JPH0541989A

JPH0541989A - ヒト副甲状腺ホルモンをコードする合成遺伝子

Info

Publication number: JPH0541989A
Application number: JP24786391A
Authority: JP
Inventors: Tsunehiko Fukuda; 常彦福田; Yuuri Ooshika; 祐里大鹿; Takahisa Yamada; 隆央山田
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1990-09-28
Filing date: 1991-09-26
Publication date: 1993-02-23
Anticipated expiration: 2017-02-04
Also published as: JP3252916B2

Abstract

(57)【要約】【目的】ヒト副甲状腺ホルモン（ｈＰＴＨ）を効率よく
生産させる方法を提供する。【構成】ｈＰＴＨのアミノ酸配列に対応すると共にｈＰ
ＴＨを効率よく発現させるに適したＤＮＡを見出し、該
ＤＮＡを製造し、該ＤＮＡを含む組み換えＤＮＡで形質
転換した形質転換体を用いるｈＰＴＨの製造法を確立し
た。【効果】ｈＰＴＨ発現率の高い本発明の新規なｈＰＴＨ
遺伝子の使用により、ｈＰＴＨを大腸菌を宿主とした系
で大量に直接発現させることが可能となった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト副甲状腺ホルモン
（以下hPTHと略記）製造のための組換えＤＮＡ技術に関
し、より具体的にはｈＰＴＨのアミノ酸配列に対応する
合成遺伝子およびそれを含むＤＮＡ、該ＤＮＡで形質転
換した形質転換体およびこれらを用いるｈＰＴＨの製造
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ｈＰＴＨは副甲状腺から分泌される、84
個のアミノ酸から成るポリペプチドホルモンであり、カ
ルシウム代謝の最も重要なレギュレーターの１つであ
る。したがってｈＰＴＨの、副甲状腺機能低下症や骨粗
鬆症などの種々の骨疾患への臨床応用は、非常に期待さ
れるところである。しかし天然に存在するｈＰＴＨは極
めて微量であり、またｈＰＴＨは比較的小分子量の蛋白
質であり、化学的に全合成が可能であるとは云え、それ
には高度に熟練した技術と多大な困難が伴う。そこで最
近、組換えＤＮＡ技術による生産が注目されるようにな
った。ｈＰＴＨのＤＮＡ配列はG.N.Hendyらによって最
初に明らかにされた〔プロシージングス・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.
Acad.Sci）USA, 78, 7365-7369（1981）〕。それ以後、
２，３のグループによりｈＰＴＨｃＤＮＡがクローニ
ングされ、種々の発現ベクターに組みこまれ、微生物に
よるｈＰＴＨの合成が試みられてきた。アレストローム
ら(特開平2-501108)らはｃＤＮＡ由来の遺伝子の酵母に
よる分泌発現を試みているが、ｈＰＴＨを単離同定する
に至っていない。A.Hφgsetら〔バイオケミカル・アンド
・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション(Bioc
hem.Biophys.Res.Commun.)，166，50-60(1990)〕はｈＰ
ＴＨのＮ末端にMet-Gly残基を含む遺伝子をｈＰＴＨｃ
ＤＮＡクローンから調製し大腸菌で発現させたが、得ら
れた蛋白質はＮ末端にＭｅｔ−Ｇｌｙが付加されたｈＰ
ＴＨであり、ｈＰＴＨの活性を有さなかった。E.Wingen
derら〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー(J.Biol.Chem.）246, 4367-4373（1989)〕は大腸菌
においてｈＰＴＨをβ-ガラクトシダーゼとの融合蛋白
質として発現させたが、不要部分を切除した蛋白質はＮ
末端にＰｒｏが付加した分子であった。A.Hφgsetら
〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
(J.Biol.Chem.）265, 7338-7344（1990)〕はｈＰＴＨの
ｃＤＮＡをスタフィロコッカスアウレウス(S.aureus)-
プロテインＡのプロモーターおよびシグナルペプチド遺
伝子の下流に連絡し、これを大腸菌で菌体外に分泌発現
させ、ｈＰＴＨを分離同定する事に成功している。しか
し、この際の産生量も約１ｍｇ／1リットル培養液で、
精製過程における損失などを考慮に入れれば、産業上の
見地からは不充分な発現量である。更に、化学合成遺伝
子による発現も行われている〔ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem.），263,1307
（1988)〕が、この場合の発現量も200μｇ／1リットル
と不充分なものである。

【０００３】ある生物の蛋白質の遺伝子を他の宿主で発
現させようとする場合、その遺伝子を得る方法として
は、その生物由来の遺伝子を用いる場合の他に、遺伝子
を化学合成する事が考えられる。ＤＮＡオリゴマーの自
動合成の技術が進歩した近年、その蛋白質が比較的低分
子量で、そのアミノ酸配列もしくはＤＮＡ配列が分かっ
ている場合は、次のような点で合成遺伝子の方が有利な
場合が多い。すなわち、１）目的の遺伝子が比較的容易
に得られる。２）遺伝子をプラスミドに組み込む際の末
端の配列や、遺伝子の改変を行ったりするための適当な
制限酵素の認識配列を自由に組み込める。３）目的の遺
伝子産物が高発現するように遺伝子配列を設計できる事
などである。W.L.Sungら〔バイオケミストリー・アンド
・セルラー・バイオロジー（Biochem.Cell.Biol.）64.1
33-138（1986）〕はｈＰＴＨの構造遺伝子を、酵母にお
いて最も容認されているアミノ酸コドンを採用して合成
し、この遺伝子をS.A.Rabbaniら〔ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem.）,263,13
07-1313（1988)〕は大腸菌で発現させた。しかしその生
産量は極めて低く、実用的なものではない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上記のようにｈＰＴＨ
は、ｃＤＮＡ由来の遺伝子や合成遺伝子を用いる種々の
系で発現が試みられているが、いずれもその生産量は低
く、産業上の見地からは不充分なものであった。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らはｈＰＴＨを
効率よく生産させる方法を開発すべく、鋭意研究を重ね
た結果上記の問題点を解決するに適したｈＰＴＨのＤＮ
Ａ配列を見出し、更に該遺伝子の製法、該遺伝子を含む
組換えＤＮＡ、該ＤＮＡで形質転換した形質転換体、そ
れらによるｈＰＴＨの製造法を確立し、本発明を完成し
たものである。合成遺伝子の配列は、遺伝子の発現を高
めるための種々の条件を満足するように設計される。そ
の１つに、発現系の細胞において最も容認されたコドン
を採用するのが良いとされている。そこで、本発明のｈ
ＰＴＨ遺伝子においては遺伝子組換え法による蛋白質の
生産にしばしば用いられる大腸菌と酵母で共通して容認
されるコドンを採用した。またコドンを選ぶ際に遺伝子
の改変を行なったりするために好都合な制限酵素の認識
配列を適当な位置に設けることを考慮した。さらにまた
目的とする遺伝子を正確に構築するために、ＤＮＡ鎖上
における比較的長い不必要な回文配列の存在や、連続し
た繰り返し配列はできる限り排除した。遺伝子の発現を
高めるさらに１つの条件として、構造遺伝子に対応する
ｍＲＮＡの安定性ならびに翻訳効率も重視される。この
場合、ｍＲＮＡの塩基配列が決定する高次構造が重要な
意味を持つとされている。そこで本発明のｈＰＴＨ遺伝
子では設計の過程でコンピューターを利用してループ構
造等を検索し、著しいものはこれを排除する様、配列に
若干の修正を加えた。このようにして図１（配列番号：
1）に示すような、ｈＰＴＨの製造に最も適した新現な
ＤＮＡ配列を見出した。この遺伝子配列は前述のW. L.
Sungらの合成遺伝子と、そのＤＮＡ配列が25.4％異なる
ものである。図１にはＤＮＡ配列に加えてアミノ酸配列
を示す。

