JPH0549489A - 発酵法によるｌ−フエニルアラニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ブレビバクテリウム属またはコリネバクテ
リウム属に属し、チロシン要求性とＬ−フェニルアラニ
ル−Ｌ−チロシン耐性を有し、かつＬ−フェニルアラニ
ン生産能を有する変異株を用いた発酵法によるＬ−フェ
ニルアラニンの製造法。 【効果】 本発明で使用する菌株はＬ−フェニルアラ
ニンの生産能に優れており、本発明の方法により従来法
より安価かつ効率的にＬ−フェニルアラニンを発酵生産
することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、発酵法によるＬ−フェ
ニルアラニンの製造法に関する。Ｌ−フェニルアラニン
は、必須アミノ酸として、また、医薬品あるいはジペプ
チド甘味料であるＬ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラ
ニンメチルエステルの原料等として重要である。

【０００２】

【従来の技術】従来、発酵法によるＬ−フェニルアラニ
ンの製造法としては、ミクロコッカス属、バチルス属ま
たはブレビバクテリウム属細菌のチロシン要求性変異株
を使用する方法（特公昭３７−６３４５号）、ブレビバ
クテリウム属に属し、チロシンを生育のために要求しか
つ５−メチルトリプトファンに耐性を有する変異株を使
用する方法（特公昭５１−２１０７９号）、アルスロバ
クター属またはコリネバクテリウム属に属し、Ｌ−フェ
ニルアラニン代謝アナログに耐性を有する変異株を使用
する方法（特公昭５１−２８７１２号）、更にはブレビ
バクテリウム属またはコリネバクテリウム属に属し、デ
コイニンに感受性を有する変異株を使用する方法（特公
昭５８−１４１９９号）等が知られている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、Ｌ−
フェニルアラニン生成能が更に向上した変異株を取得す
ることにより、従来法より安価かつ効率的な発酵法によ
るＬ−フェニルアラニンの製造法を提供することであ
る。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、Ｌ−フェ
ニルアラニンを効率よく発酵生産する方法を開発するた
めに鋭意研究を重ねた結果、ブレビバクテリウム属また
はコリネバクテリウム属に属し、チロシン要求性とＬ−
フェニルアラニル−Ｌ−チロシン耐性を有し、かつＬ−
フェニルアラニン生産能を有する変異株の使用がその目
的に適合しうることを見い出し、この知見に基づいて本
発明を完成させるに至った。

【０００５】すなわち、本発明は、ブレビバクテリウム
属またはコリネバクテリウム属に属し、チロシン要求性
とＬ−フェニルアラニル−Ｌ−チロシン耐性を有し、か
つＬ−フェニルアラニン生産能を有する変異株を培養
し、培養液中にＬ−フェニルアラニンを生成蓄積せし
め、これを採取することを特徴とする発酵法によるＬ−
フェニルアラニンの製造法を提供するものである。

【０００６】本発明において使用する変異株は、ブレビ
バクテリウム属またはコリネバクテリウム属に属し、チ
ロシンを生育のために要求し、親株の生育を阻害する濃
度のＬ−フェニルアラニル−Ｌ−チロシンの存在下で生
育可能で、かつＬ−フェニルアラニン生産能を有するも
のである。また、これらの性質に加えて、５−メチルト
リプトファン耐性やフェニルアラニンアナログ耐性等、
Ｌ−フエニルアラニンの生産能を高めることが従来知ら
れている他の性質を付与することにより、更に生産能の
高い変異株を得ることもできる。

【０００７】本発明で使用する変異株を具体的に例示す
れば以下のものがある。

【０００８】ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタ
ム ＡＪ１２６３７（ＦＥＲＭ Ｐ−１２３８３）（チ
ロシン要求性、Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−チロシン耐
性、５−メチルトリプトファン耐性、ｐ−フルオロフェ
ニルアラニン耐性、メチオニン要求性、デコイニン感受
性） コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ＡＪ１２
６３８（ＦＥＲＭ Ｐ−１２３８２）（チロシン要求
性、Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−チロシン耐性）

