JPH0542264B2

JPH0542264B2 -

Info

Publication number: JPH0542264B2
Application number: JP58148552A
Authority: JP
Inventors: Yoshiro Takeda; Hideo Inoe; Akemichi Ueno; Juzo Kawashima; Tsutomu Uenoyama
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1983-08-12
Filing date: 1983-08-12
Publication date: 1993-06-28
Also published as: JPS6041498A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は哺乳動物血清アルブミン由来ペプチ
ド、詳しくはインスリン作用促進活性を有する上
記ペプチドを製造する方法に関する。哺乳動物の血清アルブミンは、血漿総蛋白質の
約60％を占め、血清中の主要蛋白質である。該血
清アルブミンは、血漿膠質浸透圧を維持し、各種
ビタミン、ホルモン、薬剤等の運搬に関与するこ
とが知られているが、それ自体はインスリン作用
促進活性を有していない。本発明者らは従来よりインスリンの作用を促
進、増強させる因子につき鋭意研究を行なつて来
たが、その過程で上記哺乳動物の血清アルブミン
にトリプシン、アクロシン、コクナーゼ及びE.
coliプロテアーゼの少なくとも１種を作用させ
て分解させた分解物中に、上記インスリン作用促
進活性を有するペプチドが存在するという新しい
事実を発見した。本発明は上記知見に基づいて完成させたもので
あり、哺乳動物血清アルブミンにトリプシン、ア
クロシン、コクナーゼ及びE.coliプロテアーゼ
の少なくとも１種を作用させてインスリン作用促
進活性を有するペプチドを得ることを特徴とする
哺乳動物血清アルブミン由来ペプチドの製造法に
係る。本発明によれば、簡単な操作で、従来知られて
いない新しいインスリン作用促進活性を有するペ
プチドの取得することができる。本発明方法により得られる上記ペプチドは、イ
ンスリン作用促進活性という特有の生理作用を有
する点において特徴つけられる。ここでインスリ
ン作用促進活性とは、インスリンの作用すなわち
生体内において主として筋や脂肪組織へのグリコ
ースやアミノ酸の取り込み及びグルコースのグリ
コーゲン・脂肪への転換を促進して血糖を低下さ
せる働きを促進する作用を言う。従つて本発明に
より得られる上記ペプチドは、インスリン作用の
不足による代謝異常状態いと定義される糖尿病の
治療に有用である。一般に糖尿病は、大別して膵臓におけるインス
リン分泌量の絶対的不足に基因する型糖尿病
（インスリン依存性糖尿病）と、主としてインス
リンに対する感受性の低下による型糖尿病（イ
ンスリン非依存性糖尿病）とに分類される。本発
明により得られるペプチドは、インスリン作用の
促進によりインスリン感受性の改善を計り得るも
のであり、殊に型糖尿病の治療に有効である。
また、型、型糖尿病を問わず、インスリン療
法に際して本発明により得られるペプチドを併用
することによりインスリン製剤の使用量を大巾に
節約できると同時に、インスリンの長期あるいは
大量療法にみられるインスリン抗体の産生に基因
するインスリンシヨツクやインスリン抵抗性の発
現を予防することができる。本発明方法において用いられる哺乳動物血清ア
ルブミンとしては、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌ、
ヒト、サル、マウス等の哺乳動物より各種方法に
より単離糖製された市販の血清アルブミンのいず