【０００６】該遺伝子は融合ペプチドとして発現させる
こともできるし、融合ペプチドとせず、直接ｈＰＴＨと
して発現することもできる。前者の場合は、ｈＰＴＨの
合成遺伝子の５’末端側に開始コドンＡＴＧから始まる
ｈＰＴＨ以外の蛋白質をコードするＤＮＡを配し、停止
コドン（例えばＴＡＡ）で終るか、または開始コドンＡ
ＴＧから始まるｈＰＴＨ合成遺伝子の３’末端側にｈＰ
ＴＨ以外の蛋白質をコードするＤＮＡを配し、停止コド
ン（例えばＴＡＡ）で終ってもよい。後者の直接発現に
用いるには図２（配列番号：２）に示すように、ｈＰＴ
Ｈのポリペプチドをコードする配列に加えて開始コドン
ＡＴＧ，停止コドン（例えばＴＡＡ）を各々５’末端と
３’末端に直接配し、また５’末端と３’末端はベクタ
ーへの挿入のために例えば各々NdeＩ，BamHＩ付着末端
とする。本発明のｈＰＴＨ遺伝子の合成に当っては、例
えば図２（配列番号：２および３）に示すように最終的
にはｈＰＴＨ遺伝子を14個のフラグメントに分割した
が、ここでフラグメントの自己会合を避けるために、
５’あるいは３’末端に自己相補的配列が出現しないよ
う注意した。図３に各ＤＮＡフラグメントを示す。この
フラグメントへの分割の仕方は上記自己会合を避ける等
の注意をすれば、上記のものに限定される必要はなく、
種々の分け方が可能である。

【０００７】各ＤＮＡフラグメント(＃１〜＃14)（配列
番号：４〜17）は既知の合成法に従って製造し得る。＃
１と＃14を除く各フラグメントは必要に応じて５’末端
をポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、一挙に全フ
ラグメントをハイブリダイズさせＤＮＡリガーゼによっ
て連結させるか、もしくはリン酸化したフラグメントを
まず２ないし３群に分けてハイブリダイズさせ、ＤＮＡ
リガーゼにより二重鎖ＤＮＡとし、さらに各群を再びＤ
ＮＡリガーゼで連結させる事によって完全な二重鎖ｈＰ
ＴＨ遺伝子が得られた(図４参照)。これをｐＵＣ19のNd
eＩおよびBamHＩによる消化物と結合させ、新規プラス
ミドpU・PTH・C19を得、大腸菌ＪＭ109を形質転換する。
単離したプラスミドについてＤＮＡフラグメントの一部
をプライマーとしてSanger法によって塩基配列を決定
し、また、より簡便にはNdeＩ・BamHＩ消化で得られたＤ
ＮＡフラグメントをAvrII，NcoＩ,HgiAＩ,AluＩなどで
消化し、正しい制限部位を有することにより目的とする
ｈＰＴＨ遺伝子の存在を確認する。

【０００８】本発明の合成遺伝子を発現するに際して
は、プラスミド、バクテリオファージなどのベクターに
挿入した組換えＤＮＡとして用いることが好ましい。該
プラスミドとしては、たとえば大腸菌由来のpＢＲ322
〔ジ−ン（Gene),2,95(1977)〕,pＢＲ325〔ジーン,4,12
1(1978)〕,pＵＣ12〔ジーン,19，259(1982)〕,pＵＣ13
〔ジーン,19,259(1982)〕、枯草菌由来のpＵＢ110〔バ
イオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニ
ケーョン(Biochemical and Biophysical Research Comm
unication),112,678(1983)〕などが挙げられるが、その
他のものであっても、宿主内で複製増殖されるものであ
れば、いずれをも用いることができる。またファージベ
クターとしては、たとえばλgt11〔ヤング及びデーヴィ
ス(Young, R., and Davis, R.,)プロシーディングズ・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
・オブ・ザ・ユー・エス・エー(Proc. Natl. Acad. Sc
i.,U.S.A.),80,1194(1983)〕などが挙げられるが、その
他のものであっても宿主内で増殖できるものであれば用
いることができる。このようにして得られたプラスミド
は、適当な宿主たとえばエシェリヒア(Escherichia)属
菌，バチルス(Bacillus)属菌，酵母，動物細胞などに導
入する。

【０００９】プラスミドで宿主を形質転換する方法とし
ては、たとえばティー・マニアティス(T．Maniatis)ら，
モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning),コー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spri
ng Harbor Laboratory)，第249頁(1982)に記載のカルシ
ウムクロライド法あるいはカルシウムクロライド／ルビ
ジウムクロライド法などが挙げられる。またファージ・
ベクターを用いる場合には、たとえば増殖させた大腸菌
にインビトロパッケージング法を用いて導入することが
できる。

【００１０】上記組換えＤＮＡは前記した開始コドンＡ
ＴＧの上流にプロモーターを有しているのが好ましく、
該プロモーターは、形質転換体の製造に用いる宿主に対
応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよ
い。たとえば、大腸菌(Escherichia coli;例、MM294，B
L21，BL21/PLys, W3110, DH1, N4830など）ではtrpプロ
モーター、lacプロモーター、rec Ａプロモーター、λ
ＰＬプロモーター、lppプロモーター、Ｔ７プロモータ
ーなど、枯草菌(Bacillus subtilis;例、MI 114など）
ではSPO1プロモーター、SPO２プロモーター、penPプロ
モーターなど、バチルス・ブレビス（Bacillus brevi
s）では主要菌体外蛋白質プロモーターなど、酵母（Sac
charomyces cerevisiae；例、AH22など）ではPHO5プロ
モーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプ
ロモーターなど、動物細胞（例、サル細胞COS-7，チャ
イニーズハムスター細胞CHOなど）ではＳＶ40由来のプ
ロモーターやマウス白血病ウィルス（MuLV）由来のＬＴ
Ｒ領域のプロモーターなどが挙げられる。とりわけ宿主
が大腸菌の場合はプロモーターがＴ７プロモーター、tr
pプロモーターまたはλＰＬプロモーターであることが
好ましく、宿主が動物細胞の場合は、上記プロモーター
に加え、エンハンサーを有することが好ましい。

