JPH0720992B2 - ヒルディン−ｐａとその誘導体、それらの製造法と応用 - Google Patents
ヒルディン−ｐａとその誘導体、それらの製造法と応用Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明はヒルディン−PAとの誘導体、それらの製造法、
それらを有効成分として含む薬用製剤ならびにそれら有
効成分の応用に関するものである。
それらを有効成分として含む薬用製剤ならびにそれら有
効成分の応用に関するものである。
薬用ヒル（Hirudo medicinalis）からはすでに二三の有
効成分が抽出されている。それらは種々のポリペプチド
類で、タン白分解酵素（プロティナーゼ）阻害剤として
作用し、一部は抗トロンビン作用をもっている。これら
有効成分に関する文献中では、いわゆるエグリン類（Eg
linen）とヒルディン類（Hirudinen）との間に相違があ
る。DE-PS28 08 396には２種類のエグリン類は記載され
ている。粗製ヒルディン類を得る方法は、例えば“Die
Pharmazie"第36巻,653−660頁（1981年）および“Metho
ds in Enzymology"第45巻,669−678頁（1976年）に記載
されている。ヒルディンの主要構成要素たるアミノ酸の
完全な配列順序は、“FEBS1104"（Federation of Europ
ean Biochemical Societies,第165巻,180-184頁（1984
年）によって公知である。
効成分が抽出されている。それらは種々のポリペプチド
類で、タン白分解酵素（プロティナーゼ）阻害剤として
作用し、一部は抗トロンビン作用をもっている。これら
有効成分に関する文献中では、いわゆるエグリン類（Eg
linen）とヒルディン類（Hirudinen）との間に相違があ
る。DE-PS28 08 396には２種類のエグリン類は記載され
ている。粗製ヒルディン類を得る方法は、例えば“Die
Pharmazie"第36巻,653−660頁（1981年）および“Metho
ds in Enzymology"第45巻,669−678頁（1976年）に記載
されている。ヒルディンの主要構成要素たるアミノ酸の
完全な配列順序は、“FEBS1104"（Federation of Europ
ean Biochemical Societies,第165巻,180-184頁（1984
年）によって公知である。
さて驚いたことに粗製ヒルディンは、さらに別の薬理作
用をもつ成分を含むことが発見された。そこで本発明
は、ヒルエキス中の薬理作用をもつ物質について研究す
ること、とくにヒルエキスに含まれるヒルディン成分中
の新しい有効成分について、より詳細に研究することを
目的としている。
用をもつ成分を含むことが発見された。そこで本発明
は、ヒルエキス中の薬理作用をもつ物質について研究す
ること、とくにヒルエキスに含まれるヒルディン成分中
の新しい有効成分について、より詳細に研究することを
目的としている。
本発明により、この目的を達成する方法はヒルディン−
PAと称する新しいヒルディン成分、その分解産物および
その脱硫酸誘導体を製造することである。
PAと称する新しいヒルディン成分、その分解産物および
その脱硫酸誘導体を製造することである。
本発明は下記の式Ｉをもつヒルディン−PAに関係してお
り、 式中のＮ−末端で２個までのアミノ酸が短縮され、およ
び脱硫酸された誘導体で、その場合式Ｉにおいて、 （１）64位のチロジングループ中、フェノール性水酸基
に結合している硫酸基が欠けているもの （２）（１）に記載した硫酸エステル基と最後のアミノ
酸群（66位）または最後の２個のアミノ酸群（66位およ
び65位）が欠けているものならびに薬用に供し得るそれ
らの塩類に関するものである。
り、 式中のＮ−末端で２個までのアミノ酸が短縮され、およ
び脱硫酸された誘導体で、その場合式Ｉにおいて、 （１）64位のチロジングループ中、フェノール性水酸基
に結合している硫酸基が欠けているもの （２）（１）に記載した硫酸エステル基と最後のアミノ
酸群（66位）または最後の２個のアミノ酸群（66位およ
び65位）が欠けているものならびに薬用に供し得るそれ
らの塩類に関するものである。
本発明の主要な物質は式Ｉのヒルディン−PAおよびその
誘導体で、アモノ酸鎖がＮ−末端でシーケンスＩまたは
シーケンスITだけ短縮されたものである。
誘導体で、アモノ酸鎖がＮ−末端でシーケンスＩまたは
シーケンスITだけ短縮されたものである。
とくに優先するのは上記式Ｉのヒルディン−PAおよび、
それから上述の定義に従って脱硫酸された誘導体であ
る。
それから上述の定義に従って脱硫酸された誘導体であ
る。
前述の式中で示されている頭文字は、IUPAC命名法に定
められているペプチド結合のタン白構成アミノ酸類をあ
らわしている。これらタン白類の塩類もまた本発明の対
象物である。
められているペプチド結合のタン白構成アミノ酸類をあ
らわしている。これらタン白類の塩類もまた本発明の対
象物である。
本発明によるヒルディン−PAは、総数66個のアミノ酸か
ら成り、その分子量は7087,比アンチトロンビン活性は6
80−720IU/mg、そのトロンビンとその複合体は解離恒数
ki＝４×10-11Ｍである。
ら成り、その分子量は7087,比アンチトロンビン活性は6
80−720IU/mg、そのトロンビンとその複合体は解離恒数
ki＝４×10-11Ｍである。
ヒルディン−PAとその誘導体は、既知のヒルディンと構
造がきわめて近似である。しかしながらタン白連鎖中の
二三の重要な位置、特にその頭と末尾において、アミノ
酸の配列が、既知のヒルディンと特異的に相違する。そ
こからさらに、実用上大きい意味をもつ相違点が生まれ
る。これらペプチド類の三次構造（Tertir-Struktu
r）は３個のジスルフィド架橋で安定化されている。著
しい点は、ヒルディン−PAの64位にあるチロジン残基の
フェノール性水酸基上に、強酸性の硫酸がモノエステル
結合をしていることである。それはつぎの構造式で示す
ことができる。
造がきわめて近似である。しかしながらタン白連鎖中の
二三の重要な位置、特にその頭と末尾において、アミノ
酸の配列が、既知のヒルディンと特異的に相違する。そ
こからさらに、実用上大きい意味をもつ相違点が生まれ
る。これらペプチド類の三次構造（Tertir-Struktu
r）は３個のジスルフィド架橋で安定化されている。著
しい点は、ヒルディン−PAの64位にあるチロジン残基の
フェノール性水酸基上に、強酸性の硫酸がモノエステル
結合をしていることである。それはつぎの構造式で示す
ことができる。
これらのグループは既知のヒルディンにも存在するが、
その位置が63位である。
その位置が63位である。
ヒルディンは生物学的にKi値が約３×10-11Ｍで、強力
なトロンビン阻害剤に属し、トロンビンに特異的に作用
するが、種々の血液凝固力をもつそのほかのプロティナ
ーゼは阻害しない。ヘパリンとは反対に本発明のヒルデ
ィン類の阻害作用は、トロンビンに直接働くその薬理作
用のうちでは、血液凝固作用が重要で、血栓症の予防に
きわめて好適である。望ましくない副作用は今日までの
ところ確認されていない。犬およびヒトに静脈内投与す
る際、非常に高用量でも心拍数、呼吸、血圧、血小板
数、フィブリノーゲンおよびヘモグロビンに対する影響
は全く見られない。比較実験で本発明の化合物はヘパリ
ンより優れている。
なトロンビン阻害剤に属し、トロンビンに特異的に作用
するが、種々の血液凝固力をもつそのほかのプロティナ
ーゼは阻害しない。ヘパリンとは反対に本発明のヒルデ
ィン類の阻害作用は、トロンビンに直接働くその薬理作
用のうちでは、血液凝固作用が重要で、血栓症の予防に
きわめて好適である。望ましくない副作用は今日までの
ところ確認されていない。犬およびヒトに静脈内投与す
る際、非常に高用量でも心拍数、呼吸、血圧、血小板
数、フィブリノーゲンおよびヘモグロビンに対する影響
は全く見られない。比較実験で本発明の化合物はヘパリ
ンより優れている。
本発明のヒルディン類を製造するには、既知のヒル・エ
キスから出発するのが最もよい。すでに述べたように、
この種のエキスの製造法は、例えば“Die Pharmazie"第
36巻653-660頁（1981年）または“Methods in Enzymolo
gy"第45巻669-678頁（1976年）に述べられている。
キスから出発するのが最もよい。すでに述べたように、
この種のエキスの製造法は、例えば“Die Pharmazie"第
36巻653-660頁（1981年）または“Methods in Enzymolo
gy"第45巻669-678頁（1976年）に述べられている。
その際ヒル（Hirudo medicinalis）またはヒルの頭部を
細切、ホモジナイズして、組織泥を水性アセトンまたは
食塩溶液またはバッファー溶液で抽出し、エタノールで
エキス中の不純物を分画沈澱させ、溶液を真空濃縮し、
濃縮液をアセトンで分画沈澱させる。その高濃度アセト
ン溶液で得られた沈澱を分離、水で抽出、抽出物を凍結
乾燥する。それ自体は既知のこの凍結乾燥物から出発す
る本発明の製造法は、つぎの各項を特徴としている。す
なわち、 （Ａ）得られた凍結乾燥物をpH7.8のバッファーで平衡
