JPH01211490A - ヒト神経成長因子遺伝子セグメント - Google Patents
ヒト神経成長因子遺伝子セグメントInfo
- Publication number
- JPH01211490A JPH01211490A JP63035042A JP3504288A JPH01211490A JP H01211490 A JPH01211490 A JP H01211490A JP 63035042 A JP63035042 A JP 63035042A JP 3504288 A JP3504288 A JP 3504288A JP H01211490 A JPH01211490 A JP H01211490A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sequence
- growth factor
- nerve growth
- human nerve
- factor gene
- Prior art date
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- Pending
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/48—Nerve growth factor [NGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野コ
本発明はヒト神経成長因子遺伝子セグメントに関するも
のであり、更に詳しくはヒト神経成長因子をコードする
新規な遺伝子セグメント及びその製造方法、この遺伝子
セグメントを含む組換えプラスミド、この組換えプラス
ミドを細膓内に保有する微生物、この微生物を用いてヒ
ト神経成長因子を製造する方法並びにこの方法によって
製造することのできる新規なヒト神経成長因子融合蛋白
質に関するものである。
のであり、更に詳しくはヒト神経成長因子をコードする
新規な遺伝子セグメント及びその製造方法、この遺伝子
セグメントを含む組換えプラスミド、この組換えプラス
ミドを細膓内に保有する微生物、この微生物を用いてヒ
ト神経成長因子を製造する方法並びにこの方法によって
製造することのできる新規なヒト神経成長因子融合蛋白
質に関するものである。
神経成長因子（以下ＮＧＦと略記する）は胎生時のを髄
神経節細胞や交感神経節細胞の生存および成長分化に必
要な物質であり、特に雄マウスの顎下腺に多量に含まれ
ている。
神経節細胞や交感神経節細胞の生存および成長分化に必
要な物質であり、特に雄マウスの顎下腺に多量に含まれ
ている。
マウスＮＧＦは沈降係数７８．分子量的１３１，５００
のポリペプチドで古くから研究されて来た［バイオケミ
ストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） 、６巻、２２
０３−２２０９頁（１９６７）１ 、１分子の７８ Ｉ
ＩＧＦは２単位のα、１単位のβ及び２単位のγ各すブ
ユニットからなる（α２βγ２）がβ−サブユニット（
以下β−ＮＧＦと略記する）のみが神経成長因子として
生物活性を有する。
のポリペプチドで古くから研究されて来た［バイオケミ
ストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） 、６巻、２２
０３−２２０９頁（１９６７）１ 、１分子の７８ Ｉ
ＩＧＦは２単位のα、１単位のβ及び２単位のγ各すブ
ユニットからなる（α２βγ２）がβ−サブユニット（
以下β−ＮＧＦと略記する）のみが神経成長因子として
生物活性を有する。
マウスβ−ＮＧＦはアミノ酸１１８個からなるポリペプ
チドである［アンゲレッティ他（Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ。
チドである［アンゲレッティ他（Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ。
に、 Ｈ，ｅｔ ａｌ、）プロシーデングス・オプ・
ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒ０Ｃ
。
ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒ０Ｃ
。
Ｈａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃ１．） ｕｓ＾、６８巻
、２４１７−２４２０頁（１９７１）１． 最近ヒト
β−ＮＧＦのアミノ酸配列がｃＤＮ＾から推定され、マ
ウスβ−ＮＧＦと類似していることが示唆された［ネー
チャー（Ｎａｔｕｒｅ）３０３巻８２１−８２５頁（１
９８３） ］ 。
、２４１７−２４２０頁（１９７１）１． 最近ヒト
β−ＮＧＦのアミノ酸配列がｃＤＮ＾から推定され、マ
ウスβ−ＮＧＦと類似していることが示唆された［ネー
チャー（Ｎａｔｕｒｅ）３０３巻８２１−８２５頁（１
９８３） ］ 。
ヒト神神経成長子は知覚神経、交感神経細胞などの神経
細胞を成長、増殖させる作用を持ち、詳細には、神経増
殖作用、細胞骨格の重合化、オルガネラの増大、核に関
連する膜の変質などの作用があり、同化作用としては、
代謝前駆体の取り込み、即ち、ウリジン、グルコースお
よびアミノ酸の取り込みやＲＮ＾合成、蛋白質合成を促
進する。
細胞を成長、増殖させる作用を持ち、詳細には、神経増
殖作用、細胞骨格の重合化、オルガネラの増大、核に関
連する膜の変質などの作用があり、同化作用としては、
代謝前駆体の取り込み、即ち、ウリジン、グルコースお
よびアミノ酸の取り込みやＲＮ＾合成、蛋白質合成を促
進する。
また特殊な同化作用としてチロシン・ヒドロキシラーゼ
合成、ドパミン−β−ヒドロキシラーゼ合成、オルニチ
ン・デカルボキシラーゼ合成を増強する。このような作
用から近年老人性痴呆防止薬として期待されているもの
の一つである。
合成、ドパミン−β−ヒドロキシラーゼ合成、オルニチ
ン・デカルボキシラーゼ合成を増強する。このような作
用から近年老人性痴呆防止薬として期待されているもの
の一つである。
上述したネーチャー、３０３巻８２１−８２５頁（１９
８３）番こは、ヒトβ−ＮＧＦをｐＢＲ３２２プラスミ
ド中ヘクロン化したことが記載されている。しかしその
発現については報告されていない。
８３）番こは、ヒトβ−ＮＧＦをｐＢＲ３２２プラスミ
ド中ヘクロン化したことが記載されている。しかしその
発現については報告されていない。
［発明が解決しようとする問題点］
一般に真核生物の遺伝子は、原核生物遺伝子の発現が可
能なベクター系へ組込み、これを原核細胞中へ導入した
としても、その真核生物遺伝子の発現（遺伝子産物の産
生）が、少なくとも検出し得る程度になされるかどうか
は必ずしも期待できない、また、遺伝子の塩基配列が明
らかになれば、微生物中で頻度の高いコドンを選択して
化学合成によって微生物中でより発現し易い遺伝子セグ
メントを合成することが考えられるが、遺伝子配列中で
の相同配列の存在その他のなめ、望ましくないアニーリ
ングを起したり、場合によってはループ等を形成する恐
れなどがあるうえ、発現可能な形でベクターへ組込むた
めの制限酵素部位の設定などの組合せの選択も加って、
その構築は容易でない。
能なベクター系へ組込み、これを原核細胞中へ導入した
としても、その真核生物遺伝子の発現（遺伝子産物の産
生）が、少なくとも検出し得る程度になされるかどうか
は必ずしも期待できない、また、遺伝子の塩基配列が明
らかになれば、微生物中で頻度の高いコドンを選択して
化学合成によって微生物中でより発現し易い遺伝子セグ
メントを合成することが考えられるが、遺伝子配列中で
の相同配列の存在その他のなめ、望ましくないアニーリ
ングを起したり、場合によってはループ等を形成する恐
れなどがあるうえ、発現可能な形でベクターへ組込むた
めの制限酵素部位の設定などの組合せの選択も加って、
その構築は容易でない。
［問題点を解決するための手段］
本発明者らは、先に特開昭６１−２０５４８５号におい
て、ヒト神経成長因子遺伝子セグメント及び該遺伝子セ
グメントを含む組み換えプラスミド、該プラスミドを細
胞中に保有する微生物、また微生物中に蓄積されたタン
パク質よりヒト神経成長因子を製造する方法を発明済み
である。
て、ヒト神経成長因子遺伝子セグメント及び該遺伝子セ
グメントを含む組み換えプラスミド、該プラスミドを細
胞中に保有する微生物、また微生物中に蓄積されたタン
パク質よりヒト神経成長因子を製造する方法を発明済み
である。
しかしながらより大量にヒト神経成長因子（ＮＧＦ）を
得ようとする場合、幾つかの問題がある事が分かった。
得ようとする場合、幾つかの問題がある事が分かった。
すなわち、■ＮＧＦを直接発現、生産する場合において
は細胞中での発現率に不十分な点があり、■また融合タ
ンパク質としてＮＧＦを発現、生産する場合、得られた
融合タンパク質を酵素により部位特異的に切断する操作
が必要となるが、この際使用する酵素がより安価で入手
し易くまな高純度のものを使用する事が結果的に得られ
るＮＧＦの品質に大きく係わってくる。特開昭６１−２
０５４８５号において使用する血液凝固因子ｒａｃｔｏ
ｒｘａは［Ｓ、 Ｉｗａｎａｇａら、ジャーナル・オブ
・バイオケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｔ ）９７巻
、１３４７ページ、 ５号、１９８５年】等にその精製
方法が報告されているがいずれも小スケールのものであ
り、本発明を実施するに必要な量のｒａｃｔｏｒｘａを
得ることはできない。
は細胞中での発現率に不十分な点があり、■また融合タ
ンパク質としてＮＧＦを発現、生産する場合、得られた
融合タンパク質を酵素により部位特異的に切断する操作
が必要となるが、この際使用する酵素がより安価で入手
し易くまな高純度のものを使用する事が結果的に得られ
るＮＧＦの品質に大きく係わってくる。特開昭６１−２
０５４８５号において使用する血液凝固因子ｒａｃｔｏ
ｒｘａは［Ｓ、 Ｉｗａｎａｇａら、ジャーナル・オブ
・バイオケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｔ ）９７巻
、１３４７ページ、 ５号、１９８５年】等にその精製
方法が報告されているがいずれも小スケールのものであ
り、本発明を実施するに必要な量のｒａｃｔｏｒｘａを
得ることはできない。
そこで本発明者らはさらに鋭意研究を行った結果、融合
タンパク質を血液凝固因子トロンビンの認識アミノ酸配
列を介して発現させた後トロンビンで得られた融合タン
パク質を切断しＮＧＦをうる方法が大スケールの場合よ
り相応しいことを見出だし、本発明を完成するに至った
。
タンパク質を血液凝固因子トロンビンの認識アミノ酸配
列を介して発現させた後トロンビンで得られた融合タン
パク質を切断しＮＧＦをうる方法が大スケールの場合よ
り相応しいことを見出だし、本発明を完成するに至った
。
トロンビンはｆａｃｔｏｒＸａと同様に血清中から精製
される血液凝固因子の一種の酵素であるが、現在医薬と
して広く用いられているため高純度のものが工業的に生
産されており本発明において使用するにより相応しいも
のである。
される血液凝固因子の一種の酵素であるが、現在医薬と
して広く用いられているため高純度のものが工業的に生
産されており本発明において使用するにより相応しいも
のである。
本発明は第一に上流側にトロンビンの認識アミノ酸配列
をコードする ＤＮＡ配列を結合したヒトβ−ＮＧＦ遺
伝子セグメントを提供するものである。
をコードする ＤＮＡ配列を結合したヒトβ−ＮＧＦ遺
伝子セグメントを提供するものである。
このヒトβ−ＮＧＦ遺伝子セグメントは、その上流側末
端に、式 ％式％ （式中ＸはＮ末端よりトロンビンの認識アミノ酸配列を
コードするＤＮＡ配列を、Ｘｏはその相補配列を示す）
で表わされるＤＮＡ配列を、またその下流側末端に停止
コドンを含み、制限酵素開裂末端で終る、式 ％式％（２） （式中ソは最初の停止コドンの第二の塩基から制限酵素
開裂末端の３′末端までを表わし、ＹｏはＹの相補配列
で、制限酵素開裂末端の５°末端までを表わす）で表わ
されるＤｌｌ＾配列を持つものである。
端に、式 ％式％ （式中ＸはＮ末端よりトロンビンの認識アミノ酸配列を
コードするＤＮＡ配列を、Ｘｏはその相補配列を示す）
で表わされるＤＮＡ配列を、またその下流側末端に停止
コドンを含み、制限酵素開裂末端で終る、式 ％式％（２） （式中ソは最初の停止コドンの第二の塩基から制限酵素
開裂末端の３′末端までを表わし、ＹｏはＹの相補配列
で、制限酵素開裂末端の５°末端までを表わす）で表わ
されるＤｌｌ＾配列を持つものである。
トロンビンの認識アミノ酸配列としては例えばＶａｌ−
Ｐｒｏ−Ａｒ（ｌで表される配列をあげることができ更
にＤＮＡ配列では、そのＸ及びＸｏとしては、式５式％ で表わされる配列を例示することができる。
Ｐｒｏ−Ａｒ（ｌで表される配列をあげることができ更
にＤＮＡ配列では、そのＸ及びＸｏとしては、式５式％ で表わされる配列を例示することができる。
下流側に付加される、停止コドンを含み制限酵素開裂末
端で終るＤＮＡ配列のＹ及びＹｏとしては、制限酵素
Ｓａｔ Ｉ の開裂末端の配列を含む、式５式％ で表わされる配列を例示することができる。
端で終るＤＮＡ配列のＹ及びＹｏとしては、制限酵素
Ｓａｔ Ｉ の開裂末端の配列を含む、式５式％ で表わされる配列を例示することができる。
上記（１）式では上流側末端がＢＯ＋ １１の末端で終
っている。
っている。
本発明のβ−ＮＧＦ遺伝子セグメントはそのコードする
アミノ酸配列において、前述のｃＤＮＡのそれと同一で
あるが、特に大腸菌中で効果的に発現さ゛れると期待さ
れるコドンに置換されている。
アミノ酸配列において、前述のｃＤＮＡのそれと同一で
あるが、特に大腸菌中で効果的に発現さ゛れると期待さ
れるコドンに置換されている。
本発明におけるβ−ＮＧＦ遺伝子セグメントを含む組み
替えプラスミドは、たとえば次のような方法によって製
造することができる。すなわち特開昭６１−２０５４８
５号「ヒト神経成長因子遺伝子セグメント」により製造
される組換えプラスミドｐＮＦ−７を用い、その一部で
ある血液凝固因子Ｘａの認識配列（Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｙ−Ａｒｇ）をコードするＤＮＡ配列、すなわち式、 ５°ＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴ３゜ ＴＡＧＣＴＴＣＣＡＧＣ＾ ・・・（５）をトロン
ビンの認識配列（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−＾「９）をコードす
るＤＮＡ配列、すなわち式、 ５°ＧＴＴＣＣＧＣＧＴ ３゜ ＣＡＡＧＧＣＧＣＡ ・・・（６）に置換す
る方法である。
替えプラスミドは、たとえば次のような方法によって製
造することができる。すなわち特開昭６１−２０５４８
