JPH0542439B2 - - Google Patents
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- JPH0542439B2 JPH0542439B2 JP59090057A JP9005784A JPH0542439B2 JP H0542439 B2 JPH0542439 B2 JP H0542439B2 JP 59090057 A JP59090057 A JP 59090057A JP 9005784 A JP9005784 A JP 9005784A JP H0542439 B2 JPH0542439 B2 JP H0542439B2
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
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- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の目的
産業上の利用分野
本発明は臭化シアンによるペプチド開裂に際し
て、所望でないチオール反応を抑制する改良法に
関する。 従来の技術 組み替えDNA手法の実現により目的物質の製
造、回収および精製に関する多数の製造上の条件
を向上させる必要が生じた。組み替えDNA法に
より製造した生成物は、多くの場合まず「融合遺
伝子生成物」、即ち、導入配列（leading
sequence）および／または後続配列（following
sequence）が所望のアミノ酸配列に結合した生
成物として得られる。従つて、過剰の配列を有す
るペプチドから目的のペプチドを開裂する方法を
見出すことが必要になり、ある公知の化学的方法
が広く用いられてきた。それらの中には、臭化シ
アン（CNBr）を用いて所望ペプチド内のメチオ
ニル残基のカルボキシ末端で開裂させる方法が含
まれる。目的生成物内に利用できるメチオニル残
基が存在せず、目的生成物のアミノ末端と過剰の
ペプチド配列の結合部にメチオニル残基がちよう
ど配列していれば、CNBr開裂は組み替えDNA
法において非常に有効な目的物質製造法になる。 発明が解決しようとする問題点 CNBrを用いた選択的開裂には欠点がないわけ
ではない。１つの大きな欠点は、チオール含有ア
ミノ酸残基を有するペプチドを製造しようとする
場合において明らかである。臭化シアンはチオー
ルのジスルフイドへの変換を促進することにより
CNBr開裂の間に不要の副産物を生成することが
知られている。Ho et al.、Synthetic
Communications３、317−320（1973）には、
CNBrをアルキルおよびアリールナトリウムチオ
ラートと反応させると対応するジスルフイドを生
成することが記載されている。Abe et al.、J.
Org.Chem.39、253−255（1974）には、ホモシス
チンを２−メルカプトエタノールと反応させる
と、ホモシステインおよびホモシステインと２−
メルカプトエタノールとの混合ジスルフイドを生
成することが記載されている。この反応をCNBr
の存在下と非存在下の両方で実施すると、CNBr
存在下において、混合ジスルフイドの量が非常に
増加すると共にホモシステインの量が減少する。 他方、Sekita et al.、Keio J.Med.24、203−
210（1975）がウレアーゼとホスホリラーゼｂの
CNBr開裂を記載しており、該開裂は２−メルカ
プトエタノールを添加することにより増加し得る
ことを示唆しているが、この効果について何ら明
確な根拠を明らかにしていない。また、上記効果
はジチオスレイトールでもチオジグリコールでも
達成されないと報告している。 発明の構成 問題点を解決するための手段および作用 今回、組み替えDNAの工程から得られる発酵
固形物のCNBrを介した不所望のジスルフイドへ
の変換や不可逆なシステイン修飾を、CNBr開裂
に先立つて少量のチオ硫酸イオンを添加すること
により減少させまたは排除できることを見出し
た。基本的に、組み替えDNA法によるチオール
含有ペプチドの製造は、組み替え微生物の発酵、
発酵固形物の回収、CNBrを用いた融合遺伝子生
成物の開裂および開裂した生成物のスルフイトリ
シスによるＳ−スルホン化ペプチドの取得が含ま
れる。得られるペプチドは容易に別のＳ−スルホ
ン化誘導体と結合するか、それ自体で分子内縮合
させて所望のジスルフイド含有生成物を得る。生
成物のスルフイトリシスにおいて、CNBrがチオ
ール含有物質に作用することにより、クロマトグ