させたSephadexカラムでクロマトグラフィーにかける。
細切、ホモジナイズして、組織泥を水性アセトンまたは
食塩溶液またはバッファー溶液で抽出し、エタノールで
エキス中の不純物を分画沈澱させ、溶液を真空濃縮し、
濃縮液をアセトンで分画沈澱させる。その高濃度アセト
ン溶液で得られた沈澱を分離、水で抽出、抽出物を凍結
乾燥する。それ自体は既知のこの凍結乾燥物から出発す
る本発明の製造法は、つぎの各項を特徴としている。す
なわち、 （Ａ）得られた凍結乾燥物をpH7.8のバッファーで平衡
させたSephadexカラムでクロマトグラフィーにかける。
（Ｂ）抗トロンビン活性をもつフラクションを凍結乾燥
し、凍結乾燥物を脱塩して再度凍結乾燥する。
し、凍結乾燥物を脱塩して再度凍結乾燥する。
（Ｃ）凍結乾燥物をDEAC−セルロースを用いるアニオン
交換クロマトグラフィーにかけ、その際pH6.5のバッフ
ァーで平衡させpH6.0のバッファーで溶離する。
交換クロマトグラフィーにかけ、その際pH6.5のバッフ
ァーで平衡させpH6.0のバッファーで溶離する。
（Ｄ）抗トロンビン活性をもつフラクションを凍結乾燥
し、脱塩後再度凍結乾燥する。
し、脱塩後再度凍結乾燥する。
（Ｅ）凍結乾燥物をpH6.0のバッファーで平衡させたDEA
C−Sephadexカラムに流し、pH5.0のバッファーとpH3.7
のバッファーとから造った一連の直線グラージェント．
バッファーで溶離する。
C−Sephadexカラムに流し、pH5.0のバッファーとpH3.7
のバッファーとから造った一連の直線グラージェント．
バッファーで溶離する。
（Ｆ）pH4.6およびpH4.7で溶離される抗トロンビン活性
フラクションを凍結乾燥し、脱塩後再度凍結乾燥する。
フラクションを凍結乾燥し、脱塩後再度凍結乾燥する。
（Ｇ）最後にC18型逆相分離剤（reversed phase-Trennm
aterial）を充填したHPLCカラムを用いて凍結乾燥物を
クロマトグラフィーにかけ、溶離液として、（Ａ）トリ
フルオロ酢酸の0.1％水溶液、（Ｂ）フルオロ酢酸の0.1
％アセトニトリル溶液に（Ａ）を40％（V/V）加えた溶
液を用い、イソクラティック（isokratische:単一溶媒
組成溶離）な条件下〔（Ａ）63％＋（Ｂ）37％〕に、４
種類のトロンビン阻害フラクションを得る。この４種の
フラクションの中、第一のフラクションが求めるヒルデ
ィン−PAを含んでいる。
aterial）を充填したHPLCカラムを用いて凍結乾燥物を
クロマトグラフィーにかけ、溶離液として、（Ａ）トリ
フルオロ酢酸の0.1％水溶液、（Ｂ）フルオロ酢酸の0.1
％アセトニトリル溶液に（Ａ）を40％（V/V）加えた溶
液を用い、イソクラティック（isokratische:単一溶媒
組成溶離）な条件下〔（Ａ）63％＋（Ｂ）37％〕に、４
種類のトロンビン阻害フラクションを得る。この４種の
フラクションの中、第一のフラクションが求めるヒルデ
ィン−PAを含んでいる。
（Ｈ）ヒルディン−PAの脱硫酸体をつくるには、64位に
あるチロジン残基のフェノール性水酸基に結合している
硫酸基を加水分解によって離脱させ、かつ、希望する場
合には、上記脱硫反応で生成する66位、65位のアミノ酸
を別々に、あるいは一緒に加水分解的に切断する。そし
て （Ｉ）ヒルディン−PAの分解産物をつくにはヒルディン
−PAをペプチダーゼとインキュベートし、生成物をRP−
HPLCで分離、各々の生成物を単離し、凍結乾燥する。
あるチロジン残基のフェノール性水酸基に結合している
硫酸基を加水分解によって離脱させ、かつ、希望する場
合には、上記脱硫反応で生成する66位、65位のアミノ酸
を別々に、あるいは一緒に加水分解的に切断する。そし
て （Ｉ）ヒルディン−PAの分解産物をつくにはヒルディン
−PAをペプチダーゼとインキュベートし、生成物をRP−
HPLCで分離、各々の生成物を単離し、凍結乾燥する。
Ａ項のクロマトグラフィーは、主としてSephadex G-75
を用いて行い、その際pH7.8のバッファーとして、トリ
エタノールアミン50mM、食塩300mMまたは400mMを含む水
溶液を用いる。これらのバッファー溶液にも、また後に
述べるバッファーにも、これにさらに例えば0.02％のNa
N3を加えることができる。
を用いて行い、その際pH7.8のバッファーとして、トリ
エタノールアミン50mM、食塩300mMまたは400mMを含む水
溶液を用いる。これらのバッファー溶液にも、また後に
述べるバッファーにも、これにさらに例えば0.02％のNa
N3を加えることができる。
陰イオン交換クロマトグラフィーは主としてWhatman DE
-52またはDE-53を用いて行い、その際pH6.3の平衡用バ
ッファーとしては、主として酢酸アンモニウムバッファ
ー（NH4Ac30mMに、必要に応じてNaN30.02％を加えても
の）を、またpH6.0の溶離用バッファーとしては主とし
て酢酸ナトリウムバッファー（その組成:NaAc0.2M＋NaC
l0.19M）を用いる。
-52またはDE-53を用いて行い、その際pH6.3の平衡用バ
ッファーとしては、主として酢酸アンモニウムバッファ
ー（NH4Ac30mMに、必要に応じてNaN30.02％を加えても
の）を、またpH6.0の溶離用バッファーとしては主とし
て酢酸ナトリウムバッファー（その組成:NaAc0.2M＋NaC
l0.19M）を用いる。
溶離用バッファーとしては食塩のグラーディエントを用
いることもでき、その場合まず酢酸アンモニウム0.03M,
食塩0.19M,pH6.5を用い、ついで酢酸アンモニウム0.03
M,食塩0.3M,pH6.5を用いて行う。
いることもでき、その場合まず酢酸アンモニウム0.03M,
食塩0.19M,pH6.5を用い、ついで酢酸アンモニウム0.03
M,食塩0.3M,pH6.5を用いて行う。
Sephadex DEAE-A25クロマトグラフィーではpH6.0のバッ
ファーとして、主として前述の組成の酢酸ナトリウムバ
ッファーを用いる。pHグラージェントの調整には、同じ
く前述のバッファーで、一方はpH5.0、他方はpH3.7のも
のを用いる。pHが約4.6から4.7までで溶離されるフラク
ションは、抗トロンビン活性をもち、ヒルディン・プー
ル１と称する。ほぼpH4.4で溶離されるフラクションは
ヒルディン・プール２として単離される。
ファーとして、主として前述の組成の酢酸ナトリウムバ
ッファーを用いる。pHグラージェントの調整には、同じ
く前述のバッファーで、一方はpH5.0、他方はpH3.7のも
のを用いる。pHが約4.6から4.7までで溶離されるフラク
ションは、抗トロンビン活性をもち、ヒルディン・プー
ル１と称する。ほぼpH4.4で溶離されるフラクションは
ヒルディン・プール２として単離される。
抗トロンビン活性をもつプール１は、ついで凍結乾燥
し、脱塩後再度凍結乾燥する。
し、脱塩後再度凍結乾燥する。
脱塩は通常Sephadex G25を用いて行われる。その際展開
剤としては水を用いる。HPLC−分離には、例えばSupelc
o−カラムLC-18-DB型、５μｍまたはLichrospher−カラ
ム100CH-18/2型、５μm4.6×250ml（Merck社製）を用い
る。
剤としては水を用いる。HPLC−分離には、例えばSupelc
o−カラムLC-18-DB型、５μｍまたはLichrospher−カラ
ム100CH-18/2型、５μm4.6×250ml（Merck社製）を用い
る。
この種カラムを用いる操作は、流速1ml/分、温度25℃で
実施し、214nmおよび254nmで検出する。
実施し、214nmおよび254nmで検出する。
この方法でヒルディン・プール１をHPLC−分離すると４
個のトロンビン阻害因子が得られる。量が最も多いもの
は、文献で既知のヒルディンと一致する。その他の小フ
ラクションは、既知のヒルディンのアミノ酸が交換され
ている点で相違するだけである。本発明のヒルディン−
PAは、効力最強のフランクションとその次に強いフラク
ションとその次に強いフラクションに含まれている。そ
れはＮ−末端イソロイシンをもつ、完全に新規な形の阻
害剤であり、下記のような特質と配列順序をもっている
ことが確立された。
個のトロンビン阻害因子が得られる。量が最も多いもの
は、文献で既知のヒルディンと一致する。その他の小フ
ラクションは、既知のヒルディンのアミノ酸が交換され
ている点で相違するだけである。本発明のヒルディン−
PAは、効力最強のフランクションとその次に強いフラク
ションとその次に強いフラクションに含まれている。そ
れはＮ−末端イソロイシンをもつ、完全に新規な形の阻
害剤であり、下記のような特質と配列順序をもっている
ことが確立された。
上述のヒルディン−PAフラクションのタン白は、固定相
に固定され、その状態でエドマン（Edman）分解に付せ
られた。この場合に用いられた固定相上で自動的にアミ
ノ酸配列順位を決定する標準操作については、例えば次
の２つの総説論文に記載されている。すなわち:W.Machl
eidt“Modern Methods in Protein-Chemistry-Revue Ar
ticles"（Walter de Gruyter ＆ Co.,Berlin,New York,
1983年発行）およびRichard A.Laursen,W.Machleidt:
“Methods of Biochemical Analysis"第26巻201-284頁
（1980年）に述べられている。この場合、アミノ酸配列
順序を決定すべきペプチド（zusequenzierende Pepti
d）は、アミノ酸測鎖の官能基を介して、不溶性相体す
なわち固定相に共有結合により固定される。固定相上で
はエドマン分解の環化反応が進行し、それが逐次Ｎ−末
端のアミノ酸の切断を起こすに至る。ペプチドと固定相
との結合は、エドマン分解の条件下に安定でなければな
らないが、しかしそれがＣ−末端までの分解を妨げては
ならない。
に固定され、その状態でエドマン（Edman）分解に付せ
られた。この場合に用いられた固定相上で自動的にアミ
ノ酸配列順位を決定する標準操作については、例えば次
の２つの総説論文に記載されている。すなわち:W.Machl
eidt“Modern Methods in Protein-Chemistry-Revue Ar
ticles"（Walter de Gruyter ＆ Co.,Berlin,New York,
1983年発行）およびRichard A.Laursen,W.Machleidt:
“Methods of Biochemical Analysis"第26巻201-284頁
（1980年）に述べられている。この場合、アミノ酸配列
順序を決定すべきペプチド（zusequenzierende Pepti
d）は、アミノ酸測鎖の官能基を介して、不溶性相体す
なわち固定相に共有結合により固定される。固定相上で
はエドマン分解の環化反応が進行し、それが逐次Ｎ−末
端のアミノ酸の切断を起こすに至る。ペプチドと固定相
との結合は、エドマン分解の条件下に安定でなければな
らないが、しかしそれがＣ−末端までの分解を妨げては
ならない。
この操作法を行うに際し、システイン酸のフェニルチオ
尿素誘導体が、システイン残基の位置同定の上に極めて
好適である。だからＮ−末端のアミノ酸配列順序を解明
するために、ヒルディン−PAの自然体および酸化体を用
いて逐次分解を行った。一つの分解ごとにタン白25nMol
を用い、そのタン白の半分はアミノ基を介してジイソシ
アナートグラス（DITC−glas）に、他の半分はカルボキ
シル基のカルボジイミド結合により、アミノプロピルグ
ラス（APG）に固定されていた。この２通りの固定化技
法は、例えば前述の引用文献W.Machleidt“Modern Meth
ods in Protein-Chemistry,1983"の270頁と273頁に記載
されている。リジン残基はα−アミノ基を介して、高収
率でDITC−グラス上に結合するので、１回の分解反応ご
とにＮ−末端アミノ酸も、リジン残基の位置のわかる混
合カップリン法を用いるのてが有利である。
尿素誘導体が、システイン残基の位置同定の上に極めて
好適である。だからＮ−末端のアミノ酸配列順序を解明
するために、ヒルディン−PAの自然体および酸化体を用
いて逐次分解を行った。一つの分解ごとにタン白25nMol
を用い、そのタン白の半分はアミノ基を介してジイソシ
アナートグラス（DITC−glas）に、他の半分はカルボキ
シル基のカルボジイミド結合により、アミノプロピルグ
ラス（APG）に固定されていた。この２通りの固定化技
法は、例えば前述の引用文献W.Machleidt“Modern Meth
ods in Protein-Chemistry,1983"の270頁と273頁に記載
されている。リジン残基はα−アミノ基を介して、高収
率でDITC−グラス上に結合するので、１回の分解反応ご
とにＮ−末端アミノ酸も、リジン残基の位置のわかる混
合カップリン法を用いるのてが有利である。
ヒルディン−PAのシーケンスをまず46位まで解明するこ
とができた（図１）。システイン残基とリジン残基の位
置究明は成功したが、それらのフェニルチオ尿素（PT
H）誘導体は定量することができなかった。開放環はAs
p,Glu,Ser,ThrおよびProのPTH−誘導体をあらわしてい
る。それはPTH−誘導体の収率が低かったアミノ酸類の
代表である。ヒルディン−PA酸化体の逐次分解反応を反
復した場合の収率は10−34回で94％と計算された（図
１）。第35位、すなわちLys35-停止点（Lys35−Ankerpu
kt）ではPTH−アミノ酸の収率が飛躍的に低下する。こ
れらのデータは最後のアミノ酸残基の停止点Lys47を介
してなお少量の材料が結合しており、同時にカルボキシ
ル基カップリングの収率が低かったことを意味してい
る。
とができた（図１）。システイン残基とリジン残基の位
置究明は成功したが、それらのフェニルチオ尿素（PT
H）誘導体は定量することができなかった。開放環はAs
p,Glu,Ser,ThrおよびProのPTH−誘導体をあらわしてい
る。それはPTH−誘導体の収率が低かったアミノ酸類の
代表である。ヒルディン−PA酸化体の逐次分解反応を反
復した場合の収率は10−34回で94％と計算された（図
１）。第35位、すなわちLys35-停止点（Lys35−Ankerpu
kt）ではPTH−アミノ酸の収率が飛躍的に低下する。こ
れらのデータは最後のアミノ酸残基の停止点Lys47を介
してなお少量の材料が結合しており、同時にカルボキシ
ル基カップリングの収率が低かったことを意味してい
る。
第１図の説明 ヒルディンPA酸化物のPTHアミノ酸収率回帰直線（Regre
ssionsgeraden）の計算は、10−34位の閉環体（ausgefu
llten Kreise）から行った。勾配から反復収率が94％と
出た。閉環体はAsp,Glu,Pro,Thr,Serに用いられた。そ
れらは一部が担体の側鎖に固定されているか（Asp,Gl
u）、不完全開裂か（Pro）、または分解反応に当たり一
部破壊される（Thr,Ser）。
ssionsgeraden）の計算は、10−34位の閉環体（ausgefu
llten Kreise）から行った。勾配から反復収率が94％と
出た。閉環体はAsp,Glu,Pro,Thr,Serに用いられた。そ
れらは一部が担体の側鎖に固定されているか（Asp,Gl
u）、不完全開裂か（Pro）、または分解反応に当たり一
部破壊される（Thr,Ser）。
リジンは陽性と判明したが、定量することはできなかっ
た。
た。
ヒルディンPA酸化体のトリプシン分解 トリプシン分解生成物（tryptischen Spaltansatzes）
をRP−HPLCを用いて分離すると、タン白のピークが19個
得られた。ペプチドの確認（Charakterisierung）はア
ミノ酸分析および手動一段式エドマン分解（ein-Schrit
t-Handedmanabbau）、すなわちDABITC/PITC二重カップ
リング法（Doppel-kupplungsmethods,Chang,Brauer＋Wi
ttmann-Liebold,1978,FEBS-Lett.93,205-214（1978）参
照）を用いるＮ−末端決定法によった。ペプチドTR3は
トリペプチドＧ−Ｎ−Ｋと同定され、既知の位置25−27
位と判明した。ペプチドTR16は、従来の配列順位情報と
一致し、36位（Asp）から始まるＣ−末端ペプチドであ
った。このペプチドはAPGとカップルさせたのち、自動
式固定相エドマン分解に付した。AspとGluは側鎖を保護
（Fixierung）したため、これらのPTH誘導体の収率はか
なり低下した。その他の誘導体についてはすでに述べた
とおりである。第２段階エドマン分解（Asu）の収率を1
00％とし、これを基準にしてその他の収率を計算した。
閉環体（Ausgefllten Kreise）に対する回帰直線の勾
配から、反復収率が93.3％と算出された（図２）。
をRP−HPLCを用いて分離すると、タン白のピークが19個
得られた。ペプチドの確認（Charakterisierung）はア
ミノ酸分析および手動一段式エドマン分解（ein-Schrit
t-Handedmanabbau）、すなわちDABITC/PITC二重カップ
リング法（Doppel-kupplungsmethods,Chang,Brauer＋Wi
ttmann-Liebold,1978,FEBS-Lett.93,205-214（1978）参
照）を用いるＮ−末端決定法によった。ペプチドTR3は
トリペプチドＧ−Ｎ−Ｋと同定され、既知の位置25−27
位と判明した。ペプチドTR16は、従来の配列順位情報と
一致し、36位（Asp）から始まるＣ−末端ペプチドであ
った。このペプチドはAPGとカップルさせたのち、自動
式固定相エドマン分解に付した。AspとGluは側鎖を保護
（Fixierung）したため、これらのPTH誘導体の収率はか
なり低下した。その他の誘導体についてはすでに述べた
とおりである。第２段階エドマン分解（Asu）の収率を1
00％とし、これを基準にしてその他の収率を計算した。
閉環体（Ausgefllten Kreise）に対する回帰直線の勾
配から、反復収率が93.3％と算出された（図２）。
アミノ酸分析結果と、配列順位決定後のアミノ酸組成を
比較したところ、１個のアミノ酸の矛盾があらわれた。
すなわち：シーケンス内で１個のGlxの値があまりに少
な過ぎた。このアミノ酸はＣ−末端アミノ酸を形成して
いなければならなかった。もしそうでなければもう１個
