JPH0549647B2 - - Google Patents

Description

請求の範囲 １ グリコサミノグリカンに架橋および共有結合
されたコラーゲン分子から実質的になる繊維格子
に、該繊維格子を創傷部位に適用する前に細胞を
接種してなる上記繊維格子。 ２ 火傷部位の健康組織に通常存在する細胞内タ
ンパクマトリツクスの形態的特徴に似た形態的特
徴を有し、細胞が接種されている、特許請求の範
囲第１項に記載の繊維格子。 ３ 該グリコサミノグリカンが次群：コンドロイ
チン６−サルフエート、コンドロイチン４−サル
フエート、ヘパリン、ヘパランサルフエート、ケ
ラタンサルフエート、デルマタンサルフエート、
キチンおよびキトサンから選択される、特許請求
の範囲第１項に記載の繊維格子。 政府の支持 ここに記載する発明は、ナシヨナル・インスチ
チユーツ・オブ・ヘルス（National Institutes
of Health）からの許可により全部または一部分
が支持されている。 技術分野 本発明は、医薬、外科、生物学、生化学および
ポリマーの分野である。 背景の技術 皮膚への損傷またはその損失は、極端な痛み、
奇形、断節、および死を生ずる、非常に重大な傷
であることがある。ひどく火傷をした人の薬剤お
よび外科の処置は、非常に時間を消費しかつ費用
がかかり、複雑な装置と高度に熟練した人員を必
要とする。広範囲の瘢痕および傷の拘縮は、生理
学的、感情的および社会的な損傷に導びくことが
ある。 皮膚の損失または傷は、火または熱湯により、
機械的または化学的な傷により、あるいは皮膚の
病変により、最も普通に引き起こされる。火傷は
皮膚の最も普通の原因であるので、火傷について
ここで述べる。しかしながら、この分野の専門家
にとつて起こりうる小さい例外を除いて何らかの
種類の傷または病気により生ずる皮膚の損失また
は損傷の処置を本発明により実施できることを理
解すべきである。 火傷、傷、病気、あるいは皮膚または器官の全
部または一部分の除去を受けた人間または動物を
ここで「患者」と呼ぶ。組織が失なわれ、損傷さ
れ、病気となり、あるいは外科的に除去された体
の区域を、ここで「創傷」または「創傷床」と呼
ぶ。細胞を取り入れる無傷の皮膚または器官の区
域、細胞銀行あるいは細胞を取り入れまたは他の
方法で取る組織培養物を、ここで「供与点」とい
う。創傷上の細胞の成長により再生される組織
を、ここで「新真皮」、「新表皮」または「新器
官」の組織という。 皮膚の構造 正常の、損傷を受けない皮膚は、いくつかの層
から構成されている〔１〕。外層、通常上皮と呼
ばれる、はいくつかの種類の上皮細胞細ら構成さ
れる。それは神経のフイブリルを含有するが、血
管を含有しない。上皮の最外層、通常角質層
stratum corneumと呼ばれる、は典型的な増殖
速度が低い扁平（すなわち、比較的平らな）細胞
からなる。これらの細胞は摩耗により徐々に脱ぎ
落ち下層からの細胞と置換される。次ぎの層は通
常淡明層stratum lucidumと呼ばれ、これはある
区域において存在しないことがある。扁平細胞の
最下層は、通常顆粒stratum granulosumと呼ば
れる。それより下に２層の非扁平細胞すなわちマ
ルピギー層（stratum malpighii）（また粉夜網
rete mucosum）および芽層stratum
germinativumが存在する。 表皮の基部（真皮の付近）にまたはその付近に
存在する細胞は、しばしば基底細胞と呼ばれる。
これらは増殖速度が比較的高く、そして他の基底
細胞を生じることがあり、あるいは引き続いて増
殖しない成熟上皮細胞を生じうる。上皮細胞はケ
ラチン、すなわち細胞壁中に分泌されあるいは含
有されうるタンパク質を産生する。このタンパク
質は比較的固く、皮膚に靭性と強さを付与する。 上皮の下には、真皮と呼ばれる細胞および結合
組織の層が存在する。この層は間葉細胞からな