れであつてもよい。またこれは上記各種哺乳動物
より常法に従つて単離調製されてもよい。また上
記血清アルブミンに作用させるトリプシン等の酵
素も酵素製剤としての市販品又は常法に従い単離
調製したもののいずれであつてもよい。本発明方法においては上記血清アルブミンにト
リプシン、アクロシン、コクナーゼ及びE.coliプ
ロテアーゼから選ばれた少なくとも１種の酵素
を作用させて、そのペプチド結合を特定部位で分
解させる。上記各酵素によるペプチド結合の分解
反応は、用いる酵素の作用至適温度及びPH条件下
に行なわれる。之等条件は酵素の種類により若干
異なるが、一般に約20〜40℃の温度範囲、5.0〜
9.5PH範囲とするのが適当であり、通常酵素は原
料血清アルブミン（基質）重量の1/10〜1/250重
量程度の範囲で用いられ、反応は約15分〜36時間
で完結する。各酵素毎に上記分解反応条件を例示
すれば、下記第１表の通りとなる。【表】なお、必要に応じて酵素阻害剤例えば大豆トリ
プシン阻害剤（Soybean trypsin inhibitor）等
を用いて反応を停止させてもよい。上記トリプシ
ンによる分解反応により原料血清アルブミンは、
その立体障害のない部位において、これを構成す
るアルギニン（Arg）又はリジン（Lys）のカル
ボキシル基側のペプチド結合が切断され、かくし
てインスリン作用促進活性を有する活性画分とし
て所望のペプチドを収得できる。上記ペプチドは、反応液より通常のペプチドの
分離手段により分離精製することができ、また通
常の凍結乾燥手段により保存することができる。
上記分離精製手段としては、例えばセフアデツク
スＧ−50、セフアデツクスＧ−100（フアルマシア
社製）等のゲル過担体を用いる分子過法、透
析法、電気泳動法、SP−セフアデツクスＣ−25
（フアルマシア社製）、DEAE−セルロース（ホワ
ツトマン社製）等のイオン交換カラムクロマツグ
ラフイー又は高速液体カラムクロマトグラフイー
等及びこれ等各方法を組み合せた方法を例示でき
る。上記精製手段の好ましい一例は次の通りであ
る。即ち反応液又はその凍結乾燥品を例えば酢酸
アンモニウム、酢酸等の弱酸性溶液に溶解し、ゲ
ル過し、凍結乾燥する。この時脱塩が不充分で
あれば水に懸濁後再度凍結乾燥する。上記ゲル
過により得た活性画分を次いで酢酸ナトリウム、
リン酸、クエン酸等の緩衝液に溶解後、陽イオン
交換カラムクロマトグラフイーを行ない、必要に
応じて、酢酸緩衝液で洗浄後、0.1Mは以下の食
塩を含む緩衝液で洗浄し、0.1〜2.0M、好ましく
は0.1〜0.8M程度の食塩直線濃度勾配により溶出
させ、最大活性ピークを集める。これを透析後、
凍結乾燥を行なうことにより精製品を得る。これ
は更に必要に応じて高速液体クロマトグラフイー
等により精製することもできる。かくして本発明方法により、精製されたインス
リン作用促進活性を有する哺乳動物血清アルブミ
ン由来ペプチドを得る。上記方法により得られる所望ペプチドは、その
Ｃ末端にArg又はLysが存在し、Ｎ末端は、原料
アルブミンのArg又はLysのカルボキシル基と結
合していたアミノ酸が存在し、原料アルブミンに
由来する特定のアミノ酸配列を含んでいる。上記の如くして得られる本発明ペプチドは、薬
理的に許容される酸性化合物又は塩基性化合物と
塩を形成させることができる。斯かる酸性化合物
としては、例えば塩酸、硫酸、リン酸、臭化水素
酸等の無機酸、フマール酸、マレイン酸、酢酸、
シユウ酸、リンゴ酸、クエン酸等の有機酸を、ま
た塩基性化合物としては、例えば水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭酸ナ
トリウム、炭酸水素カリウム等を挙げることがで
きる。本発明により得られる上記ペプチド又はその塩