５号「ヒト神経成長因子遺伝子セグメント」により製造
される組換えプラスミドｐＮＦ−７を用い、その一部で
ある血液凝固因子Ｘａの認識配列（Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｙ−Ａｒｇ）をコードするＤＮＡ配列、すなわち式、 ５°ＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴ３゜ ＴＡＧＣＴＴＣＣＡＧＣ＾ ・・・（５）をトロン
ビンの認識配列（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−＾「９）をコードす
るＤＮＡ配列、すなわち式、 ５°ＧＴＴＣＣＧＣＧＴ ３゜ ＣＡＡＧＧＣＧＣＡ ・・・（６）に置換す
る方法である。
具体的には、プラスミドｐＮＦ−７の血液凝固因子Ｘａ
の認識配列（ｌｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒａ）をコー
ドするＤＮＡ配列部位を、その上流及び下流返戻の任意
の制限酵素認識配列により切り出し、切り出されたＤＮ
Ａフラグメントの血液凝固因子Ｘａの認識配列（Ｉｌｅ
−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｏ）をコードする部分を、トロ
ンビンの認識配列（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）をコード
するＤＮＡ配列に置き換えた配列を持つＤＮＡを合成し
公知の方法で、切り出した残りのプラスミド部分に挿入
する。
の認識配列（ｌｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒａ）をコー
ドするＤＮＡ配列部位を、その上流及び下流返戻の任意
の制限酵素認識配列により切り出し、切り出されたＤＮ
Ａフラグメントの血液凝固因子Ｘａの認識配列（Ｉｌｅ
−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｏ）をコードする部分を、トロ
ンビンの認識配列（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）をコード
するＤＮＡ配列に置き換えた配列を持つＤＮＡを合成し
公知の方法で、切り出した残りのプラスミド部分に挿入
する。
ここで用いることにできる制限酵素としてはＢａｔ Ｕ
及び■ｏＲＩを例示することができる。
及び■ｏＲＩを例示することができる。
組み換えプラスミドｐＮＦ−７に制限酵素！！ＬＬＩｒ
。
。
及びＥｃｏＲＩを作用させることにより次式に示す配列
のＤＮＡが切りだされる。
のＤＮＡが切りだされる。
”ＧＡＴＣＴＴＣＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＴＣＣＴＣ
ＣＴＣＴＣＡＣＣＣＧＡＴＣＴＴＣＡＡＧＴ＾ＧＣＴＴ
ＣＣＡＧＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧＣＴＡＧＡ
ＡＧＣＡＣＣＧＴＧＧＣＧ ３゜ ＧＴＧＧＣＡＣＣＧＣＴＴＡＡ ・・・（７）この
ＤＮＡフラグメントの血液凝固因子Ｘａの認識配列（Ｉ
ｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）をコードする部分を、
トロンビンの認識配列（ｖａｔ−Ｐｒｏ−Ａｒａ）をコ
ードするＤＮＡ配列に置き換えたＤＮＡフラグメントの
例を次式に示す。
ＣＴＣＴＣＡＣＣＣＧＡＴＣＴＴＣＡＡＧＴ＾ＧＣＴＴ
ＣＣＡＧＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧＣＴＡＧＡ
ＡＧＣＡＣＣＧＴＧＧＣＧ ３゜ ＧＴＧＧＣＡＣＣＧＣＴＴＡＡ ・・・（７）この
ＤＮＡフラグメントの血液凝固因子Ｘａの認識配列（Ｉ
ｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）をコードする部分を、
トロンビンの認識配列（ｖａｔ−Ｐｒｏ−Ａｒａ）をコ
ードするＤＮＡ配列に置き換えたＤＮＡフラグメントの
例を次式に示す。
５°ＧＡ丁ＣＴＴＣＧＴＴＣｅＧＣＧＴＴＣＣＴＣＣＴ
ＣＴＣＡＣＣＣＧＡＴＣＴＴＣＡＡＧＣＡＡＧＧＣＧＣ
ＡＡＧＧＡＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧＣＴＡＧＡＡＧＣＡＣ
ＣＧＴＧＧＣＧ ３゜ ＧＴＧＧＣＡＣＣＧＣＴＴＡＡ ・・・（８）上
記（８）式に示すＤＮＡフラグメントを合成し５゜末端
をポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化した後７
４−１７４−１ｉを用いて、ｐＮＦ−７からＤＮＡ ７
ラグメントを切り出した残りの部分に挿入することがで
きる。
ＣＴＣＡＣＣＣＧＡＴＣＴＴＣＡＡＧＣＡＡＧＧＣＧＣ
ＡＡＧＧＡＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧＣＴＡＧＡＡＧＣＡＣ
ＣＧＴＧＧＣＧ ３゜ ＧＴＧＧＣＡＣＣＧＣＴＴＡＡ ・・・（８）上
記（８）式に示すＤＮＡフラグメントを合成し５゜末端
をポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化した後７
４−１７４−１ｉを用いて、ｐＮＦ−７からＤＮＡ ７
ラグメントを切り出した残りの部分に挿入することがで
きる。
本発明において用いる合成りＮＡフラグメントは通常１
５ｂａｓｅ前後のサブ・フラグメントごとにまず合成す
る。サブ・フラグメントとしては次のようなものが例示
できる。
５ｂａｓｅ前後のサブ・フラグメントごとにまず合成す
る。サブ・フラグメントとしては次のようなものが例示
できる。
０１ ５’ＧＡＴＣＴＴＣＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴ ３゜
１１２ ５’ＣＣｒＣＣ丁ＣＴＣＡＣＣＣＧＡ
３’０３ ＳｏＴＣＴＣＣＣＡＣＣＧＴＧＧＣＧ ３
゜［１５°ＧＡＧＧＡＡＣＧＣＧＧＡＡＣＧＡＡ ３゜
１２ ５°＾ＡＧ＾ＴＣＧＧＧＴＧＡＧＡＧ ３゜［３
５°ＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＧＧＴＧＧ ３゜合成後これ
らサブフラグメントを混合し、相互に相補性のある組み
合わせごとに両者を水素結合させ、二本鎖オリゴヌクレ
オチドとし、それらをＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅにより結合
し、２本の完全な相補鎖とする方法により製造される。
１１２ ５’ＣＣｒＣＣ丁ＣＴＣＡＣＣＣＧＡ
３’０３ ＳｏＴＣＴＣＣＣＡＣＣＧＴＧＧＣＧ ３
゜［１５°ＧＡＧＧＡＡＣＧＣＧＧＡＡＣＧＡＡ ３゜
１２ ５°＾ＡＧ＾ＴＣＧＧＧＴＧＡＧＡＧ ３゜［３
５°ＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＧＧＴＧＧ ３゜合成後これ
らサブフラグメントを混合し、相互に相補性のある組み
合わせごとに両者を水素結合させ、二本鎖オリゴヌクレ
オチドとし、それらをＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅにより結合
し、２本の完全な相補鎖とする方法により製造される。
まずこれらのオリゴヌクレオチド・サブフラグメントの
各−本鎖部分を合成する。この合成は例えば固相法で行
うことができる。
各−本鎖部分を合成する。この合成は例えば固相法で行
うことができる。
固相法の担体としては、１１−（アミノメチル）フェニ
ル基を持つジビニルベンゼン架橋ポリスチレン樹脂［三
好他（に、 Ｈｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ、）、ヌクレ
フ・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅｓ、）、８巻、５５０７頁（１９８Ｇ）参照］又
はシリカゲル［（Ｍ、Ｏ，Ｈａｔｔｅｕｃｃｉ ａｔ
ａｌ、ｌジャナル・サブ・ザ・アメリカン・ケミカル・
ソサイエティ （Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、 ）１０３巻、３１８
５頁（１９８１）参照］が好ましい。
ル基を持つジビニルベンゼン架橋ポリスチレン樹脂［三
好他（に、 Ｈｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ、）、ヌクレ
フ・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅｓ、）、８巻、５５０７頁（１９８Ｇ）参照］又
はシリカゲル［（Ｍ、Ｏ，Ｈａｔｔｅｕｃｃｉ ａｔ
ａｌ、ｌジャナル・サブ・ザ・アメリカン・ケミカル・
ソサイエティ （Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、 ）１０３巻、３１８
５頁（１９８１）参照］が好ましい。
各フラグメントの３°末端を構成する４種類のデオキシ
ヌクレオチド、すなわち、デオキシシチジン、デオキシ
アデノシン、デオキシグアノシン及びチミジンを、前王
者についてはそのアミノ基をベンゾイル基、イソブチリ
ル基等で保護した後、常法によりそれぞれ５°−ジメト
キシトリチル化３−コハク酸エステルとする［プロ力他
（Ｂｒｏｋａ ｃ、 ｅｔ ａｌ、）、ヌクレック・ア
シッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ
ｓ、）、 ８巻、 ５４６１〜５４７１頁（１９８０
）＃Ｊｊ照］。
ヌクレオチド、すなわち、デオキシシチジン、デオキシ
アデノシン、デオキシグアノシン及びチミジンを、前王
者についてはそのアミノ基をベンゾイル基、イソブチリ
ル基等で保護した後、常法によりそれぞれ５°−ジメト
キシトリチル化３−コハク酸エステルとする［プロ力他
（Ｂｒｏｋａ ｃ、 ｅｔ ａｌ、）、ヌクレック・ア
シッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ
ｓ、）、 ８巻、 ５４６１〜５４７１頁（１９８０
）＃Ｊｊ照］。
これを前記担体のアミノ基と結合したちのくヌクレオシ
ド担体）を、前記オリゴヌクレオチドの３°末端に用い
る０次いで、これらの３°末末端ヌクレオシド体に、偶
数個のデオキシリボヌクレオチドよりなるオリゴヌクレ
オチドについては、３°末端より第二番目に相当するモ
ノヌクレオチド［ＡおよびＣについてはトベンゾイル化
、Ｇについてはトイソブリル化して保護したもの、おの
おの５°、−ＯＨを４．４°−ジメトキシトリチル化、
かつ３°−リン酸をモノ（オルトクロルフェニル）エー
テル化して保護］を、奇数個のデオキシリボヌクレオチ
ドよりなるオリゴヌクレオチドについては３゛末端より
第二および第三番目に相当するジヌクレオチド（おのお
の保護については前と同じ）を、縮合剤を用いて結合さ
せる。縮合剤としては、メシチレンスルホニル−３−ニ
トロトリアゾリド（Ｈ３ＮＴ） 、２，４．６−トリイ
ソプロビルベンゼンスルホニルー３−ニトロトリアゾリ
ド（ＴＰＳＮＴ ） 、メチシチレンスルホニルーテト
ラゾリド（ＭＳＴｅ）、トラゾリド（ＴＰＳＴｅ）等が
適当である。
ド担体）を、前記オリゴヌクレオチドの３°末端に用い
る０次いで、これらの３°末末端ヌクレオシド体に、偶
数個のデオキシリボヌクレオチドよりなるオリゴヌクレ
オチドについては、３°末端より第二番目に相当するモ
ノヌクレオチド［ＡおよびＣについてはトベンゾイル化
、Ｇについてはトイソブリル化して保護したもの、おの
おの５°、−ＯＨを４．４°−ジメトキシトリチル化、
かつ３°−リン酸をモノ（オルトクロルフェニル）エー
テル化して保護］を、奇数個のデオキシリボヌクレオチ
ドよりなるオリゴヌクレオチドについては３゛末端より
第二および第三番目に相当するジヌクレオチド（おのお
の保護については前と同じ）を、縮合剤を用いて結合さ
せる。縮合剤としては、メシチレンスルホニル−３−ニ
トロトリアゾリド（Ｈ３ＮＴ） 、２，４．６−トリイ
ソプロビルベンゼンスルホニルー３−ニトロトリアゾリ
ド（ＴＰＳＮＴ ） 、メチシチレンスルホニルーテト
ラゾリド（ＭＳＴｅ）、トラゾリド（ＴＰＳＴｅ）等が
適当である。
さらに前者のオリゴヌクレオチドについては、同様に保
護した第三および第四番目に相当するジヌクレオチド、
第五および第六番目に相当するジヌクレオチド・・・・
・・と、後者のオリゴヌクレオチドについては第四およ
び第五番目、第六および第七番目・・・・・・と各ジヌ
クレオチドを同様にして５°方向へ順次結合させる。但
し必要に応じて途中でモノヌクレオチド、トリヌクレオ
チド、テトラヌクレオチドなどを用いてもよい。
護した第三および第四番目に相当するジヌクレオチド、
第五および第六番目に相当するジヌクレオチド・・・・
・・と、後者のオリゴヌクレオチドについては第四およ
び第五番目、第六および第七番目・・・・・・と各ジヌ
クレオチドを同様にして５°方向へ順次結合させる。但
し必要に応じて途中でモノヌクレオチド、トリヌクレオ
チド、テトラヌクレオチドなどを用いてもよい。
この調製法を第１図に示した。同図中Ｐはポリスチレン
の１駕ジビニルベンゼンとの共重合体を、ｂｚおよび１
ｂはベンゾイル基およびイソブチリル基を、Ｂはｂｚ＾
、 ｉｂＧ、 ｂｚｃまたは■を、Ｂｏは＾、Ｇ、Ｃま
たは■を、 ＤＨＴｒは４．４°−ジメトキシトリチル
基を、Ａｒはオルトクロロフェニル基を、ＢＳＡはベン
ゼンスルホン酸のメチレンジクロリド−メタノール混合
溶媒（容量比１：３）溶液（２ｘ）を、ＤＨＡＰは４−
ジメチルアミノピリジンの０．１４Ｍピリジン溶液を、
ＴＨＧ−ＰＡＯは１，１，３．３−テトラメチルグユニ
ジウム２−ピリジンアルドキシメートのジオキサン−水
混合溶媒（容量比９：１）溶液（０，５Ｎ ）を示す。
の１駕ジビニルベンゼンとの共重合体を、ｂｚおよび１
ｂはベンゾイル基およびイソブチリル基を、Ｂはｂｚ＾
、 ｉｂＧ、 ｂｚｃまたは■を、Ｂｏは＾、Ｇ、Ｃま
たは■を、 ＤＨＴｒは４．４°−ジメトキシトリチル
基を、Ａｒはオルトクロロフェニル基を、ＢＳＡはベン
ゼンスルホン酸のメチレンジクロリド−メタノール混合
溶媒（容量比１：３）溶液（２ｘ）を、ＤＨＡＰは４−
ジメチルアミノピリジンの０．１４Ｍピリジン溶液を、
ＴＨＧ−ＰＡＯは１，１，３．３−テトラメチルグユニ
ジウム２−ピリジンアルドキシメートのジオキサン−水
混合溶媒（容量比９：１）溶液（０，５Ｎ ）を示す。
上記ジヌクレオチドは、４種類のヌクレオチドの順列に
より１６種類が必要であるが、その合成法は、例えば第
２図に示す方法によることができる。
より１６種類が必要であるが、その合成法は、例えば第
２図に示す方法によることができる。
ただし、ＤＨＴｒは、４°、４°−ジメトキシトリチル
基、Ｂ及びＢｏは６−トベンゾイルアデニンー９−イル