り、線維芽細胞と血管および脈管の細胞を含む。
毛包、脂肪腺および汗腺は真皮から皮膚表面へ延
びる。このような腺および毛包は、上皮でライニ
ングされている。 間葉細胞はコラーゲンすなわち線維のタンパク
質を産性しかつ分泌する。このようなコラーゲン
は細胞を取り囲みかつ含有する構造マトリツクス
を形成し、これは組織の強さを増加する。 真皮との間の界面は、平らであるよりはむし
ろ、折りたたまれ、小突起状をなしている。した
がつて、比較的平らな火傷は上皮の全部と多数の
位置における真皮の一部分を除去するが、損傷区
域において散在する無傷の上皮細胞の群を残す。
多少深い火傷は上皮細胞の表面のすべて（および
同様に真皮細胞の一部分）を除去するが、毛包、
脂肪腺および汗腺をライニングする上皮細胞を破
壊する。これが起こつた場合、毛包および腺から
の上皮細胞は創傷より上方において増殖しかつ移
動することができ、上皮の浅い層をつくる。この
ような層はしばしば不規則でありかつ薄く、そし
て創傷の適切な治ゆを妨害することがある。前述
の火傷のいずれも、第２度の火傷と分類される。
上皮と真皮の全厚さを破壊する火傷は、毛包およ
び腺をライニングする上皮を含み、「完全な厚さ
の」すなわち第３度の火傷として分類される
〔２〕。 火傷の処理 広範な皮膚の損失または傷を受けた患者は、感
染および体液の過度の損失により、直ちに危険に
さらされる。これらの要求の両者を解決するため
には、ひどい皮膚の創傷はある種の膜で速やかに
閉じなくてはならない。この要求を満たすために
種々の試みがなされてきた。パピルスまた動物の
皮膚については、西暦紀元前約1500年にまでさか
のぼることができる。特別に準備されたブタの皮
膚は、商業的に入手容易であるため、今日外科医
によりしばしば使用されている。これらの異種移
植片（すなわち、人間以外の源の膜）を創傷の上
に約３〜５日間おおうことができる。しかしなが
ら、それは患者により拒否され、開いた創傷が残
る。したがつて、それは数日後通常除去または交
換され、患者の皮膚がゆつくり治ゆする間の間に
合わせの役割をする〔３〕。 同種移植片、異型移植片とも呼ばれる、は人間
の死体から得ることができる。しかしながら、そ
れは供給に欠乏し、そして異種移植片と同様に、
短期間後通常拒絶される。免疫抑制薬物を使用し
て、異種移植片または同種移植片の拒絶を減少
し、これによりそれが創傷をおおうことができる
期間を延長することができる。しかしながら、免
疫抑制薬物の使用は患者の感染に対する発病性を
増加する〔４〕。 自己移植片は、患者の損傷を受けない区域ある
いは可能ならば患者の一卵性双子から除去した
（“取り入れた”）皮膚の部分的厚さの断片である。
異種移種片または同種移植片に似ず、自己移植片
は患者により拒絶されず、その代わり、創傷へ永
久的に付着し、増殖するようになりこれにより創
傷を閉じる上皮および真皮の新らしい層を提供す
る〔５〕。 取り入れ（harvesting）手術は、皮膚切除器と
呼ばれる器具を用いて通常実施される。皮膚切除
器は、振動する刃と、カツトの深さおよび幅を調
整する調節装置を含有する〔６〕。角質層statum
corneum中の細胞は通常急速に再生しないので、
事実上すべての取り入れ手術は顆粒stratum
granulosumから細胞を除去する。皮膚の小突起
状の性質のため、ほとんどの取り入れ手術はまた
マルピギー層stratum malpinghiiおよび芽層
stratum germinativumから細胞ならびに有意な
量の真皮を除去する。 取り入れ手術は痛く、侵略的プロセスであり、
傷跡を生ずる。したがつて、それは最小に保つべ
きである。さらに、ひどい傷を受けた患者は体の
ほとんど全部上の皮膚を失なうかあるいは損傷す
ることがある。これは自己移植に有効な、健康な
無傷の皮膚をきびしく制限しうる。これが起こつ
たとき、異種移植片または同種移植片を創傷の表