ラフイーでの精製工程を複雑にし収率を低下させ
る不可逆的修飾誘導体が多量に生成することが分
かつた。このようにして、生成物の減量とクロマ
トグラフイー上性質が似ている不純物による汚損
が生じる。これらの欠点が共にチオ硫酸イオンの
存在により顕著に減じられまたは排除されること
を見出した。 更に、チオール含有ペプチドのCNBr開裂の間
にチオ硫酸イオンを用いると別の利点が有ること
を見出した。それは、通常続いて行なわれるスル
フイトリシス反応する中間体（おそらくスルフエ
ニルＳ−スルホン化物であると思われる）を生成
させることである。スルフイトリシスは、従来、
チオールペプチドを酸化剤の存在下に亜硫酸ナト
リウムで処理することにより行なわれ、酸化剤と
してはテトラチオン酸が最も好ましいとされてき
た。ところがチオ硫酸イオンの存在下のCNBr開
裂で生成する上記中間体は高価なテトラチオン酸
ナトリウム試薬が存在しなくても亜硫酸ナトリウ
ムで処理すると容易にスルフイトリシスされた生
成物に変換される。 従つて、本発明はチオール含有ペプチドを
CNBrを用いてメチオニル開裂する間の所望でな
いチオール反応を抑制するに際して、該開裂をチ
オ硫酸イオンの存在下で実施することを特徴とす
る方法に関する。 本発明方法は、ペプチド、CNBrおよびチオ硫
酸イオンの相互作用を包含する。所望のペプチド
は、臭化シアンにより攻撃されて開裂するメチオ
ニン残基を少なくとも１個含有し、最少限１個の
チオール含有アミノ酸を含有するものである。こ
の基準に合致するペプチドには、成長ホルモン、
プロインシユリン、インシユリンＡ鎖およびイン
シユリンＢ鎖などがある。 本発明による開裂反応は水性酸溶媒の存在下で
実施する。用い得る代表的な酸は、トリフルオロ
酢酸、酢酸、塩酸、硫酸、リン酸、ギ酸などであ
り、ギ酸が特に好ましい。他に非水性、非酸性溶
媒を溶媒混液中に含有してもよいが、水に対する
酸の割合に注意して制御するのが非常に好まし
い。溶媒混液が非酸性、非水性成分を包含しても
しなくても、酸の至適存在量は、水に対してモル
過剰量である。特に、ギ酸の場合の好ましい酸水
溶液は67.5容量％ギ酸である。 臭化シアンは、出発物質のペプチドに存在する
各々のメチオニンのモル数当り少なくとも１モル
に相当するに充分な量を混液中に添加する。大過
剰量のCNBrを用いることもでき、何ら不都合は
ない。従つて、CNBrはペプチドメチオニル残基
にしておよそ６〜10倍モル量存在する。また、通
常の過剰量のCNBrを用いないとしても、本発明
方法においては、混液中に添加したチオ硫酸イオ
ンのモル量に相当するに充分なモル量のCNBrを
更に加える必要がある。しかし、要するに、メチ
オニル残基とチオ硫酸塩の合計量に対して大過剰
量のCNBrを必ず存在させれば、所望のCNBr量
にすることができる。 本発明方法の要点はチオ硫酸イオンを添加する
ことにある。代表的には、チオ硫酸塩をその無機
塩、一般的にはチオ硫酸ナトリウム、チオ硫酸カ
リウムなどのアルカリ金属塩、の型で添加する。
好ましい塩はチオ硫酸ナトリウムである。 チオ硫酸塩の使用量は混液中に存在するチオー
ルの量に直接依存する。チオール１モル当り少な
くとも１モルのチオ硫酸塩を使用しなければなら
ず、不純物として求核物質が反応液中に存在する
場合はそれに相当し中和し得るに充分な量のチオ
硫酸塩を使用しなければならない。従つて、大過
剰量、例えば、チオール含量の約10倍量までのチ
オ硫酸塩を不都合なしに用い得るし、一般的に用
いる。しかし、本方法においてチオ硫酸塩の使用
し得る量に実質上の上限がないとはいえ、チオ硫
酸塩は臭化シアンを消耗するので普通の条件下で
要する以上の量のCNBrが存在することが必要に
なることに注意しなければならない。従つて、好
ましくはチオ硫酸塩の量をCNBrの不必要な消費
を最少にするように制御する。 本発明の方法による開裂反応は、約15℃から
CNBrの沸点（約35℃）までの温度で実施する。
好ましくは、本反応は約15℃〜約30℃で、最も好
ましくは、約20℃〜約25℃で実施する。 本反応はメチオニール開裂が完了するに充分な
時間、一般的には約12時間までで実施する。普通
は約６時間後に本反応は完了する。 メチオニル開裂が終了したら、混液は普通は約
25℃で減圧下に蒸発させてほぼ乾固し、残渣を元
の濃度の約２倍になるように水に溶解して凍結乾
燥する。この粗製の凍結乾燥物質のスルフイトリ
シスは、一般的に、0.1M亜硫酸ナトリウム、１
ｍＭシステインおよび0.1Mエチレンジアミンの
存在下にPH8.5、22℃で８時間、7M尿素１当り