基、４−トベンゾイルシトシンー１−イル基、２−トイ
ソーブチリルグアニン−９−イル基、チミン−１−イル
基から選ばれ、同−又は異なってもよい、 Ｈ３ＮＴは
メシチレンスルホニル−３−ニトロトリアゾリドを示す
、これらのジヌクレオチドへの保護基導入は公知の方法
［例えば蛋白質核酸酵素、２６（４）、２５９（１ｑａ
１）］により容易に行うことができる。
基、Ｂ及びＢｏは６−トベンゾイルアデニンー９−イル
基、４−トベンゾイルシトシンー１−イル基、２−トイ
ソーブチリルグアニン−９−イル基、チミン−１−イル
基から選ばれ、同−又は異なってもよい、 Ｈ３ＮＴは
メシチレンスルホニル−３−ニトロトリアゾリドを示す
、これらのジヌクレオチドへの保護基導入は公知の方法
［例えば蛋白質核酸酵素、２６（４）、２５９（１ｑａ
１）］により容易に行うことができる。
「プラスミド及びその調製」
本発明の第三は本発明のβ−ＮＧＦ遺伝子セグメントを
含む組換えプラスミドを提供するものである。 即ち、
β−ＮＧＦ遺伝子セグメントを含み微生物中で自ど一殖
可能な組換えプラスミドを提供するものである。そして
好ましくはヒトβ−ＮＯＦ遺伝子の上流にこの遺伝子を
発現可能に支配するプロモーターオペレーター系を含み
、そのプロモーター・オペレーター系の上流とヒトβ−
ＮＧＦ遺伝子の下流との間にプラスミドを自己増殖可能
とする部分及び薬剤耐性をコードする部分を含むもので
ある。
含む組換えプラスミドを提供するものである。 即ち、
β−ＮＧＦ遺伝子セグメントを含み微生物中で自ど一殖
可能な組換えプラスミドを提供するものである。そして
好ましくはヒトβ−ＮＯＦ遺伝子の上流にこの遺伝子を
発現可能に支配するプロモーターオペレーター系を含み
、そのプロモーター・オペレーター系の上流とヒトβ−
ＮＧＦ遺伝子の下流との間にプラスミドを自己増殖可能
とする部分及び薬剤耐性をコードする部分を含むもので
ある。
プロモーター・オペレーター系としては、ア・ノテネー
タ一部分を欠く、細菌のトリプトファン・プロモーター
・オペレーター系を例示することができる。
タ一部分を欠く、細菌のトリプトファン・プロモーター
・オペレーター系を例示することができる。
本発明の組換えプラスミドは大腸菌などの微生物に形質
転換して、本発明のヒトβ−ＮＧＦ遺伝子の産物を融合
蛋白質の形で産生させることができる。
転換して、本発明のヒトβ−ＮＧＦ遺伝子の産物を融合
蛋白質の形で産生させることができる。
「形質転換体」
本発明の組換プラスミドは慣用の方法で［例えばコーエ
ンら、プロシーデングス・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａ
ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ）Ｕ、Ｓ、Ａ、、 ６９巻
、２１１０頁（１９７２）］容易に大腸菌などの微生物
に形質転換できる。
ンら、プロシーデングス・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａ
ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ）Ｕ、Ｓ、Ａ、、 ６９巻
、２１１０頁（１９７２）］容易に大腸菌などの微生物
に形質転換できる。
これらの菌株の菌学的性質はアンピシリン耐性を獲得し
ていることとβ−ＮＯＦ融合蛋白質を発現し、産生ずる
こと以外に宿主菌株と変りはなく、同様の条件で容易に
培養することができる。またアンピシリン添加培地を用
いることができる。
ていることとβ−ＮＯＦ融合蛋白質を発現し、産生ずる
こと以外に宿主菌株と変りはなく、同様の条件で容易に
培養することができる。またアンピシリン添加培地を用
いることができる。
本発明の形質転換された大腸菌菌株はこれを栄養培地中
で培養することによってヒトβ−ＮＧＦ遺伝子を効率よ
く増幅することができる。また本発明のβ−ＮＧＦ遺伝
子の上流にその発現を支配し、かつ可能とするプロモー
ター・オペレーター系、特にそのアッテネーター部分を
欠如するトリプトファン・プロモーター・オペレーター
系を持つものは、ヒトβ−ＮＧＦをヒト成長ホルモンの
Ｎ末端側の一部との融合蛋白質の形で発現し、菌体内に
蓄積する。この場合（トリプトファン・プロモーター・
オペレーター系のとき）ヒトβ−ＮＧＦの産生（ＩＩＲ
Ｎ＾合成）はインドールアクリル酸の添加によって強く
誘導される。
で培養することによってヒトβ−ＮＧＦ遺伝子を効率よ
く増幅することができる。また本発明のβ−ＮＧＦ遺伝
子の上流にその発現を支配し、かつ可能とするプロモー
ター・オペレーター系、特にそのアッテネーター部分を
欠如するトリプトファン・プロモーター・オペレーター
系を持つものは、ヒトβ−ＮＧＦをヒト成長ホルモンの
Ｎ末端側の一部との融合蛋白質の形で発現し、菌体内に
蓄積する。この場合（トリプトファン・プロモーター・
オペレーター系のとき）ヒトβ−ＮＧＦの産生（ＩＩＲ
Ｎ＾合成）はインドールアクリル酸の添加によって強く
誘導される。
この融合蛋白質は次の様なアミノ酸配列を有する。
すなわち、式
％式％
ＶＡＬ ＬＥＤ ＧＬＹ ＧＬＵ ＶＡＬ
ＡＳＮ ＩＬＥ ＡＳＮ ＡＳＮ ５ＥＲＶＡ
Ｌ ＰＩＩＥ ＬＹＳ ＧＬＮ ＴＹＲＰＩＩ
Ｅ ＰＩＩＥ ＧＬＵ ＴＨＲＬＹＳＣＹＳ
ＡＲＧ ＡＳＰ ＰＲＯＡＳＮ ＰＲＯＶＡＬ
ＡＳＰ ＳＥＲＧＬＹＣＹＳ ＡＲＧ ＧＬＹ Ｉ
ＬＥ ＡＳＰ ＳＥＲＬＹＳ ＨＩＳ ＴＲＰ ＡＳＮ
ＳＥＲＴＹＲＣＹＳ ＴＨＲＴＨＲＴＨＲＨＩＳ
ＴＨＲＰＩＥ ＶＡＬＬＹＳ ＡＬＡ ＬＥＬＩ
Ｔ）ＩＲＭＥＴ ＡＳＰ Ｇｔｙ ｔｙｓ Ｇ
ＬＮ ＡＬＡＡＬＡ ＴＲＰ ＡＲＧ ＰＨＥ
ＩＬＥ ＡＲＧ ＩＬＥ ＡＳＰ Ｔ）Ｉ
ＲＡＬＡＣＹＳ ＶＡＬ ＣＹＳ ＶＡＬ Ｌ
ＥＤ ＳＥＲＡＲＧ ＬＹＳ ＡＬＡ ＶＡＬ
ＡＲＧ 菌体内に蓄積されたΔ−ＮＧＦとヒト成長ホルモンの一
部との融合タンパク質は菌体を溶菌させた後、通常の生
理活性蛋白質回収法によって分離回収することができる
０例えば培養終了後、菌体を遠心分離により集菌し、リ
ン酸Ｍ街液中で超音波、リゾチーム、フレンチプレス、
ダイノミル等の処理をして得られる上清液を硫安分画成
いはゲル濾過により目的の蛋白質分画を得る。更に高純
度を必要とするときは抗体カラム法等で精製することも
できる。
ＡＳＮ ＩＬＥ ＡＳＮ ＡＳＮ ５ＥＲＶＡ
Ｌ ＰＩＩＥ ＬＹＳ ＧＬＮ ＴＹＲＰＩＩ
Ｅ ＰＩＩＥ ＧＬＵ ＴＨＲＬＹＳＣＹＳ
ＡＲＧ ＡＳＰ ＰＲＯＡＳＮ ＰＲＯＶＡＬ
ＡＳＰ ＳＥＲＧＬＹＣＹＳ ＡＲＧ ＧＬＹ Ｉ
ＬＥ ＡＳＰ ＳＥＲＬＹＳ ＨＩＳ ＴＲＰ ＡＳＮ
ＳＥＲＴＹＲＣＹＳ ＴＨＲＴＨＲＴＨＲＨＩＳ
ＴＨＲＰＩＥ ＶＡＬＬＹＳ ＡＬＡ ＬＥＬＩ
Ｔ）ＩＲＭＥＴ ＡＳＰ Ｇｔｙ ｔｙｓ Ｇ
ＬＮ ＡＬＡＡＬＡ ＴＲＰ ＡＲＧ ＰＨＥ
ＩＬＥ ＡＲＧ ＩＬＥ ＡＳＰ Ｔ）Ｉ
ＲＡＬＡＣＹＳ ＶＡＬ ＣＹＳ ＶＡＬ Ｌ
ＥＤ ＳＥＲＡＲＧ ＬＹＳ ＡＬＡ ＶＡＬ
ＡＲＧ 菌体内に蓄積されたΔ−ＮＧＦとヒト成長ホルモンの一
部との融合タンパク質は菌体を溶菌させた後、通常の生
理活性蛋白質回収法によって分離回収することができる
０例えば培養終了後、菌体を遠心分離により集菌し、リ
ン酸Ｍ街液中で超音波、リゾチーム、フレンチプレス、
ダイノミル等の処理をして得られる上清液を硫安分画成
いはゲル濾過により目的の蛋白質分画を得る。更に高純
度を必要とするときは抗体カラム法等で精製することも
できる。
β−ＮＣＦ又はそのヒト成長ホルモンとの融合蛋白質が
細胞壁に吸着されているときは塩酸グアニジン処理を行
って完全に抽出し、これを再活性化して高い収率で回収
することもできる。
細胞壁に吸着されているときは塩酸グアニジン処理を行
って完全に抽出し、これを再活性化して高い収率で回収
することもできる。
本発明の微生物により産生されたヒト成長ホルモンとの
融合タンパク質はその融合部位にトロンビンの認識部位
（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）を有し、この酵素で処理す
ることによって完全かつ付加アミノ残基のないヒトβ−
ＭＧＦとすることができる。この処理は前述の公知の方
法に準じて行うことができる。
融合タンパク質はその融合部位にトロンビンの認識部位
（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）を有し、この酵素で処理す
ることによって完全かつ付加アミノ残基のないヒトβ−
ＭＧＦとすることができる。この処理は前述の公知の方
法に準じて行うことができる。
またその生成物である天然型ヒトβ−ＮＧＦも前述の方
法で精製分離することができる。
法で精製分離することができる。
［実施例］
以下本発明を実施例により更に詳しく説明する。
なお実施例中で略号で示した試薬は以下のとおりである
。
。
標準Ｍ漬液： ５０ ｉ＋ＨＴｒｉｓ−塩酸 ｐＨ７，
５３５１Ｎ ＨＱＣｌｚ ３５ ｍＭ ２−メルカプトエタノールＴｒｉｓ−Ｎａ
Ｃ１： １０ ｍＨＴｒｉｓ−塩酸 ＋１ｌＮＬ 。
５３５１Ｎ ＨＱＣｌｚ ３５ ｍＭ ２−メルカプトエタノールＴｒｉｓ−Ｎａ
Ｃ１： １０ ｍＨＴｒｉｓ−塩酸 ＋１ｌＮＬ 。
０．１４ｍＨＮａＣＩ
ＴＥ−蔗糖 ： ２５％（ｗ／ｖ） 蔗糖５０ ｍＭ
Ｔｒｉｓ−塩酸 ｐＨ８，０１ｍＨＥＤＴ＾ リゾチーム、 １ｏ ｓｏ／■ｌリゾチーム０．２５Ｈ
ＴｒｉＳ−塩酸 ｐＨ８，００，５Ｎ ＥＤＴ＾： ｐ
Ｈ８，０ ＰＮａｓｅ ： ０．０４Ｍ酢酸絹衝液（ＩＩＨ５
，Ｏ）に１０−ｇ／ｌの濃度に溶かし、１００℃で ５分間過熱処理する。
Ｔｒｉｓ−塩酸 ｐＨ８，０１ｍＨＥＤＴ＾ リゾチーム、 １ｏ ｓｏ／■ｌリゾチーム０．２５Ｈ
ＴｒｉＳ−塩酸 ｐＨ８，００，５Ｎ ＥＤＴ＾： ｐ
Ｈ８，０ ＰＮａｓｅ ： ０．０４Ｍ酢酸絹衝液（ＩＩＨ５
，Ｏ）に１０−ｇ／ｌの濃度に溶かし、１００℃で ５分間過熱処理する。
ｔｙｔｉＣＭｉｘｔｕｒｅ ： ｏ、ｔｘ非イオン性界
面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００） ５０１８ Ｔｒｉｓ−塩酸 ｐ）１８．０６２．５ｍＭ
ＥＤＴＡ ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６００Ｇニ一級の粉
末 ５８ ＮａＣＩ Ｃ５ＣＩ ：固体 ＦＢ温溶液エチジウムブロマイドを水に対して７ｍ！ｌ
／ＩＩになる様溶解して調整。
面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００） ５０１８ Ｔｒｉｓ−塩酸 ｐ）１８．０６２．５ｍＭ
ＥＤＴＡ ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６００Ｇニ一級の粉
末 ５８ ＮａＣＩ Ｃ５ＣＩ ：固体 ＦＢ温溶液エチジウムブロマイドを水に対して７ｍ！ｌ
／ＩＩになる様溶解して調整。
ＴＥ ： １０ａ＋１４ Ｔｒｉｓ−塩酸 ｐＨ７，４
１，０ｍＭ ＥＤＴＡ ＴＥ−ｓａｒｋｏｓｙｌ ： ７０ｍ）ｌ Ｔｒｉｓ
−塩酸１■ＨＥＤＴＡ ０．３８％５ｏｄｉｕｓ Ｎ−Ｌａｕｒｏｙｌ ５
ａｒｋｏ−３ｉｎａｔｅ ＤＨ７，４ ＴＥＮ ： １０１８ Ｔｒｉｓ−塩酸１ ｍＨＥ
ＤＴＡ ０、ＩＭ ＮａＣｌ ｐＨ７，４ 実施例１ ［オリゴヌクレオチドの合成］ ＋１１ ｄＧＡＴＣＴＴＣＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴ （０
１＞ ）合成５°−（４，４°−ジメトキシトリチル）
−トベンゾイルデオキシチミジン担体〈１００μｍａｔ
／を前記ポリスチレン樹脂 ５０■〉をピリジン中−夜
室温で放置し次のような操作により縮合反応を行った。
１，０ｍＭ ＥＤＴＡ ＴＥ−ｓａｒｋｏｓｙｌ ： ７０ｍ）ｌ Ｔｒｉｓ
−塩酸１■ＨＥＤＴＡ ０．３８％５ｏｄｉｕｓ Ｎ−Ｌａｕｒｏｙｌ ５
ａｒｋｏ−３ｉｎａｔｅ ＤＨ７，４ ＴＥＮ ： １０１８ Ｔｒｉｓ−塩酸１ ｍＨＥ
ＤＴＡ ０、ＩＭ ＮａＣｌ ｐＨ７，４ 実施例１ ［オリゴヌクレオチドの合成］ ＋１１ ｄＧＡＴＣＴＴＣＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴ （０
１＞ ）合成５°−（４，４°−ジメトキシトリチル）
−トベンゾイルデオキシチミジン担体〈１００μｍａｔ
／を前記ポリスチレン樹脂 ５０■〉をピリジン中−夜
室温で放置し次のような操作により縮合反応を行った。
操 作
１）ジクロロメタン−メタノール（７：３ 、 Ｖ／Ｖ
”）２ ｍｌにより３回洗浄。
”）２ ｍｌにより３回洗浄。
２）２駕ベンゼンスルホン酸溶液（溶媒ジクロロメタン
−メチルアルコール、７：３）２ｍｌで２分間処理した
後、同じ混合溶媒で３回洗浄する操作を繰返して発色の
なくなることを確かめた。
−メチルアルコール、７：３）２ｍｌで２分間処理した
後、同じ混合溶媒で３回洗浄する操作を繰返して発色の
なくなることを確かめた。
３）ピリジン２ｍｌにより３回洗浄。
４１５’−（４，４°−ジメトキシトリチル）グアニジ
ル−Ｐ（ｏ−クロロフェニル）−１ベンゾイルデオキシ
チミジン−３° （０−クロロフェニル）ホスフェート
のピリジン溶液（０，２ｍｌ、同ヌクレオチド ２０■
を含む）を加え溶媒を減圧留去した。
ル−Ｐ（ｏ−クロロフェニル）−１ベンゾイルデオキシ
チミジン−３° （０−クロロフェニル）ホスフェート
のピリジン溶液（０，２ｍｌ、同ヌクレオチド ２０■
を含む）を加え溶媒を減圧留去した。
５）縮合剤、メシチレンスルホニル−３−ニトロトリア
ゾリド（２０■）のピリジン溶液（０，２ｍ１）を加え
４０℃、２０分間放置しな。
ゾリド（２０■）のピリジン溶液（０，２ｍ１）を加え
４０℃、２０分間放置しな。
６）ピリジン２ ｍｌにより２回洗浄。
７１０．４Ｍジメチルアミノピリジンのピリジン溶液（
１，８ｍ１）及び無水酢酸（０，２ｍ１）を加え３分間
放置した。
１，８ｍ１）及び無水酢酸（０，２ｍ１）を加え３分間
放置した。
８）ピリジン２ ｍｌにより３回洗浄、続いて上記２）
以降の操作を５−（４，４’−ジメＩ・キシトリチル〉
グアニジル−Ｐ−（ｏ−クロロフェニル）−トベンゾイ
ルデオキシチミジン−３−（０−クロロフェニル）ホス
フェートに変えて５’−（４，４−ジメトキシトリチル
）−Ｎ〜ベンゾイルデオキシグアニジル−Ｐ−（０−ク
ロロフェニル）デオキシシトシン−３’−（ｏ−クロロ
フェニル）ホスフェートを用いて行い、さらに同様の保
護基を有するｄＣＣ，ｄＨ，ｄＣＧ、 ｄ７Ｔ、 ｄＴ
Ｃ。
以降の操作を５−（４，４’−ジメＩ・キシトリチル〉
グアニジル−Ｐ−（ｏ−クロロフェニル）−トベンゾイ
ルデオキシチミジン−３−（０−クロロフェニル）ホス
フェートに変えて５’−（４，４−ジメトキシトリチル
）−Ｎ〜ベンゾイルデオキシグアニジル−Ｐ−（０−ク
ロロフェニル）デオキシシトシン−３’−（ｏ−クロロ
フェニル）ホスフェートを用いて行い、さらに同様の保
護基を有するｄＣＣ，ｄＨ，ｄＣＧ、 ｄ７Ｔ、 ｄＴ
Ｃ。