面全体に配置して感染と脱水を抑制する。それら
の移植片は、自己移植片が入手できるようになる
につれて、徐々に交換する。自己移植片は、供与
点から反復して取り入れることができる。このよ
うな手術において、異種移植片または同種移植片
のある区域を除去しかつ廃棄し、自己移植片と交
換する。各供与点は、他の自己移植片をそれから
取る前に、治ゆさせなくてはならない。これには
実質的な遅延を要し、そして患者の回復を延長す
る。 自己移植法の１つの重要な変法において、ある
パターンのスリツトを取り入れた皮膚の片におい
て切る。これにより皮膚を伸長して網にし、これ
によりその皮膚片によりおおうことができる創傷
の面積を増加する〔７〕。移種後、オートローガ
ス細胞は移動し、増殖し、スリツトで生じたすき
間を満たす。究極的に、自己移植片の助けによ
り、前創傷区域は再生した皮膚の層によりおおわ
れる。この層は、種々の問題、たとえば、肥大し
た傷跡不快、および収縮不能、にされされる。 二重層の膜 出願人は、皮膚の損失または損傷の処置に有用
である合成多層膜（以後、二層の膜）の共同発明
者（他の人を含む）である。米国特許第4060081
号（Yannas et al、1977）および米国特許第
4280954号（Yanns et al、1981）、それらの教示
を引用によつてここに加える、参照。簡単に言え
ば、この膜の上層はシリコーンエラストマーのよ
うなポリマーからなる。この層はいくつかの所望
の物理的性質、たとえば引張り強さ、縫合可能
性、水分束の抑制、およびバクテリアおよびウイ
ルスに対する不透過性を膜に付与する。下層はコ
ラーゲンおよびグリコサミノグリカン（GAG、
ムコポリサツカライドとしても呼ばれる）から作
られた、高度に多孔質の格子からなる。この材料
中の使用に適しうるGAGの種々の形態は、コン
ドロイチン−６−サルフエート、コンドロイチン
４−サルフエート、ヘパリン、ヘパラン サルフ
エート、ケラタン サルフエート、デルマタンサ
ルフエート、チチンおよびチトサンを包含する。 コラーゲン／GAG格子は、支持構造物もしく
は「骨組み」構造物として効果的に作用し、火傷
からの上皮細胞および間葉細胞はその内部また上
部で生成しかつ増殖することができる。その組成
および構造は、移植片受容体による実質的な免疫
応答を誘発しないように調整され、そしてそれは
体により利用または排除される無毒の物質に生分
解される。 コラーゲン／GAG格子のいつかのパラメータ
ー（主として橋かけ密度、多孔度およびGAG含
量）を制御して、格子がコラゲナーゼおよび他の
酵素で生分解される速度を調整することが可能で
ある。過度に急速に生分解する格子は十分な治ゆ
が起こる前に消失し、一方過度にゆつくり生分解
する格子は細胞の移動を妨害しかつ格子を取り囲
む細胞の線維形成層を形成する傾向がある。ほぼ
30日後に生分解する格子を火傷の患者に使用する
ことが好ましいと、信じられる。 火傷は患者が病院へ入れられるとき、完全に破
壊されあるいはひどく損傷した皮膚の区域は死ん
だ皮膚または損傷した皮膚、いわゆる「焼痂」を
しばしば含有する。焼痂を通常外科的に除去し
て、それが治ゆ過程を妨害することを防ぐ。損傷
した皮膚および死んだ皮膚を切除しこれによつて
無傷の上皮細胞が創傷の周辺に存在するようにす
る。前述の二層の膜で創傷表面を注意して包み、
創傷と膜との間に空気ポケツトが捕捉されること
を防ぐ。膜は通常、常用の技術により、無傷の皮
膚へ縫合する。次いで、移植した区域を包帯でお
おう。 コラーゲン／GAG格子は創傷の収縮を減小す
ることを、出願人は観測した。一般に、創傷の収
縮は、創傷中に存在する細胞および創傷の周辺の
水平方向の動きからなる。それは実質的な変形お
よび傷跡を生ずるので、その防止または減少は非
常に望ましい。 数日の期間内で、創傷床からの健康な細胞は膜
のコラーゲン／GAG格子中に移動しかつその内
