはｐＨ８付近で行われ、又その為の緩衝剤としては自
体公知の緩衝剤、例えばリン酸緩衝液、トリス緩衝液、
グツドバッファーなどが例外なく用いられるが、通常リ
ン酸緩衝ｅ、がよく用いられる。
かくして、本発明は、簡単な操作で、感度よく、又共存
物質の影響を受けず、正確度の高いクレアチニンの定量
方法を提供するものであり、臨床検査の診断分野に於て
貢献するところ甚だ犬なるものがある。
物質の影響を受けず、正確度の高いクレアチニンの定量
方法を提供するものであり、臨床検査の診断分野に於て
貢献するところ甚だ犬なるものがある。
以下に実施例を示し、更に詳細に説明するが、本発明は
、これらに限定されるものではない。
、これらに限定されるものではない。
実施例１．血清中のクレアチニンの定量定量用試薬
酵素試液Ａ：クレアチニンアミドヒドロラーゼ５５０単
位。下記緩衝液で全量１０ｒｎｌにする。
位。下記緩衝液で全量１０ｒｎｌにする。
酵素試液Ｂ：クレアチンアミジノヒドロラーゼ１２５単
位、ザルコシンオキソグーゼ ５０単位、ホルムアルデ
ヒドデヒドロゲナーゼ ３単位、キ酸デヒドロゲナーゼ
５単位、−ＮＡＤ ５ｍｇ。下記緩衝液で全量ＩＯ−
にする。
位、ザルコシンオキソグーゼ ５０単位、ホルムアルデ
ヒドデヒドロゲナーゼ ３単位、キ酸デヒドロゲナーゼ
５単位、−ＮＡＤ ５ｍｇ。下記緩衝液で全量ＩＯ−
にする。
緩衝液ニトリトン
ン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で全量４０ｒｎｌにする。
定量法
血清又はクレアチニン標準液 １００μｔ？：とり、こ
れに上記酵素試液Ａ Ｏ．５−及び酵素試液８１、５ｍ
ｌ”加え、３７°Ｃで１０分間反応させる。これらとは
別に血清又はクレアチニン標準液の代りに精製水音用い
て同様の操作全行ない、試液ブランク層液を調製する。
れに上記酵素試液Ａ Ｏ．５−及び酵素試液８１、５ｍ
ｌ”加え、３７°Ｃで１０分間反応させる。これらとは
別に血清又はクレアチニン標準液の代りに精製水音用い
て同様の操作全行ない、試液ブランク層液を調製する。
この試液ブランクｍ液を対照として、波長３ ４ ０
ｎｍの吸光度を測定する。
ｎｍの吸光度を測定する。
その吸光産直ｋＥｓ及びＥｓｔｄとする。また、血清１
００μｔに上記緩衝液０．５ ｍｌ及び酵素試液Ｂ１、
５−に加え、３７℃で１０分間加温後、試液ブランク溶
液を対照として、波長３ ４ ０ ｎｍの吸光度を測定
する。その吸光産直ｋ ＥＢとする。血清中のクレアチ
ニン量は＜Ｅｓ−ＥＢ）とＥｓｔｄとを比較することに
よってめる。第１図にその検量線を示す。
００μｔに上記緩衝液０．５ ｍｌ及び酵素試液Ｂ１、
５−に加え、３７℃で１０分間加温後、試液ブランク溶
液を対照として、波長３ ４ ０ ｎｍの吸光度を測定
する。その吸光産直ｋ ＥＢとする。血清中のクレアチ
ニン量は＜Ｅｓ−ＥＢ）とＥｓｔｄとを比較することに
よってめる。第１図にその検量線を示す。
実施例１．の方法で血清中のクレアチニン量をめ、従来
から用いられているヤツフエ法の測定値と比較した。ヤ
ノフェ法とは、ピクリン酸とクレアチニンがアルカリ中
で作る橙赤色の伺加化合物の波長５ ２ ０ ｎｍの吸
−ｉｉｖ測定して、試料中のクレアチニン量ヲ求める方
法である。この結果を第１表に示す。
から用いられているヤツフエ法の測定値と比較した。ヤ
ノフェ法とは、ピクリン酸とクレアチニンがアルカリ中
で作る橙赤色の伺加化合物の波長５ ２ ０ ｎｍの吸
−ｉｉｖ測定して、試料中のクレアチニン量ヲ求める方
法である。この結果を第１表に示す。
本発明方法は従来のヤソフエ法と比較して特異的な反応
音用いるため、正確度の高い測定を行なうことができる
。
音用いるため、正確度の高い測定を行なうことができる
。
ン犬゛ト４ｐ白
第 １ 表
実施例２．血清中のクレアチンの定量
定量用試薬
酵素試液Ａ：クレアチンアミジノヒドロラーゼ３５０単
位。下記緩衝液で全量１０−にする。
位。下記緩衝液で全量１０−にする。
酵素試液Ｂ：ザルコシンオキシダーゼ ５０単位、ホル
ムアルデヒドデヒドロゲナーゼ ３単位、ギ酸デヒドロ
ゲナーゼ ５単位、ＮＡＤ ５ｚｖ０下記緩衝液で全量
１０−にする。
ムアルデヒドデヒドロゲナーゼ ３単位、ギ酸デヒドロ
ゲナーゼ ５単位、ＮＡＤ ５ｚｖ０下記緩衝液で全量
１０−にする。