及びｄＧＡを用いて順次５°方向へＤＮＡ鎖を延長した
後、樹脂を０．５Ｍ）リメチルグアニジウムーピリジン
−２−アルドオキシメー） ［Ｃ，Ｂ、Ｒｅｅｓｅ ｅ
ｔ ａｔ。
後、樹脂を０．５Ｍ）リメチルグアニジウムーピリジン
−２−アルドオキシメー） ［Ｃ，Ｂ、Ｒｅｅｓｅ ｅ
ｔ ａｔ。
、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ、、 ２７２７
（１９７８）］の］ジオキサンー水９：１ ）の溶液（
１ｍｌ）中３８時時間上うした。樹脂を５０駕ピリジン
水により洗浄し液と洗液を合せて減圧濃縮し、残渣に濃
アンモニア水（１５ｍｌ）を加え密栓して５５℃で５時
間加温した。アンモニアを留去し、ピリジニウム型強酸
性陽イオン交換樹脂（ｄｏｗｅｘ ５０．商標）２ｍｌ
を加え、樹脂を５０駕ピリジン水により洗浄し、液と洗
液を合せて濃縮した。濃縮液に少量の水を加え酢酸エチ
ルでオキシムを抽出して除いた。水層を水で希釈し、そ
の一部を分取してジメトキシトリチル基の定量を行い全
体の量を推定した。ジメトキシトリチル基の分子吸光係
数を７１．７００とすると７７．４ Ａ２５４ユニツト
から １μ穐０１の粗オリゴヌクレオチドが合成された
ことがわかった。
（１９７８）］の］ジオキサンー水９：１ ）の溶液（
１ｍｌ）中３８時時間上うした。樹脂を５０駕ピリジン
水により洗浄し液と洗液を合せて減圧濃縮し、残渣に濃
アンモニア水（１５ｍｌ）を加え密栓して５５℃で５時
間加温した。アンモニアを留去し、ピリジニウム型強酸
性陽イオン交換樹脂（ｄｏｗｅｘ ５０．商標）２ｍｌ
を加え、樹脂を５０駕ピリジン水により洗浄し、液と洗
液を合せて濃縮した。濃縮液に少量の水を加え酢酸エチ
ルでオキシムを抽出して除いた。水層を水で希釈し、そ
の一部を分取してジメトキシトリチル基の定量を行い全
体の量を推定した。ジメトキシトリチル基の分子吸光係
数を７１．７００とすると７７．４ Ａ２５４ユニツト
から １μ穐０１の粗オリゴヌクレオチドが合成された
ことがわかった。
水層を減圧乾固し残渣に８０％酢酸１０ｍ１を加え２５
℃、３０分間保った後溶媒を留去し、残渣を水と酢酸エ
チルに溶解した。水層を濃縮した後、イオン交換クロマ
トグラフィーにかけた。イオン交換体はＤＥＡＥ−ＴＯ
ＶＯｐｅａｒｌ ６５Ｏ３（商標）を用いた。これをカ
ラム（０，７Ｘ２１ｃｍ）につめ７Ｈ尿素、２０ｍＭ
）リスー塩酸綬衡液（ｐＨ７゜５）中、０．１〜０．３
Ｈの食塩濃度勾配で溶出した。紫外線吸収によりオリゴ
ヌクレオチドを検出し、中央部をとりセルロース膜を用
いて透析により脱塩し、１０．０＾２６０ユニツト（５
００μｇ）を得た。 ）ＩＰＬＣ（Ｃ，８シリ力ゲル担
体）および−次元ホモクロマトグラフィーで単一である
ことにより純度を確認した。
℃、３０分間保った後溶媒を留去し、残渣を水と酢酸エ
チルに溶解した。水層を濃縮した後、イオン交換クロマ
トグラフィーにかけた。イオン交換体はＤＥＡＥ−ＴＯ
ＶＯｐｅａｒｌ ６５Ｏ３（商標）を用いた。これをカ
ラム（０，７Ｘ２１ｃｍ）につめ７Ｈ尿素、２０ｍＭ
）リスー塩酸綬衡液（ｐＨ７゜５）中、０．１〜０．３
Ｈの食塩濃度勾配で溶出した。紫外線吸収によりオリゴ
ヌクレオチドを検出し、中央部をとりセルロース膜を用
いて透析により脱塩し、１０．０＾２６０ユニツト（５
００μｇ）を得た。 ）ＩＰＬＣ（Ｃ，８シリ力ゲル担
体）および−次元ホモクロマトグラフィーで単一である
ことにより純度を確認した。
（２） ｄＧＡＧＧＡＡＣＧＣＧＧＡＡＣＧＡＡ（Ｌ、
）の合成ｕ１の場合と同様にして今度は５°−（４，
４−ジメトキシトリチル）アデノシン担体を用い、まず
５°−（４，４°−ジメトキシトリチル）グアニジル−
Ｐ−（ｏ−クロロフェニル）−トベンゾイルデオキシア
デニン−３°−（０−クロロフェニル）ホスフェートを
用いた他はｕｌの場合と同様に縮合を行った。
）の合成ｕ１の場合と同様にして今度は５°−（４，
４−ジメトキシトリチル）アデノシン担体を用い、まず
５°−（４，４°−ジメトキシトリチル）グアニジル−
Ｐ−（ｏ−クロロフェニル）−トベンゾイルデオキシア
デニン−３°−（０−クロロフェニル）ホスフェートを
用いた他はｕｌの場合と同様に縮合を行った。
さらに第１−２表中の塩基配列に従い保護基を有するジ
ヌクレオチドを用いてＵ、の場合と同様にしてＤＮＡ鎖
延長、脱保護基及び生成物の精製分離を行いＬｌ５−Ｏ
Ａ２６０ユニツト（２５０μｇ）を得た。
ヌクレオチドを用いてＵ、の場合と同様にしてＤＮＡ鎖
延長、脱保護基及び生成物の精製分離を行いＬｌ５−Ｏ
Ａ２６０ユニツト（２５０μｇ）を得た。
同様にしてｕ２、ｕ３、［２及び［３を構成するオリゴ
ヌクレオチド（第１−１表及び第１−２表）を５’−（
４，４°−ジメトキシトリチル）−Ｎ−イソブチリルデ
オキシグアノシン担体、 ５’−（４，４’−ジメト
キシトリチル）−トベンゾイルデオキシアデノシン担体
を用い、第１−１表および第１−２表記載の塩基配列に
従い、各々保護基を有するジヌクレオチドを ｕｌ及び
Ｌｌの場合と同様にして３°末端側から５°側へ向って
順次縮合させ、脱保護基及び精製分離を行って調製した
。得られたオリゴヌクレオチドを第１−１表および第１
−２表に示す。
ヌクレオチド（第１−１表及び第１−２表）を５’−（
４，４°−ジメトキシトリチル）−Ｎ−イソブチリルデ
オキシグアノシン担体、 ５’−（４，４’−ジメト
キシトリチル）−トベンゾイルデオキシアデノシン担体
を用い、第１−１表および第１−２表記載の塩基配列に
従い、各々保護基を有するジヌクレオチドを ｕｌ及び
Ｌｌの場合と同様にして３°末端側から５°側へ向って
順次縮合させ、脱保護基及び精製分離を行って調製した
。得られたオリゴヌクレオチドを第１−１表および第１
−２表に示す。
第１−１表
１１１５°ＧＡＴＣＴＴＣＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴ ３゜
０２５°ＣＣＴＣＣＴＣＴＣＡＣＣＣＧＡ ３゜０３５
°ＴＣＴＣＣＣＡＣＣＧＴＧＧＣＧ ３゜第１−２表 Ｌｌ ５°ＧＡＧＧＡＡＣＧＣＧＧＡＡＣＧＡＡ ３゜
［２５°ＡＡＧＡＴＣＧＧＧＴＧＡＧＡＧ ３゜Ｌ３
５°ＡＡＴ丁ＣＧＣＣＡＣＧＧＴＧＧ ３’実施例２ ０ＨＡフラグメントエの合成 上述したオリゴヌクレオチドの合成で得られたオリゴヌ
クレオチドｕ 、ｕ 及びｕ３並びに［、［及び［３を
用いて次の反応を行い、合成ＤＮＡフラグメント■を得
た。
０２５°ＣＣＴＣＣＴＣＴＣＡＣＣＣＧＡ ３゜０３５
°ＴＣＴＣＣＣＡＣＣＧＴＧＧＣＧ ３゜第１−２表 Ｌｌ ５°ＧＡＧＧＡＡＣＧＣＧＧＡＡＣＧＡＡ ３゜
［２５°ＡＡＧＡＴＣＧＧＧＴＧＡＧＡＧ ３゜Ｌ３
５°ＡＡＴ丁ＣＧＣＣＡＣＧＧＴＧＧ ３’実施例２ ０ＨＡフラグメントエの合成 上述したオリゴヌクレオチドの合成で得られたオリゴヌ
クレオチドｕ 、ｕ 及びｕ３並びに［、［及び［３を
用いて次の反応を行い、合成ＤＮＡフラグメント■を得
た。
０．２５マイクロキユーリーの ［γ−３２ＰコＡＴＰ
（１，２ｘ１０ ｃｐｓ／ｕｌ） ｌｕｌ、各オリゴ
ヌクレオチドＯｎ ０．２ （Ａ２６ｏ）と、６ｕ／Ｉ
１１のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造株製造）
０．５μｍを２ｕｌのカイネーション績衝液［２５０ｍ
Ｍ ）リス−ＨＣｌ ＤＨ８，０１５０■ＨＭｏＣｌ２
１５０ ｍＭ ２−メルカプトエタノール／ ５ｉＭ
スペルミン］に溶解したものを混合し、３７℃２０分間
インキュベートした。それから２０ｉＨ＾ＴＰ Ｏ，０
２５ｕｌを加え、更に４５分間反応させた。更に２０鵬
Ｍ ＡＴＰ １ ｕｌを追加し４５分間反応させ１０ｍ
Ｍトリス−ＨＣｌ （ｐＨ８，０）および１ｍＨＥＤＴ
Ａを加え１０Ａ２６０ ”’とした。
（１，２ｘ１０ ｃｐｓ／ｕｌ） ｌｕｌ、各オリゴ
ヌクレオチドＯｎ ０．２ （Ａ２６ｏ）と、６ｕ／Ｉ
１１のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造株製造）
０．５μｍを２ｕｌのカイネーション績衝液［２５０ｍ
Ｍ ）リス−ＨＣｌ ＤＨ８，０１５０■ＨＭｏＣｌ２
１５０ ｍＭ ２−メルカプトエタノール／ ５ｉＭ
スペルミン］に溶解したものを混合し、３７℃２０分間
インキュベートした。それから２０ｉＨ＾ＴＰ Ｏ，０
２５ｕｌを加え、更に４５分間反応させた。更に２０鵬
Ｍ ＡＴＰ １ ｕｌを追加し４５分間反応させ１０ｍ
Ｍトリス−ＨＣｌ （ｐＨ８，０）および１ｍＨＥＤＴ
Ａを加え１０Ａ２６０ ”’とした。
これらの７ラグメントをアニールするため、反応混合物
をライゲーション緩衝液（３３０ＩＩＩＨトリス−ＨＣ
Ｉ ｐＨ７，６／３３ ｇｔＭ ＭｏＣｌ、、
／ ２．５−ＨＡＴＰ）５１１１中で７０℃２分間
加熱し、それからゆっくり室温まで冷却した０次に２−
メルカプトエタノール（２−ＥｔＳＨ０，２Ｍ ）
１．３ｕｌを加えた反応混合物を１３℃に冷却後、Ｔ、
ＤＮＡリガーゼ〈宝酒造株製３５０ ｕ／ｕｌ ）
２ｕｌを加え ２時間インキュベートした。
をライゲーション緩衝液（３３０ＩＩＩＨトリス−ＨＣ
Ｉ ｐＨ７，６／３３ ｇｔＭ ＭｏＣｌ、、
／ ２．５−ＨＡＴＰ）５１１１中で７０℃２分間
加熱し、それからゆっくり室温まで冷却した０次に２−
メルカプトエタノール（２−ＥｔＳＨ０，２Ｍ ）
１．３ｕｌを加えた反応混合物を１３℃に冷却後、Ｔ、
ＤＮＡリガーゼ〈宝酒造株製３５０ ｕ／ｕｌ ）
２ｕｌを加え ２時間インキュベートした。
その後、６５℃で５分間加熱して反応を停止させた。
生成したＤＮＡのフラグメントをフェノール処理後エタ
ノールを加えて沈澱させ遠心分離し、１０％アクリルア
ミドゲル電気泳動（１５０Ｖ／ ２．５時間）に付
し、その後ゲルから抽出し、エタノールにて沈澱後、遠
心分離して １０１Ｍトリス−ＨＣＩ（ｐＨ８，０＞
／ １μＨＥｆｌＴＡ溶液に溶解した。
ノールを加えて沈澱させ遠心分離し、１０％アクリルア
ミドゲル電気泳動（１５０Ｖ／ ２．５時間）に付
し、その後ゲルから抽出し、エタノールにて沈澱後、遠
心分離して １０１Ｍトリス−ＨＣＩ（ｐＨ８，０＞
／ １μＨＥｆｌＴＡ溶液に溶解した。
こうして下記フラグメント０．０５＾２６０ユニツト（
２，０Ｍｇ）を得た。
２，０Ｍｇ）を得た。
実施例３
組換プラスミド及び形質転換株の調製
プラスミドｐＮＦ−７（Ｅ、 ニアす／ｐＮＦ−７、微
工研菌寄第８１３２号から調製〉 ５μｇを標準緩衝液
６μｍに懸濁し、ム＋Ｉ ＩＩ １２ ｕ及び」並胆１
０ｕ を加え３１℃２時間消化した０反応液をフェノ
ール抽出した後、エタノール沈殿を行ってＤＮＡを回収
、５％アクリルアミドゲル電気泳動に付し、長い二重鎖
ＤＮＡ部分を抽出し、約３μｇの直鎖状二重ｇＤＮＡで
あるベクターＤＮＡ ｆＪＨＦ−７へ１ｇ４Ｎ−江靜Ｉ
を得た。
工研菌寄第８１３２号から調製〉 ５μｇを標準緩衝液
６μｍに懸濁し、ム＋Ｉ ＩＩ １２ ｕ及び」並胆１
０ｕ を加え３１℃２時間消化した０反応液をフェノ
ール抽出した後、エタノール沈殿を行ってＤＮＡを回収
、５％アクリルアミドゲル電気泳動に付し、長い二重鎖
ＤＮＡ部分を抽出し、約３μｇの直鎖状二重ｇＤＮＡで
あるベクターＤＮＡ ｆＪＨＦ−７へ１ｇ４Ｎ−江靜Ｉ
を得た。
得られたベクターＤＮＡ ０ＨＦ−７／ＬＬＬＩＩ−劇
鱈ｆ（０，５ｕ ｔ ／ ｕｌ ） ３ｕｌと、実施
例２で合成したＤＮ＾フラグメントＩ（Ｓ°末端にＢ＜
ＩＩ ＩＩサイトを有し、それにつづ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
−＾ｒｇのアミノ酸コドンの塩基配列を介しヒト神経成
長因子の遺伝子の一部及び末端はＥｃｏＲＩサイト）の
カイネーション混合液（０，３μｔ ／ ｐｌ ）を
３．１６二■２０８μｍを加え、ライゲーション緩衝液
ａｕ１０．２Ｍ ２−メルカプトエタノール１μｍ中で
Ｔ４−ＤＮＡリガ〜ゼ （３５０ｕ／ １１ ＞１ ｕ
ｌで２０℃・２０時間反応させた。
鱈ｆ（０，５ｕ ｔ ／ ｕｌ ） ３ｕｌと、実施
例２で合成したＤＮ＾フラグメントＩ（Ｓ°末端にＢ＜
ＩＩ ＩＩサイトを有し、それにつづ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
−＾ｒｇのアミノ酸コドンの塩基配列を介しヒト神経成
長因子の遺伝子の一部及び末端はＥｃｏＲＩサイト）の
カイネーション混合液（０，３μｔ ／ ｐｌ ）を
３．１６二■２０８μｍを加え、ライゲーション緩衝液
ａｕ１０．２Ｍ ２−メルカプトエタノール１μｍ中で
Ｔ４−ＤＮＡリガ〜ゼ （３５０ｕ／ １１ ＞１ ｕ
ｌで２０℃・２０時間反応させた。
フェノール処理後１反発液からエタノールで沈澱させＤ
ＮＡを回収後次の操作により形質転換およびスクリーニ
ングを行った。
ＮＡを回収後次の操作により形質転換およびスクリーニ
ングを行った。
組換プラスミドｐＮＦ−７１（１，５ｕ ｔｔ ／２０
ｕｌ濃度のもの） １０ｕ＋と大腸菌ＨＢ１０１を Ｌ
ｂｒｏｔｈ ５ｕｌで一晩培養し、更に１００．１で
あらためて培１ＩＯ１１５＾６６゜になったら３０分間
氷冷した。遠心分離後、沈殿物を５０ ＩＮ Ｃａ１ｌ
、、 ５０ｍ１に懸濁、６０分間水冷後、遠心し５０１
Ｎ ＣａＣ１，、−２０Ｘ ｇｌｙｃｅｒｏｌ １０
ａ＋Ｉに懸濁したカルシウム処理菌０．１ｕｌを混合、
０℃に保った。
ｕｌ濃度のもの） １０ｕ＋と大腸菌ＨＢ１０１を Ｌ
ｂｒｏｔｈ ５ｕｌで一晩培養し、更に１００．１で
あらためて培１ＩＯ１１５＾６６゜になったら３０分間
氷冷した。遠心分離後、沈殿物を５０ ＩＮ Ｃａ１ｌ
、、 ５０ｍ１に懸濁、６０分間水冷後、遠心し５０１
Ｎ ＣａＣ１，、−２０Ｘ ｇｌｙｃｅｒｏｌ １０
ａ＋Ｉに懸濁したカルシウム処理菌０．１ｕｌを混合、
０℃に保った。
４２℃に６０秒間加熱した後、室温に戻した。
Ｌ−ｂｒｏｔｈ （Ｂａｃｔｏ −Ｔｒｙｐｔｏｎｅ
−１、、ＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ Ｏ，５ｇ 、 Ｎ
ａＣｌ ０．５ｇ 、 Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｏｉ ｇを水
１００ ｍｌで溶解 ｐＨ７，２に調製し−たもの）１
ｕｌを加えて３７℃・３０〜６０分オンキュベートした
６次に１３、ＯＯＯｒｇｍで５分間遠心し、上滑をすて
た後、沈澱をＬ−ｂｒｏｔｈ Ｏ，３ａ＋ｌに懸濁させ
た。０．１ｕｌずつ寒天培地（ＢａＣｔＯ・ＴＩ’ＶＤ
ｔＯｎｅ １ｔ 、 ｙｅａｓｔ ＥＸｔｒａＣｔＯ，
５ｇ 、 ＮａＣｌ Ｇ、５ｇ 、 Ｇｌｕｃｏｓｅ
Ｏ，１ｇに寒天１．５ｇとアンピシリン３弯を加えたも
の〉 ３枚に広げ各コロニーより得られたプラスミド画
分の制限酵素開裂地図が予定したｐＮＦ−ＴＩのそれと
一致するコロニーを選択しな。
−１、、ＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ Ｏ，５ｇ 、 Ｎ
ａＣｌ ０．５ｇ 、 Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｏｉ ｇを水