生成物50ｇの割合で実施する。 明らかなように、本発明方法は、不可逆な副反
応を最小にし、所望のジスルフイド最終産物を製
造するのに用い得るスルフイトリシス生産物に容
易に変換するのに特に適したペプチド中間体を生
成する点で特に有利である。 以下に実施例を提示して本発明方法を例示する
が、本発明の範囲はこれにより制限されるもので
はない。 実施例 １ 融合遺伝子生成物を開裂するインシユリンＡ鎖
の製造 Ａ鎖の凍結乾燥発酵固形物500mgに67.5％
（ｖ／ｖ）ギ酸10mlを加え、15分間撹拌したのち、
チオ硫酸ナトリウム・七水和物15mg（粗製発酵固
形物３％wt／wt）を加えた。チオ硫酸ナトリウ
ムの可溶化に続いて、臭化シアンを0.05M（53mg）
の濃度になるように加えた。本反応は22℃で12時
間後に完了した。得られた試料を減圧下に蒸発さ
せ、元の濃度の２倍になるように水に可溶化して
凍結乾燥した。 実施例 ２ 融合遺伝子生成物を開裂するインシユリンＢ鎖
の製造 Ｂ鎖の凍結乾燥発酵固形物900mgに67.5％
（ｖ／ｖ）ギ酸10mlを加え、15分間撹拌したのち、
チオ硫酸ナトリウム・七水和物27mg（粗製発酵固
形物３％wt／wt）を加えた。チオ硫酸ナトリウ
ムの可溶化に続いて、臭化シアンを0.10M（106
mg）の濃度になるように加えた。本反応は22℃で
12時間後に完了した。得られた試料を減圧下に蒸
発させ、元の濃度の２倍になるように水に可溶化
して凍結乾燥した。 実施例 ３ 融合遺伝子生成物を開裂するプロインシユリン
の製造 プロインシユリン凍結乾燥発酵固形物１ｇに、
67.5％（ｖ／ｖ）10mlを加え、15分間撹拌したの
ち、チオ硫酸ナトリウム・七水和物30mg（粗製発
酵固形物３％wt／wt）を加えた。チオ硫酸ナト
リウムの可溶化に続いて、臭化シアンを0.10M
（106mg）の濃度になるように加えた。本反応は22
℃で12時間後に完了した。得られた試料を減圧下
に蒸発させ、元の濃度の２倍になるように水に可
溶化して凍結乾燥した。 実施例 ４ 開裂融合遺伝子生成物のスルフイトリシス 実施例１〜３で得た開裂融合遺伝子生成物を以
下の方法でスルフイトリシスに付した。 CNBr開裂させた発酵固形物500mgをPH8.5で
0.1Mエチレンジアミン／7M脱イオン尿素10mlに
溶解し、亜硫酸ナトリウム0.1Mの濃度に、シス
テインを１ｍＭの濃度になるように加えた。溶解
後、本反応は22℃で８時間後に完了した。 発明の効果 前述の実施例１〜３のようにして得た生成物を
スルフイトリシスに付して、チオ硫酸ナトリウム
の非存在下に実施してCNBr開裂から得た場合と
比較した。下記の表に示したように、CNBr開裂
に際してチオ硫酸ナトリウムが存在すると、固形
物当りのスルフイトリシスに利用し得る生成物の
量およびスルフイトリシスされた生成物の量が実
質的に増加する。 【表】
て、所望でないチオール反応を抑制する改良法に
関する。 従来の技術 組み替えDNA手法の実現により目的物質の製
造、回収および精製に関する多数の製造上の条件
を向上させる必要が生じた。組み替えDNA法に
より製造した生成物は、多くの場合まず「融合遺
伝子生成物」、即ち、導入配列（leading
sequence）および／または後続配列（following
sequence）が所望のアミノ酸配列に結合した生
成物として得られる。従つて、過剰の配列を有す
るペプチドから目的のペプチドを開裂する方法を
見出すことが必要になり、ある公知の化学的方法
が広く用いられてきた。それらの中には、臭化シ
アン（CNBr）を用いて所望ペプチド内のメチオ
ニル残基のカルボキシ末端で開裂させる方法が含
まれる。目的生成物内に利用できるメチオニル残
基が存在せず、目的生成物のアミノ末端と過剰の
ペプチド配列の結合部にメチオニル残基がちよう
ど配列していれば、CNBr開裂は組み替えDNA
法において非常に有効な目的物質製造法になる。 発明が解決しようとする問題点 CNBrを用いた選択的開裂には欠点がないわけ
ではない。１つの大きな欠点は、チオール含有ア
ミノ酸残基を有するペプチドを製造しようとする
場合において明らかである。臭化シアンはチオー
ルのジスルフイドへの変換を促進することにより
CNBr開裂の間に不要の副産物を生成することが
知られている。Ho et al.、Synthetic
Communications３、317−320（1973）には、
CNBrをアルキルおよびアリールナトリウムチオ
ラートと反応させると対応するジスルフイドを生
成することが記載されている。Abe et al.、J.