緩衝液ニトリトンＸ−１００４０■。０．１ＭＩＪン酸
緩衝液（ｐＨ８，０）で全量 ４０ｍ１にする。
緩衝液（ｐＨ８，０）で全量 ４０ｍ１にする。
定量法
血清又はクレアチン標準液 １００ｍ１’ｔとり、これ
に上記酵素試液Ａ ００５−及び酵素試液８１．５＋ｎ
ｌ’ｅ加え、３７℃で１０分間反応させる。これらとは
別に血清又はクレアチン標準液の代りに精製水を用いて
同様の操作を行ない、試液ブランク溶液を調製する。こ
の試液≠書≠宍咋剰ブランク溶液を対照として、波長３
４０ ｎｍの吸光度を測定する。その吸光度’ｋ ＥＳ
及びＥｓｔｄとする。また、血清 １００μｔに上記緩
衝液０．５ ｍｅ及び酵素試液８ １．５ｍｌ’５加え
、３７°Ｃで１０分間加温後、試液ブランク溶液を対照
として、波長３４０ｎｒｎの吸光度を測定する。その吸
光度１直７！−ＥＢとする。血清中のクレアチン量は（
ＥＳ −ＥＢ ）とＥｓｔｄとｔ比較することによって
める。第２図にその検量線會示す。
に上記酵素試液Ａ ００５−及び酵素試液８１．５＋ｎ
ｌ’ｅ加え、３７℃で１０分間反応させる。これらとは
別に血清又はクレアチン標準液の代りに精製水を用いて
同様の操作を行ない、試液ブランク溶液を調製する。こ
の試液≠書≠宍咋剰ブランク溶液を対照として、波長３
４０ ｎｍの吸光度を測定する。その吸光度’ｋ ＥＳ
及びＥｓｔｄとする。また、血清 １００μｔに上記緩
衝液０．５ ｍｅ及び酵素試液８ １．５ｍｌ’５加え
、３７°Ｃで１０分間加温後、試液ブランク溶液を対照
として、波長３４０ｎｒｎの吸光度を測定する。その吸
光度１直７！−ＥＢとする。血清中のクレアチン量は（
ＥＳ −ＥＢ ）とＥｓｔｄとｔ比較することによって
める。第２図にその検量線會示す。
比較例１．血清中のクレアチンの定量〔従来法〕定量用
試薬 酵素試液Ａ：実施例２゜に同じ。
試薬 酵素試液Ａ：実施例２゜に同じ。
酵素試液Ｂ：実施例２．の組成からギ酸デヒドロゲナー
ゼを除いたもの。
ゼを除いたもの。
緩衝液：実施例２．に同じ。
定量法
実施例２．に同じ。
第３図に比較例１の検量線を示す。
第２図及び第３図から明らかなように、本発明はギ酸デ
ヒドロゲナーゼを用いない場合に比べて、感度が高くな
っている。
ヒドロゲナーゼを用いない場合に比べて、感度が高くな
っている。
実施例３．血清中のクレアチニンの定量実施例１．０方
法とその試液中ギ酸デヒドロゲナーゼを除いた試液を用
いた方法とで、同じ血清中のクレアチニンを繰り返し測
定した。その結果を第２表に示す。
法とその試液中ギ酸デヒドロゲナーゼを除いた試液を用
いた方法とで、同じ血清中のクレアチニンを繰り返し測
定した。その結果を第２表に示す。
ン丈下＃色
第２表
以上の結果より明らかなように、本発明方法は測定感度
が高く、ギ酸デヒドロゲナーゼ金除いた測定法と比べて
再現性がよく、正確度の高い測定が可能である。
が高く、ギ酸デヒドロゲナーゼ金除いた測定法と比べて
再現性がよく、正確度の高い測定が可能である。
第１図は、実施例１に於ける検量線を表わし、横軸はク
レアチニン濃度ＣＩＩｌ＆／ｄｇ ） 縦軸ハ３４０ｎ
ｍに於ける吸光度を表わす。 第２図、第３図はそれぞれ実施例２．比較例１゜に於け
る検量線を表わし、いずれも横軸はクレアチン濃度ＣＴ
ｎ９／ｄｌ）縦軸は３４０ ｎｍに於ける吸光度を表わ
す。 特許出願人 和光純薬工業株式会社 第１１！Ｉ クレアチニン濃度（■／ｄＬ） 第２図 クレアチン濃度 （ｍＬ１／ｄｔ） 第３図 クレアチン濃度 （ｍｇ／ｄｚ） 手続補正書 １、 事件の表示 謂イυロ絽椅軒扉第１３２／よθす ２ 発明の名称 ３ 補正をする者 事件との関係 特許出願人 ４、補正命令の日付 ５、 補正により減少する発明の数 ２６． 補正の対
象 明細書の発明の名称の欄、特許請求の範囲の欄及び発明
の詳細な説明の欄。 ７、補正の内容 （１） 発明の名称の欄に記載の「クレアチニン及びク
レアチンの定量方法及び定量用試薬」を１クレアチニン
及びクレアチンの定量方法」と補正する。 （２、特許請求の範囲を別紙のとおり補正する。 （３）明細書１４頁１６行目に記載の「ンクロコッカス
属」ヲ「ミクロコツカス属」と補正する。 （４） 明細書１９貞６行目に記載の「血清又はクレア
チン標準？＆１００ｍ１’ｋｒ血清又はクレアチン標準
液１００μｔ」と補正する。 以上 別紙 ２、特許請求の範囲 （１） 被検試料中のクレアチニンを定量するにあたり