１００ ｍｌで溶解 ｐＨ７，２に調製し−たもの）１
ｕｌを加えて３７℃・３０〜６０分オンキュベートした
６次に１３、ＯＯＯｒｇｍで５分間遠心し、上滑をすて
た後、沈澱をＬ−ｂｒｏｔｈ Ｏ，３ａ＋ｌに懸濁させ
た。０．１ｕｌずつ寒天培地（ＢａＣｔＯ・ＴＩ’ＶＤ
ｔＯｎｅ １ｔ 、 ｙｅａｓｔ ＥＸｔｒａＣｔＯ，
５ｇ 、 ＮａＣｌ Ｇ、５ｇ 、 Ｇｌｕｃｏｓｅ
Ｏ，１ｇに寒天１．５ｇとアンピシリン３弯を加えたも
の〉 ３枚に広げ各コロニーより得られたプラスミド画
分の制限酵素開裂地図が予定したｐＮＦ−ＴＩのそれと
一致するコロニーを選択しな。
寒天培地で増した菌を５ＴＥＴ ｂｕｆｆｅｒ（８Ｘ
５ｕｃｒｏｓｅ。
５ｕｃｒｏｓｅ。
５０ｓＨＴｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ８，ｏ）、 ５
０ｓＨＥＤＴＡ 、 ５＄ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
）に懸濁させた。リゾチーム（１０■／１ｍ１Ｇ、２５
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ８，ｏ）） ２０ｕｌを
加えて沸騰水中で６０秒間加熱した後、１３．０ＯＯｒ
ｐ鵬で１０分間遠心した。
０ｓＨＥＤＴＡ 、 ５＄ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
）に懸濁させた。リゾチーム（１０■／１ｍ１Ｇ、２５
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ８，ｏ）） ２０ｕｌを
加えて沸騰水中で６０秒間加熱した後、１３．０ＯＯｒ
ｐ鵬で１０分間遠心した。
上清にｌ５Ｏ９ｒＯＱａｎＯＩ Ｏ，５ｍｌを加えて一
２０℃に３０分間放置、１３．ＧＯＯｒＤ−で１０分間
遠心した後、沈澱をＩＥ＆！衡液５０μｍに溶解し、１
ｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ ８ｏｕｔを加えて一２０℃に３
０分間放置、１３． ｏｏｏｒｐ■で １ｏ分間遠心し
た後、沈澱を乾燥させた。
２０℃に３０分間放置、１３．ＧＯＯｒＤ−で１０分間
遠心した後、沈澱をＩＥ＆！衡液５０μｍに溶解し、１
ｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ ８ｏｕｔを加えて一２０℃に３
０分間放置、１３． ｏｏｏｒｐ■で １ｏ分間遠心し
た後、沈澱を乾燥させた。
沈殿をＨ２０２０，６ｕｌに溶解し、ｂｕｆｆｅｒ ６
Ｉ１１．５８ＮａＣＩ ０．９ｕｌ、Ｂａｔ ＩＩ（８
０／ｕｌ） １ｕ１．Ｓａｌ Ｉ （８Ｕ／μＩ）
１．５ｕｌを加えて３７℃で９０分間反応させた。
Ｉ１１．５８ＮａＣＩ ０．９ｕｌ、Ｂａｔ ＩＩ（８
０／ｕｌ） １ｕ１．Ｓａｌ Ｉ （８Ｕ／μＩ）
１．５ｕｌを加えて３７℃で９０分間反応させた。
次にＲＮａＳｅ −Ａ （１０■／ ａ＋ｌ ）
０．２ｕｌを加え３１℃、３０分間反応させた。
０．２ｕｌを加え３１℃、３０分間反応させた。
得られた液をフェノール処理し、エタノール沈澱後５％
ＰＡＧＥにて電気泳動に付し、β−ＮＧＦ遺伝子セグメ
ントを含む目的のＤＮＡを大量に得た。
ＰＡＧＥにて電気泳動に付し、β−ＮＧＦ遺伝子セグメ
ントを含む目的のＤＮＡを大量に得た。
実施例５ （発現）
実施例４で得られたＥ コリ／ ｐＮＦ−Ｔ１を下に示
す培地５ｍｌで一晩培養した。
す培地５ｍｌで一晩培養した。
Ｈａ２ＨＰ０４０．５５ ｇ
にＨ２ＰＯ４０，２ｇ
Ｈａ ０．５ ｇ
ＮＨ４０，１ｆ
ｃａｓａｓｉｎｏ ａｃｉｄ ０．２ｇ（１＋ｕ
ｃｏｓｅ ｏ、 ４ ｇＭａＳ０４０
．、 ＋＋ｕｏｌ ＣａＣ１２０，０１ｆｆ１ｌｏ＋ ｔｈｉａｍｉｎｅ−ＨＣＩ １ Ｎａ１ｐｉ
ｃｉｌｌｉｎ ２ Ｋ次（： 上７
ｆ’ｒ ラｔＬ ｆｓ ’Ｒ養Ｈ１００ｕｌ ヲＭ
ｇＣＩ ２−０ 、２ Ｘｃａｓａｍｔｎｏ ａｃｉｄ
−０，４％ Ｇｌｕｃｏｓｅ−＾ｍｐｉｌｌｉｎ （
２０μｔ ／ ｍｌ ）−チアミン（１０Ｈｇ／ｍｌ）
の培地５ｍｌで培養、 １時間後３−ｉｎｄｏｌａｃｒ
ｙｔｉｃ ａｃｉｄ （１０ｑ／１ｍ１エタノール）
２０ｕｌを加え２４時間培養した。
ｃｏｓｅ ｏ、 ４ ｇＭａＳ０４０
．、 ＋＋ｕｏｌ ＣａＣ１２０，０１ｆｆ１ｌｏ＋ ｔｈｉａｍｉｎｅ−ＨＣＩ １ Ｎａ１ｐｉ
ｃｉｌｌｉｎ ２ Ｋ次（： 上７
ｆ’ｒ ラｔＬ ｆｓ ’Ｒ養Ｈ１００ｕｌ ヲＭ
ｇＣＩ ２−０ 、２ Ｘｃａｓａｍｔｎｏ ａｃｉｄ
−０，４％ Ｇｌｕｃｏｓｅ−＾ｍｐｉｌｌｉｎ （
２０μｔ ／ ｍｌ ）−チアミン（１０Ｈｇ／ｍｌ）
の培地５ｍｌで培養、 １時間後３−ｉｎｄｏｌａｃｒ
ｙｔｉｃ ａｃｉｄ （１０ｑ／１ｍ１エタノール）
２０ｕｌを加え２４時間培養した。
培養終了後、遠心分離機で１３．ＯＯＯｒｐｍ ５分
間遠心し、菌体を集めた。
間遠心し、菌体を集めた。
その一部をＳａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ ６２．５ｍｌ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ６，８） 、 ２％
ＳＤＳ ５ｓＨＥＤＴＡ、 １０％ ０１ｙＣｅｒ
Ｏ１。
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ６，８） 、 ２％
ＳＤＳ ５ｓＨＥＤＴＡ、 １０％ ０１ｙＣｅｒ
Ｏ１。
３５ ＩＮ ２−＋１ｅｒＣａＤｔＯｅｔｈａｎＯＩ
、 ０．００１％ＢＰＲ−に懸濁、沸騰水中で５分間加
熱した後、遠心分離し、その上清について、０．１％５
Ｏ３−１５％ＰＡＧＥで電気法動を行い分子量３．０ｘ
ｌＯのものが得られた。
、 ０．００１％ＢＰＲ−に懸濁、沸騰水中で５分間加
熱した後、遠心分離し、その上清について、０．１％５
Ｏ３−１５％ＰＡＧＥで電気法動を行い分子量３．０ｘ
ｌＯのものが得られた。
このパターンをデンシトメーターでスキャンニングを行
い、生成量を計算した。その結果全タンパクの１５％の
ｈＧＨ−β−ＮＧＦ融合蛋白質の生成を認めた。
い、生成量を計算した。その結果全タンパクの１５％の
ｈＧＨ−β−ＮＧＦ融合蛋白質の生成を認めた。
実施例６
トロンビンによる融合タンパク質からのＮＧＦの切断
５１の８９−ｃａｓ ｍｅｄｉｕｍ中Ｅ コリ／ＤＮＦ
−ＴＩをＩＡＡで誘導したｔ１１１２時間培養し、集菌
し、約１０ｔ（湿重量）を得た。これを超音波破砕し、
１０．Ｇｏ。
−ＴＩをＩＡＡで誘導したｔ１１１２時間培養し、集菌
し、約１０ｔ（湿重量）を得た。これを超音波破砕し、
１０．Ｇｏ。
ｒｐｍ、 １５分４℃で遠心し沈澱を得た。これを７８
尿素−１０＊ＨＴｒｉｓ −ＨＣＩ（ｌ１８７．５）−
２０ｍＨメルカプトエタノール溶液５０ｍ１に溶解し、
１０．ＧＯＯｒｐｍ、 １５分４℃で遠心して沈澱を除
き、上清を同溶液にて１００ ｍｌとし、同溶液にて平
衡化したＤＥＡＥ−セルロース（φ２．８Ｘ１５ａａ＞
のカラムにかけ０から１３Ｈの食塩（全量１？ｚ）によ
る直線濃度勾配法により蛋白質を溶出し約７ｍｌずつ分
画し、各フラクションを５Ｏ３−１２，５Ｘ ＰＡＧＥ
により目的物を検出し、水に対して透析して約１２■の
融合蛋白質をえた。この約８０μａを１００ｍＨＴｒｉ
ｓ−ｔｌｃＩ（ｐＨ８，０）中トロンビン１μｇにより
３７℃１．５時間加水分解し分解物をアクリルアミド電
気泳動に付し、ヒトβ−ＮＧＦと推定される分子量１３
．０００の分画を得た。
尿素−１０＊ＨＴｒｉｓ −ＨＣＩ（ｌ１８７．５）−
２０ｍＨメルカプトエタノール溶液５０ｍ１に溶解し、
１０．ＧＯＯｒｐｍ、 １５分４℃で遠心して沈澱を除
き、上清を同溶液にて１００ ｍｌとし、同溶液にて平
衡化したＤＥＡＥ−セルロース（φ２．８Ｘ１５ａａ＞
のカラムにかけ０から１３Ｈの食塩（全量１？ｚ）によ
る直線濃度勾配法により蛋白質を溶出し約７ｍｌずつ分
画し、各フラクションを５Ｏ３−１２，５Ｘ ＰＡＧＥ
により目的物を検出し、水に対して透析して約１２■の
融合蛋白質をえた。この約８０μａを１００ｍＨＴｒｉ
ｓ−ｔｌｃＩ（ｐＨ８，０）中トロンビン１μｇにより
３７℃１．５時間加水分解し分解物をアクリルアミド電
気泳動に付し、ヒトβ−ＮＧＦと推定される分子量１３
．０００の分画を得た。
また加水分解物はラットフェオクロモサイトーマｐｃ１
２細胞を用いたＮＧＦ活性測定法で活性が認められた。
２細胞を用いたＮＧＦ活性測定法で活性が認められた。
（発明の効果）
本発明のβ−ＮＧＦ遺伝子セグメントは大腸菌中できわ
めて発現され易く、しがもその調製は容易である。
めて発現され易く、しがもその調製は容易である。
本発明の組み換えプラスミドはこのβ−ＮＧＦ遺伝子セ
グメントを効率よく増幅し、かつ適当な発現系を導入す
ることにより、このプラスミドによって形質転換された
微生物にβ−ＮＧＦ融合タンパク質の産生能を付与でき
る。
グメントを効率よく増幅し、かつ適当な発現系を導入す
ることにより、このプラスミドによって形質転換された
微生物にβ−ＮＧＦ融合タンパク質の産生能を付与でき
る。
また本発明により天然からは得ることの出来ないヒトβ
−ＮＧＦを効率よく大量に製造することができるように
なり、その医薬としての利用の道が開かれた０本発明に
より大量に得られたヒト神経成長因子を用いｔ＝老人性
痴呆を初め各種の神経性疾患の治療など今後の研究に期
待が持たれる。
−ＮＧＦを効率よく大量に製造することができるように
なり、その医薬としての利用の道が開かれた０本発明に
より大量に得られたヒト神経成長因子を用いｔ＝老人性
痴呆を初め各種の神経性疾患の治療など今後の研究に期
待が持たれる。
参考例
本発明の原料となるプラスミドｐＮＦ−７は、特開昭６
１−２０５４８５号明細書中に記載された通り、以下の
ようにして調整した。
１−２０５４８５号明細書中に記載された通り、以下の
ようにして調整した。
［オリゴヌクレオチドの合成］
（１１ｄＧＡＴＣＴＴＣＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＴＣ
ＣＴＣＣ（ｔｌｌ−１１〕合成５°−（４，４−ジメト
キシトリチル）−トベンゾイルデオキシシチジン担体（
１００μｍｏｌ／ｒ前記ポリスチレン樹脂 ５０■）を
ピリジン中−夜室温で放１し次のような操作により縮合
反応を行った。
ＣＴＣＣ（ｔｌｌ−１１〕合成５°−（４，４−ジメト
キシトリチル）−トベンゾイルデオキシシチジン担体（
１００μｍｏｌ／ｒ前記ポリスチレン樹脂 ５０■）を
ピリジン中−夜室温で放１し次のような操作により縮合
反応を行った。
（操作）
１）ジクロロメタン−メタノール（７：３ 、Ｖ／Ｖ
）２ｍｌにより３回洗浄。
）２ｍｌにより３回洗浄。
２）２χベンゼンスルホン酸溶液（溶媒ジクロロメタン
−メチルアルコール、７：３）２ｍｌで２分間処理した
後、同じ混合溶媒で３回洗浄する操作を繰返して発色の
なくなることを確かめた。
−メチルアルコール、７：３）２ｍｌで２分間処理した
後、同じ混合溶媒で３回洗浄する操作を繰返して発色の
なくなることを確かめた。
３）ピリジン２ｍｌにより３回洗浄。
４）５°−（４，４°−ジメトキシトリチル）チミジリ
ル−Ｐ（ｏ−クロロフェニル）−トベンゾイルデオキシ
シトシン３゛（０−クロロフェニル）ホスフェートのピ
リジン溶液（９，２ｍｌ、同ヌクレオチド ２０■を含
む）を加え溶媒を減圧留去した。
ル−Ｐ（ｏ−クロロフェニル）−トベンゾイルデオキシ
シトシン３゛（０−クロロフェニル）ホスフェートのピ
リジン溶液（９，２ｍｌ、同ヌクレオチド ２０■を含
む）を加え溶媒を減圧留去した。
５）縮合剤、メシチレンスルホニル−３−ニトロトリア
ゾリド（２０■）のピリジン溶液（０，２ｍ１）を加え
４０℃、２０分間放置した。
ゾリド（２０■）のピリジン溶液（０，２ｍ１）を加え
４０℃、２０分間放置した。
６）ピリジン２ｍｌにより２回洗浄。
７） ０．１Ｍジメチルアミノピリジンのピリジン溶液
（１，８ｍ１）及び無水酢酸（０，２ｍ１）を加え３分
間放置した。
（１，８ｍ１）及び無水酢酸（０，２ｍ１）を加え３分
間放置した。
８）ピリジン２ｍｌにより３回洗浄、続いて上記２）以
降の操作を５°−（４，４°−ジメトキシトリチル）チ
ミジリルーＰ−（ｏ−クロロフェニル）−トベンゾイル
デオキシシトシン−３−（０−クロロフェニル）ホスフ
ェートに変えて５°−（４，４−ジメトキシトリチル）
−トベンゾイルデオキシシリシリルーｐ−（０−クロロ
フェニル）デオキシシトシン−３’−（ｏ−クロロフェ
ニル）ホスフェートを用いて行い、さらに同様の保護基
を有するｄＴＴ、 ｄＣＧ、 ｄＧＴ、 ｄＡＧ、 ｄ
ＧＡ。
降の操作を５°−（４，４°−ジメトキシトリチル）チ
ミジリルーＰ−（ｏ−クロロフェニル）−トベンゾイル
デオキシシトシン−３−（０−クロロフェニル）ホスフ
ェートに変えて５°−（４，４−ジメトキシトリチル）
−トベンゾイルデオキシシリシリルーｐ−（０−クロロ
フェニル）デオキシシトシン−３’−（ｏ−クロロフェ
ニル）ホスフェートを用いて行い、さらに同様の保護基
を有するｄＴＴ、 ｄＣＧ、 ｄＧＴ、 ｄＡＧ、 ｄ
ＧＡ。
ｄＴＣ，ｄＣＡ、 ｄＴＴ、 ｄＴＣ及びｄＣＡを用い
て順次５゛方向へＤＭＡ鎖を延長した後、樹脂を０．５
Ｍ）リメチルグアニジウムーピリジン−２−アルドオキ
シメート［Ｃ，Ｂ、 Ｒｅｅｖｅ ｅｔ ａｌ、
、 丁ｅｔｒａ−ｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ、、
２７２７ （１９７８） ］の］ジオキサンー水９：１
）の溶液（１ｍｌ）中３８時時間上うした。樹脂を５
０駕ピリジン水により洗浄し液と洗液を合せて減圧濃縮
し、残渣に濃アンモニア水（１５ｍｌ）を加え密栓して
５５℃で５時間加温した。アンモニアを留去し、ピリジ
ニウム型強酸性陽イオン交換樹脂（ｄｏｗｅｘ ５０゜
商標）２ｍｌを加え、樹脂を５０％ピリジン水により洗
浄し、液と洗液を合せて濃縮した。濃縮液に少量の水を
加え酢酸エチルでオキシムを抽出して除いた。水層を水
で希釈し、その一部を分取してジメトキシトリチル基の
定量を行い全体の量を推定した。 ジメトキシトリチル
基の分子吸光係数を７１．７００とすると７７．４ Ａ
２５４ユニツトから １μｓｏｌの粗オリゴヌクレオチ
ドが合成されたことがわかった。
て順次５゛方向へＤＭＡ鎖を延長した後、樹脂を０．５
Ｍ）リメチルグアニジウムーピリジン−２−アルドオキ
シメート［Ｃ，Ｂ、 Ｒｅｅｖｅ ｅｔ ａｌ、
、 丁ｅｔｒａ−ｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ、、
２７２７ （１９７８） ］の］ジオキサンー水９：１
）の溶液（１ｍｌ）中３８時時間上うした。樹脂を５
０駕ピリジン水により洗浄し液と洗液を合せて減圧濃縮
し、残渣に濃アンモニア水（１５ｍｌ）を加え密栓して
５５℃で５時間加温した。アンモニアを留去し、ピリジ
ニウム型強酸性陽イオン交換樹脂（ｄｏｗｅｘ ５０゜