【００１１】得られた形質転換体をそれ自体公知の培地
で培養する。大腸菌の形質転換体のための培地として
は、例えばＬＢ培地が挙げられる。大腸菌の形質転換体
の培養は通常15〜43℃、好ましくは28〜40℃で２〜24時
間、好ましくは４〜16時間で行われ、必要により通気や
撹拌を加えることもできる。培養後、公知の方法で菌体
が集められる。大腸菌の形質転換体の場合には菌体を緩
衝液または尿素、塩酸グアニジンなどの蛋白変性剤を含
む緩衝液に懸濁し、超音波処理、リゾチーム処理または
ガラスビーズなどによる機械的破砕により破壊し、遠心
分離によりｈＰＴＨを含む抽出液が得られる。ｈＰＴＨ
は公知の手段を用いて抽出液から分離精製できる。分離
精製手段としては、ゲルろ過、陽イオン交換樹脂もしく
は陰イオン交換樹脂を用いるイオン交換クロマトグラフ
ィー、疎水性クロマトグラフィー、分配吸着クロマトグ
ラフィーなどのカラムクロマトグラフィーや高速液体ク
ロマトグラフィーが挙げられる。バチルス属菌、酵母、
動物細胞の形質転換体の培養、培養物からのｈＰＴＨの
分離精製もそれ自体公知の方法が用いられる。得られた
ｈＰＴＨはカルシウム代謝に異常のある種々の疾病、例
えば骨粗鬆症、副甲状腺機能低下症の治療剤や高血圧症
の治療剤として使用できる。その投与量は、投与対象、
疾病などを考慮し、個々の場合について適宜決定され、
体重１ｋｇあたり、１日１ｎｇ〜100μｇの範囲内で適
量が投与される。ｈＰＴＨは通常、薬理的に許容され得
る担体、賦形剤、希釈剤と混合され、主として非経口的
に、注射剤、経鼻剤、直腸剤、経膣剤、経皮剤として投
与されるが、場合により経口的に投与されてもよい。

【００１２】ｈＰＴＨ合成遺伝子の発現の一例を次に述
べる(図５参照)。pU・PTH・C19からNdeＩ-BamHＩで切り出
される267塩基対のＤＮＡを発現用ベクターpET3CのNde
Ｉ、BamHＩ部位に組込み、Ｔ７プロモーター支配下の発
現用ベクターpET・PTH・3Cを得た。pET・PTH・3Cを用いて
大腸菌ＢＬ21を形質転換し、生育するコロニーをアンピ
シリン感受性を指標にして選別し、目的ｈＰＴＨ遺伝子
を含む株を得た。これら形質転換株を培養し、遠沈によ
る集菌の後菌体を７Ｍグアニジン処理した液中に含まれ
るｈＰＴＨをＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動(SDS
-PAGE)後のクマシーブリリアントブルー(CBB)による染
色、もしくはSDS-PAGE後のｈＰＴＨ抗体によるイムノブ
ロッティングによりｈＰＴＨを定量したところ、約200
ｍｇ／ｌ以上の産生量を示した(図６、図７参照)。この
発現量は大腸菌におけるｈＰＴＨの直接発現としては画
期的なものである。

【００１３】

【作用】本発明ではｈＰＴＨ遺伝子のＤＮＡ配列とし
て、発現系の細胞において最も容認されたコドンを採用
し、しかもＤＮＡ配列に対応するｍＲＮＡの高次構造を
も考慮して遺伝子設計することによって、ｍＲＮＡの安
定性、翻訳効率が良好なものとなって、ｈＰＴＨが効率
よく生産される。また本発明では構造遺伝子の内部に数
種の制限酵素の認識部位を設けることによって、遺伝子
挿入の成否、挿入方向の確認を容易にしたり、将来ｈＰ
ＴＨの類縁体蛋白質を合成する際の遺伝子改変を容易に
したり、また数種類のベクターに乗せることができる
等、遺伝子操作上の有利さ、多様性を発揮し得るもので
ある。

【００１４】

【実施例】

実施例１１．ＤＮＡ断片の合成図３に示す14種のＤＮＡ断片(＃１〜＃14）（配列番
号：４〜17）は適当に保護されたＤＮＡ β-シアノエチ
ルホスホアミダイトを原料とし、アプライドバイオシス
テムズ社、モデル380Ａ・ＤＮＡ自動合成装置を用いて合
成した。合成のプロトコールはアプライドバイオシステ
ムズ社指定のものを用いた。合成した保護ＤＮＡオリゴ
マー・樹脂を、0.2μmoleの樹脂に対し濃アンモニア水
２mｌ中で60℃、６時間加熱した。得られた生成物を逆
相高速液体クロマトグラフィー（以下HPLCと略記）で精
製し、５’末端水酸基のみがジメトキシトリチル基で保
護されたＤＮＡオリゴマーを得た。これを80％酢酸２m
ｌ、20分間処理し５’末端のジメトキシトリチル基を除
去し、生成物を逆相ＨＰＬＣ、イオン交換ＨＰＬＣで精
製した。この様にして合成した１４種のＤＮＡオリゴマ
ーは図３（配列番号：４〜17）に示した通りである。

【００１５】２．ＤＮＡオリゴマーのリン酸化５’末端になるべき＃１（配列番号：４），＃14（配列
番号：17）を除いた12種のＤＮＡオリゴマー（＃２〜＃
13）(配列番号:５〜16）各々を25μｌのリン酸化反応液
〔ＤＮＡオリゴマー10μg，50mM Tris-HCl，pH7.6，10m
M MgCl₂，1mMスペルミジン,10mMジチオスレイトール(以
後DTTと略記)，0.1ｍｇ/mｌウシ血清アルブミン(以後BS
Aと略記),１mM ATP，10ユニットＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼ（宝酒造)〕中で37℃ １時間反応させ、５’末
端をリン酸化した。この反応液を65℃で10分間処理し、
次いで凍結、融解後、次の反応に用いた。