のGlxの存在に気付かれなかったはずだからである。Ｃ
−末端の配列および、チロジン残基がヒルディンにおけ
ると同様チロジン−Ｏ−硫酸エステル残基であるか否か
の疑問を解明するため、カルボキシペプチダーゼＹを用
いてＣ−末端配列決定を行わなければならなかった。
比較したところ、１個のアミノ酸の矛盾があらわれた。
すなわち：シーケンス内で１個のGlxの値があまりに少
な過ぎた。このアミノ酸はＣ−末端アミノ酸を形成して
いなければならなかった。もしそうでなければもう１個
のGlxの存在に気付かれなかったはずだからである。Ｃ
−末端の配列および、チロジン残基がヒルディンにおけ
ると同様チロジン−Ｏ−硫酸エステル残基であるか否か
の疑問を解明するため、カルボキシペプチダーゼＹを用
いてＣ−末端配列決定を行わなければならなかった。
第２図の説明 トリプシンペプチドTR16のPTHアミノ酸収率 エドマン分解第２段階の収率を100％とし、これに基づ
いてその他の収率を計算した。回帰直線の計算には閉環
体を引用し、その勾配から反復収率93.3％が得られた。
閉環体はアミノ酸Asp,Glu,Pro,ThrおよびSerに使用した
（図１参照）。
いてその他の収率を計算した。回帰直線の計算には閉環
体を引用し、その勾配から反復収率93.3％が得られた。
閉環体はアミノ酸Asp,Glu,Pro,ThrおよびSerに使用した
（図１参照）。
カルボキシペプチダーゼＹ（CPY）を用いるヒルディンP
AのＣ−末端配列順位決定 ヒルディンPAのＣ−末端配列順位決定は、天然ヒルディ
ン−PA,ペプチドTR16およびあらかじめ60℃,30分間50％
TFAとインキュベートされたペプチドTR16について行っ
た。アスパラギン酸およびその他のアミノ酸が遊離する
に至るに先立ち、まずグルタミン酸が迅速に離脱するの
が見られた（図３）。
AのＣ−末端配列順位決定 ヒルディンPAのＣ−末端配列順位決定は、天然ヒルディ
ン−PA,ペプチドTR16およびあらかじめ60℃,30分間50％
TFAとインキュベートされたペプチドTR16について行っ
た。アスパラギン酸およびその他のアミノ酸が遊離する
に至るに先立ち、まずグルタミン酸が迅速に離脱するの
が見られた（図３）。
チロジンの遊離はTFA処理したペプチドTR16においての
み追跡できたが、他の２つのサンプルにCPYを作用させ
た場合は、合成チロジン−Ｏ−硫酸エステルと同じよう
に振る舞う１個のアミノ酸が脱離した。だからヒルディ
ン−PAの64位にあるチロジン残基も同様にチロジン−Ｏ
−硫酸エステル残基と同定された。だが最も驚くべき結
果はＣ−末端アミノ酸がGluであったことである。TR16
の自動配列順位決定に当たり、この残基が存在するとい
う何らの証拠も得られていなかったので、それは完全に
Ｃ−末端カルボキシル基および側鎖のカルボキシル基を
介して担体にカップリングしており、従ってその同定が
できなかったはずである。AspはCPYで加水分解され難
く、従って分解反応における限定因子である。そのため
にＣ−末端のアミノ酸の位置決定が困難となり、その上
２個のAspが近接配列されてあらわれ、Proは検出されな
かった。従ってCPY−分解によるＣ−末端構造は−Tyr-A
sp-Gluの式しか与えられ得ない。
み追跡できたが、他の２つのサンプルにCPYを作用させ
た場合は、合成チロジン−Ｏ−硫酸エステルと同じよう
に振る舞う１個のアミノ酸が脱離した。だからヒルディ
ン−PAの64位にあるチロジン残基も同様にチロジン−Ｏ
−硫酸エステル残基と同定された。だが最も驚くべき結
果はＣ−末端アミノ酸がGluであったことである。TR16
の自動配列順位決定に当たり、この残基が存在するとい
う何らの証拠も得られていなかったので、それは完全に
Ｃ−末端カルボキシル基および側鎖のカルボキシル基を
介して担体にカップリングしており、従ってその同定が
できなかったはずである。AspはCPYで加水分解され難
く、従って分解反応における限定因子である。そのため
にＣ−末端のアミノ酸の位置決定が困難となり、その上
２個のAspが近接配列されてあらわれ、Proは検出されな
かった。従ってCPY−分解によるＣ−末端構造は−Tyr-A
sp-Gluの式しか与えられ得ない。
第３図の説明 CPYを触媒とするヒルディン−PA,C−末端アミノ酸遊離
反応の時間的経過 ヒルディン−PAをCPY（40/l＝w/w）と、10mMリン酸バッ
ファー（pH7.4）中、37℃でインキュベートした。イン
キュベーション混合物から一定時間おきに一定量のサン
プルを採り、pH2.0に調整して凍結乾燥する。凍結乾燥
中の遊離アミノ酸をアミノ酸分析器にかけて分析した。
プロリンは検出されなかった。Ｃ−末端のシーケンスは
−Tyr-Asp-Gluと決定された。
反応の時間的経過 ヒルディン−PAをCPY（40/l＝w/w）と、10mMリン酸バッ
ファー（pH7.4）中、37℃でインキュベートした。イン
キュベーション混合物から一定時間おきに一定量のサン
プルを採り、pH2.0に調整して凍結乾燥する。凍結乾燥
中の遊離アミノ酸をアミノ酸分析器にかけて分析した。
プロリンは検出されなかった。Ｃ−末端のシーケンスは
−Tyr-Asp-Gluと決定された。
ヒルディン−PA全体のシーケンスは図４に示す。
第４図の説明 下記の方法で同定されたヒルディン−PA構成アミノ酸の
シーケンス： 本発明によるヒルディン−PA分解産物は、ヒルディン−
PAを酵素分解に付し、限定タン白分解を行うことによっ
て得られる。それにはカルボキシペプチダーゼのような
ペプチダーゼ、すなわちアミノ酸鎖をカルボキシル端末
から切断するプロテアーゼ、および／またはアミノペプ
チダーゼ、すなわちアミノ酸鎖をアミノ端末から切断す
るプロテアーゼを用いる。担体と結合した状態でも存在
し得る適当なプロテアーゼは、カルボキシペプチダーゼ
Ａ類、ロイシンアミノペプチダーゼおよびカテプシンA,
B,C,Dであるが、とくに適しているのはカルボキシペプ
チダーゼＹおよびカテプシンＣである。
シーケンス： 本発明によるヒルディン−PA分解産物は、ヒルディン−
PAを酵素分解に付し、限定タン白分解を行うことによっ
て得られる。それにはカルボキシペプチダーゼのような
ペプチダーゼ、すなわちアミノ酸鎖をカルボキシル端末
から切断するプロテアーゼ、および／またはアミノペプ
チダーゼ、すなわちアミノ酸鎖をアミノ端末から切断す
るプロテアーゼを用いる。担体と結合した状態でも存在
し得る適当なプロテアーゼは、カルボキシペプチダーゼ
Ａ類、ロイシンアミノペプチダーゼおよびカテプシンA,
B,C,Dであるが、とくに適しているのはカルボキシペプ
チダーゼＹおよびカテプシンＣである。
カテプシンＣはジペプチジルアミノペプチダーゼ（Dipe
ptidylaminopeptidase）としてジペプチドをタン白の非
置換アミノ端末から切断することが知られている。とこ
ろがヒルディンのタン白分解に際しては、カテプシンＣ
がＣ−端末のエクソペプチダーゼ（Exopeptidase）活性
をもっており、従ってカテプシンＣでヒルディン−PAを
分解すると、Ｃ−端末からも切断されることが発見され
た。
ptidylaminopeptidase）としてジペプチドをタン白の非
置換アミノ端末から切断することが知られている。とこ
ろがヒルディンのタン白分解に際しては、カテプシンＣ
がＣ−端末のエクソペプチダーゼ（Exopeptidase）活性
をもっており、従ってカテプシンＣでヒルディン−PAを
分解すると、Ｃ−端末からも切断されることが発見され
た。
ヒルディンのタン白分解は主としてカテプシンＣを用い
て行われる。インキュベーションは37℃で行うのがよ
い。カテプシンＣの酵素活性における最適pHは、弱酸性
域すなわち５−６である。
て行われる。インキュベーションは37℃で行うのがよ
い。カテプシンＣの酵素活性における最適pHは、弱酸性
域すなわち５−６である。
タン白分解後得られる混合分解産物の分離はHPLCで行わ
れる。クロマトグラフィー用カラムとしては、例えばSu
pelco−カラムLC-18-DBまたはLichrospher−カラム100-
CH-18/2が用いられる。溶離剤としてはトリフルオロ酢
酸の0.1％水溶液（V/V,バッファーＡ）およびトリフル
オロ酢酸の0.1％アセトニトリル溶液にバッファーＡを4
0％（V/V）を加えたものの勾配溶液が好適であると判明
した。
れる。クロマトグラフィー用カラムとしては、例えばSu
pelco−カラムLC-18-DBまたはLichrospher−カラム100-
CH-18/2が用いられる。溶離剤としてはトリフルオロ酢
酸の0.1％水溶液（V/V,バッファーＡ）およびトリフル
オロ酢酸の0.1％アセトニトリル溶液にバッファーＡを4
0％（V/V）を加えたものの勾配溶液が好適であると判明
した。
本発明によれば、脱硫酸ヒルディン−PAは上式のヒルデ
ィン−PA中にモノ硫酸エステルとして存在する64位のチ
ロジン基のフェノール性水酸基を遊離させることによっ
て得られる。
ィン−PA中にモノ硫酸エステルとして存在する64位のチ
ロジン基のフェノール性水酸基を遊離させることによっ
て得られる。
HO-SO2−Ｏ−Pept→HO−Pept の式 （ここでPeptはヒルディンの残余の分をあらわしてい
る）に従って、この基を遊離させるには、例えば加水分