商標）２ｍｌを加え、樹脂を５０％ピリジン水により洗
浄し、液と洗液を合せて濃縮した。濃縮液に少量の水を
加え酢酸エチルでオキシムを抽出して除いた。水層を水
で希釈し、その一部を分取してジメトキシトリチル基の
定量を行い全体の量を推定した。 ジメトキシトリチル
基の分子吸光係数を７１．７００とすると７７．４ Ａ
２５４ユニツトから １μｓｏｌの粗オリゴヌクレオチ
ドが合成されたことがわかった。
水層を減圧乾固し残渣に８０％酢酸１０ｍ１を加え２５
℃、３０分間保った後溶媒を留去し、残渣を水と酢酸エ
チルに溶解した。水層を濃縮した後、イオン交換クロマ
トグラフィーにかけた。イオン交換体はＤＥＡＥ−丁ｏ
ｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｓ （商標）を用いた。これ
をカラム＜ ０．７ｘ２１ｃｍ）につめ７Ｈ尿素、２０
＋＋８ トリス−塩酸綬衡液（ｐＨ７，５＞中、０．１
〜０．３Ｍの食塩濃度勾配で溶出した。紫外線吸収によ
りオリゴヌクレオチドを検出し、中央部をとりセルロー
ス膜を用いて透析により脱塩し、１２．３ Ａ２６゜ユ
ニット（６００μｇ）を得た。 ＨＰＬＣ（Ｃ，８
シリ力ゲル担体）および−次元ホモクロマトグラフィー
で単一であることにより純度を確認した。
℃、３０分間保った後溶媒を留去し、残渣を水と酢酸エ
チルに溶解した。水層を濃縮した後、イオン交換クロマ
トグラフィーにかけた。イオン交換体はＤＥＡＥ−丁ｏ
ｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｓ （商標）を用いた。これ
をカラム＜ ０．７ｘ２１ｃｍ）につめ７Ｈ尿素、２０
＋＋８ トリス−塩酸綬衡液（ｐＨ７，５＞中、０．１
〜０．３Ｍの食塩濃度勾配で溶出した。紫外線吸収によ
りオリゴヌクレオチドを検出し、中央部をとりセルロー
ス膜を用いて透析により脱塩し、１２．３ Ａ２６゜ユ
ニット（６００μｇ）を得た。 ＨＰＬＣ（Ｃ，８
シリ力ゲル担体）および−次元ホモクロマトグラフィー
で単一であることにより純度を確認した。
（２） ｄＧＴＧＡＧＡＧＧＡＧＧ＾＾ＣＧＡＣＣＴＴ
ＣＧＡＴＧＡＡ（Ｌｌ、 ）の合成 ｕｌ−１の場合と同様にして５°畳４．４−ジメトキシ
トリチル）アデノシン担体を用い、まず５°−（４，４
−ジメトキシトリチル）グアニジル−Ｐ−（０−クロロ
フェニル）−に−ベンゾイルデオキシアデニン−３°−
（０−クロロフェニル）ホスフェートを用いた他はυ１
−１の場合と同様に縮合を行った。
ＣＧＡＴＧＡＡ（Ｌｌ、 ）の合成 ｕｌ−１の場合と同様にして５°畳４．４−ジメトキシ
トリチル）アデノシン担体を用い、まず５°−（４，４
−ジメトキシトリチル）グアニジル−Ｐ−（０−クロロ
フェニル）−に−ベンゾイルデオキシアデニン−３°−
（０−クロロフェニル）ホスフェートを用いた他はυ１
−１の場合と同様に縮合を行った。
さらに第１−２表中下線で示した単位で保護基を有する
ジヌクレオチドを用いてｕｌ−１の場合と同様にしてＤ
ＮＡ鎖延長、脱保護基及び生成物の精製分離を行い［５
，６＾２６Ｇユニツト（２８０μｇ）を得た。
ジヌクレオチドを用いてｕｌ−１の場合と同様にしてＤ
ＮＡ鎖延長、脱保護基及び生成物の精製分離を行い［５
，６＾２６Ｇユニツト（２８０μｇ）を得た。
同様にしてｕ 、ｕ ・・・・・・’１−２３及び
り、−２１Ｌ ・・・・・・’１−２３を構成する
オリゴヌクレオチド（第２−１表及び第２−２表）を５
°−（４，４°−ジメトキシトリチル）−トイツブチリ
ルデオキシグアノシン担体、５°−（４，４°−ジメト
キシトリチル）−Ｎ−ベンゾイルデオキシアデノシン担
体、５゛−（４，４−ジメトキシトリチル）−トベンゾ
イルデオキシシチジン担体及び５°−（−４，４°−ジ
メトキシトリチル）チミジン担体を用い、第２−１表及
び第２−２表の塩基配列に従って、各々保護基を有する
モノ−またはジヌクレオチドをＵ 及びＬｌ−１の場
合と同様にして３°末端側から５°側へ向って順次縮合
させ、脱保護基及び精製分離を行って調製した。得られ
たオリゴヌクレオチドを第２−１表および第２−２表に
示す。
り、−２１Ｌ ・・・・・・’１−２３を構成する
オリゴヌクレオチド（第２−１表及び第２−２表）を５
°−（４，４°−ジメトキシトリチル）−トイツブチリ
ルデオキシグアノシン担体、５°−（４，４°−ジメト
キシトリチル）−Ｎ−ベンゾイルデオキシアデノシン担
体、５゛−（４，４−ジメトキシトリチル）−トベンゾ
イルデオキシシチジン担体及び５°−（−４，４°−ジ
メトキシトリチル）チミジン担体を用い、第２−１表及
び第２−２表の塩基配列に従って、各々保護基を有する
モノ−またはジヌクレオチドをＵ 及びＬｌ−１の場
合と同様にして３°末端側から５°側へ向って順次縮合
させ、脱保護基及び精製分離を行って調製した。得られ
たオリゴヌクレオチドを第２−１表および第２−２表に
示す。
ロ → ロ ＋ ロ ｅ５ ロ ←
←丘 −、。 、 い 。 、 ｏ 。
←丘 −、。 、 い 。 、 ｏ 。
コ コ コ コ コ コ コ コ ＝
υ１−１９ ５°ＡＴＧＧＴＡＡＡＣＡＧＧＣＡＧＣＴ
３゜０１−２０ ５°ＴＧＧＣＧＴＴＴＣＡＴＣＣＧ
ＣＡＴ ”１１−２１ ”ＣＧＡＣＡＣＣＧＣＴＴＧ
ＣＧＴＡＴ ３゜１１−２２ ５°ＧＴＧＴＴＣＴＧＴ
ＣＴＣＧＴＡＡＧ ３°及ヒ０１−２３ ５°ＧＣＴＧ
ＴＴＣＧＴＴＡＡＴＡＧ ３゜昧 Ｑ ４ Ｑ
Ｑ ”−１”３ Ｗ −Ｑ−）ＩＪ’）
ｕ’） ｌ／ｌ−１ｕ１ リ） １
１ μ） −１ｅｌ ！−ｅｌｌＪ
ｅ’＞ 嘴才 −１ＣＤ
Ｎ ６ＱＬｌ−１９５°ＧＡＡＡＣＧＣＣＡＡＧＣ
ＴＧＣＣＴ ３″Ｌ１−２０ ５°ＧＧＴＧＴＣＧＡ
ＴＧＣＧＧＡＴ ”１１−２１ ”ＡＧＡＡＣＡＣＡ
ＴＡＣＧＣＡＡＧＣ３゜Ｌｉ−２２”°ＧＡＡＣＡＧＣ
ＣＴＴＡＣＧＡＧＡＣ３° 及びし１−２３ ”Ｔ
ＣＧＡＣＴＡＴＴＡＡＣ”［合成神経成長因子遺伝子フ
ラグメントＩ 、ＩＩ、ＩＩＩ 、ＩＶ及びＶ ）合成
コ （１）合成神経成長遺伝子フラグメント■の合成上述し
たオリゴヌクレオチドの合成で得られたオリゴヌクレオ
チドＵ 、Ｕ 及びＵ３並びにＬ 、Ｌ 及び
Ｌ３を用いて次の反応を行い、合成神経成長因子遺伝子
フラグメントＩを得た。
υ１−１９ ５°ＡＴＧＧＴＡＡＡＣＡＧＧＣＡＧＣＴ
３゜０１−２０ ５°ＴＧＧＣＧＴＴＴＣＡＴＣＣＧ
ＣＡＴ ”１１−２１ ”ＣＧＡＣＡＣＣＧＣＴＴＧ
ＣＧＴＡＴ ３゜１１−２２ ５°ＧＴＧＴＴＣＴＧＴ
ＣＴＣＧＴＡＡＧ ３°及ヒ０１−２３ ５°ＧＣＴＧ
ＴＴＣＧＴＴＡＡＴＡＧ ３゜昧 Ｑ ４ Ｑ
Ｑ ”−１”３ Ｗ −Ｑ−）ＩＪ’）
ｕ’） ｌ／ｌ−１ｕ１ リ） １
１ μ） −１ｅｌ ！−ｅｌｌＪ
ｅ’＞ 嘴才 −１ＣＤ
Ｎ ６ＱＬｌ−１９５°ＧＡＡＡＣＧＣＣＡＡＧＣ
ＴＧＣＣＴ ３″Ｌ１−２０ ５°ＧＧＴＧＴＣＧＡ
ＴＧＣＧＧＡＴ ”１１−２１ ”ＡＧＡＡＣＡＣＡ
ＴＡＣＧＣＡＡＧＣ３゜Ｌｉ−２２”°ＧＡＡＣＡＧＣ
ＣＴＴＡＣＧＡＧＡＣ３° 及びし１−２３ ”Ｔ
ＣＧＡＣＴＡＴＴＡＡＣ”［合成神経成長因子遺伝子フ
ラグメントＩ 、ＩＩ、ＩＩＩ 、ＩＶ及びＶ ）合成
コ （１）合成神経成長遺伝子フラグメント■の合成上述し
たオリゴヌクレオチドの合成で得られたオリゴヌクレオ
チドＵ 、Ｕ 及びＵ３並びにＬ 、Ｌ 及び
Ｌ３を用いて次の反応を行い、合成神経成長因子遺伝子
フラグメントＩを得た。
０２５マイクロキユーリーの ［γ−３２Ｐ ］ ＡＴ
Ｐ（１，２Ｘ１０ Ｃ１ｌ■／ｕｌ） １ｕｌ、各オ
リゴヌクレオチド０００２（Ａ２６ｏ）と、６ｕ／ｕｌ
のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造株製造）０５
ｕ１を２μｍのカイネーション絹衝液［２５０５Ｍトリ
ス−ＨＣｌ Ｄ）＋ ８．０１５０ ｍＨＮｏＣｌ２
１５０ ｍＨ２−メルカプトエタノール１５−Ｍスペ
ルミン］に溶解したものを混合し、３７℃２０＋間イン
キエベートした。それから八ＴＰ ２０ｉＮの０．０
２５ｕｌを加え、更に４５分間反応させた。更に２０層
ＨＡＴＰ １．＋を追加し４５分間反応させ１０ｉＮ
トリス−ＨＣｌ （ｐ）ｌ ８．０＞およびＩｇＮ
ＥＤＴ＾を加え１０＾２６０”’としな。
Ｐ（１，２Ｘ１０ Ｃ１ｌ■／ｕｌ） １ｕｌ、各オ
リゴヌクレオチド０００２（Ａ２６ｏ）と、６ｕ／ｕｌ
のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造株製造）０５
ｕ１を２μｍのカイネーション絹衝液［２５０５Ｍトリ
ス−ＨＣｌ Ｄ）＋ ８．０１５０ ｍＨＮｏＣｌ２
１５０ ｍＨ２−メルカプトエタノール１５−Ｍスペ
ルミン］に溶解したものを混合し、３７℃２０＋間イン
キエベートした。それから八ＴＰ ２０ｉＮの０．０
２５ｕｌを加え、更に４５分間反応させた。更に２０層
ＨＡＴＰ １．＋を追加し４５分間反応させ１０ｉＮ
トリス−ＨＣｌ （ｐ）ｌ ８．０＞およびＩｇＮ
ＥＤＴ＾を加え１０＾２６０”’としな。
これらの７ラグメントをアニールするため、反応混合物
をライゲーションＭ衝液（３３０ＩＩＭトリスーＩ（Ｃ
Ｉ ＯＨ？、 ６ ／ ３３１Ｎ ＮＱＣ＋２ ／ ２
−５１８ ＡＴＰ ） ５ ｕｌ中で７０℃２分間加熱
し、それからゆっくり室温まで冷却しな０次に２−メル
カプトエタノール（２−ＥｔＳＨ０，２Ｎ ） １．
３μｍを加えた反応混合物を１３℃に冷却後、Ｔ４ＤＭ
Ａリガーゼ（宝酒造株製３５０υ／ｕｌ＞２１１１を加
え２時間インキュベートした。その後、６５℃で５分間
加熱して反応を停止させた。生成したＯＨ＾のフラグメ
ントをフェノール処理後エタノールを加えて沈澱させ遠
心分離し、１０％アクリルアミドゲル電気泳動（１５０
Ｖ／ ２．５時間〉に付し、その後ゲルから抽出し
、エタノールにて沈ｍｔ＊、遠心分離して １０１Ｍト
リス−ＨＣｌ （ｐ）１８．０ ）／１μＨＥＤＴ＾溶
液に溶解した。各０．０５ Ａ２６ｏユニツト（２，０
μｇ＞。
をライゲーションＭ衝液（３３０ＩＩＭトリスーＩ（Ｃ
Ｉ ＯＨ？、 ６ ／ ３３１Ｎ ＮＱＣ＋２ ／ ２
−５１８ ＡＴＰ ） ５ ｕｌ中で７０℃２分間加熱
し、それからゆっくり室温まで冷却しな０次に２−メル
カプトエタノール（２−ＥｔＳＨ０，２Ｎ ） １．
３μｍを加えた反応混合物を１３℃に冷却後、Ｔ４ＤＭ
Ａリガーゼ（宝酒造株製３５０υ／ｕｌ＞２１１１を加
え２時間インキュベートした。その後、６５℃で５分間
加熱して反応を停止させた。生成したＯＨ＾のフラグメ
ントをフェノール処理後エタノールを加えて沈澱させ遠
心分離し、１０％アクリルアミドゲル電気泳動（１５０
Ｖ／ ２．５時間〉に付し、その後ゲルから抽出し
、エタノールにて沈ｍｔ＊、遠心分離して １０１Ｍト
リス−ＨＣｌ （ｐ）１８．０ ）／１μＨＥＤＴ＾溶
液に溶解した。各０．０５ Ａ２６ｏユニツト（２，０
μｇ＞。
こうして下記フラグメントを得た。
Ｃ丁■＾＾ＧＡＧＡＣＡＡＡＣ
同様４：Ｌｌｌ−４〜０１−８及びＬｌ−４〜Ｌ１−８
カらフラグメント■を、ｔｌｌ−９〜０１−２３ 及び
Ｌｌ−９〜０１−２３ カらフラグメント■を、１１１
−１４〜Ｕｌ−１８及び［１−１４〜Ｌ１−１８カら−
ｙ−ｙグメント■を、０１−１９〜０１−２３及び１１
−１９〜Ｌ１−２３からフラグメント■を、得た。
カらフラグメント■を、ｔｌｌ−９〜０１−２３ 及び
Ｌｌ−９〜０１−２３ カらフラグメント■を、１１１
−１４〜Ｕｌ−１８及び［１−１４〜Ｌ１−１８カら−
ｙ−ｙグメント■を、０１−１９〜０１−２３及び１１
−１９〜Ｌ１−２３からフラグメント■を、得た。
ＩＩ・
ＩＩＩ：
ＧＧＣＴＴＧＧＧＣＣＡＡＣＴＧＡＧＡＣ５°ＧＡＣＴ
ＣＴＧＧＴＴＧＴＣＧＴＧＧＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＡ Ｉｖ： ＡＴＣＧＡＣＴＣＣＡＡＡＣＡＣＴＧＧＡＡＣＴＣＴＴ
ＡＣＴＧＣＴＡＧＣＴＧＡＧＧＴＴＴＧＴＧＡＣＣＴ丁
ＧＡＧＡＡＴＧＡＣＧＴＧＴＴＡＣＣＴＡＣＣＡＴＴＴ
Ｇ ５′ Ａ丁ＧＧＴＡＡＡＣＡＧＧＣＡＧＣＴＴＧＧＣＧ
ＴＴＣＣＧＴＣＧＡＡＣＣＧＣＡ Ｖ： ■丁ＣＡＴＣＣＧＣＡＴＣＧＡＣＡＣＣＧＣＴＴＧＣＧ
ＴＡＴＧＴＡＡＧＴＡＧＧＣＧＴＡＧＣＴＧＴＧＧＣＧ
ＡＡＣＧＣＡＴＡＣＡＧＴＴＣＴＧＴＣＴＣＧＴＡＡＧ
ＧＣＴＧＴＴＣＧ丁ＴＡＡＴＡＧ３゜ＣＡＡＧＡＣＡＧ
ＡＧＣＡＴＴＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡＡＴＴＡＴＣＡＧＣ
Ｔ［全合成神経成長因子遺伝子の合成］ 合成神経成長因子遺伝子フラグメント１、Ｉｆ、■１、
ＩＶおよびＶの合成の項で得られた各フラグメントの１
０１Ｈトリス−ＨＣｌ （ＥＩＨ８，０）／１１ＨＥＤ
Ｔ＾溶液からＴ４ ・ＤＮＡリガーゼを用い全合成神経
成長因子遺伝子を合成する。
ＣＴＧＧＴＴＧＴＣＧＴＧＧＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＡ Ｉｖ： ＡＴＣＧＡＣＴＣＣＡＡＡＣＡＣＴＧＧＡＡＣＴＣＴＴ
ＡＣＴＧＣＴＡＧＣＴＧＡＧＧＴＴＴＧＴＧＡＣＣＴ丁
ＧＡＧＡＡＴＧＡＣＧＴＧＴＴＡＣＣＴＡＣＣＡＴＴＴ
Ｇ ５′ Ａ丁ＧＧＴＡＡＡＣＡＧＧＣＡＧＣＴＴＧＧＣＧ
ＴＴＣＣＧＴＣＧＡＡＣＣＧＣＡ Ｖ： ■丁ＣＡＴＣＣＧＣＡＴＣＧＡＣＡＣＣＧＣＴＴＧＣＧ
ＴＡＴＧＴＡＡＧＴＡＧＧＣＧＴＡＧＣＴＧＴＧＧＣＧ
ＡＡＣＧＣＡＴＡＣＡＧＴＴＣＴＧＴＣＴＣＧＴＡＡＧ
ＧＣＴＧＴＴＣＧ丁ＴＡＡＴＡＧ３゜ＣＡＡＧＡＣＡＧ
ＡＧＣＡＴＴＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡＡＴＴＡＴＣＡＧＣ
Ｔ［全合成神経成長因子遺伝子の合成］ 合成神経成長因子遺伝子フラグメント１、Ｉｆ、■１、
ＩＶおよびＶの合成の項で得られた各フラグメントの１
０１Ｈトリス−ＨＣｌ （ＥＩＨ８，０）／１１ＨＥＤ
Ｔ＾溶液からＴ４ ・ＤＮＡリガーゼを用い全合成神経
成長因子遺伝子を合成する。
各フラグメントの１０１１Ｈトリス−Ｈｅｌ （ＤＮＡ
、 Ｏ）／１ｅＭＥＤＴＡ！ＢＲ（Ｉ ｔｒｉ １ ｕ
ｌ 、 ［夏〜ｖは各ｏ、ｓｕ＋） を水１１．８ｕ
ｌに希釈しライゲーション緩衝液４Ｉ１１中で７０℃、
２分間加熱し、それからゆっくり室温まで冷却した１次
に０．２８２−メルカプトエタノール１ｕｌを加え反応
混合物を２０℃に冷却後Ｔ４ ・ＤＮＡリガーゼ（宝酒
造（株）製３５０ ｔｌ ／ｕｌ） ０．２ｕ＋を加
え２時間インキュベートした。その後、６５℃で５分間
加熱して反応を停止させた。生成した全合成神経成長因
子遺伝子をフェノール処理後エタノールを加えて沈殿さ
せ遠心分離後、５％・アクリルアミドゲル電気泳動に付
し、その後ゲルより切り出し溶出させ、エタノールにて
再沈澱させた。
、 Ｏ）／１ｅＭＥＤＴＡ！ＢＲ（Ｉ ｔｒｉ １ ｕ
ｌ 、 ［夏〜ｖは各ｏ、ｓｕ＋） を水１１．８ｕ
ｌに希釈しライゲーション緩衝液４Ｉ１１中で７０℃、
２分間加熱し、それからゆっくり室温まで冷却した１次
に０．２８２−メルカプトエタノール１ｕｌを加え反応
混合物を２０℃に冷却後Ｔ４ ・ＤＮＡリガーゼ（宝酒