【００１６】３．ＤＮＡフラグメントの連結(図４−
１，図４−２参照)３−１ｈＰＴＨ遺伝子の２重鎖構成の１連の段階は図
４−１に示した通りである〔図中左端に突起のある棒
（・─）印は５'末端水酸基がリン酸化されていること
を示す〕。たとえばブロックＩの連結は次の様にした。
５種(ＤＮＡフラグメント＃２〜＃６（配列番号：５〜
９）に各々対応する)の上記２の操作で得たＤＮＡフラ
グメントのリン酸化反応液を7.5μｌずつと５'末端に相
当するＤＮＡフラグメント＃1（配列番号：４）の2.5μ
gとを合わせ、50μｌとした。これに５ユニットのＴ４
ＤＮＡリガーゼ(ニューイングランド・バイオラボ社)を
加え、14℃で５時間インキュベートした後、65℃で10分
間処理し、反応を止めてブロックＩを得た。同様にして
ブロックII、IIIを得た。これらブロックＩ〜IIIを各々
20μｌずつ混合し、ここに５ユニットのＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを加え14℃で20時間インキュベートし、65℃で10分
間処理し、反応を止めた。これを7.5％アクリルアミド
ゲルを用いて、緩衝液(pH8.3)〔100mM Tris-HCl,100mM
ホウ酸、2mM EDTA〕中、160Ｖで1.5時間電気泳動にかけ
た。泳動後、0.6ｍｇ/ｌのエチジウムブロマイド（EtB
r）でゲルを染色し、263bpのＤＮＡ断片を含むゲル片を
透析チューブ内に封入し、泳動用緩衝液内に沈め、ＤＮ
Ａ断片をゲルから電気的に溶出した〔ジャーナルオブ
モレキュラーバイオロジー(J.Mol.Biol), 110, 119(197
7)〕。この透析チューブ内液を回収し、これを0.2M NaC
l,20mMTris-HCl（pH7.4), 10mM ＥＤＴＡ溶液であらか
じめ緩衝化したElutip-d・カラム（Schleicher & Schnel
l社) に注いでＤＮＡを吸着させ、次いで 1.0M NaCl、2
0mM Tris-HCl（pH7.4)、1.0mM ＥＤＴＡ緩衝液で溶出さ
せた。溶出液に２倍量のエタノールを加え、−20℃に冷
却した後、遠心でＤＮＡを沈殿させた。

【００１７】３−２ｈＰＴＨ遺伝子の２重鎖構成の１
連の段階は図４−２に示した方法でも達成できる〔図中
左端に突起のある棒（・─）印は５'末端水酸基がリン酸
化されていることを示す〕。12種（ＤＮＡフラグメント
＃２から＃13（配列番号：５〜16）に各々対応する）の
ＤＮＡフラグメントのリン酸化反応液（上記２で得られ
た）５μｌずつと５’末端に相当するＤＮＡフラグメン
ト＃１（配列番号：４），＃14（配列番号：17）各々２
μｇを混ぜ、70μｌとした。これに５ユニットのＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ（宝酒造）を加え、15℃で20時間インキュ
ベートした。これを８％アクリルアミドゲルを用いて、
緩衝液（pH8.3）〔100mM Tris-HCl,100mMホウ酸、2mM E
DTA〕中、125Ｖで２時間電気泳動にかけた。泳動後、0.
6ｍｇ／ｌのEtBrでゲルを染色し、263bpのＤＮＡ断片を
含むゲル片を透析チューブ内に封入し、泳動用緩衝液内
に沈め、ＤＮＡ断片をゲルから電気的に溶出した。この
透析チューブ内液についてフェノール処理を２回行った
のち、水層（上層）を回収し、２倍量のエタノールを加
え、−70℃に冷却した後、遠心でＤＮＡを沈殿させた。
このようにして約１μｇのＤＮＡフラグメントが得ら
れ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）によるリ
ン酸化を行ったのち、以下の実験４−２に供された。

【００１８】４．ｈＰＴＨ遺伝子のクローニング（図
５）４−１クローニングベクターには大腸菌のプラスミド
pBR322由来のpUC19〔Messing.J.，ジーン(Gene)，33 10
3-109（1985)〕を使用した。pUC19ＤＮＡを20μｌの反
応液〔20mM Tris-HCl，pH7.6,7mM MgCl₂，150mM NaCl，
10mM 2-メルカプトエタール，20ユニットのNdeＩ(ニュ
ーイングランド・バイオラボ社)，15ユニットのBamHＩ
(宝酒造)〕中、37℃、24時間反応させた後、水で５倍稀
釈し、65℃で20分間処理し、酵素を失活させた。この反
応液５μｌと約５当量のＤＮＡフラグメント（上記３−
１)を混合し、50mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl₂，10m
M DTT, １mM スペルミジン，0.1ｍｇ／mｌ BSAおよび１
mM ＡＴＰを含む20μｌの反応液として、14℃、15時間
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランド・バイオラボ
社製）を作用させて、ｈＰＴＨ遺伝子をプラスミドに結
合させた。この反応液を用い、既知の方法に従い、大腸
菌ＪＭ109株〔Messing.J.ジーン(Gene), 33 103-119(19
85)〕を形質転換させた。すなわち、−70℃で保存して
いた50μｌのコンピテントセル〔Hanahan,D.,ジャーナ
ルオブモレキュラーバイオロジー(J.Mol.Biol.)，16
6，557(1983)〕を０℃、15分間インキュベートした後、
10μｌの上記反応液を添加した。さらに０℃、30分間イ
ンキュベートした後、42℃で1.5分間、さらに０℃で２
分間インキュベートした。この反応液に200μｌのＬＢ
倍地(1リットル当りバクトトリプトン10ｇ、バクトイー
スト抽出物５ｇ、NaCl ５ｇを含む)を加え、37℃、１時
間インキュベートした。この大腸菌を50μｇ/mｌのアン
ピシリン,100μg/mｌ X-Gal,0.1mM ＩＰＴＧを含むＬＢ
寒天培地上にまき、37℃で１晩培養した。生じたアンピ
シリン耐性コロニー中、β-ガラクトシダーゼ欠損の14
株を選び、この転換株のプラスミドＤＮＡをアルカリ法
〔Maniatis,T.ら、モレキュラークローニング（Molecu
lar Cloning（Cold SpringHarbour)、368-369（198
2）〕により粗精製し、NｃoＩおよびＢamＨＩ消化、さ
らにNdeＩおよびBamHＩ消化した。これら消化物の1.7％
アガロースゲルでの泳動パターンから、１株が正しくｈ
ＰＴＨ遺伝子の挿入されている転換株であることがわか
った。