Org.Chem.39、253−255（1974）には、ホモシス
チンを２−メルカプトエタノールと反応させる
と、ホモシステインおよびホモシステインと２−
メルカプトエタノールとの混合ジスルフイドを生
成することが記載されている。この反応をCNBr
の存在下と非存在下の両方で実施すると、CNBr
存在下において、混合ジスルフイドの量が非常に
増加すると共にホモシステインの量が減少する。 他方、Sekita et al.、Keio J.Med.24、203−
210（1975）がウレアーゼとホスホリラーゼｂの
CNBr開裂を記載しており、該開裂は２−メルカ
プトエタノールを添加することにより増加し得る
ことを示唆しているが、この効果について何ら明
確な根拠を明らかにしていない。また、上記効果
はジチオスレイトールでもチオジグリコールでも
達成されないと報告している。 発明の構成 問題点を解決するための手段および作用 今回、組み替えDNAの工程から得られる発酵
固形物のCNBrを介した不所望のジスルフイドへ
の変換や不可逆なシステイン修飾を、CNBr開裂
に先立つて少量のチオ硫酸イオンを添加すること
により減少させまたは排除できることを見出し
た。基本的に、組み替えDNA法によるチオール
含有ペプチドの製造は、組み替え微生物の発酵、
発酵固形物の回収、CNBrを用いた融合遺伝子生
成物の開裂および開裂した生成物のスルフイトリ
シスによるＳ−スルホン化ペプチドの取得が含ま
れる。得られるペプチドは容易に別のＳ−スルホ
ン化誘導体と結合するか、それ自体で分子内縮合
させて所望のジスルフイド含有生成物を得る。生
成物のスルフイトリシスにおいて、CNBrがチオ
ール含有物質に作用することにより、クロマトグ
ラフイーでの精製工程を複雑にし収率を低下させ
る不可逆的修飾誘導体が多量に生成することが分
かつた。このようにして、生成物の減量とクロマ
トグラフイー上性質が似ている不純物による汚損
が生じる。これらの欠点が共にチオ硫酸イオンの
存在により顕著に減じられまたは排除されること
を見出した。 更に、チオール含有ペプチドのCNBr開裂の間
にチオ硫酸イオンを用いると別の利点が有ること
を見出した。それは、通常続いて行なわれるスル
フイトリシス反応する中間体（おそらくスルフエ
ニルＳ−スルホン化物であると思われる）を生成
させることである。スルフイトリシスは、従来、
チオールペプチドを酸化剤の存在下に亜硫酸ナト
リウムで処理することにより行なわれ、酸化剤と
してはテトラチオン酸が最も好ましいとされてき
た。ところがチオ硫酸イオンの存在下のCNBr開
裂で生成する上記中間体は高価なテトラチオン酸
ナトリウム試薬が存在しなくても亜硫酸ナトリウ
ムで処理すると容易にスルフイトリシスされた生
成物に変換される。 従つて、本発明はチオール含有ペプチドを
CNBrを用いてメチオニル開裂する間の所望でな
いチオール反応を抑制するに際して、該開裂をチ
オ硫酸イオンの存在下で実施することを特徴とす
る方法に関する。 本発明方法は、ペプチド、CNBrおよびチオ硫
酸イオンの相互作用を包含する。所望のペプチド
は、臭化シアンにより攻撃されて開裂するメチオ
ニン残基を少なくとも１個含有し、最少限１個の
チオール含有アミノ酸を含有するものである。こ
の基準に合致するペプチドには、成長ホルモン、
プロインシユリン、インシユリンＡ鎖およびイン
シユリンＢ鎖などがある。 本発明による開裂反応は水性酸溶媒の存在下で
実施する。用い得る代表的な酸は、トリフルオロ
酢酸、酢酸、塩酸、硫酸、リン酸、ギ酸などであ