解の方法を用いることができ、その加水分解には、化学
的方法も生物学的方法も利用することができる。
る）に従って、この基を遊離させるには、例えば加水分
解の方法を用いることができ、その加水分解には、化学
的方法も生物学的方法も利用することができる。
化学的に遊離させるには、主として通常の酸性触媒の存
在下に加水分解を行う。それには希塩酸溶液例えば２−
4N塩酸水溶液を用いる方法などがあるが、有利なのは、
反応媒体としてのトリフルオロ酢酸中で行うかトリフル
オロ酢酸の水溶液を反応媒体ならびに溶媒として加えて
用いることである。ペプチド結合切断の危険を最少限度
に止めるために緩和な条件、例えば室温を超えない温度
で行い、かつ加水分解の進行度を薄層クロマトグラフィ
ーなどにより分析しながら追跡することが望ましい。
在下に加水分解を行う。それには希塩酸溶液例えば２−
4N塩酸水溶液を用いる方法などがあるが、有利なのは、
反応媒体としてのトリフルオロ酢酸中で行うかトリフル
オロ酢酸の水溶液を反応媒体ならびに溶媒として加えて
用いることである。ペプチド結合切断の危険を最少限度
に止めるために緩和な条件、例えば室温を超えない温度
で行い、かつ加水分解の進行度を薄層クロマトグラフィ
ーなどにより分析しながら追跡することが望ましい。
だが加水分解には主として、特殊酵素アリルスルファタ
ーゼ（Arylsulfatasen）による生物学的方法が適用され
る。アリルスルファターゼは緩和な条件下に、フェノー
ルの硫酸エステルを分解して遊離のフェノール体を生成
する。硫酸エステル化された水酸基の生物学的遊離は、
有効成分を強化した酵素製剤や単離した酵素を用いて行
うか、あるいは生成したまゝの単離しない酵素系（Enzy
msystemin situ）を用いて行うこともできる。そのよう
な酵素系には、生きたままか、あるいは殺した生物学的
材料、例えば増殖中の微生物あるいは静止中の微生物、
細胞培養物，細胞ホモジネートもしくは細胞の自己融解
物をそのまゝ用いる方法などがある。生物学的方法の一
大長所は、選択性がきわめて高いこと、つまり破壊され
易い原料物質中の他の官能基、とりわけペプチド結合を
破壊することなく、希望するモノ硫酸エステル結合にだ
け作用することである。本発明の化合物は主としてヒル
ディン−PAを、緩衡剤入り水溶液または水性懸濁液中
で、ある種のアリルスルフェターゼ、例えばHelix poma
tia（カタツムリ属の動物）から得られたアリルスルフ
ァターゼとともに、通常酵素反応に用いられる温度、20
−40℃、特に25−30℃で処理して製造される。反応は主
として弱酸性すなわちpH4−７、特にpH5−６で行われ、
このpHは有機カルボン酸のアルカリ金属塩または有機塩
基との塩、例えば酢酸ナトリウム、あるいは特に好んで
用いられる酢酸ピリジン（約pH5.4）の0.03−0.3モル溶
液からなる緩衝液によってつくられる。
ーゼ（Arylsulfatasen）による生物学的方法が適用され
る。アリルスルファターゼは緩和な条件下に、フェノー
ルの硫酸エステルを分解して遊離のフェノール体を生成
する。硫酸エステル化された水酸基の生物学的遊離は、
有効成分を強化した酵素製剤や単離した酵素を用いて行
うか、あるいは生成したまゝの単離しない酵素系（Enzy
msystemin situ）を用いて行うこともできる。そのよう
な酵素系には、生きたままか、あるいは殺した生物学的
材料、例えば増殖中の微生物あるいは静止中の微生物、
細胞培養物，細胞ホモジネートもしくは細胞の自己融解
物をそのまゝ用いる方法などがある。生物学的方法の一
大長所は、選択性がきわめて高いこと、つまり破壊され
易い原料物質中の他の官能基、とりわけペプチド結合を
破壊することなく、希望するモノ硫酸エステル結合にだ
け作用することである。本発明の化合物は主としてヒル
ディン−PAを、緩衡剤入り水溶液または水性懸濁液中
で、ある種のアリルスルフェターゼ、例えばHelix poma
tia（カタツムリ属の動物）から得られたアリルスルフ
ァターゼとともに、通常酵素反応に用いられる温度、20
−40℃、特に25−30℃で処理して製造される。反応は主
として弱酸性すなわちpH4−７、特にpH5−６で行われ、
このpHは有機カルボン酸のアルカリ金属塩または有機塩
基との塩、例えば酢酸ナトリウム、あるいは特に好んで
用いられる酢酸ピリジン（約pH5.4）の0.03−0.3モル溶
液からなる緩衝液によってつくられる。
基質（ヒルディン）に対する酵素の使用比率は一般に製
品の活性に応じて定められ、通常1:2ないし1:100、とり
わけ1:5ないし1:20である；酵素製剤はできるだけ高純
度、高活性のものを用いるのが有利である。アリルスル
ファターゼは硫酸基の分解に際してのみならず、硫酸基
の導入に際しても触媒作用をあらわし、原料と終末生成
物との平衡状態をもたらすように働くので、酵素製剤ご
とに予備実験によって最適濃度、基質に対する使用比
率、および脱硫酸時間を設定するのが有利である。しか
し一般に、数分後には反応が終わっている。活性酵素と
長時間（約４時間まで）接触させておいても（例えば反
応混合物をそのまゝ放置するなどして）、反応生成物の
品質には何らの影響も及ぼさない。
品の活性に応じて定められ、通常1:2ないし1:100、とり
わけ1:5ないし1:20である；酵素製剤はできるだけ高純
度、高活性のものを用いるのが有利である。アリルスル
ファターゼは硫酸基の分解に際してのみならず、硫酸基
の導入に際しても触媒作用をあらわし、原料と終末生成
物との平衡状態をもたらすように働くので、酵素製剤ご
とに予備実験によって最適濃度、基質に対する使用比
率、および脱硫酸時間を設定するのが有利である。しか
し一般に、数分後には反応が終わっている。活性酵素と
長時間（約４時間まで）接触させておいても（例えば反
応混合物をそのまゝ放置するなどして）、反応生成物の
品質には何らの影響も及ぼさない。
酵素による脱硫酸反応進展経過は、分取したサンプルに
ついて、生物分析法により追跡することができる。実用
的には試料を短時間（約３分間）100℃に加熱して酵素
活性を破壊し、基質をカルボキシペプチダーゼＹの一種
で処理する（カルボキシペプチダーゼＹはペプチド鎖を
カルボキシ側から切断し、各アミド化合物を分解するこ
とで、アミノ酸が順次切断されてゆく）。ペプチド鎖は
通常15分で対応する硫酸化された64位のアミノ酸および
／または遊離の64位アミノ酸（Tyr64）が完全に切断さ
れ、普通のアミノ酸分析装置で定量することができると
ころまで進行する。
ついて、生物分析法により追跡することができる。実用
的には試料を短時間（約３分間）100℃に加熱して酵素
活性を破壊し、基質をカルボキシペプチダーゼＹの一種
で処理する（カルボキシペプチダーゼＹはペプチド鎖を
カルボキシ側から切断し、各アミド化合物を分解するこ
とで、アミノ酸が順次切断されてゆく）。ペプチド鎖は
通常15分で対応する硫酸化された64位のアミノ酸および
／または遊離の64位アミノ酸（Tyr64）が完全に切断さ
れ、普通のアミノ酸分析装置で定量することができると
ころまで進行する。
E,D−短縮脱硫酸ヒルディン類は、ヒルディン−PAの加
水分解に際し、２つのＣ末端アミノ酸骨格CluとAspの切
断によって生成する。その際できる混合物の分離は、例
えば生産用規模のHPLC（prparative HPLC-Chromatogr
aphie）によって行われる。脱硫酸ヒルディン−PAはヒ
ルディン−PAと同じ生物学的性質をもっている。
水分解に際し、２つのＣ末端アミノ酸骨格CluとAspの切
断によって生成する。その際できる混合物の分離は、例
えば生産用規模のHPLC（prparative HPLC-Chromatogr
aphie）によって行われる。脱硫酸ヒルディン−PAはヒ
ルディン−PAと同じ生物学的性質をもっている。
本発明の物質は遊離型および塩の形で存在し得る。本品
は遊離のアミノ基またはアミジノ基をもっているので、
酸付加塩（Ｓureadditionassalze）としても存在し得
る。酸付加塩としては、治療に応用可能な通常の酸が付
加してできた塩で、生理的耐容性のある塩が考えられ
る。無機酸としてはハロゲン水素酸例えば塩化水素酸が
考えられるが、硫酸，リン酸，もしくはピロリン酸を挙
げることもできる。有機酸としては、例えばジベンゼン
スルホン酸,p−トルエンスルホン酸，メタンスルホン酸
のような低級アルカンスルホン酸などのスルホン酸類が
あり、他方酢酸，乳酸，パルミチン酸，ステアリン酸，
リンゴ酸，酒石酸，アルコルビン酸および／またはクエ
ン酸のようなカルボン酸類が用いられる。また本発明の
化合物は遊離のカルボキシル基をもっているから、ある
種の塩基との塩、例えばナリウム，カリウム，カルシウ
ムまたはマグネシウム塩、あるいはアンモニウム塩や、
生理的に耐え得る含窒素有機塩基との塩としても存在し
得る。
は遊離のアミノ基またはアミジノ基をもっているので、
酸付加塩（Ｓureadditionassalze）としても存在し得
る。酸付加塩としては、治療に応用可能な通常の酸が付
加してできた塩で、生理的耐容性のある塩が考えられ
る。無機酸としてはハロゲン水素酸例えば塩化水素酸が
考えられるが、硫酸，リン酸，もしくはピロリン酸を挙
げることもできる。有機酸としては、例えばジベンゼン
スルホン酸,p−トルエンスルホン酸，メタンスルホン酸