【００１９】４−２ｈＰＴＨ遺伝子のクローニングは
以下の方法でも行った。クローニングベクターにはpUC1
9（宝酒造）を使用した。pUC19 ＤＮＡ 0.5μｇを10μ
ｌの反応液〔50mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl₂，100m
MNaCl，1mM ジチオスレイトール、20ＵのNdeＩ（ニュー
イングランド・バイオラボ社)、10ＵのBamHＩ（宝酒
造）〕中、37℃、５時間反応させた後、65℃で15分間処
理し、酵素を失活させた。この反応液１μｌと約10当量
のＤＮＡフラグメント(上記３−２)とを混合し、ＤＮＡ
ライゲーションキット（宝酒造）を用い、ｈＰＴＨ遺伝
子をプラスミドに結合させた。大腸菌ＪＭ109株への形
質転換は上記４−１と同じ方法で行った。生じたアンピ
シリン耐性コロニー中、β-ガラクトシダーゼ欠損の17
株を選び、この転換株のプラスミドＤＮＡをアルカリ法
により粗精製し、NcoＩおよびBamHＩ消化、さらにNdeＩ
およびBamHＩ消化した。これら消化物の1.5％アガロー
スゲルでの泳動パターンから、３株が正しくｈＰＴＨ遺
伝子の挿入されている転換株であることがわかった。上
記４−１および４−２で得たクローニングベクターをpU
・PTH・C19と名付けた。このプラスミドpU・PTH・C19を
持つ大腸菌ＪＭ109組み換え体の１白金耳を、50μｇ/m
ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地20mｌに接種し、37℃
で一夜、振盪培養した。この培養液からプラスミドＤＮ
Ａを粗精製し、20μｇ/mｌのRNaseを含むＴＥ緩衝液（1
0mM Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA）80μｌに溶かした。

【００２０】実施例２ｈＰＴＨの発現用プラスミドの構築ならびに形質転換体
の製造（図５）１）上記実施例１の４項で得られた約10μｇのpU・PTH・C
19を反応液〔150mM NaCl,20mM Tris-HCl（pH7.8),７mM
MgCl₂，10mM 2-メルカプトエタノール，40ユニットNde
Ｉ,20ユニットBamHＩ（宝酒造)〕中、37℃、５時間反応
させた後、1.7％アガロースゲル電気泳動により263bp
ＤＮＡ断片を常法に従って精製した。一方、発現用ベク
ターにはpET3C〔Stadier,F.W.ら、メソッズインエン
ザイモロジー（Methods in Enzymology), 195 60-89(19
90)〕を使用した。pET3C ＤＮＡを上記と同様にして、N
deＩ及びBamHＩ消化し、この反応液に４倍量の水を加
え、65℃で20分間加熱し、酵素を失活させた。この様に
して得た263bp ＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡは各々、
両端にNdeＩ消化およびBamHＩ消化により生じた単鎖の
付着端を有する。これら両者を混合し、50mM Tris-HC
l，pH7.6，10mM MgCl₂，10mM DTT，１mMスペルミジン0.
1ｍｇ／mｌ BSAおよび１mM ATP存在下、14℃，16時間Ｔ
４ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランド・バイオラボ
社）を作用させてＤＮＡを結合し、前出と同様な方法で
大腸菌ＪＭ109株を形質転換させた。次にこの大腸菌を5
0μｇ/mｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上にま
き、37℃で１日培養した。生じたアンピシリン耐性コロ
ニーを選んだ。さらに転換株のプラスミドＤＮＡをNde
Ｉ-BamHＩ，Bgl II-BamHＩ，EcoRＩ-NdeＩ，AvrII-Bgl
IIなどの制限酵素の組み合わせで消化し、ポリアクリル
アミド電気泳動のパターンから、正しくｈＰＴＨ遺伝子
を含む形質転換株を選択した。この様にして得た発現用
プラスミドをＰＥ−ＰＴＨと、また形質転換株をエシェ
リヒアコリＪＭ109／ｐＥ−ＰＴＨと名づけた。

【００２１】２）上記１）で得られたＪＭ109/ＰＥ−Ｐ
ＴＨよりプラスミドＤＮＡを単離、粗精製して、Ｔ７プ
ロモーターの発現に必要なＴ７ＲＮＡポリメレースを持
つ大腸菌ＭＭ294（DE3）〔ヨーロッパ公開第４１６５０
５号公報〕を形質転換した。まず大腸菌ＭＭ294（DE3)
１白金耳をＬＤ培地10mｌに接種し、37℃でクレットが6
0から180の間になるまで振盪培養した。この培養液50m
ｌに10％W/Vポリエチレングリコール、5％v/vジメチル
スルホキシドおよび50mM MgCl₂(pH6.5)を加え、反応液
が100μｌになるようにＬＢ培地を加えた。これにプラ
スミドＤＮＡ10ｎｇを加え４℃で10分間インキュベート
した後、50μｇ/mｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地
上にまき、37℃で一夜培養した。生じたコロニーから前
述と同様にして得たプラスミドＤＮＡを制限酵素で消化
し、その電気泳動パターンよりｈＰＴＨ遺伝子を含む形
質転換株を選び、これをエシェリヒアコリＭＭ294(DE
3）/ｐＥ−ＰＴＨと名づけた。エシェリヒアコリＭＭ
294(DE3）/ｐＥ−ＰＴＨは財団法人発酵研究所（ＩＦ
Ｏ）にＩＦＯ１５０８７として１９９０年８月２８日
に寄託され、また通商産業省工業技術院微生物工業技術
研究所（ＦＲＩ）にＦＥＲＭＢＰ−３１１０として１
９９０年９月２５日に寄託されている。

【００２２】実施例３ｈＰＴＨの製造１）エシェリヒアコリＭＭ294(DE3）/ｐＥ−ＰＴＨを
50μｇ/mｌのアンピシリンを含むＬＢ培地中、37℃で一
晩振盪培養した。この培養液100μｌを200mｌのフラス
コに分注した10mｌの同じ培地に加え、37℃でクレット
値が約170になるまで培養した後、イソプロピル-β-D-
チオガラクトピラノシド(IPTG）を加えて、0.1mMとなる
ようにした。さらに２時間培養を続けた後、この培養液
１mｌを15000rpm、４℃、５分間遠心分離し、得られた
菌体を、0.5M Tris.HCl(pH6.8)、10％グリセロール、10
％(W/V)ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、β-メルカプト
エタール0.1％(W/V)、ブロモフェノールブルーの入った
水溶液100μｌ〔Laemmli，U.K，ネイチャー（Nature）,
227 680（1970)〕に溶かし３分間煮沸後、16％SDSポリ
アクリルアミド電気泳動(PAGE)に付した。泳動の後ゲル
をクマシーブリリアントブルーで染色したところ、標準
品ｈＰＴＨと同じ移動度を示す濃いバンドが観察された
（図６参照）。また別のゲルをｈＰＴＨ抗体を用いたウ
エスタンブロッティングに付した結果、ここでも標準ｈ
ＰＴＨと同じ染色パターンが得られた（図７参照）。ゲ
ルの染色、ウエスタンブロッティングにおける標準品と
の量的比較より、ｈＰＴＨは１リットル培養液に換算し
て約200ｍｇ発現していた。