部で増殖し始める。間葉細胞および微小血管は、
膜の平面に対して垂直の方向に移動する。皮膚表
面はここで水平と見なされるので、間葉皮膚の成
長方向はここで垂直と呼ぶ。上皮細胞は格子表面
を水平方向（すなわち、膜平面に沿つて）移動す
る。火傷および他の皮膚の創傷は比較的浅い傾向
をもつので、間葉細胞は新真皮をつくるために非
常に遠くまで移動する必要はない。しかしなが
ら、上皮細胞は、新上皮をつくりかつ創傷を閉じ
るために、大きい距離を移動することが必要であ
ろう。 30日以内に、上皮細胞は約0.75cmの距離を水平
方向に移動しかつ増殖することができる。したが
つて、約1.5cmより大きくない水平方向の小さい
寸法をもつ創傷は、上皮細胞がすべての側面から
創傷を閉じると仮定すると、約30日以内に上皮移
動により閉じられうるであろう。しかしながら、
広範な火傷はしばしばすべての方向に1.5cmを越
える。たとえば、ひどく火傷を受けた患者は、肩
より下方における皮膚の事実上すべてを失なくと
は異常ではない。したがつて、上皮細胞は数100
日を越える期間の間に正常の移動により大きい創
傷の中央区域へ到達することができない。非常に
大きい創傷のとき、生分解速度が約30日であるコ
ラーゲン／GAG格子は、上皮細胞が創傷を閉じ
ることができるだいぶ前に完全に生分解されるで
あろう。 本発明の開示 本発明は、火傷における細胞の成長または組織
の発生を促進するために、線維質格子中への細胞
の導入に関する。本発明による細胞の導入は、外
科的技法、力を用いる方法またはその他の手法に
より行えるが、本明細書ではこれらをすべて接種
“seding”と呼ぶことにする。接種は、生物学的
に相容性のある格子を火傷の近傍においた場合に
おこる細胞の自然浸潤、泳動および再生とは異な
る。本発明方法による接種に適した一つの型の線
維質格子は、グリコサミノグリカンで架橋された
コラーゲンからなる。 細胞は、本発明方法により、線維質格子中の任
意の特定の所望個所中に導入でき、かつ線維質格
子の任意の所望区域に均一に分配できる。接種プ
ロセスを生き残つた各細胞は再生し増殖して細胞
の群落になる。格子内の各群落は合体するまで成
長して、再生された凝似真皮組織、凝似表皮組織
または凝似器官組織からなる均一層ないし均一体
を形成する。かような群落を発生しうる細胞を適
切に載置することにより回復期間を大巾に短縮で
きる。加えて、コラーゲン／グリコサミノグリカ
ンに接種する本発明方法を用いて再生した組織
は、普通の火傷処置すなわち従来の自己植皮法に
より再生された組織よりも、より滑らかで、より
均一で、線維組織の増殖が少く、瘢痕となりにく
く、かつより可撓性である。 図面の説明 第１図は、皮膚の一部の簡略斜視図である。 第２図は、本発明方法による細胞接種に適切
な、米国特許第4060081号記載の二層膜の斜視図
である。 第３図の、本発明にしたがう自己植皮態様の工
程順を示すフローチヤートである。 第４図は、本発明にしたがいコラーゲン格子上
に細胞の水性懸濁液を分配するのに使用できる態
様の工程順を示すフローチヤートである。 第５図は、本発明にしたがい細胞の水性懸濁液
をコラーゲン格子上に撒布するのに使用できる装
置の斜視図である。 本発明の最良の実施態様 多孔性のコラーゲン格子に細胞を接種するに
は、多くの好ましい実施態様がある。かような実
施態様のいくつかを説明する。便宜上いろいろな
見出しをつけだが、それらの実施態様をそのよう
な見出しに限定するものではない。 各実施態様には一長一短ある。それ故、各実施
態様は一つまたはそれ以上の特定の型の火傷また
は処理目的に対し特に適当であることになる。加
えて、一つの実施態様を他の一つまたはそれ以上
の実施態様と組み合わせることにより、治療の間
に患者の状態または回復の進度に応じて変更でき
る多面的な融通性のある治療計画をたてることも