のような低級アルカンスルホン酸などのスルホン酸類が
あり、他方酢酸，乳酸，パルミチン酸，ステアリン酸，
リンゴ酸，酒石酸，アルコルビン酸および／またはクエ
ン酸のようなカルボン酸類が用いられる。また本発明の
化合物は遊離のカルボキシル基をもっているから、ある
種の塩基との塩、例えばナリウム，カリウム，カルシウ
ムまたはマグネシウム塩、あるいはアンモニウム塩や、
生理的に耐え得る含窒素有機塩基との塩としても存在し
得る。
従って本発明の化合物は、製造操作如何によって遊離型
もしくは酸付加塩，分子内塩，あるいは塩基との塩とし
て得ることができる。遊離化合物からは再度、酸類例え
ばすでに述べた塩を形成する酸類と反応させ、蒸発乾固
法や凍結乾燥法により、治療用に適する酸付加塩を得る
ことがある。分子内塩はpHを適当な中性点に調整するこ
とで得られる。
もしくは酸付加塩，分子内塩，あるいは塩基との塩とし
て得ることができる。遊離化合物からは再度、酸類例え
ばすでに述べた塩を形成する酸類と反応させ、蒸発乾固
法や凍結乾燥法により、治療用に適する酸付加塩を得る
ことがある。分子内塩はpHを適当な中性点に調整するこ
とで得られる。
発明はさらに、本発明の化合物またはその医薬用塩類
を、場合により薬用担体および／または補佐薬とともに
含有する医薬用製剤の製法にも拘わる。
を、場合により薬用担体および／または補佐薬とともに
含有する医薬用製剤の製法にも拘わる。
これらの組成物はそりわけ前日の諸疾患に際し、非経口
的（静脈内，皮内，筋肉内,/皮下）または経口的または
局所に適用するのに好適である。用量は第一に、投与形
態如何と治療または予防の目的如何に関係する。有効１
回投与量（Einzeldosen）および投与方式は、患者個々
人のその時の状態に応じて定めるのが最良である。その
際、重要な血液因子の測定に必要な手段は、専門家によ
く知られている。本発明の化合物を注射する場合の有効
１回容量は、普通0.005−0.1mg/kg（体重）の範囲内で
あるが、主として用いられる範囲は0.01−0.05mg/kg
（体重）である。投与は静注，筋肉注または皮下注射に
よる。従って本薬用製剤の非経口的単一投与形態は、投
与方法如何に応じて１回量が、本発明の化合物0.4−7.5
mgを含む。この薬用製剤は一般に、有効成分のほかにあ
る種のバッファー，例えばpH3.5−７のリン酸のバッフ
ァーを含める必要があり、また等張溶液にするため食
塩，マンニトールまたはソルビトールを加える。本製剤
は凍結乾燥状態または溶解状態で存在し得るが、溶液に
あっては殺菌力のある保存剤を添加するのが有利であ
る。例えば0.2−0.3％の４−ヒドロキシ安息香酸メチル
エステルまたはエチルエステルを添加することができ
る。
的（静脈内，皮内，筋肉内,/皮下）または経口的または
局所に適用するのに好適である。用量は第一に、投与形
態如何と治療または予防の目的如何に関係する。有効１
回投与量（Einzeldosen）および投与方式は、患者個々
人のその時の状態に応じて定めるのが最良である。その
際、重要な血液因子の測定に必要な手段は、専門家によ
く知られている。本発明の化合物を注射する場合の有効
１回容量は、普通0.005−0.1mg/kg（体重）の範囲内で
あるが、主として用いられる範囲は0.01−0.05mg/kg
（体重）である。投与は静注，筋肉注または皮下注射に
よる。従って本薬用製剤の非経口的単一投与形態は、投
与方法如何に応じて１回量が、本発明の化合物0.4−7.5
mgを含む。この薬用製剤は一般に、有効成分のほかにあ
る種のバッファー，例えばpH3.5−７のリン酸のバッフ
ァーを含める必要があり、また等張溶液にするため食
塩，マンニトールまたはソルビトールを加える。本製剤
は凍結乾燥状態または溶解状態で存在し得るが、溶液に
あっては殺菌力のある保存剤を添加するのが有利であ
る。例えば0.2−0.3％の４−ヒドロキシ安息香酸メチル
エステルまたはエチルエステルを添加することができ
る。
局所に適用する製剤は水溶液，ローション，ジェリー，
油性溶液または油性浮遊液，あるいは含脂肪軟膏，とり
わけエマルジョン軟膏とすることができる。水溶液製剤
は、例えば本発明の有効成分またはその治療適用可能な
塩をpH4−6.5の水性バッファー溶液に溶かし、望むなら
ばこれにその他の有効成分，例えば消炎薬および／また
はポリマー結合剤，例えばポリビニルピロリドンおよび
／または保存剤を追加することができる。有効成分濃度
は溶液10ml中、またはジェリー10g中0.08−1.5mgである
が、多くの場合0.25−1.0mgが用いられる。
油性溶液または油性浮遊液，あるいは含脂肪軟膏，とり
わけエマルジョン軟膏とすることができる。水溶液製剤
は、例えば本発明の有効成分またはその治療適用可能な
塩をpH4−6.5の水性バッファー溶液に溶かし、望むなら
ばこれにその他の有効成分，例えば消炎薬および／また
はポリマー結合剤，例えばポリビニルピロリドンおよび
／または保存剤を追加することができる。有効成分濃度
は溶液10ml中、またはジェリー10g中0.08−1.5mgである
が、多くの場合0.25−1.0mgが用いられる。
局所に適用する油性製剤は、例えば本発明の化合物また
はその治療適用可能な塩を油に溶かし、場合によってこ
れにステアリン酸アルミニウムのような膨張剤および／
またはモノステアリン酸グリセリン，モノラウリン酸ソ
ルビタン，モノステアリン酸ソルビタンあるいはモノオ
レイン酸ソルビタンなど、HLB（親水性／親脂肪性バラ
ンス）が10以下の界面活性剤を加えることによって得ら
れる。含脂肪軟膏は、例えば本発明の化合物またはその
塩を塗布可能な軟膏基剤中に浮遊させ、場合によっては
これにHLBが10以下の界面活性剤を加えて得られる。エ
マルジョン軟膏は本発明の有効成分またはその塩の水溶
液を、軟質で塗布可能な脂肪性基剤およびHLB10以下の
界面活性剤とよく練り合わせることによって得られる。
これら局所適用剤形にはすべて保存剤を添加することが
できる。有効成分の濃度は、基剤約10g中約0.08−1.5mg
であるが、多くの場合0.25−1.0mgが用いられる。
はその治療適用可能な塩を油に溶かし、場合によってこ
れにステアリン酸アルミニウムのような膨張剤および／
またはモノステアリン酸グリセリン，モノラウリン酸ソ
ルビタン，モノステアリン酸ソルビタンあるいはモノオ
レイン酸ソルビタンなど、HLB（親水性／親脂肪性バラ
ンス）が10以下の界面活性剤を加えることによって得ら
れる。含脂肪軟膏は、例えば本発明の化合物またはその
塩を塗布可能な軟膏基剤中に浮遊させ、場合によっては
これにHLBが10以下の界面活性剤を加えて得られる。エ
マルジョン軟膏は本発明の有効成分またはその塩の水溶
液を、軟質で塗布可能な脂肪性基剤およびHLB10以下の
界面活性剤とよく練り合わせることによって得られる。
これら局所適用剤形にはすべて保存剤を添加することが
できる。有効成分の濃度は、基剤約10g中約0.08−1.5mg
であるが、多くの場合0.25−1.0mgが用いられる。
医療用に直接人体または哺乳動物の体に適用することを
目的とする上記組成物あるいはその医薬用製剤のほか
に、本発明は、ヒトまたは哺乳動物の生体外において医
療目的に使用する薬用組成物および薬用製剤にも拘わ
る。そのような組成物および製剤は、第一に凝固防止用
血液添加剤として用いられ、生命体の外において循環
用，治療用（例えば人工腎臓での透析用），貯蔵用ある
いは修飾用（例えば血液分画（Haemoseparation）用）
などに供される。
目的とする上記組成物あるいはその医薬用製剤のほか
に、本発明は、ヒトまたは哺乳動物の生体外において医
療目的に使用する薬用組成物および薬用製剤にも拘わ
る。そのような組成物および製剤は、第一に凝固防止用
血液添加剤として用いられ、生命体の外において循環
用，治療用（例えば人工腎臓での透析用），貯蔵用ある
いは修飾用（例えば血液分画（Haemoseparation）用）
などに供される。
貯蔵液や単投与形態（Einzeldosis-Form）の製剤など
は、その組成が前述の注射用製剤に似ている。しかし便
利なのは、有効成分の量または濃度を処理する血液の容
積、もっと厳密にいえば血液中のトロンビン含有量に基
づいて算出することである。その際つぎのことに注意す
る必要がある。すなわち本発明の有効成分（遊離形とし
て）は、 （ａ）ほぼ５倍重量のトロンビンを完全に不活性化す
る； （ｂ）大量でも生理的に無害であり、かつ （ｃ）高濃度でも、循環血液中から速やかに排泄される
ので、例えば輸血に際して過剰投与しても、何らの危険
をも伴わない。
は、その組成が前述の注射用製剤に似ている。しかし便
利なのは、有効成分の量または濃度を処理する血液の容
積、もっと厳密にいえば血液中のトロンビン含有量に基
づいて算出することである。その際つぎのことに注意す
る必要がある。すなわち本発明の有効成分（遊離形とし
て）は、 （ａ）ほぼ５倍重量のトロンビンを完全に不活性化す
る； （ｂ）大量でも生理的に無害であり、かつ （ｃ）高濃度でも、循環血液中から速やかに排泄される
ので、例えば輸血に際して過剰投与しても、何らの危険
をも伴わない。
本発明の化合物およびその塩類を生物学的分析によるト
ロンビン定量に応用すること、ならびに、本発明の有効