【００２３】２) Ｅ．ｃｏｌｉ内に蓄積されたｈＰＴ
Ｈを以下のようにして精製した。上記と同様にして得ら
れた培養液200mlからの菌体を８Ｍ尿素、50ｍＭＴｒｉ
ｓ・ＨＣｌ（ｐＨ7.5）、50ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭ α
−トルエンスルホニルフルオライドを含有する緩衝液
（５ｍｌ)に懸濁し、氷冷下で激しく撹拌し(約１時
間)、菌体を破壊した。15000ｒｐｍ、４℃、20分間遠心
分離し、上清を集め、沈殿について同じ組成の緩衝液
（３ｍｌずつ）で同様の抽出操作を２度行なった。上清
液を合わせ、２倍に希釈し、この液を、４Ｍ尿素を含む
50ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５）で平衡化し
た、ＴＳＫ−ゲル、ＣＭ−トーヨーパールのカラム（東
ソー）（10ｍｌ）に通し、目的物を吸着させた、４Ｍ尿
素を含む、50ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５）で
カラムを洗浄し（約10ｍｌを要した）、２８０ｎｍにお
ける吸収がなくなったら、５０ｍＭ酢酸アンモニウム
（ｐＨ５）緩衝液50ｍｌ−0.5Ｍ酢酸アンモニウム（ｐ
Ｈ６）緩衝液50ｍｌを用いた直線濃度勾配法でカラムを
展開した（流速:10ｍｌ／時間、１フラクション２ｍ
ｌ）。フラクション33−47を集め、これを凍結乾燥し
た。これを以下の条件の逆相高速液体クロマトグラフィ
ーに付した。カラム：ＹＭＣ−パックＡ−３２５Ｓ−
５１２０ＡＯＤＳ（１×30ｃｍ）（ワイ・エム・シー
製）；溶媒：0.1％トリフルオル酢酸を含む、25％から5
0％までのアセトニトリルによる直線濃度勾配法（30分
間）；流速：３ｍｌ／分。目的物のピーク（保持時間1
7.0分）を分取した。得られた溶出液をＢｉｏ−Ｒａｄ
ＡＧ１×８（酢酸型）（Bio-Rad laboratory）のカラム
に通し洗液も合わせアセトニトリルを留去した後、凍結
乾燥した。目的のｈＰＴＨが白色粉末として4.2ｍｇ得
られた。本標品は以下の諸分析結果より、高純度のｈＰ
ＴＨであることが示された。

【００２４】ａ）逆相ＨＰＬＣにて鋭い単一ピークを
示した（図８参照）。カラム：ＹＭＣ−パックＡ−３２
４Ｓ−５ＤＤＳ１２０Ａ φ10×300ｍｍ；溶出液：
Ａ（0.1％トリフルオル酢酸）、Ｂ（0.1％トリフルオル
酢酸を含むアセトニトリル）；濃度勾配：０−３分（０
％，Ｂ）、３−10分（０−30％，Ｂ）、10−70分（30−
45％，Ｂ）ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび、泳動後のウエスタンブ
ロッティングでも標準品と同じ移動度の単一バンドを示
した（条件は図６、図７と同じ、図９、図10参照）。

【００２５】ｃ）アミノ酸分析（チオグリコール酸存在
下、減圧封管中、110℃、24時間、5.7Ｎ塩酸加水分解、
カッコ内は理論値を示す）：Ａsｐ（10），10.5；Ｔｈ
ｒ（１），0.96；Ｓｅｒ（７），6.04；Ｇｌｕ（11），
11.73；Ｐｒｏ（３），2.88；Ｇｌｙ（４）4.69；Ａｌ
ａ（７），7.03；Ｖａｌ（８），7.91；Ｍｅｔ（２），
1.96；Ｉｌｅ（１），1.06；Ｌｅｕ（10），10.6；Ｐｈ
ｅ（１），1.10；Ｌｙｓ（９），9.32；Ｈｉｓ（４），
4.04；Ａｒｇ（５），4.00；Ｔｒｐ（１），0.97（回収
率82.3％）ｄ）アプライドバイオシステムズ社気相シークエンサ
ーモデル４７０ＡによりＮ末端アミノ酸配列分析で、
１位Ｓｅｒから15位Ｌｅｕまでの配列が正しいものであ
る事が示された。ｅ）0.1Ｎ塩酸中でのブロムシアン分解後のファースト
アトムボムバートメント質量分析（日本電子、ＪＭＳ−
ＨＸ１１０を用いた。）において次のピークが観測され
た。（１位−７位）−ホモセリン（ＭＨ+）実測値：８５８．５理論値：８５８．５（１位−１７位）−ホモセリン（ＭＨ+)実測値：１９９０．２理論値：１９９０．０（９位−１７位）−ホモセリン（ＭＨ+)実測値：１１０２．７理論値：１１０２．７ホルミルホモセリンやホモセリンに由来するピークは観
測されなかった。

【００２６】更にアスパラギン特異的エンドペプチダー
ゼによる消化後の分析においても次のピークが観測され
た。

【００２７】（１位−１６位） (ＭＨ+）実測値：１８１９．９理論値：１８１９．９（１７位−３３位） (ＭＨ+）実測値：２１６８．８理論値：２１６８．１（５８位−７６位）(Ｍ＋Ｎａ)実測値：２０６１．８理論値：２０６２．０（７７位−８４位）（ＭＨ+)実測値：８７４．４理論値：８７４．５以上の結果によりここで得られたｈＰＴＨはＮ末端にＭ
ｅｔやホルミル−Ｍｅｔを含まず正しく１位Ｓｅｒから
始まり、Ｃ末端84位Ｇｌｎで終わる構造を有していると
判断された。