【０００９】この様な変異株を得る際に使用される親株
としては、ブレビバクテリウム属またはコリネバクテリ
ウム属に属する公知のＬ−フェニルアラニン生産菌を使
用することができる。具体的に例示すると次のようなＬ
−フェニルアラニン生産菌が用いられる。

【００１０】ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタ
ム ＡＪ１１４７５（ＦＥＲＭ Ｐ−５２４８）（チロ
シン要求性、５−メチルトリプトファン耐性、ｐ−フル
オロフェニルアラニン耐性、メチオニン要求性、デコイ
ニン感受性；特公昭５８−１４１９９号公報参照）

【００１１】さらに以下に示すような野生株も親株とし
て使用できる。

【００１２】 ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム ＡＴＣＣ１３８６９ ブレビバクテリウム・フラバム ＡＴＣＣ１４０６７ コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ＡＴＣＣ１３８７０ コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２

【００１３】これらの親株に、先にチロシン要求性を付
与した後Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−チロシン耐性を付
与してもよいし、先にＬ−フェニルアラニル−Ｌ−チロ
シン耐性を付与した後チロシン要求性を付与してもよ
い。

【００１４】これらの親株を変異処理する方法は、例え
ばＸ線や紫外線の照射あるいはＮ−メチル−Ｎ’−ニト
ロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下、ＮＧと記す）等の
変異誘導剤に接触せしめる等の通常の方法が適用でき
る。

【００１５】本発明の変異株の取得のより具体的な実験
例を以下に示す。

【００１６】ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタ
ム ＡＴＣＣ１３８６９より誘導したチロシン要求性、
５−メチルトリプトファン耐性、ｐ−フルオロフェニル
アラニン耐性、メチオニン要求性、デコイニン感受性の
Ｌ−フェニルアラニン生産菌ＡＪ１１４７５（ＦＥＲＭ
Ｐ−５２４８）を完全寒天斜面培地で培養し、生育し
た菌体を集めて０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
に１．１×１０9個／ｍｌになるように懸濁し、これに
２００μｇ／ｍｌの濃度になるようにＮＧを加え、室温
で３０分間保持した後、同緩衝液で洗浄した。得られた
菌体を同緩衝液で希釈し、表１に示す組成に１ｇ／ｌの
Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−チロシンを加えた最少寒天
平板培地に塗布し、３１．５℃で４〜１０日間培養し
た。

【００１７】

【表１】

【００１８】寒天平板培地上に生育したコロニ−を耐性
株として採取した。次いで表２に示す組成の培地を試験
管に３ｍｌずつ分注し１１５℃で１０分間加熱殺菌した
後、予め乾熱滅菌した炭酸カルシウムを１５０ｍｇずつ
加え、この培地に採取した耐性株をそれぞれ一白金耳ず
つ接種し、３１．５℃で７２時間振盪培養し、各耐性株
のＬ−フェニルアラニン生産能を測定した。その結果、
親株に比べてＬ−フェニルアラニン生産能が向上した変
異株が高頻度で見いだされた。かくしてチロシン要求性
とＬ−フェニルアラニル−Ｌ−チロシン耐性を有し、か
つ高いＬ−フェニルアラニン生産能を有する変異株とし
て、ブラビバクテリウム・ラクトフェルメンタム ＡＪ
１２６３７（ＦＥＲＭ Ｐ−１２３８３）を取得した。

【００１９】

【表２】

【００２０】同様な操作により、コリネバクテリウム・
アセトアシドフィラム ＡＴＣＣ１３８７０を親株とし
て、チロシン要求性変異株コリネバクテリウム・アセト
アシドフィラム ＰＨ−１を取得後Ｌ−フェニルアラニ
ル−Ｌ−チロシン耐性を賦与することにより、高いＬ−
フェニルアラニン生産能を有する変異株としてコリネバ
クテリウム・アセトアシドフィラム ＡＪ１２６３８
（ＦＥＲＭ Ｐ−１２３８２）を得た。

【００２１】次にこのようにして得た変異株並びにその
親株のＬ−フェニルアラニル−Ｌ−チロシンに対する耐
性度を調べた結果を表３に示す。測定方法は、完全寒天
斜面培地で培養して得た各菌株の菌体を、小型試験管に
３ｍｌ宛入れた表３に示す濃度のＬ−フェニルアラニル
−Ｌ−チロシンを含む最小培地に接種し、３１．５℃で
２４時間振とう培養を行い、培養液の５６０ｎｍにおけ
る吸光度を測定し生育度を求めることによった。表３に
はＬ−フェニルアラニル−Ｌ−チロシンを含まない最小
培地での生育度を１００とした時の相対値を示した。