は、単独であるいはインスリンと併用することに
より抗糖尿病剤として使用することができる。そ
の場合有効成分を通常製剤的担体と共に製剤組成
の形態に加工して用いるが、中でも注射剤として
使用するのが好ましい。注射剤として調製される
場合、得られる製剤は殺菌され且つ血液と等張で
あるのが好ましい。注射剤の形態に成形するのに
際しては、希釈剤としてこの分野に於いて慣用さ
れているものを使用できる。例えば、水、生理食
塩水等を挙げることができる。なおこの場合等張
性の溶液を調製するに充分な量の食塩、あるいは
グリセリンを注射剤の形態の製剤中に含有せしめ
てもよい。また上記製剤には通常の緩衝剤、無痛
化剤、保存剤等、更に必要に応じて着色剤、香
料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品をも含有せし
め得るものである。また上記有効成分は使用時に
注射用蒸留水に溶解し、用時溶解剤としても使用
できる。上記の如くして調製される製剤は、その形態に
応じた方法で投与され得る。注射剤の場合には単
独であるいはアミノ酸等の通常の補液と混合して
静脈内投与される。以下本発明方法を更に詳しく説明するため実施
例を挙げる。尚実施例における試料のインスリン
作用促進活性は、以下の方法により測定した。＜インスリン作用促進活性＞雄性ウイスター（Wistar）系ラツト（体重150
〜300ｇ）より副睾丸脂肪組織を摘出し、
Explant（脂肪組織塊）を調製する。10個の
Explant（湿重量として7.5〜10mg）を、Ｄ−〔Ｕ−
¹⁴C）グルコース0.05μCi／ml、重曹1.5mg／ml、
ペニシリン35U／ml及びストレプトマイシン0.1
mg／mlを含むＭ−199〔「医学のあゆみ」第62巻、
第６号、435頁、昭和42年８月５日発行参照〕培
地に浮かべたシリコン処理レンズペーパー上に載
せ〔Topper.Y.J.、et al、Methods in
Enzymology.39、443（1975）〕、３％炭酸ガス含有
気相下に、37℃で20時間培養する。培養後
Explantの湿重量を測定し、その全量を2N−
KOHの50％エタノール溶液１ml中で、100℃で２
時間加水分解する。6N−硫酸0.5mlで酸性化した
水解物より３mlの石油エーテルで脂肪酸を抽出
し、常法により放射能を測定し、グルコースから
の脂肪酸への転換量を、培地中に比放射能より算
出する。試料のインスリン作用促進活性は、上記反応系
内に試料とインシユリン（0.2ｍＵ／ml）とを添
加して得られる上記比放射能算出値を、インスリ
ンの単独添加により得られる同算出値に対する百
分率で表わす。実施例１結晶ウシ血清アルブミン（マイルス社製）を、
未変性のままTPCKトリプシン（ワーシントン社
製）を用い、0.1M重炭酸アンモニウム（PH8.1）
中で12時間消化した（基質濃度１％、酵素：基質
＝１：100重量比）。消化後直ちに凍結乾燥した
（後記薬理試験で用いられている未精製の本発明
ペプチドはこの段階で得られたものを使用してい
る）。１ｇの乾燥消化物を0.1M酢酸アンモニウム
（PH5.6）14.5mlに溶解し、セフアデツクスＧ−50
（フアルマシア社、4.4×90cm）のカラムを用いて
ゲル過（流速20ml／時間、４℃、フラクシヨン
8.7ml／チユーブ）して、活性画分（フラクシヨ
ンNo.87〜130）を集め、凍結乾燥した。上記セフアデツクスＧ−50を用いたゲル過に
おける溶出活性パターンを第１図に示す。第１図
において横軸はフラクシヨンNo.を、縦軸はインス
リン作用促進活性を示す。また図中１は230nｍ
での吸光度曲線を示し、２はインスリン作用促進
活性パターンを３は280nｍでの吸光度曲線を示
す。上記で得た活性画分乾燥品を、脱塩のため更に