物質を含んでいて、この目的に役立つ製剤、例えば固体
混合物ならびに溶液類、特に水溶液も本発明の目的に含
まれる。水溶液は本発明の有効物質（その塩類も含む）
の厳密な量もしくは濃度をもつほかになお不活性補佐
薬、例えば前記注射用製剤のところで述べたような、例
えば安定化作用および／または変質防止作用（Konservi
erende Aufgabe）をもつ補佐薬をも含ませることができ
る。
ロンビン定量に応用すること、ならびに、本発明の有効
物質を含んでいて、この目的に役立つ製剤、例えば固体
混合物ならびに溶液類、特に水溶液も本発明の目的に含
まれる。水溶液は本発明の有効物質（その塩類も含む）
の厳密な量もしくは濃度をもつほかになお不活性補佐
薬、例えば前記注射用製剤のところで述べたような、例
えば安定化作用および／または変質防止作用（Konservi
erende Aufgabe）をもつ補佐薬をも含ませることができ
る。
本明細書ならびに特許請求の範囲では、アミノ酸とその
残基に対し、一般に承認されている命名法規則に従って
略記号を用い、天然産Ｌ−系列のα−アミノ酸をあらわ
す。
残基に対し、一般に承認されている命名法規則に従って
略記号を用い、天然産Ｌ−系列のα−アミノ酸をあらわ
す。
実施例１ 粗ヒルディン（アセトンで分画沈澱させて得られる）2.
5gを20mlの溶離用バッファーに溶かし、Sephadex G-75m
ediumカラム（3.8×150cm）にかける。溶離用バッファ
ーとしてはトリエタノールアミン0.05M,NaCl0.4M,NaN
30.02％からなるpH7.8の溶液を用いる。流速:55ml/h,分
画容積:9.7ml。
5gを20mlの溶離用バッファーに溶かし、Sephadex G-75m
ediumカラム（3.8×150cm）にかける。溶離用バッファ
ーとしてはトリエタノールアミン0.05M,NaCl0.4M,NaN
30.02％からなるpH7.8の溶液を用いる。流速:55ml/h,分
画容積:9.7ml。
トロンビン阻止力のあるフラクションを合併し（300−4
00ml）,UM05−メンブラン付のAmicon限外ロ過セル中で
脱塩、ついで凍結乾燥した。
00ml）,UM05−メンブラン付のAmicon限外ロ過セル中で
脱塩、ついで凍結乾燥した。
凍結乾燥物はDEAE−セルローズ（DE-52,Whatman;2.5×1
00cm）上で陰イオン交換クロマトグラフィーにかけた。
平衡用バッファーは酢酸アンモニウム0.03Mからなり、p
H:6.5;流速:25ml/h;分画容積:8.3ml。
00cm）上で陰イオン交換クロマトグラフィーにかけた。
平衡用バッファーは酢酸アンモニウム0.03Mからなり、p
H:6.5;流速:25ml/h;分画容積:8.3ml。
阻止剤1.4gを平衡用バッファー10mlに溶かし、pHを調整
して、クロマトグラフィーにかけた。
して、クロマトグラフィーにかけた。
カラムはキモトリプシン阻止力が溶離されるまで平衡用
バッファーで展開した。溶離は下記組成の酢酸ナトリウ
ムバッファー（pH6.0）で行った:NaAc0.2M,NaCl0.19M,N
aN3溶液0.02％。
バッファーで展開した。溶離は下記組成の酢酸ナトリウ
ムバッファー（pH6.0）で行った:NaAc0.2M,NaCl0.19M,N
aN3溶液0.02％。
トロンビン阻止フラクションを合併し、限外ロ過法を用
いて前述のように脱塩し、凍結乾燥した。
いて前述のように脱塩し、凍結乾燥した。
続くDEAE−Sephadex A-25（カラム1.9×68cm）によるク
ロマトグラフィーには酢酸ナトリウム0.2M,NaCl0.19Mか
らなるpH6.0の平衡用バッファーを用いた。流速:11ml/
h;分画容積:3.7ml。
ロマトグラフィーには酢酸ナトリウム0.2M,NaCl0.19Mか
らなるpH6.0の平衡用バッファーを用いた。流速:11ml/
h;分画容積:3.7ml。
阻止物質63gを平衡用バッファー10mlに溶かし、pHを調
整したのちクロマトグラフィーにかけた。
整したのちクロマトグラフィーにかけた。
カラムは２時間平衡用バッファーで展開し、ついで同じ
バッファー（pH5.0）におきかえ、さらに14時間平衡さ
せた。
バッファー（pH5.0）におきかえ、さらに14時間平衡さ
せた。
カラムは直線pH−グラーディエントで溶離した（上述と
同じバッファーでpH3.7）。
同じバッファーでpH3.7）。
ほぼpH4.6−4.7で溶離されたトロンビン阻止フラクショ
ンを約3mlに濃縮した。
ンを約3mlに濃縮した。
ついで凍結乾燥し、Sephadex G-25上、水を展開剤とし
て脱塩し、再度凍結乾燥した。
て脱塩し、再度凍結乾燥した。
凍結乾燥物はRP−HPLCを用い、Lichrospher100CH-18/2,
5μm,4.6×250mmで成分分離を行った。溶離にはトリフ
ルオロ酢酸の0.1％水溶液（V/V,バッファーＡと称
す）、およびトリフルオロ酢酸の0.1％アセトニトリル
溶液にバッファーＡを40％加えたもの（V/V,バッファー
Ｂと称す）を用いた。溶離はバッファーA63％とバッフ
ァーB37％からなる溶液（V/V）を用いてイソクラティッ
クに行った。流速:1ml/分，検出:214nmおよび254nmによ
った。滞留時間9.6分で得られる溶離液は、凍結乾燥後
の固形物中に含まれていたヒルディン−PAを含んでい
る。
5μm,4.6×250mmで成分分離を行った。溶離にはトリフ
ルオロ酢酸の0.1％水溶液（V/V,バッファーＡと称
す）、およびトリフルオロ酢酸の0.1％アセトニトリル
溶液にバッファーＡを40％加えたもの（V/V,バッファー
Ｂと称す）を用いた。溶離はバッファーA63％とバッフ
ァーB37％からなる溶液（V/V）を用いてイソクラティッ
クに行った。流速:1ml/分，検出:214nmおよび254nmによ
った。滞留時間9.6分で得られる溶離液は、凍結乾燥後
の固形物中に含まれていたヒルディン−PAを含んでい
る。
実施例２ アリルスルファターゼ（ARS）とインキュベートするこ
とによる脱硫酸誘導体の製造 ARS−原液:ARS浮遊液0.1mlを0.1M酢酸アンモニウム液
（pH5.5）で2.5mlに希釈し、PD10カラムで脱塩した。
とによる脱硫酸誘導体の製造 ARS−原液:ARS浮遊液0.1mlを0.1M酢酸アンモニウム液
（pH5.5）で2.5mlに希釈し、PD10カラムで脱塩した。
ヒルディン−PA原液：バッファー1ml中に2mgを含む。
バッファー：酢酸アンモニウム0.1M溶液,pH5.5。
ヒルディン−PA原液とARS−原液1:10（V/V）の割合で混
合し、25℃でインキュベートして反応の時間的経過をHP
LCで追跡した。24時間インキュベート後３分間90℃に加
熱、混合物を下記の条件下にHPLCで分離した。
合し、25℃でインキュベートして反応の時間的経過をHP
LCで追跡した。24時間インキュベート後３分間90℃に加
熱、混合物を下記の条件下にHPLCで分離した。
カラム:Lichrospher100CH-18/2,5μm,4.6×250mm バッファーA:トリフルオロ酢酸の0.1％水溶液（V/V） バッファーB:トリフルオロ酢酸の0.1％アセトニトリル
溶液にバッファーA30％（V/V）を混合したもの 流速:1ml/分 検出:214nm 温度:25℃ 溶離：バッファーA66％とバッファーB34％（V/V）の混
合溶液により、イソクラティックに行った。
溶液にバッファーA30％（V/V）を混合したもの 流速:1ml/分 検出:214nm 温度:25℃ 溶離：バッファーA66％とバッファーB34％（V/V）の混
合溶液により、イソクラティックに行った。
実施例３ ヒルディン−PA分解産物の製造 ヒルディン−PA溶液〔2mg/ml（バッファー）〕，カテプ
シンＣ−原液（20U/l,14ml）を1:5（V/V）の割合で混合
し、37℃でインキュベートする。タン白分解の時間的経
過をRP−HPLCで追跡する。分解用混合液を５時間インキ
ュベートした後、製造規模のHPLCで分離製造する。その
条件は実施例２で述べたとおりである。
シンＣ−原液（20U/l,14ml）を1:5（V/V）の割合で混合
し、37℃でインキュベートする。タン白分解の時間的経
過をRP−HPLCで追跡する。分解用混合液を５時間インキ
ュベートした後、製造規模のHPLCで分離製造する。その
条件は実施例２で述べたとおりである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ゼーミユーラー，ウルスラ ドイツ連邦共和国デー8000、ミユンヘン 40、デストウヘスシユトラーセ 60 (72)発明者 フリツツ，ハンス ドイツ連邦共和国デー8011、ホーエンブル ン、ノイリンガーシユトラーセ 15 (72)発明者 フインク，エルンスト ドイツ連邦共和国デー2910、ウエスターシ ユテーデーギーセルホルスト、シユテール ホルナーシユトラーセ １
Claims (2)
- 【請求項１】下記式Ｉのアミノ酸配列 を有するポリペプチドであるヒルディン−PA, 式Ｉのヒルディン−PAのＮ−末端の２個までのアミノ酸
欠損ポリペプチド、 式Ｉのヒルディン−PAの64位のチロシンのフェノール性
水酸基上の硫酸エステル基を欠いたポリペプチド、およ
び 式Ｉのヒルディン−PAの64位のチロシンのフェノール性