【００２８】実験例実施例３で得られたｈＰＴＨの生物活性をシゲノら、ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第26
3巻、第18369〜18377頁、1980年〔ShigenoらThe Journ
al of Bioiogical Chemistry，263：18369−18377（198
8）〕により報告された方法を修正して評価した。96穴
マルチ・プレート〔ヌンクロン（Nunclon）、ヌンク〕上
で培養したマウス頭骸骨由来骨芽細胞様細胞株、ＭＣ３
Ｔ３−ＥＩ細胞に、0.01，0.1，1，10あるいは100ｎＭ
の類縁体を含む、100μｌの培養液〔20ｍＭのＮ−２ヒ
ドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２エタンスルホン酸
（ＨＥＰＥＳ）、0.1％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）及
び0.5ｍＭのイソブチルメチルキサンチンを含む。Ｈａ
ｎｋ’ｓ液〕を加え、30分間室温で反応させた。0.2規
定度の塩酸100μｌを加えた後、沸騰水中に２分半浸
し、ｈＰＨＴ受容体によって産生されたサイクリック・
アデノシン・１リン酸（ｃＡＭＰ）を細胞から抽出し
た。培養液中及び細胞中の総ｃＡＭＰ測定は、市販のラ
ジオイムノアッセイキット〔サイクリックＡＭＰ［¹²⁵
Ｉ］キット「デュポン−第一」、第一化学薬品〕を用い
て行なった。標準として添加したヒトＰＴＨ部分ペプチ
ド（１−34位）の濃度に依存したｃＡＭＰの産生量の増
加が常に認められ、本実施例の方法で得られたｈＰＴＨ
についてもこれとほぼ同等の活性を有していた（図11参
照）。

【００２９】

【発明の効果】本発明で提供するｈＰＴＨ遺伝子は新規
なＤＮＡ配列を有し、ｈＰＴＨの高い発現率を示し、ま
た本発明により初めて、ｈＰＴＨを大腸菌を宿主とした
系で大量に（１００〜２００ｍｇ／リットル）直接発現
されることが可能となった。更に本発明のｈＰＴＨに対
応する合成遺伝子を用いた組換えＤＮＡ技術によりｈＰ
ＴＨをより効率よく製造することができ、そのことは治
療薬としてのｈＰＴＨの生産やｈＰＴＨの生体内での生
理的な役割の研究に役立つものである。

【００３０】

【００３１】

【配列表】配列番号:1 配列の長さ:252 配列の型:核酸鎖の数:2本鎖トポロジー:直鎖状配列の種類:他の核酸、合成DNA 配列の特徴特徴を表わす記号:Mat peptide 存在位置:1・・・252 特徴を決定した方法:E 特徴を表わす記号:mutation 存在位置:7，8，9，12，15，19，21，33，36，43，51，
58，60，82，109，111，114，117，120，121，123，12
9，130，132，147，150，153，156，177，196，197，19
8，201，204，216，219 特徴を決定した方法：Ｓ

【００３２】配列番号：２配列の長さ:263 配列の型:核酸鎖の数:2本鎖トポロジー:直鎖状配列の種類:他の核酸、合成 DNA 配列の特徴特徴を示す記号:CDS 存在位置:2・・・262 特徴を決定した方法:E 特徴を示す記号:Mat peptide 存在位置:5・・・256 特徴を決定した方法:E 特徴を示す記号:mutation 存在位置:11，12，13，16，19，23，25，37，40，47，5
5，62，64，86，113，115，118，121，124，125，127，
133，134，136，151，154，157，160，181，200，201，
202，205，207，220，223，259，261，263 特徴を決定した方法：Ｓ

【００３３】配列番号：３配列の長さ:265 配列の型:核酸鎖の数:2本鎖トポロジー:直鎖状アンチセンス:ｙｅｓ

【００３４】配列番号:4 配列の長さ:30 配列の型:核酸鎖の数:1本鎖トポロジー:直鎖状配列の種類:他の核酸、合成DNA 配列の特徴特徴を示す記号:CDS 存在位置:2・・・30 特徴を決定した方法:E 配列: TATGTCTGTG TCCGAGATTC AGTTAATGCA 30。

【００３５】配列番号:5 配列の長さ:34 配列の型:核酸鎖の数:1本鎖トポロジー:直鎖状アンチセンス:Yes 配列の種類:他の核酸、合成DNA 配列の特徴特徴を示す記号:CDS 存在位置:1・・・34 特徴を決定した方法:E 配列: AGGTTATGCA TTAACTGAAT CTCGGACACA GACA 34。

【００３６】配列番号:6 配列の長さ:45 配列の型:核酸鎖の数:1本鎖トポロロジー:直鎖状配列の種類:他の核酸、合成DNA 配列の特徴特徴を示す記号:CDS 存在位置:1・・・45 特徴を決定した方法:E 配列: TAACCTTGGC AAACATTTGA ACTCCATGGA GCGTGTAGAA TGGCT 45。

【００３７】配列番号：７配列の長さ：４５配列の型:核酸鎖の数:1本鎖トポロロジー:直鎖状配列の種類:他の核酸、合成DNA 配列の特徴特徴を示す記号:CDS 存在位置:1・・・45 特徴を決定した方法:E 配列: TTACGCAGCC ATTCTACACG CTCCATGGAG TTCAAATGTT TGCCA 45。

【００３８】配列番号:8 配列の長さ:30 配列の型:核酸鎖の数:1本鎖トポロロジー:直鎖状配列の種類:他の核酸、合成DNA 配列の特徴特徴を示す記号:CDS 存在位置:1・・・30 特徴を決定した方法:E 配列: GCGTAAGAAG TTGCAGGATG TGCACAATTT 30。

【００３９】配列番号:9 配列の長さ:30 配列の型:核酸鎖の数:1本鎖トポロロジー:直鎖状アンチセンス:Yes 配列の種類:他の核酸、合成DNA 配列の特徴特徴を示す記号:CDS 存在位置:1・・・30 特徴を決定した方法:E 配列: GCAACAAAAT TGTGCACATC CTGCAACTTC 30。

【００４０】配列番号:10 配列の長さ:46 配列の型:核酸鎖の数:1本鎖トポロジー:直鎖状配列の種類:他の核酸、合成DNA 配列の特徴特徴を示す記号:CDS 存在位置:1・・・46 特徴を決定した方法:E 配列: TGTTGCCTTA GGTGCCCCAT TGGCTCCTCG TGATGCTGGT TCCCAA 46。

【００４１】配列番号:11 配列の長さ:46 配列の型:核酸鎖の数:1本鎖トポロジー:直鎖状アンチセンス：Ｙｅｓ配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列の特徴特徴を示す記号:CDS 存在位置:1・・・46 特徴を決定した方法:E 配列: TGGTCTTTGG GAACCAGCAT CACGAGGAGC CAATGGGGCA CCTAAG 46。

【００４２】配列番号:12 配列の長さ:41 配列の型:核酸鎖の数:1本鎖トポロロジー:直鎖状配列の種類:他の核酸、合成DNA 配列の特徴特徴を示す記号:CDS 存在位置:1・・・41 特徴を決定した方法:E 配列: AGACCACGTA AAAAGGAAGA CAATGTCTTA GTTGAGAGCC A 41。