50℃で保温しながら１時間吸引し、水に懸濁して
再び凍結乾燥した。上記と同一のゲル過操作を
３度行なつて集めた活性画分約720mgを60mlの
0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（PH4.3）に溶解し、
SP−セフアデツクスＣ−25（フアルマシア社製、
３×20cm）のカラムを用いてイオン交換カラムク
ロマトグラフイー（流速60ml／時間、４℃、フラ
クシヨン８ml／チユーブ）を行なつた。160mlの
0.1M酢酸緩衝液（PH4.3）で洗浄後、更に500ml
の0.1M食塩を含む0.1M酢酸緩衝液（PH4.3）で洗
浄し、2000mlの0.1M−0.8M食塩直線濃度勾配に
より溶出させた。上記溶出パターンを第２図に示す。第２図にお
いて横軸はフラクシヨンNo.、縦軸は230nｍの吸
光度、インスリン作用促進活性及び電気伝導度を
示す。又、図中１は230nｍでの吸光度曲線を、
２はインスリン作用促進活性パターンを、及び３
は電気伝導度曲線を示す。第２図より最大活性ピークは0.53M NaCl近傍
に現れることが判る。上記最大活性ピークを集め、スペクトラポア３
（スペクトラムメデイカル社製、
MWcutoff3500）透析チユーブを用いて透析（50
倍量の蒸留水５回、70時間）し、凍結乾燥した。上記で得た凍結乾燥品を、0.1％トリフルオロ
酢酸に溶解し、以下の条件下、逆相カラムを用い
た高速液体クロマトグラフイーにて精製した。＜高速液体クロマトグラフイー条件＞機器；ウオーターズ社、ALC／GPCモデル244、
液体クロマトグラフイーシステム、Ｍ−660溶
媒プログラマー、カラム；ウルトラボールRPSC（C₃、ベツクマン
アルテクス社、4.6mm×7.5cm）流速；１ml／分、25℃ チヤートスピード；60cm／時間注入量；3000μｇ／30μ 溶出；０〜60％アセトニトリル（直線濃度勾配、
30分）結果を第３図に示す。第３図において横軸は保
持時間（分）を、縦軸は220nｍ及び280nｍでの
吸光度及びインスリン作用促進活性（％）を示
し、図中１は220nｍでの吸光度曲線、２は280n
ｍでの吸光度曲線及び３はインスリン作用促進活
性を夫々示す。該図より約28分に、最大活性を示
すピークが現れることが判る。上記活性ピークを凍結乾燥して目的とするウシ
血清アルブミン由来ペプチドを得た。その収量は
原料ウシ血清アルブミン１ｇ当り590μｇであつ
た（ペプチドＢ）。上記で得た本発明のペプチドは以下の物性を有
している。 (1) SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動イトー
（ItoK.）らの方法〔J.Biol.Chem.、255、2123
（1980）〕に従い、20.86％アクリルアミド、
0.096％ビスアクリルアミド、6M尿素、
0.033M食塩、0.34Mトリス塩酸（PH8.7）の分
離用ゲルを用いた。濃縮ゲル、泳動緩衝液及び
試料緩衝液をレム（Laemmli）らの方法
〔Nature、227、680（1970）〕に準じて調製し
た。分子量マーカーとしてはBDHケミカルズ
社製キツト（分子量16949、14404、8159、
6214、2512）を用いた。上記ペプチドをβ−メルカプトエタノールで
還元処理したものの分子量を測定した結果を参
考写真１に示す。該参考写真１（右）より上記
ペプチドは、２本のバンドを示し、各バンドは
分子量マーカー6214と2512との間に現れ、その
夫々の分子量は約4900及び3500であつた。 (2) アミノ酸分析上記で得たペプチド（乾燥品）を、4Nメタ
ンスルホン酸（0.2％の３−（２−アミノエチ
ル）インドールを含有）を用いてシンプソンら
（Simpson R.T.、et al）の方法〔J.Biol.