水酸基上の硫酸エステル基を欠き、かつ66位のＥまたは
65位のＤおよび66位のＥの両方を欠いたポリペプチド、 よりなる群から選ばれたポリペプチドまたはそれらの薬
用に供し得る酸付加塩。 - 【請求項２】下記式Ｉのアミノ酸配列 を有するポリペプチドであるヒルディン−PA, 式Ｉのヒルディン−PAのＮ−末端の２個までのアミノ酸
欠損ポリペプチド、 式Ｉのヒルディン−PAの64位のチロシンのフェノール性
水酸基上の硫酸エステル基を欠いたポリペプチド、およ
び 式Ｉのヒルディン−PAの64位のチロシンのフェノール性
水酸基上の硫酸エステル基を欠き、かつ66位のＥまたは
65位のＤおよび66位のＥの両方を欠いたポリペプチド、 よりなる群から選ばれたポリペプチドまたはそれらの薬
用に供し得る酸付加塩を活性物質として含有することを
特徴とする血液保存用、トロンビン定量用、またはヒト
または哺乳動物の血液凝固防止用医薬組成物。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3445532.9 | 1984-12-13 | ||
| DE3445532A DE3445532A1 (de) | 1984-12-13 | 1984-12-13 | Hirudin-pa, desulfatohirudine-pa, verfahren zur herstellung und pharmazeutische mittel, die diese wirkstoffe enthalten |
| PCT/EP1985/000701 WO1986003493A1 (fr) | 1984-12-13 | 1985-12-12 | Hirudine-pa et ses derives, leur procede de production et leur utilisation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62501011A JPS62501011A (ja) | 1987-04-23 |
| JPH0720992B2 true JPH0720992B2 (ja) | 1995-03-08 |
Family
ID=6252712
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61500425A Expired - Lifetime JPH0720992B2 (ja) | 1984-12-13 | 1985-12-12 | ヒルディン−ｐａとその誘導体、それらの製造法と応用 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4767742A (ja) |
| EP (1) | EP0207956B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0720992B2 (ja) |
| AT (1) | ATE54317T1 (ja) |
| CA (1) | CA1299126C (ja) |
| DE (2) | DE3445532A1 (ja) |
| WO (1) | WO1986003493A1 (ja) |
Families Citing this family (41)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0209061B1 (de) * | 1985-07-17 | 1994-01-12 | Hoechst Aktiengesellschaft | Neue Polypeptide mit blutgerinnungshemmender Wirkung, Verfahren zu deren Herstellung bzw. Gewinnung, deren Verwendung und diese enthaltende Mittel |
| CA1341032C (en) * | 1987-01-23 | 2000-06-20 | John L. Krstenansky | Anticoagulant peptides |
| US5789540A (en) * | 1987-01-23 | 1998-08-04 | Merrell Pharmaceuticals Inc. | Anticoagulant peptides |
| US6005071A (en) * | 1987-01-23 | 1999-12-21 | Merrell Pharmaceuticals Inc. | Anticoagulant peptides |
| US5236898A (en) * | 1987-05-21 | 1993-08-17 | Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. | Cyclic anticoagulant peptides |
| CA1340646C (en) * | 1987-05-21 | 1999-07-13 | John L. Krstenansky | Cyclic anticoagulant peptides |
| US5192745A (en) * | 1987-05-21 | 1993-03-09 | Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. | Cyclic anticoagulant peptides |
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| DE58907266T2 (de) * | 1988-06-11 | 1994-09-29 | Ciba Geigy Ag | Polypeptide mit einer die Koagulierung hemmenden Wirkung. |
| US5268296A (en) * | 1988-06-11 | 1993-12-07 | Ciba-Geigy Corporation | DNA vector and recombinant host cell for production of hirullin P6 and P18 |
| US5167960A (en) * | 1988-08-03 | 1992-12-01 | New England Deaconess Hospital Corporation | Hirudin-coated biocompatible substance |
| US5112615A (en) * | 1988-08-03 | 1992-05-12 | New England Deaconess Hospital Corporation | Soluble hirudin conjugates |
| US4994367A (en) * | 1988-10-07 | 1991-02-19 | East Carolina University | Extended shelf life platelet preparations and process for preparing the same |
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| NL8900943A (nl) * | 1989-04-14 | 1990-11-01 | Euro Biopharm Technology B V | Protease inhibitor. |
| US5179196A (en) * | 1989-05-04 | 1993-01-12 | Sri International | Purification of proteins employing ctap-iii fusions |
| CA2026377A1 (en) * | 1989-10-03 | 1991-04-04 | John L. Krstenansky | Radiolabeled anticoagulant peptides |
| US5192747A (en) * | 1989-10-03 | 1993-03-09 | Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. | Anticoagulant peptides |
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| ATE142648T1 (de) * | 1990-07-24 | 1996-09-15 | Merrell Pharma Inc | Antigerinnungspeptide |
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| DK0687731T3 (da) * | 1990-11-08 | 1999-09-20 | Japan Energy Corp | Sekretionsvektor, transformerede mikroorganismer indeholdende vektoren og fremstilling af produkter fra denne mikroorganism |
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