できる。 自己植皮法 本発明の一つの好ましい実施態様は、二層膜の
使用を含む。使用のしかたは、キセノグラフト
（外来植皮）またはアログラフト（異物植皮）を
含むオートクラフト（自己植皮）技法と若干似て
はいるが、明瞭に異なる。既述のとおり、この二
層膜の一つの層はコラーゲン／GAG格子よりな
り、他方の層はシリコーンゴム透水制御層からな
る。自己植皮態様に含まれる工程順を第３図のフ
ローチヤートに示す。 この実施態様では、必要なら、焼痴その他の傷
んだ皮膚を外科的に除去することにより火傷部の
下準備をする。接種してない膜片を、必要なら鋏
またはスカルペルで縁とりをして適当な大きさに
した後、注意深く傷にかぶせる。膜の曲げ剛性が
充分に低いなら、効果的な接触およびエアポケツ
トの排出と達成でき、これは膜製造の間にある種
のパラメーターを調節することにより達成でき
る。膜は、当初は縫合により所定位置に保持す
る。火傷膜界面の表面エネルギーが火傷−空気界
面の表面エネルギーよりも小さいので、細胞およ
び血管が浸潤する間、膜は火傷と効果的な接触を
保つ。浸潤速度は、火傷の深さ、火傷部に露出さ
せた細胞の型および状態ならびに膜の有孔度厚さ
およびGAG含量を含むいろいろな要因に依存す
る。 現在の技術の状態では、インビボおよびインビ
トロにおける上皮細胞の成長は、線維芽細胞、内
皮細胞およびその他の間葉細胞の存在により促進
されると信じられている〔８〕。 この現象を利用するために、この実施態様の自
己表皮移植操作を、上皮細胞の成長を促進するの
に充分な数の間葉細胞および血管が膜中に成長す
るまで、または充分な無傷の細胞をドナー部から
採取できるまで、数日ないし数週間遅らせること
ができる。 この段階になつたら患者を麻酔し、デルマトー
ムまたはその他の切断装置を用いて、ドナー部か
ら上皮細胞（およびおそらくは間葉細胞）を含ん
だ表皮の薄層を採取する。常用の技法に用いて表
皮片を歯車間に挾むことによりその表面積を拡大
してもよい。患者に移植しておいたコラーゲン／
GAG膜から適当な大きさのシリコーン層を除去
する。シリコーン除去は、自己植皮すべき区域の
周囲に切りこみを入れ、そして格子を火傷部から
はずすことなく注意深くシリコーンをその下にあ
るコラーゲン／GAG格子から剥ぐことなより達
成できる。次いで採取した表皮片を露出したコラ
ーゲン格子の上に乗せ縫合する。しかる後、水分
フラツクス速度すなわち水分吸収速度が適当な任
意のカバリングないし包帯を自己植皮区域上にほ
どこして感染および脱水の防止に資する。 自己植皮した表皮片内の細胞は、群落が合体す
るまで泳動し再生して凝似表皮となる。コラーゲ
ン格子は究極的には生物学的に、格子内で成長す
る細胞が創り出す新しいコラーゲンがこれに代わ
る。凝似表皮が火傷をふさいだ後包帯をとる。 このような自己表皮移植技法は、従来の自己植
皮技法と次に列挙する点を含み多くの点で顕著を
異なる。 １ 従来の自己植皮法で、ドナー部から表皮およ
び真皮を比較的厚い層で採取する必要がある。
たとえば、従来の採取操作の間におけるデルマ
トーム上の設定深度は、通常約0.010ないし約
0.020インチ（約0.25ないし0.5mm）である。こ
のように厚いと採取の際患者の苦痛および血液
損失が増し、かつドナー部には永久的な瘢痕が
残るのが普通である。これに対し二層膜を用い
る自己植皮法でのデルマトーム設定深度は、約
0.002ないし0.004インチ（0.05ないし0.1mm）で
あることができる。したがつて極めて薄い層で
表皮を採取することになり、採取による損傷は
強い日焼けに近いものでしかない。それ故、採
取による苦痛は少く、患者の血液損失およびド
ナー部の永久的な瘢痕化はないかまたは減少す
る。 ２ 供試動物および臨床実験における本発明によ
る植皮操作の結果、二層膜を用いた自己植皮法
は従来の自己植皮法を用いて再生される皮膚よ
りも実質的により滑らかでより軟かくより柔軟