、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジ
ノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、ホルムアル
デヒドデヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ及び補
酵素ＮＡＤにコチンアミドアデニンジヌクレオテド）を
組合せて作用させ、生成するＮＡＤＨ（還元型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド）を測定することを特徴
とする、クレアチニンの定量方法。 （２）被検試料中のクレアチンを定量するＫあたり、ク
レアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダー
ゼ、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロ
ゲナーゼ及び補酵素ＮＡＤ’ｉ組合せて作用させ、生成
するＮＡＤＨ’ｉ測定することを特徴とする、クレアチ
ンの定量方法。
レアチニン濃度ＣＩＩｌ＆／ｄｇ ） 縦軸ハ３４０ｎ
ｍに於ける吸光度を表わす。 第２図、第３図はそれぞれ実施例２．比較例１゜に於け
る検量線を表わし、いずれも横軸はクレアチン濃度ＣＴ
ｎ９／ｄｌ）縦軸は３４０ ｎｍに於ける吸光度を表わ
す。 特許出願人 和光純薬工業株式会社 第１１！Ｉ クレアチニン濃度（■／ｄＬ） 第２図 クレアチン濃度 （ｍＬ１／ｄｔ） 第３図 クレアチン濃度 （ｍｇ／ｄｚ） 手続補正書 １、 事件の表示 謂イυロ絽椅軒扉第１３２／よθす ２ 発明の名称 ３ 補正をする者 事件との関係 特許出願人 ４、補正命令の日付 ５、 補正により減少する発明の数 ２６． 補正の対
象 明細書の発明の名称の欄、特許請求の範囲の欄及び発明
の詳細な説明の欄。 ７、補正の内容 （１） 発明の名称の欄に記載の「クレアチニン及びク
レアチンの定量方法及び定量用試薬」を１クレアチニン
及びクレアチンの定量方法」と補正する。 （２、特許請求の範囲を別紙のとおり補正する。 （３）明細書１４頁１６行目に記載の「ンクロコッカス
属」ヲ「ミクロコツカス属」と補正する。 （４） 明細書１９貞６行目に記載の「血清又はクレア
チン標準？＆１００ｍ１’ｋｒ血清又はクレアチン標準
液１００μｔ」と補正する。 以上 別紙 ２、特許請求の範囲 （１） 被検試料中のクレアチニンを定量するにあたり
、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジ
ノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、ホルムアル
デヒドデヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ及び補
酵素ＮＡＤにコチンアミドアデニンジヌクレオテド）を
組合せて作用させ、生成するＮＡＤＨ（還元型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド）を測定することを特徴
とする、クレアチニンの定量方法。 （２）被検試料中のクレアチンを定量するＫあたり、ク
レアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダー
ゼ、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロ
ゲナーゼ及び補酵素ＮＡＤ’ｉ組合せて作用させ、生成
するＮＡＤＨ’ｉ測定することを特徴とする、クレアチ
ンの定量方法。
Claims (4)
- （１）被検試料中のクレアチニンを定量するにあたり、
クレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノ
ヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、ホルムアルデ
ヒドデヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ及び補酵
素ＮＡＤにコーＪ−７アミる、クレアチニンの定量方法
。 - （２）被検試料中のクレアチン全定量するにあたり、ク
レアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダー
ゼ、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼギ酸デヒドロゲ
ナーゼ及び補酵素ＮＡＤ’を組合せて作用させ、生成す
るＮＡＤＨｔ”測定することを特徴とする、クレアチン
の定量方法。 - （３）クレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンア
ミジノヒドロラーゼ、サルコシンオキシダーゼ、ホルム
アルデヒドデヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ及
び補酵素ＮＡＤ’に組合せてなるタレアチニン定歇用試
薬。 - （４）クレアチンアミジノヒドロラーゼ、サルコシンオ
キシダーゼ、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ギ酸
テヒト′ロゲナーゼ及び補酵素ＮＡＤ’を組合せてなる
クレアチン定量用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13918083A JPS6030696A (ja) | 1983-07-29 | 1983-07-29 | クレアチニン及びクレアチンの定量方法及び定量用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13918083A JPS6030696A (ja) | 1983-07-29 | 1983-07-29 | クレアチニン及びクレアチンの定量方法及び定量用試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6030696A true JPS6030696A (ja) | 1985-02-16 |
Family
ID=15239423
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13918083A Pending JPS6030696A (ja) | 1983-07-29 | 1983-07-29 | クレアチニン及びクレアチンの定量方法及び定量用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6030696A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02107199A (ja) * | 1988-10-14 | 1990-04-19 | Serotetsuku:Kk | 尿酸の定量方法及びそのための尿酸定量用試薬組成物 |
| WO2004022776A3 (en) * | 2002-09-06 | 2004-07-08 | Basf Ag | Gtp cyclohydrolase ii as a target for fungicides |
-
1983
- 1983-07-29 JP JP13918083A patent/JPS6030696A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02107199A (ja) * | 1988-10-14 | 1990-04-19 | Serotetsuku:Kk | 尿酸の定量方法及びそのための尿酸定量用試薬組成物 |
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| US7435557B2 (en) | 2002-09-06 | 2008-10-14 | Basf Aktiengesellschaft | Methods of identifying inhibitors of GTP cyclohydrolase I and II |
| US7691596B2 (en) | 2002-09-06 | 2010-04-06 | Basf Se | Methods for determining GTP cyclohydrolase I or II activity |
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