【００２２】

【表３】

【００２３】これらの変異株を用いてＬ−フェニルアラ
ニンを生産せしめるには、炭素源、窒素源、無機塩類、
その他必要に応じて有機微量栄養素及び使用する微生物
が要求する栄養物質を含有する通常の液体栄養培地が使
用される。炭素源としては、使用する変異株が利用可能
なものであればよく、例えばグルコース、シュクロー
ス、糖蜜、デンプン加水分解液等が使用される。また窒
素源としては、硫安、尿素、アンモニア等が利用でき
る。有機微量栄養素としてはアミノ酸、ビタミン、脂肪
酸、核酸、さらにこれらのものを含有する酵母エキス、
ペプトン、カザミノ酸、大豆蛋白加水分解物等が使用さ
れる。

【００２４】培養方法は、発酵温度２５〜４０℃、好ま
しくは３０〜３４℃に制御しつつ通気培養を行なう。培
養開始時及び培養中のｐＨは５．０〜９．０、好ましく
は６．０〜７．５に保つのが良く、ｐＨの調整には無機
あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更には尿
素、炭酸カルシウム、アンモニアガス等を使用すること
ができる。かくして１ないし４日間培養を行うことによ
り培養液中に著量のＬ−フェニルアラニンが生成蓄積さ
れる。

【００２５】培養終了後の発酵液からのＬ−フェニルア
ラニンの採取する方法は公知の方法に従って行えばよ
い。例えば培養液より菌体を除いた後適度に濃縮し、Ｌ
−フェニルアラニンの等電点にｐＨを調整し晶析する方
法やイオン交換樹脂を用いる方法等により採取される。

【００２６】

【実施例】次に、実施例によって本発明をさらに詳細に
説明する。

【００２７】

【実施例１】表４に示す組成の培地を５００ｍｌ容振と
うフラスコに２０ｍｌずつ分注し、１１５℃で１０分間
加熱殺菌後、予め１８０℃で２時間乾熱滅菌した炭酸カ
ルシウム１ｇを加えた。この培地に表５に示す本発明で
使用する変異株またはその親株をそれぞれ一白金耳接種
し、３１．５℃で７２時間振とう培養した。培養液中に
生成蓄積したＬ−フェニルアラニンを高速液体クロマト
グラフィー（カラム：三菱化成工業製ＣＰＫ−０８、φ
２．６×５００ｍｍ、溶媒：０．２Ｍリン酸バッファ
ー、検出：ＵＶ２１０ｎｍ）により定量した。

【００２８】

【表４】

【００２９】

【表５】

【００３０】表５に示した結果から明らかなように、本
発明で使用する変異株は親株に比べてＬ−フェニルアラ
ニンの生産能が著しく向上していた。

【００３１】

【実施例２】実施例１の方法により得たブラビバクテリ
ウム・ラクトフェルメンタム ＡＪ１２６３７の培養液
１３５ｍｌを除菌し濃縮晶析によってＬ−フェニルアラ
ニンを採取した。得られたＬ−フェニルアラニンは、
２．８ｇであった。

【００３２】

【発明の効果】本発明で使用する変異株は、親株に比べ
てＬ−フエニルアラニンの生産能が向上しており、著量
のＬ−フェニルアラニンを培養液中に生成蓄積させるこ
とができるため、本発明の方法は、安価かつ効率的な発
酵法によるＬ−フェニルアラニンの製造法として好適で
ある。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ブレビバクテリウム属またはコリネバ
   クテリウム属に属し、チロシン要求性とＬ−フェニルア
   ラニル−Ｌ−チロシン耐性を有し、かつＬ−フェニルア
   ラニン生産能を有する変異株を培養し、培養液中にＬ−
   フェニルアラニンを生成蓄積せしめ、これを採取するこ
   とを特徴とする発酵法によるＬ−フエニルアラニンの製
   造法。