でかつ組織組織の増殖がよい少い皮膚の再生を
促進することを示すものである。これらの結果
はすべて極めて望ましいものであり、火傷区域
の回復、外観および機能を著るしく改善するも
のある。 ３ 強度の火傷をした患者の自己植皮に際しては
自己植皮のドナー部が得られるようになるまで
キセノグラフトまたはアログラフトを利用する
ことは稀ではない。キセノグラフトおよびアロ
グラフトは、炎症および免疫感応をひきおこ
し、患者の体が拒絶反応をおこす。キセノグラ
フトやアログラフトは一時的な保護被覆として
作用するだけで、それらを取去れば後に何も残
らない。だがそれらの使用期間をのばすために
免疫抑制剤を用いると患者は感染しやすくな
る。ところが、二層膜は、適正に調製するな
ら、炎症や拒絶反応をおこさないので、免疫抑
制剤を用いる必要がなくなるかまたは少なくな
る。シリコーン層を除去した場合、コラーゲ
ン／GAG格子は火傷部に接触したまま残り、
その中に細胞および血管が成長し増殖した生物
学的に相容性のある枠組を与えると共に表皮細
胞成長のための適切な表面を与える。 ４ キセノグラフトおよびアログラフトには、し
ばしば脱水収縮およびしわ発生の欠点があり、
患者に不快感をおこすと共に火傷の端部を感染
の危険をさらす。ところが二層膜は、適正に調
製するなら、脱水、収縮またはしわ発生の欠点
がない。 ５ 二層膜はまた、火傷の収縮およびその結果お
こる瘢痕化を防止、遅延または減少する。 細胞の水性懸濁液の製造 本発明のいくつかの好ましい実施態様では、皮
膚の凝集片を解離して、生きている繁殖力のある
細胞が溶液中に分散した懸濁液にする一つまたは
それ以上の公知の技法

〔９〕を活用する。普通の
そのような技法の一つは、採取した皮膚片をトリ
プシン、コラーゲナーゼまたは細胞を他の細胞か
らもしくは固体表面から引きはなすその他の酵素
で処理することを含む。皮膚片を一種またはそれ
以上の酸素で処理した後、表皮膚を除去した棄却
する。残つた組織は、比較的高度で繁殖する基本
的細胞を含有するものであるが、これを、細胞を
こわすことなく分離するのに充分な力でかきまぜ
る。この目的のためには、低速撹拌、渦流に付す
こと、ピペツト処理およびその他の混合法を活用
できる。細胞は、体液中にみられる物質に似たい
ろいろな塩を含む水溶液中に懸濁させるのが普通
である。この型の溶液はしばしば生理塩水と呼ば
れる。PHを略々生理的レベルに維持するためにリ
ン酸塩またはその他の非毒性物質で緩衝してもよ
いし、また動物もしくは人の血清またはその他の
蛋白源や栄養源を加えてもよい。液の密度は、細
胞の密度よりも小さくなるようにコントロールで
きる。 細胞の水性懸濁液を用いることの重要な利点
は、限られた数の細胞の増殖によつて閉鎖できる
火傷の面積ないし容積を大巾に拡大できることで
ある。その結果次のような利益がある。第一に、
自己植皮のために無傷の組織を極めて限られた量
しか得られないのであれば、その限られた数の細
胞を接種できるコラーゲン格子の面積ないし容積
を格段に増加するべく、いろいろな懸濁液を駆使
することができる。第二に、与えられた面積ない
し容積のコラーゲン格子に細胞を接種する必要が
あるなら、ドナー部から採取すべき無傷の組織の
量を大巾に減少できる。特定の場合の最適接種密
度は、予備実験により当業者が決定できる。 コラーゲン格子中または格子上に接種される細
胞の数または濃度は、懸濁液中の細胞の濃度をか
えることにより、または与えられた面積ないし容
積のコラーゲン格子上に分配する懸濁液の量をか
えることにより変化できる。 遠心法 本発明は好ましい一つの実施態様は、膜を患者
に施用する前に、遠心力に用いて、接種すべき細
胞をコラーゲン格子中に着床することを含む。こ
の方法は、I.V.Yannas.J.F.Burke、D.P.Orgillお
よびE.Skrabutの共同発明によるもので、本願と