り、ギ酸が特に好ましい。他に非水性、非酸性溶
媒を溶媒混液中に含有してもよいが、水に対する
酸の割合に注意して制御するのが非常に好まし
い。溶媒混液が非酸性、非水性成分を包含しても
しなくても、酸の至適存在量は、水に対してモル
過剰量である。特に、ギ酸の場合の好ましい酸水
溶液は67.5容量％ギ酸である。 臭化シアンは、出発物質のペプチドに存在する
各々のメチオニンのモル数当り少なくとも１モル
に相当するに充分な量を混液中に添加する。大過
剰量のCNBrを用いることもでき、何ら不都合は
ない。従つて、CNBrはペプチドメチオニル残基
にしておよそ６〜10倍モル量存在する。また、通
常の過剰量のCNBrを用いないとしても、本発明
方法においては、混液中に添加したチオ硫酸イオ
ンのモル量に相当するに充分なモル量のCNBrを
更に加える必要がある。しかし、要するに、メチ
オニル残基とチオ硫酸塩の合計量に対して大過剰
量のCNBrを必ず存在させれば、所望のCNBr量
にすることができる。 本発明方法の要点はチオ硫酸イオンを添加する
ことにある。代表的には、チオ硫酸塩をその無機
塩、一般的にはチオ硫酸ナトリウム、チオ硫酸カ
リウムなどのアルカリ金属塩、の型で添加する。
好ましい塩はチオ硫酸ナトリウムである。 チオ硫酸塩の使用量は混液中に存在するチオー
ルの量に直接依存する。チオール１モル当り少な
くとも１モルのチオ硫酸塩を使用しなければなら
ず、不純物として求核物質が反応液中に存在する
場合はそれに相当し中和し得るに充分な量のチオ
硫酸塩を使用しなければならない。従つて、大過
剰量、例えば、チオール含量の約10倍量までのチ
オ硫酸塩を不都合なしに用い得るし、一般的に用
いる。しかし、本方法においてチオ硫酸塩の使用
し得る量に実質上の上限がないとはいえ、チオ硫
酸塩は臭化シアンを消耗するので普通の条件下で
要する以上の量のCNBrが存在することが必要に
なることに注意しなければならない。従つて、好
ましくはチオ硫酸塩の量をCNBrの不必要な消費
を最少にするように制御する。 本発明の方法による開裂反応は、約15℃から
CNBrの沸点（約35℃）までの温度で実施する。
好ましくは、本反応は約15℃〜約30℃で、最も好
ましくは、約20℃〜約25℃で実施する。 本反応はメチオニール開裂が完了するに充分な
時間、一般的には約12時間までで実施する。普通
は約６時間後に本反応は完了する。 メチオニル開裂が終了したら、混液は普通は約
25℃で減圧下に蒸発させてほぼ乾固し、残渣を元
の濃度の約２倍になるように水に溶解して凍結乾
燥する。この粗製の凍結乾燥物質のスルフイトリ
シスは、一般的に、0.1M亜硫酸ナトリウム、１
ｍＭシステインおよび0.1Mエチレンジアミンの
存在下にPH8.5、22℃で８時間、7M尿素１当り
生成物50ｇの割合で実施する。 明らかなように、本発明方法は、不可逆な副反
応を最小にし、所望のジスルフイド最終産物を製
造するのに用い得るスルフイトリシス生産物に容
易に変換するのに特に適したペプチド中間体を生
成する点で特に有利である。 以下に実施例を提示して本発明方法を例示する
が、本発明の範囲はこれにより制限されるもので
はない。 実施例 １ 融合遺伝子生成物を開裂するインシユリンＡ鎖
の製造 Ａ鎖の凍結乾燥発酵固形物500mgに67.5％
（ｖ／ｖ）ギ酸10mlを加え、15分間撹拌したのち、
チオ硫酸ナトリウム・七水和物15mg（粗製発酵固
形物３％wt／wt）を加えた。チオ硫酸ナトリウ