造（株）製３５０ ｔｌ ／ｕｌ） ０．２ｕ＋を加
え２時間インキュベートした。その後、６５℃で５分間
加熱して反応を停止させた。生成した全合成神経成長因
子遺伝子をフェノール処理後エタノールを加えて沈殿さ
せ遠心分離後、５％・アクリルアミドゲル電気泳動に付
し、その後ゲルより切り出し溶出させ、エタノールにて
再沈澱させた。
［組換プラスミド及び形質転換株の調製］既知のプラス
ミドＤｔｒｐ ＥＤ５−１ ［Ｇｅｎｅ、 ９．２７（
１９８０１参照］を制限酵素ＨｉｎｆＩで消化して約５
００塩基対のＨｉｎｔ ニーＨｉｎｔ Ｉ断片をとり出
した。一方、公知のプラスミドｐＢＲ３２２［Ｇｅｎｅ
、 ２． ９５（１９７７）参照］をＥｃｏ Ｒ１で
消化して開裂させた。切り出しなＨｉｎｆＩ−Ｈｉｎｆ
Ｉ断片の両末端をｄＮＴＰの存在下ＤＮＡポリメラーゼ
で平滑末端としＥｃｏ Ｒ１で消化したのち、ｐＢＲ３
２２のＥｃｏ Ｒ１切断部に挿入し、４の１ラスミドを
調製した０次に４をＥｃｏ Ｒ１で部分消化してののＥ
ＣＯＲ１部位のみを切断し、■、 ［）Ｎ＾ポリメラー
ゼで修復後、Ｔａ ＤＮＡリガーゼにより接着を行い、
このＥｃｏ Ｒ１部位を消失させた（５）、続いてこれ
をＥｃｏ Ｒ１と貼り−Ｈで二重消化して ｐＢＲ３２
２由来のシーケンス部分のＥｃｏ Ｒ１とシ１工旧部位
の間の領域をも欠失させた。このようにして得られたプ
ラスミド（６）をｐＯｃＴ２−９”と命名した。 ｐＯ
ｃＴ２−９は、４．３にｂ（にｂａｓｅｐａｉｒ）を有
し、コーエンらの方法［Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
ミドＤｔｒｐ ＥＤ５−１ ［Ｇｅｎｅ、 ９．２７（
１９８０１参照］を制限酵素ＨｉｎｆＩで消化して約５
００塩基対のＨｉｎｔ ニーＨｉｎｔ Ｉ断片をとり出
した。一方、公知のプラスミドｐＢＲ３２２［Ｇｅｎｅ
、 ２． ９５（１９７７）参照］をＥｃｏ Ｒ１で
消化して開裂させた。切り出しなＨｉｎｆＩ−Ｈｉｎｆ
Ｉ断片の両末端をｄＮＴＰの存在下ＤＮＡポリメラーゼ
で平滑末端としＥｃｏ Ｒ１で消化したのち、ｐＢＲ３
２２のＥｃｏ Ｒ１切断部に挿入し、４の１ラスミドを
調製した０次に４をＥｃｏ Ｒ１で部分消化してののＥ
ＣＯＲ１部位のみを切断し、■、 ［）Ｎ＾ポリメラー
ゼで修復後、Ｔａ ＤＮＡリガーゼにより接着を行い、
このＥｃｏ Ｒ１部位を消失させた（５）、続いてこれ
をＥｃｏ Ｒ１と貼り−Ｈで二重消化して ｐＢＲ３２
２由来のシーケンス部分のＥｃｏ Ｒ１とシ１工旧部位
の間の領域をも欠失させた。このようにして得られたプ
ラスミド（６）をｐＯｃＴ２−９”と命名した。 ｐＯ
ｃＴ２−９は、４．３にｂ（にｂａｓｅｐａｉｒ）を有
し、コーエンらの方法［Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ、、 Ｕ、Ｓ、Ａ、、 ６９．２１
１０（１９７２） ］によって大腸菌に形質転換してＡ
ｌｐ 、 Ｔｃ をマーカーとしてクローニングし
た。
１０（１９７２） ］によって大腸菌に形質転換してＡ
ｌｐ 、 Ｔｃ をマーカーとしてクローニングし
た。
こうして得たｐＯｃＴ２−９の残ったＥｃｏ ８１部位
をＥｃｏ Ｒ１で切断した６次いで、エクソヌクレアー
ゼＢａｌ ３１で両末端から約３０ ｂ、ｐ、を除去し
、除去した部分に化学合成したＣｌａ Ｉリンカ−５°
＾ＡＴＣＧＡＴＴ３′ ＴＴＡＧＣＴ＾＾ をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿入閏環しＤＣＣｌプラ
スミド（７）を調製した。
をＥｃｏ Ｒ１で切断した６次いで、エクソヌクレアー
ゼＢａｌ ３１で両末端から約３０ ｂ、ｐ、を除去し
、除去した部分に化学合成したＣｌａ Ｉリンカ−５°
＾ＡＴＣＧＡＴＴ３′ ＴＴＡＧＣＴ＾＾ をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿入閏環しＤＣＣｌプラ
スミド（７）を調製した。
得られたプラスミドｐＣＴ １はｐＯｃＴ２−９の場合
と同様、大腸菌に形質転換してクローニングおよび増幅
を行った。こうして得たプラスミドｐＣＴ １を、マク
サム・ギルバート法［Ｈａｘａｍ ＆ Ｇ１１ｂｅｒｔ
。
と同様、大腸菌に形質転換してクローニングおよび増幅
を行った。こうして得たプラスミドｐＣＴ １を、マク
サム・ギルバート法［Ｈａｘａｍ ＆ Ｇ１１ｂｅｒｔ
。
Ｐｒｏｃ、 Ｍａｒｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、、 Ｕ
、Ｓ、Ａ、、 ｒａ、 ｓ６゜（１９７７）］によって
シーケンシングを行い確認した。
、Ｓ、Ａ、、 ｒａ、 ｓ６゜（１９７７）］によって
シーケンシングを行い確認した。
得られたプラスミドｐＣＴ １ をＢｏａ工■およびＣ
１ａ ）で二重消化し、ポリアクリルアミド電気泳動に
よって長い方の断片、即ちＤＣＴ １がらｔｒｐリーダ
ー領域のリポソーム付着部位、アテニュエーター領域、
第１構造遺伝子であるｔｒｐ Ｅのリポソーム付着部位
を取り除いた断片を得た。この断片に５゜ ＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＧＴＡＡ丁ＣＧＡ
Ｔ３゜ＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡ丁ＴＴＴＴＣＣＣＡＴＴＡ
ＧＣＴＡＧＣＣで表わされる合成りＮ＾を挿入し、Ｔ４
ＤＮ＾リガーゼを用いて接着閉環した。
１ａ ）で二重消化し、ポリアクリルアミド電気泳動に
よって長い方の断片、即ちＤＣＴ １がらｔｒｐリーダ
ー領域のリポソーム付着部位、アテニュエーター領域、
第１構造遺伝子であるｔｒｐ Ｅのリポソーム付着部位
を取り除いた断片を得た。この断片に５゜ ＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＧＴＡＡ丁ＣＧＡ
Ｔ３゜ＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡ丁ＴＴＴＴＣＣＣＡＴＴＡ
ＧＣＴＡＧＣＣで表わされる合成りＮ＾を挿入し、Ｔ４
ＤＮ＾リガーゼを用いて接着閉環した。
この様にして得られたプラスミドをＣａｌ ＩおよびＳ
ａｔ 丁で切断し、ポリアクリルアミド電気泳動によっ
て長い方の断片を得た。これに５゛末端（玉鎖）がＣ１
ａ Ｉ構造、３°末端（玉鎖）が５ａｔ−工構造を有し
、前述したＤＮＡシーケンスからなるヒト成長ホルモン
遺伝子を挿入し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで接着して、ヒト
成長ホルモン遺伝子の組込まれたプラスミドｐＧＨ−１
９を得ることができた。
ａｔ 丁で切断し、ポリアクリルアミド電気泳動によっ
て長い方の断片を得た。これに５゛末端（玉鎖）がＣ１
ａ Ｉ構造、３°末端（玉鎖）が５ａｔ−工構造を有し
、前述したＤＮＡシーケンスからなるヒト成長ホルモン
遺伝子を挿入し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで接着して、ヒト
成長ホルモン遺伝子の組込まれたプラスミドｐＧＨ−１
９を得ることができた。
融合蛋白質発現型−ＰＮＦ７
プラスミドＤＧＨ−Ｌ９ （Ｅ、コリ ＩＩＧＨ−１９
、微工研菌寄第７６０６号から調製）５μｇを標準緩衝
液６加え３７℃２時間消化した０反応液をフェノール抽
出した後、エタノール沈殿を行ってＤＮＡを回収、５％
アクリルアミドゲル電気泳動に付し、長い二重鎖ＤＮＡ
部分を抽出し、約３μｇの直鎖状二重鎖ＤＮＡ ｒある
ベク９−ＤＮＡ ＤＧＨ−Ｌ９／ ＬＬＬ ＩＩ−Ｓａ
ｔ １を得た。得られたベクターＤＮＡ ｐＧＨ−Ｌ９
／！ｉＬＩ［−５ａｌ Ｉ （０，５ｕｒ／ｕｌ）
３ｕｌと、５°末端に！ＪＬＬ Ｉ Ｉサイトを有し
、それにつづ＜ Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇのア
ミノ酸コドンの塩基配列を介しヒト神経成長因子の遺伝
子〈３°末端にＳａｌ Ｉサイト、その上流に５ｔｏｐ
ｅ ｃｏｄｅｎｓ）のカイネーション混合液（０，３
μｔ ／ ｕｌ ）を３ｕｌに８２０８μｍを加え、ラ
イゲーションＭｆｌｆ液４μ＋０．２８２−メルカプト
エタノールｌｕｌ中で７４．ＤＮＡリガーゼ（３５０ｕ
／ ｕｌ ）１．１で２０℃・２０時間反応させた。
、微工研菌寄第７６０６号から調製）５μｇを標準緩衝
液６加え３７℃２時間消化した０反応液をフェノール抽
出した後、エタノール沈殿を行ってＤＮＡを回収、５％
アクリルアミドゲル電気泳動に付し、長い二重鎖ＤＮＡ
部分を抽出し、約３μｇの直鎖状二重鎖ＤＮＡ ｒある
ベク９−ＤＮＡ ＤＧＨ−Ｌ９／ ＬＬＬ ＩＩ−Ｓａ
ｔ １を得た。得られたベクターＤＮＡ ｐＧＨ−Ｌ９
／！ｉＬＩ［−５ａｌ Ｉ （０，５ｕｒ／ｕｌ）
３ｕｌと、５°末端に！ＪＬＬ Ｉ Ｉサイトを有し
、それにつづ＜ Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇのア
ミノ酸コドンの塩基配列を介しヒト神経成長因子の遺伝
子〈３°末端にＳａｌ Ｉサイト、その上流に５ｔｏｐ
ｅ ｃｏｄｅｎｓ）のカイネーション混合液（０，３
μｔ ／ ｕｌ ）を３ｕｌに８２０８μｍを加え、ラ
イゲーションＭｆｌｆ液４μ＋０．２８２−メルカプト
エタノールｌｕｌ中で７４．ＤＮＡリガーゼ（３５０ｕ
／ ｕｌ ）１．１で２０℃・２０時間反応させた。
フェノール処理後、反応液からエタノールで沈澱させＤ
ＮＡを回収、次の操作により形質転換及びスクリーニン
グを行った。
ＮＡを回収、次の操作により形質転換及びスクリーニン
グを行った。
組換プラスミドＰＮＦ−７（１，５μｔ／２０．１濃度
のも））１０ｕ１と大腸菌ＨＢ１０１をＬ ｂｒｏｔｈ
５ａ＋Ｉで一晩培養し更に１００ｕｌであらためて培
養、０．１５八６６０になったら３０分間氷冷した。遠
心分離後、沈殿物を５０１Ｎ ＣａＣｌ、、 ５０ｍ１
に懸濁、６０分間水冷後、遠心し５０ ＩＮ ＣａＣｌ
、、 ２０Ｘ ｇｌｙｃｅｒｏｌ １０ｍ１に懸濁
したカルシウム処理菌０．１ｍｌを混合、０℃に保った
゛。
のも））１０ｕ１と大腸菌ＨＢ１０１をＬ ｂｒｏｔｈ
５ａ＋Ｉで一晩培養し更に１００ｕｌであらためて培
養、０．１５八６６０になったら３０分間氷冷した。遠
心分離後、沈殿物を５０１Ｎ ＣａＣｌ、、 ５０ｍ１
に懸濁、６０分間水冷後、遠心し５０ ＩＮ ＣａＣｌ
、、 ２０Ｘ ｇｌｙｃｅｒｏｌ １０ｍ１に懸濁
したカルシウム処理菌０．１ｍｌを混合、０℃に保った
゛。
４２℃に６０秒間加熱した後、室温に戻した。
ｔ−ｂｒｏｔｈ （ａａｃｔｏ ・ 丁ｒｙｐｔｏ
ｎｅ・ １ ｇ 、 ’１ｅａｓｔＥｘｔｒａｃ
ｔ Ｏ，５ｇ 、 ＮａＣｌ Ｏ，Ｓｇ 、 Ｇｌｕｃ
ｏｓｅ Ｏ，１ｇを水１００ ｍｌで溶解 ＤＨ７，２
に調製したもの）１ｍｌを加えて３７℃・３０〜６０分
インキュベートした０次に１３、 ＯＯＯｒｐｍで５分
間遠心し、上清をすてた後、沈澱をし−ｂｒｏｔｈ ０
．３ ｍｌに懸濁させた。 ０．１ｍｌずつ寒天培地
（Ｂａｃｔｏ −Ｔｒｙｐｔｏｎｅ １ｇ 、 Ｙｅａ
ｓｔ Ｅ×ｔｒａｃｔＯ，５ｇ 、 ＮａＣｌ ０．５
ｇ 、 Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｏ，１ｇに寒天１．５ｇとア
ンピシリン３■を加えたもの） ３枚に広げ各コロニー
より得られたプラスミド画分の制限酵素開裂地図が予定
したｐＮＦ−７のそれと一致するコロニーを選択した。
ｎｅ・ １ ｇ 、 ’１ｅａｓｔＥｘｔｒａｃ
ｔ Ｏ，５ｇ 、 ＮａＣｌ Ｏ，Ｓｇ 、 Ｇｌｕｃ
ｏｓｅ Ｏ，１ｇを水１００ ｍｌで溶解 ＤＨ７，２
に調製したもの）１ｍｌを加えて３７℃・３０〜６０分
インキュベートした０次に１３、 ＯＯＯｒｐｍで５分
間遠心し、上清をすてた後、沈澱をし−ｂｒｏｔｈ ０
．３ ｍｌに懸濁させた。 ０．１ｍｌずつ寒天培地
（Ｂａｃｔｏ −Ｔｒｙｐｔｏｎｅ １ｇ 、 Ｙｅａ
ｓｔ Ｅ×ｔｒａｃｔＯ，５ｇ 、 ＮａＣｌ ０．５
ｇ 、 Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｏ，１ｇに寒天１．５ｇとア
ンピシリン３■を加えたもの） ３枚に広げ各コロニー
より得られたプラスミド画分の制限酵素開裂地図が予定
したｐＮＦ−７のそれと一致するコロニーを選択した。
寒天培地で増した菌を５ＴＥＴ ｂｕｆｆｅｒ（８％
５ｕｃｒｏｓｅ。
５ｕｃｒｏｓｅ。
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ（ＤＮＡ、０１． ５０ｍＭ
ＥＤＴ八 、 ５％Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ １００）に懸濁させた。
ＥＤＴ八 、 ５％Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ １００）に懸濁させた。
リゾチーム（１０■／ １ ｍｌ ０．２５Ｍ ｒｒ
ｉｓ−ｕｃｌ （ｐｔ１８．０）） ２ｏ、＋を加えて
沸騰水中で６０秒間加熱した後、１３．０００ｒｐ園で
１０分間遠心した。
ｉｓ−ｕｃｌ （ｐｔ１８．０）） ２ｏ、＋を加えて
沸騰水中で６０秒間加熱した後、１３．０００ｒｐ園で
１０分間遠心した。
上清にｉ ５ｏ（ｌｒｏｐａｎｏ Ｉ ０．５ ｍｌを
加えて一２０℃に３０分間放置、１３．ＯＯＯｒｐｍで
１０分間遠心した後、沈澱をＴＥＩ衡液Ｓｏｕ＋に溶解
し、１ｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ ８０ｇ１を加えて一２０
℃に３０分間放置、１３． ＯＯＯｒｐｍで １０分間
遠心した後、沈澱を乾燥させた。
加えて一２０℃に３０分間放置、１３．ＯＯＯｒｐｍで
１０分間遠心した後、沈澱をＴＥＩ衡液Ｓｏｕ＋に溶解
し、１ｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ ８０ｇ１を加えて一２０
℃に３０分間放置、１３． ＯＯＯｒｐｍで １０分間
遠心した後、沈澱を乾燥させた。
沈澱を８２０２０．６ｕｌに溶解し、ｂｕｙｅｒ ６１
１．５ＭＮａＣｌ０．９１＋Ｉ、ＬＬＬ ＩＩ （８Ｌ
Ｉ／ ｕｌ ） １ｕｌ 、Ｓａｔ １（ａｕ ／
ｕｌ ） １．５ｕｌを加えて３７℃で９０分間反
応させた０次にＲＮａＳｅ Ａ （１０ｗ／ ｍｌ
） ０．２ｕｌを加え３１℃、３０分閏反応させた。
１．５ＭＮａＣｌ０．９１＋Ｉ、ＬＬＬ ＩＩ （８Ｌ
Ｉ／ ｕｌ ） １ｕｌ 、Ｓａｔ １（ａｕ ／
ｕｌ ） １．５ｕｌを加えて３７℃で９０分間反
応させた０次にＲＮａＳｅ Ａ （１０ｗ／ ｍｌ
） ０．２ｕｌを加え３１℃、３０分閏反応させた。
得られた液をフェノール処理し、エタノール沈澱後５％
ＰＡＧＥにて電気泳動に付し、β−ＮＧＦ遺伝子セグメ
ントを含む目的のＤＮＡを大量に得た。
ＰＡＧＥにて電気泳動に付し、β−ＮＧＦ遺伝子セグメ
ントを含む目的のＤＮＡを大量に得た。