【００４３】配列番号:13 配列の長さ:41 配列の型:核酸鎖の数:1本鎖トポロジー:直鎖状アンチセンス:Yes 配列の種類:他の核酸、合成DNA 配列の特徴特徴を示す記号:CDS 存在位置:1・・・41 特徴を決定した方法:E 配列: TTTTCATGGC TCTCAACTAA GACATTGTCT TCCTTTTTAC G 41。

【００４４】配列番号:14 配列の長さ:42 配列の型:核酸鎖の数:1本鎖トポロジー:直鎖状配列の種類:他の核酸、合成DNA 配列の特徴特徴を表わす記号:CDS 存在位置:1・・・42 特徴を決定した方法:E 配列: TGAAAAATCC CTAGGCGAGG CAGACAAGGC CGATGTGAAT GT 42。

【００４５】配列番号:15 配列の長さ:42 配列の型:核酸鎖の数:1本鎖トポロジー:直鎖状アンチセンス:Yes 配列の種類:他の核酸、合成DNA 配列の特徴特徴を表わす記号:CDS 存在位置：１・・・４２特徴を決定した方法：Ｅ配列: GTTAATACAT TCACATCGGC CTTGTCTGCC TCGCCTAGGG AT 42。

【００４６】配列番号:16 配列の長さ:29 配列の型:核酸鎖の数:1本鎖トポロジー:直鎖状配列の種類:他の核酸、合成DNA 配列の特徴特徴を表わす記号:CDS 存在位置:1・・・28 特徴を決定した方法:E 配列: ATTAACTAAA GCTAAATCCC AGTAATGAG 29。

【００４７】配列番号:17 配列の長さ:27 配列の型:核酸鎖の数:1本鎖トポロロジー:直鎖状アンチセンス:Yes 配列の種類:他の核酸、合成DNA 配列の特徴特徴を示す記号:CDS 存在位置:6・・・27 特徴を決定した方法:E 配列: GATCCTCATT ACTGGGATTT AGCTTTA 27。

【図面の簡単な説明】

【図１】ｈＰＴＨに対応する本発明の合成遺伝子のＤＮ
Ａ配列およびアミノ酸配列を示した図である。

【図２】本発明のｈＰＴＨ遺伝子合成の際のＤＮＡフラ
グメントの分割の一例を示した図である。

【図３】本発明のｈＰＴＨ対応合成遺伝子製造用ＤＮＡ
フラグメントの一例を示す図である。

【図４−１】図３の各ＤＮＡフラグメントを連結してｈ
ＰＴＨ合成遺伝子を製造する模式図である。

【図４−２】図３の各ＤＮＡフラグメントを連結してｈ
ＰＴＨ合成遺伝子を製造する模式図である。

【図５】本発明のｈＰＴＨ対応合成遺伝子を組み込ん
だ、発現用プラスミドの構築図である。

【図６】本発明遺伝子による形質転換体におけるｈＰＴ
Ｈの産生を示した電気泳動図とそのウェスタンブロッテ
ィングの図である。図中、レーン１が分子量マーカー、
レーン２が標準品ｈＰＴＨ、レーン３がＩＰＴＧで誘導
をかけた形質転換体の抽出物（培養液10μｌ相当）、レ
ーン４がＩＰＴＧで誘導をかけていない形質転換体の抽
出物（培養液10μｌ相当）である。

【図７】本発明遺伝子による形質転換体におけるｈＰＴ
Ｈの産生を示した電気泳動図とそのウェスタンブロッテ
ィングの図である。図中、レーン１がプレステインド分
子量マーカー、レーン２が誘導をかけていない形質転換
体の抽出物（培養液10μｌ相当）、レーン３がＩＰＴＧ
で誘導をかけて培養した形質転換体の抽出物（培養液10
μｌ相当）、レーン４が標準品ＰＴＨである。

【図８】精製したｈＰＴＨの逆相ＨＰＬＣにおける溶出
パターンを示す。

【図９】ｈＰＴＨ標品の電気泳動図とそのウエスタンブ
ロッティングの図である。図中レーン１がプレステイン
ド分子量マーカー、レーン２が本発明で得られた精製ｈ
ＰＴＨ、レーン３が標準品ｈＰＴＨである。

【図１０】ｈＰＴＨ標品の電気泳動図とそのウエスタン
ブロッティングの図である。図中レーン１がプレステイ
ンド分子量マーカー、レーン２が本発明で得られた精製
ｈＰＴＨ、レーン３が標準品ｈＰＴＨである。

【図１１】ｈＰＴＨフラグメントの生物活性を示す図で
あり、−＊−が合成ｈＰＴＨ（１−３４）フラグメン
ト、--●--が本発明で得られた精製ｈＰＴＨに関する。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＤＮＡ配列：ＴＣＴＧＴＧＴＣＣＧＡＧＡＴＴＣＡＧＴＴＡＡＴＧＣＡＴＡＡＣＣＴＴＧＧＣＡＡＡＣＡＴＴＴＧＡＡＣＴＣＣＡＴＧＧＡＧＣＧＴＧＴＡＧＡＡＴＧＧＣＴＧＣＧＴＡＡＧＡＡＧＴＴＧＣＡＧＧＡＴＧＴＧＣＡＣＡＡＴＴＴＴＧＴＴＧＣＣＴＴＡＧＧＴＧＣＣＣＣＡＴＴＧＧＣＴＣＣＴＣＧＴＧＡＴＧＣＴＧＧＴＴＣＣＣＡＡＡＧＡＣＣＡＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＡＡＧＡＣＡＡＴＧＴＣＴＴＡＧＴＴＧＡＧＡＧＣＣＡＴＧＡＡＡＡＡＴＣＣＣＴＡＧＧＣＧＡＧＧＣＡＧＡＣＡＡＧＧＣＣＧＡＴＧＴＧＡＡＴＧＴＡＴＴＡＡＣＴＡＡＡＧＣＴＡＡＡＴＣＣＣＡＧで示されるヒト副甲状腺ホルモン発現のための合成遺伝
子を含有するＤＮＡ。
【請求項２】複数のオリゴデオキシヌクレオチドを酵素
的に連結し、所望によりベクターに挿入することを特徴
とする、請求項１記載のＤＮＡの製造法。
【請求項３】合成遺伝子が大腸菌Ｔ７プロモーターの制
御領域に挿入されているベクターである、請求項１記載
のＤＮＡ。
【請求項４】請求項１または３記載のＤＮＡによって形
質転換した形質転換体。
【請求項５】請求項４記載の形質転換体を培養し、培養
物中にヒト副甲状腺ホルモンを生成蓄積せしめ、これを
採取することを特徴とするヒト副甲状腺ホルモンの製造
法。