Chem.、251、193（1976）〕に従い、110℃で24
時間加水分解した。加水分解物を中和後、日立
835型アミノ酸自動分析計を用いて分析した。
結果を下記第２表に示す。尚表中各アミノ酸は
IUPACの略号で示し、各アミノ酸組成は試料
１モル当りの各アミノ酸のモル量で表わす。ま
たHalf−Cysは、過蟻酸酸化後のシステイン酸
として示した。【表】 (3) Ｎ−末端アミノ酸配列ペプチド試料を、エドマン分解にかけ、３段
階まで測定を行なつた〔Iwanaga S.、et al、
Eur.J.Biochem.、８、189（1969）〕。アミノ酸
のフエニルチオヒダントイン誘導体の同定は、
C₁₈逆相カラム（TSK LS410K、ODS、東洋曹
達社製）を用いたHPLCにより行なつた
〔Omichi K.、et al、J.Biochem.、87、483
（1980）〕。その結果第１段階でArg及びLeuが、第２段
階でHis及びLysが、第３段階でProが夫々同定
された。 (4) 本発明ペプチド試料をオフアーレル
（O′Farrell、P.H.）の方法〔J.Biol.Chem.、
250、4007（1975）〕に準じて等電点電気泳動を
行なつた結果、その等電点は約5.1であつた。以上の理化学的性質及び構造的特徴より、本実
施例で得られたペプチドは、ウシ血清アルブミン
の115番目のアミノ酸であるLeuをＮ末端とし、
143番目のArgをＣ末端とする29個のアミノ酸よ
りなるペプチドと、144番目のArgをＮ末端とし、
184番目のArgをＣ末端とする41個のアミノ酸よ
りなるペプチドとが、123番目のCysと167番目の
Cysとの間でＳ−Ｓ結合にて架橋された、以下の
一次構造式で示されるものであると推定される。一次構造式〔１〕【表】
｜｜

S Asp
183
｜｜
Met−Thr−Glu−Ile−Lys−Pro−Le
u−Leu−Cys−Ala−Gly−Lys
｜
175 172
Arg−OH

184 C末端

実施例２実施例１において、SP−セフアデツクスＣ−
25を用いたイオン交換クロマトグラフイーに代え
DEAEセルロース（ワツトマンDE52、ワツトマ
ン社製、3.2×60cm）を用いた。セフアデツクス
Ｇ−50によりゲル過活性画分乾燥品500mgを
0.01M重炭酸アンモニウム50ml溶液（PH8.0）に
溶解し、重炭酸アンモニウム濃度勾配（0.1〜
0.4M）によりイオン交換クロマトグラフイー
（流速43ml／時間、フラクシヨン10ml／チユーブ）
を行なつた。上記で得た活性画分につき、以後実施例１と同
一操作を繰返して、目的とするウシ血清アルブミ
ン由来ペプチドを得た。その収量は原料アルブミ
ン１ｇ当り1350μｇであつた。またその物性は実
施例１で得たそれと一致した。実施例３実施例１におけるウシ血清アルブミンに代え、
ヒト血清アルブミン（フラクシヨンＶ、脱脂肪
酸、生化学工業社製）を用い、同一操作を繰返し
て、ヒト血清アルブミン由来ペプチド（ペプチド
Ｈ）を得た。上記で得たヒト血清アルブミン由来ペプチドは
以下の物性を有している。 (1) SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動実施例
１の(1)で行なたと同様な方法により測定した結
果を参考写真２に示す。参考写真２（左）より上記ペプチドは、２本
のバンドを示し、各バンドは分子量マーカー
6214と2512との間に現れ、その夫々の分子量は
約5000及び3500であつた。 (2) アミノ酸分析実施例１の(2)で行なつたと同様な方法により
分析した結果を下記第３表に示す。【表】【表】 (3) Ｎ−末端アミノ酸配列実施例１の(3)で行なつたと同様な方法により
測定した結果第１段階でArg及びLeuが、第２
段階でHis及びValが、第３段階でPro及びArg
が夫々同定された。以上の理化学的性質及び構造的特徴より、本
実施例で得られたペプチドは、ヒト血清アルブ
ミンの115番目のアミノ酸であるLeuをＮ末端