第１図はＤＮＡの合成法を示した図であり、第２図はＤ
ＮＡの合成の除用いるジヌクレオチドの合成法を示した
図である。
ＮＡの合成の除用いるジヌクレオチドの合成法を示した
図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）ヒト神経成長因子遺伝子の上流側末端に、式【遺
伝子配列があります。】 （式中Ｘは血液凝固因子の一つであるトロンビンの認識
アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を、Ｘ′はその相
補配列を示す）で表されるＤＮＡ配列を、またその下流
側末端に停止コドンを含み、制限酵素開裂末端で終る、
式 【遺伝子配列があります。】 （式中Ｙは最初の停止コドンの第二の塩基から制限酵素
開裂末端の３′末端までを表わし、Ｙ′はＹの相補配列
で、制限酵素開裂末端の５′末端までを表わす）で表わ
されるＤＮＡ配列を有するヒト神経成長因子遺伝子セグ
メント。 （２）ヒト神経成長因子遺伝子の上流側に付加されるＤ
ＮＡ配列のＸが、血液凝固因子の一つであるトロンビン
の認識アミノ酸配列のうち、Ｎ末端よりＶａｌ−Ｐｒｏ
−Ａｒｇで表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配
列であり、Ｘ′がその相補配列である特許請求の範囲第
（１）項記載のヒト神経成長因子遺伝子セグメント。 （３）ヒト神経成長因子遺伝子の上流側に付加されるＤ
ＮＡ配列のＸ及びＸ′が、式 【遺伝子配列があります。】 で表わされる配列である特許請求の範囲第（１）項また
は（２）項記載のヒト神経成長因子遺伝子セグメント。 （４）ヒト神経成長因子遺伝子の下流側に付加されるＤ
ＮＡ配列のＹ及びＹ′が、式 【遺伝子配列があります。】 で表わされる配列である特許請求の範囲第（１）項記載
のヒト神経成長因子遺伝子セグメント。 （５）ヒト神経成長因子遺伝子のＤＮＡ配列が、式【遺
伝子配列があります。】 で表わされるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列であ
る特許請求の範囲第（１）項から第（４）項いずれかに
記載のヒト神経成長因子遺伝子セグメント。 （６）ヒト神経成長因子遺伝子のＤＮＡ配列が式【遺伝
子配列があります。】 で表わされることを特徴とする特許請求の範囲第（５）
項記載のヒト神経成長因子遺伝子セグメント。 （７）ヒト神経成長因子遺伝子の上流側末端に、式【遺
伝子配列があります。】 （式中Ｘは血液凝固因子の一つであるトロンビンの認識
アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を、Ｘ′はその相
補配列を示す）で表されるＤＮＡ配列を、またその下流
側末端に停止コドンを含み、制限酵素開裂末端で終る、
式 【遺伝子配列があります。】 （式中Ｙは最初の停止コドンの第二の塩基から制限酵素
開裂末端の３′末端までを表わし、Ｙ′はＹの相補配列
で、制限酵素開裂末端の５′末端までを表わす）で表わ
されるＤＮＡ配列を有するヒト神経成長因子遺伝子セグ
メントを含み微生物中で自己増殖可能な組み換えプラス
ミド。 （８）ヒト神経成長因子遺伝子セグメントの更に上流に
このＤＮＡを発現可能にするプロモーター・オペレータ
ー系を含み、このプロモーター・オペレーター系の上流
とヒト神経成長因子遺伝子の下流との間に組換えプラス
ミドを自己増殖可能とする部分および薬剤耐性をコード
する部分を含む、特許請求の範囲第（７）項記載の組換
えプラスミド。 （９）プロモーター・オペレーター系が、そのアッテネ
ーター部分を欠く細菌のトリプトファンプロモーター・
オペレーター系である特許請求の範囲第（８）項記載の
組換プラスミド。 （１０）ヒト神経成長因子遺伝子の上流側に付加される
ＤＮＡ配列のＸが、血液凝固因子の一つであるトロンビ
ンの認識アミノ酸配列のうち、Ｎ末端よりＶａｌ−Ｐｒ
ｏ−Ａｒｇで表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
配列であり、Ｘ′がその相補配列である特許請求の範囲
第（７）項記載の組み換プラスミド。 （１１）ヒト神経成長因子遺伝子の上流側に付加される
ＤＮＡ配列のＸ及びＸ′が、式 【遺伝子配列があります。】 で表わされる配列である特許請求の範囲第（１０）項記
載の組み換えプラスミド。 （１２）ヒト神経成長因子遺伝子の下流側に付加される
ＤＮＡ配列のＹ及びＹ′が、式 【遺伝子配列があります。】 で表わされる配列である特許請求の範囲第（７）項記載
の組み換えプラスミド。 （１３）ヒト神経成長因子遺伝子のＤＮＡ配列が、式【
遺伝子配列があります。】 で表わされるアミノ酸配列をコードするＤＮＡである特
許請求の範囲第（７）項から第（１２）項いずれかに記
載の組み換えプラスミド。 （１４）ヒト神経成長因子遺伝子のＤＮＡ配列が式【遺
伝子配列があります。】 で表わされる特許請求の範囲第（１３）項記載の組み換
えプラスミド。 （１５）プロモーター・オペレータ系のメッセンジャー
ＲＮＡ転写開始点よりヒト神経成長因子遺伝子までのＤ
ＮＡ配列が、ヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡ配列
の一部分を含む特許請求の範囲第（７）項から第（１４
）項いずれかに記載の組み換えプラスミド。（１６）ヒ
ト成長ホルモンをコードするＤＮＡ配列の一部分として
、式 【遺伝子配列があります。】 で表される配列を含む特許請求の範囲第（１５）項記載
の組換プラスミド。 （１７）ヒト神経成長因子遺伝子の上流側末端に、式【
遺伝子配列があります。】 （式中Ｘは血液凝固因子の一つであるトロンビンの認識
アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を、Ｘ′はその相
補配列を示す）で表されるＤＮＡ配列を、またその下流
側末端に停止コドンを含み、制限酵素開裂末端で終る、
式 【遺伝子配列があります。】 （式中Ｙは最初の停止コドンの第二の塩基から制限酵素
開裂末端の３′末端までを表わし、Ｙ′はＹの相補配列
で、制限酵素開裂末端の５′末端までを表わす）で表わ
されるＤＮＡ配列を有するヒト神経成長因子遺伝子セグ
メントを含み微生物中で自己増殖可能な組み換えプラス
ミドを細胞中に保有するエシェリシャ属に属する微生物
。 （１８）ヒト神経成長因子遺伝子セグメントの更に上流
にこのＤＮＡを発現可能にするプロモーター・オペレー
ター系を含み、このプロモーター・オペレーター系の上
流とヒト神経成長因子遺伝子の下流との間に組換えプラ
スミドを自己増殖可能とする部分および薬剤耐性をコー
ドする部分を含む、特許請求の範囲第（１７）項記載の
微生物。 （１９）プロモーター・オペレーター系が、そのアッテ
ネーター部分を欠く細菌のトリプトファンプロモーター
・オペレーター系である特許請求の範囲第（１８）項記
載の微生物。 （２０）ヒト神経成長因子遺伝子の上流側に付加される
ＤＮＡ配列のＸが、血液凝固因子の一つであるトロンビ
ンの認識アミノ酸配列のうち、Ｎ末端よりＶａｌ−Ｐｒ
ｏ−Ａｒｇで表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
配列であり、Ｘ′がその相補配列である組み換えプラス
ミドを細胞中に保有する、特許請求の範囲第（１７）項
記載の微生物。 （２１）ヒト神経成長因子遺伝子の上流側に付加される
ＤＮＡ配列のＸ及びＸ′が、式 【遺伝子配列があります。】 で表わされる配列である組み換えプラスミドを細胞中に
保有する、特許請求の範囲第（２０）項記載の微生物。 （２２）ヒト神経成長因子遺伝子の下流側に付加される
ＤＮＡ配列のＹ及びＹ′が、式 【遺伝子配列があります。】 で表わされる配列である組み換えプラスミドを細胞中に
保有する、特許請求の範囲第（１７）項記載の微生物。 （２３）ヒト神経成長因子遺伝子のＤＮＡ配列が、式【
遺伝子配列があります。】 で表わされるアミノ酸配列をコードするＤＮＡである組
み換えプラスミドを細胞中に保有する、特許請求の範囲
第（１７）項から第（２２）項いずれかに記載の微生物
。 （２４）ヒト神経成長因子遺伝子のＤＮＡ配列が式【遺
伝子配列があります。】 で表わされる組み換えプラスミドを細胞中に保有する、
特許請求の範囲第（２３）項記載の微生物。 （２５）プロモーター・オペレータ系のメッセンジャー
ＲＮＡ転写開始点よりヒト神経成長因子遺伝子までのＤ
ＮＡ配列が、ヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡ配列
の一部分を含む組み換えプラスミドを細胞中に保有する
、特許請求の範囲第（１７）項から第（２４）項いずれ
かに記載の微生物。 （２６）ヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡ配列の一
部分として、式 【遺伝子配列があります。】 で表される配列を含む組み換えプラスミドを細胞中に保
有する、特許請求の範囲第（２５）項記載の微生物。 （２７）ヒト神経成長因子遺伝子の上流側末端に、式【
遺伝子配列があります。】 （式中Ｘは血液凝固因子の一つであるトロンビンの認識
アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を、Ｘ′はその相
補配列を示す）で表されるＤＮＡ配列を、またその下流
側末端に停止コドンを含み、制限酵素開裂末端で終る、
式 【遺伝子配列があります。】 （式中Ｙは最初の停止コドンの第二の塩基から制限酵素
開裂末端の３′末端までを表わし、Ｙ′はＹの相補配列
で、制限酵素開裂末端の５′末端までを表わす）で表わ
されるＤＮＡ配列を有するヒト神経成長因子遺伝子セグ
メントを含み微生物中で自己増殖可能でかつヒト神経成
長因子融合タンパク質を発現することのできる組み換え
プラスミドを細胞中に保有するエシェリシャ属に属する
微生物を栄養培地により培養して、ヒト神経成長因子融
合タンパク質を蓄積させてこれを採取し、トロンビンで
消化することを特徴とするヒト神経成長因子の製造方法
。 （２８）ヒト神経成長因子遺伝子セグメントの更に上流
にアッテネーター部分を欠く細菌のトリプトファンプロ
モーター・オペレーター系を含み、このプロモーター・
オペレーター系の上流とヒト神経成長因子遺伝子の下流
との間に組換えプラスミドを自己増殖可能とする部分お
よび薬剤耐性をコードする部分を含むプラスミドを細胞
中に保有する微生物を用いる特許請求の範囲第（２７）
項記載の製造方法。 （２９）組み換えプラスミドのヒト神経成長因子遺伝子
の上流側に付加されるＤＮＡ配列のＸが、血液凝固因子
の一つであるトロンビンの認識アミノ酸配列のうち、Ｎ
末端よりＶａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇで表されるアミノ酸配
列をコードするＤＮＡ配列であり、Ｘ′がその相補配列
であるヒト神経成長因子遺伝子セグメントを含む組み換
えプラスミドを保有する微生物を用いる特許請求の範囲
第（２７）項記載の製造方法。 （３０）ヒト神経成長因子遺伝子の上流側に付加される
ＤＮＡ配列のＸ及びＸ′が、式 【遺伝子配列があります。】 で表わされる配列であるヒト神経成長因子遺伝子セグメ
ントを含む組み換えプラスミドを保有する微生物を用い
る特許請求の範囲第（２９）項記載の製造方法。 （３１）ヒト神経成長因子遺伝子の下流側に付加される
ＤＮＡ配列のＹ及びＹ′が、式 【遺伝子配列があります。】 で表わされる配列であるヒト神経成長因子遺伝子セグメ
ントを含む組み換えプラスミドを保有する微生物を用い
る特許請求の範囲第（２７）項記載の製造方法。 （３２）ヒト神経成長因子遺伝子のＤＮＡ配列が、式【
遺伝子配列があります。】 で表わされるアミノ酸配列をコードするＤＮＡであるヒ
ト神経成長因子遺伝子セグメントを含む組み換えプラス
ミドを保有する微生物を用いる特許請求の範囲第（２７
）項から第（３１）項いずれかに記載の製造方法。 （３３）ヒト神経成長因子遺伝子のＤＮＡ配列が、式【
遺伝子配列があります。】 で表わされるヒト神経成長因子遺伝子セグメントを含む
組み換えプラスミドを保有する微生物を用いる特許請求
の範囲第（３２）項記載の製造方法。 （３４）プロモーター・オペレータ系のメッセンジャー
ＲＮＡ転写開始点よりヒト神経成長因子遺伝子までのＤ
ＮＡ配列が、ヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡ配列
の一部分を含むヒト神経成長因子遺伝子セグメントを含
む組み換えプラスミドを保有する微生物を用いることを
特徴とする特許請求の範囲第（２７）項から（３３）項
いずれかに記載の微生物。 （３５）ヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡ配列の一
部分として、式 【遺伝子配列があります。】 で表される配列を含むヒト神経成長因子遺伝子セグメン
トを含む組み換えプラスミドを保有する微生物を用いる
特許請求の範囲第（３５）項記載の製造方法。 （３６）式 【遺伝子配列があります。】 【遺伝子配列があります。】 で表わされるヒト神経成長因子融合蛋白質。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63035042A JPH01211490A (ja) | 1988-02-19 | 1988-02-19 | ヒト神経成長因子遺伝子セグメント |
| EP19890102795 EP0329175A1 (en) | 1988-02-19 | 1989-02-17 | Human nerve growth factor gene segment |
| AU30133/89A AU3013389A (en) | 1988-02-19 | 1989-02-20 | Human nerve growth factor gene segment |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63035042A JPH01211490A (ja) | 1988-02-19 | 1988-02-19 | ヒト神経成長因子遺伝子セグメント |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01211490A true JPH01211490A (ja) | 1989-08-24 |
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Patent Citations (1)
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Cited By (1)
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Also Published As
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