ムの可溶化に続いて、臭化シアンを0.05M（53mg）
の濃度になるように加えた。本反応は22℃で12時
間後に完了した。得られた試料を減圧下に蒸発さ
せ、元の濃度の２倍になるように水に可溶化して
凍結乾燥した。 実施例 ２ 融合遺伝子生成物を開裂するインシユリンＢ鎖
の製造 Ｂ鎖の凍結乾燥発酵固形物900mgに67.5％
（ｖ／ｖ）ギ酸10mlを加え、15分間撹拌したのち、
チオ硫酸ナトリウム・七水和物27mg（粗製発酵固
形物３％wt／wt）を加えた。チオ硫酸ナトリウ
ムの可溶化に続いて、臭化シアンを0.10M（106
mg）の濃度になるように加えた。本反応は22℃で
12時間後に完了した。得られた試料を減圧下に蒸
発させ、元の濃度の２倍になるように水に可溶化
して凍結乾燥した。 実施例 ３ 融合遺伝子生成物を開裂するプロインシユリン
の製造 プロインシユリン凍結乾燥発酵固形物１ｇに、
67.5％（ｖ／ｖ）10mlを加え、15分間撹拌したの
ち、チオ硫酸ナトリウム・七水和物30mg（粗製発
酵固形物３％wt／wt）を加えた。チオ硫酸ナト
リウムの可溶化に続いて、臭化シアンを0.10M
（106mg）の濃度になるように加えた。本反応は22
℃で12時間後に完了した。得られた試料を減圧下
に蒸発させ、元の濃度の２倍になるように水に可
溶化して凍結乾燥した。 実施例 ４ 開裂融合遺伝子生成物のスルフイトリシス 実施例１〜３で得た開裂融合遺伝子生成物を以
下の方法でスルフイトリシスに付した。 CNBr開裂させた発酵固形物500mgをPH8.5で
0.1Mエチレンジアミン／7M脱イオン尿素10mlに
溶解し、亜硫酸ナトリウム0.1Mの濃度に、シス
テインを１ｍＭの濃度になるように加えた。溶解
後、本反応は22℃で８時間後に完了した。 発明の効果 前述の実施例１〜３のようにして得た生成物を
スルフイトリシスに付して、チオ硫酸ナトリウム
の非存在下に実施してCNBr開裂から得た場合と
比較した。下記の表に示したように、CNBr開裂
に際してチオ硫酸ナトリウムが存在すると、固形
物当りのスルフイトリシスに利用し得る生成物の
量およびスルフイトリシスされた生成物の量が実
質的に増加する。 【表】
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ CNBrを用いてチオール含有ペプチドをメチ
オニル開裂するに際して、この開裂をチオ硫酸イ
オンの存在下に行なうことを特徴とする該ペプチ
ドの所望でないチオール反応を抑制する方法。 ２ チオ硫酸イオンをアルカリ金属塩として開裂
反応液に加える特許請求の範囲１記載の方法。 ３ アルカリ金属塩がチオ硫酸ナトリウムである
特許請求の範囲２記載の方法。 ４ 該チオール１モル当り少なくとも１モルを満
たすに充分な量のチオ硫酸イオンを反応液に加え
る特許請求の範囲１、２または３記載の方法。 ５ メチオニル開裂を水性酸溶媒の存在下に行な
う特許請求の範囲１または４記載の方法。 ６ 酸がギ酸である特許請求の範囲５記載の方
法。 ７ ギ酸と水の混合液が67.5容量％ギ酸である特
許請求の範囲６記載の方法。 ８ 開裂を約15℃〜約35℃の温度で行なう特許請
求の範囲１記載の方法。 ９ 温度が約20℃〜約25℃である特許請求の範囲
８記載の方法。 １０ メチオニル残基１モルおよびチオ硫酸塩１
モル当り少なくとも１モルを満たすに充分な量の
CNBrを反応液に加える特許請求の範囲１記載の
方法。
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