とし、144番目のArgをＣ末端とする30個のア
ミノ酸よりなるペプチドと、145番目のArgを
Ｎ末端とし、186番目のArgをＣ末端とする42
個のアミノ酸よりなるペプチドとが、124番目
のCysと169番目のCysとの間でＳ−Ｓ結合にて
架橋された、以下の一次構造式で示されるもの
であると推定される。一次構造式〔２〕【表】
｜｜

S Asp
185
｜｜
Leu−Glu−Asp−Leu−Lys−Pro−
Leu−Leu−Cys−Ala−Ala−Lys
｜
177 174
Arg−OH
186 C末端
実施例４実施例１におけるウシ血清アルブミンに代え、
ラツト血清アルブミン（フラクシヨンＶ、生化学
工業社製）を用い、同一操作を繰返して、ラツト
血清アルブミン由来ペプチド（ペプチドＲ）を得
た。上記で得たラツト血清アルブミン由来ペプチド
は以下の物性を有している。 (1) SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動実施例１の(1)で行なたと同様な方法により測
定した結果を参考写真３に示す。参考写真３（右）より上記ペプチドは、２本
のバンドを示し、各バンドは分子量マーカー
6214と2512との間にあらわれ、その夫々の分子
量は約5700及び3500であつた。 (2) アミノ酸分析実施例１の(2)で行なつたと同様な方法により
分析した結果を下記第４表に示す。【表】【表】 (3) Ｎ−末端アミノ酸配列実施例１の(3)で行なつたと同様な方法により
測定した結果第１段階でArg及びAspが、第２
段階でHis及びAspが、第３段階でPro及びAsn
が夫々同定された。以上の理化学的性質及び構造的特徴より、本実
施例で得られたペプチドは、ラツト血清アルブミ
ンの107番目のアミノ酸であるAspをＮ末端とし、
144番目のArgをＣ末端とする38個のアミノ酸よ
りなるペプチドと、145番目のArgをＮ末端とし、
186番目のLysをＣ末端とする42個のアミノ酸よ
りなるペプチドとが、124番目のCysと169番目の
Cysとの間でＳ−Ｓ結合にて架橋された以下の一
次構造式で示されるものであると推定される。一次構造式〔３〕【表】
｜｜

S Asp
185
｜｜
Val−Ala−Asp−Leu−Lys−Pro−
Thr−Leu−Cys−Ala−Ala−Lys
｜
177 174
Lys−OH

186 C末端

以下上記実施例で得らペプチド試料についてイ
ンスリン作用促進活性の試験例を挙げる。試験例１実施例１で行なつたウシ血清アルブミンのトリ
プシン処理に関し、トリプシンによる消化時間、
即ち15分、30分、１時間、２時間及び14時間の
夫々についてその消化物のインスリン作用促進活
性をＤ−〔Ｕ−¹⁴C〕グルコースの脂肪酸への転換
量を指標として前述した方法により測定した、結
果を第４図に示す。第４図において、１は消化物＋0.2ｍＵ／mlイ
ンスリンを、また２は消化物単独の場合を各々示
す。第４図より消化物単独ではいずれの処理時間に
対しても脂肪酸への転換量の増加はみられないの
に対し、インスリン共存下では処理時間が長くな
るのに従い脂肪酸への転換量の増加、即ちインス
リン作用促進活性が現れ、４時間以上では最大の
活性（約500％）が得られることが判る。試験例２各哺乳動物の血清アルブミンにつき、トリプシ
ン未処理のものと実施例１、３及び４で得たトリ
プシン処理後のもの（未糖製）の各々のつき、Ｄ
−〔Ｕ−¹⁴C〕グルコースから脂肪酸への転換量を
指標とした前述した方法によりインスリン作用促
進活性を測定した。結果を第５表に示す。【表】上記第５表より、インスリン無添加の条件下で
は、トリプシン処理の有無にかかわらず、いずれ
の血清アルブミンを用いても脂肪酸への転換量の
増加はみられず、インスリン存在下でもトリプシ
ン未処理ではいずれの血清アルブミンにも脂肪酸
への転換量の増加が認められない。これに対し
て、トリプシン処理を行なうことにより、ウシ、
ヒト及びラツトのいずれかの血清アルブミンにお
いても対照群に比し、有意な脂肪酸への転換量の
増加、即ちインスリン作用促進活性が現われるこ
とが判る。試験例３実施例１、３及び４で得た各哺乳動物の血清ア
ルブミン由来ペプチド（ペプチドＢ、Ｈ、Ｒ）の
各種濃度におけるインスリン作用促進活性を、前
述した方法により測定した。その結果、第５図に
示す。第５図において、Ｂ−１はウシ血清アルブミン
由来ペプチド＋0.2ｍＵ／mlインスリンを、Ｂ−
０はウシ血清アルブミン由来ペプチド単独を、Ｈ
−１は血清アルブミン由来ペプチド＋0.2ｍＵ／
mlインスリンを、Ｈ−０はヒト血清アルブミン由
来ペプチド単独を、Ｒ−１はラツト血清アルブミ
ン由来ペプチド＋0.2ｍＵ／mlインスリンを、Ｒ
及びＲ−０はラツト血清アルブミン由来ペプチド
単独をそれぞれ示す。第５図よりもウシ、ヒト及びラツト由来のいず
れのペプチドにおいても10^-7Mより、濃度に依存
したインスリン作用促進活性の上昇が見られ、
10^-5MではペプチドＢ及びペプチドＨでは約500
％、ペプチドＲでは約400％の促進活性を示すこ
とが判る。試験例４実施例１で得たウシ血清アルブミン由来ペプチ
ド（ペプチドＢ）の一定量（２×10^-6M）につい
て、添加するインスリンの濃度を段階的に変化さ
せた場合のインスリン作用促進活性を、前述した
Ｄ−〔Ｕ−¹⁴C〕グルコースの脂肪酸への転換量を
指標として測定した。その結果を第６図に示す。第６図において１はペプチドＢ＋インスリン
を、２はインスリン単独の場合を示す。第６図よりペプチドＢは添加するインスリン濃
度に依存して活性を示し、その値はインスリン濃
度が約0.10〜1.0ｍＵ／mlで顕著に上昇し、それ
以上では一定値を示すことが判る。試験例５実施例１で得たウシ血清アルブミン由来ペプチ
ド（ペプチドＢ）がインスリン作用促進活性を有
することを示す他の指標として、単離脂肪細胞で
のＤ−〔Ｕ−¹⁴C〕グルコースからのCO₂産生に及
ぼすインスリンの作用に対して、上記ペプチドが
同様の促進活性を有するかどうかについて実験を
行なつた。即ち、ラツトの副睾丸脂肪組織を摘出し、ロツ
ドベル（Rodbell、Ｍ）の方法〔J.Biol.Chem.、
239、375−380（1964）〕によつて酵素処理して得
た脂肪細胞を１％ウシ血清アルブミン及び１ｍＭ
グルコースを含むクレブスリンゲル（Krebs−
Ringer）HEPES緩衝液（PH7.4）中に懸濁させ
た。この脂肪細胞懸濁液0.4ml（細胞数約５×
10⁴）に、Ｄ−〔Ｕ−¹⁴C〕グルコース10μ
（0.2μCi）を加え、空気100％、37℃で３時間振と
う培養した。¹⁴CO₂の捕集及び計測は、オノ
（Ono.M）等の方法〔Biochim.Biophys.Acta.、
284、285−297（1972）〕に準じて行なた。その結
果を第６表に示す。【表】【表】第６表よりウシ血清アルブミン由来ペプチド
（ペプチドＢ）は、インスリンの存在下でＤ−〔Ｕ
−¹⁴C〕グルコースの細胞内移行を促進し、CO₂
産生を増加させることが実証され、しかもその効
果発現にはインスリンの添加濃度にある最適濃度
が存在していることが示唆される。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明方法による、セフアデツクスＧ
−50を用いたゲル過の溶出パターンを、第２図
はイオン交換カラムグロマトクラフイーの溶出パ
ターンを、第３図は高速液体クロマトグラフイー
での溶出パターンを示す。第４図乃至第６図は本
発明により得られるペプチドのインスリン作用促
進活性を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

１哺乳動物血清アルブミンにトリプシン、アク
ロシン、コクナーゼ及びE.coliプロテアーゼの
少なくとも１種を作用させてインスリン作用促進
活性を有するペプチドを得ることを特徴とする哺
乳動物血清アルブミン由来ペプチドの製造法。