同時に出願した昭和57年特許願503581号の主題で
あるので、その記載を参照されたい。 細胞の水性懸濁液の接種法 接種すべき細胞を含有する懸濁液はいろいろな
技法たとえば撒布、噴霧、塗布、点滴その他によ
り、コラーゲン格子上に分配できる。これらの技
法で使用できる工程順をフローチヤートとして第
４図に示す。 火傷部に焼痂があればこれを外科的に除去した
後、二層膜の片を必要なら緑どりをして火傷部に
縫合する。数日内に間葉細胞および血管が火傷部
からコラーゲン／GAG格子内に鉛直に成長して
くる。上皮細胞の成長を促進するのに充分な数の
間葉細胞および血管がコラーゲン格子内に成長し
た時点で、患者のドナー部から無傷の皮膚の薄層
を採取する。かような皮膚は、閉鎖すべき火傷部
の面積よりも実質的に小さな面積から採取すれば
足りる。採取した皮膚は前記の方法によつて処理
し、生きた上皮細胞の水性懸濁液を調製する。シ
リコーン層に切りこみをいれ、シリコーン層をコ
ラーゲン／GAG層から注意深く剥がすことによ
り、膜のある区域からシリコーン層の片を除去す
る。次いで溶液中に懸濁している上皮細胞を露出
したコラーゲン格子上に下記の任意の方法により
ランダムに接種する。 １ 撒布 この実施態様は、第５図に示す装置の
ような撒布を用いる。細胞の水性懸濁液はチユ
ーブ２からこの装置にはいるが、チユーブ２は
通常の手段により部材４に連結されている。懸
濁液は、部材４から略々三角形をなす平板６上
に流出し、保持縁８により平板６上に保持され
る。懸濁液は、平板６上を流れるにつれ、広い
浅い流れとなつて平板６の下端を通り、露出し
たコラーゲン／GAG格子上に比較的均等に分
配される。板６をシユパチユラとして用いるこ
とにより液が格子上にさらに分配することもで
きる。 この撒布装置は、プラスチツクまたは金属の
ような任意の通常の材料で作製できる。シリコ
ーンのような物質で装置を被覆して、装置表面
における液の流れを制御かつ懸濁液と装置との
親和性すなわち粘ばつきを低減することもでき
る。また部材４に弁を設けて装置を通る懸濁液
の流れを制御してもよい。 ２ 噴霧 懸濁液は、液体を小さな空輸液滴にか
える任意のノズルから噴霧してもよい。だが、
この実施態様には２つの制約がある。その一つ
は、溶液中の細胞を、大多数の細胞をこわした
り殺したりする力が圧力の作用に付してはなら
ないことである。第二には、細胞の懸濁液を、
細胞や火傷部に対し有毒または有害な流体発進
剤と混合することが必要であつてはならないこ
とである。通常入手できる大抗のノズルはこの
両制約を満たす。かようなノズルを任意の通常
の方法で細胞懸濁液の貯槽に連結できる。 ３ 塗布 細胞の水性懸濁液中にブラシを浸し、
ブラシを取出し、そして懸濁液を含んだブラシ
でコラーゲン格子をふくことにより、懸濁液を
格子上に分配できる。この方法には、実質的な
数が細胞がブラシにくつついて格子に適用され
ない不利がある。だが、それでも、懸濁液を分
配する格子のパターンなしい区別を注意深く制
御したい場合には特にこの手法が有用である。 ４ ピペツト点滴 この実施態様では、ピペツ
ト、普通の点眼器、その他同様な装置を用いて
少量の細胞懸濁液をコラーゲン格子上に分与す
る。液は多孔性格子を透過し、液中の細胞は格
子線維の網にかかり格子上または格子内に保持
される。 ５ 注射器注入 本発明の一つの好ましい実施態
様では中空の針またはその他の導管を備えた皮
下注射器により細胞の水性懸濁液を多孔性のコ
ラーゲン格子内に接種する。細胞懸濁液を注射
器のシリンダーにとり、針をコラーゲン格子中
に挿入する。注射器のプランジヤーを押圧して
一定量の液をシリンダーから押出し、針を経て
格子内に注入する。 注射器注入法の一つの利点は、米国特許第
4060081号に記載された多層膜の透水制御層の
ような、コラーゲン格子を取囲むヘテロカバリ
ングを取除くことなく、貫通するのに使用でき
ることである。ヘテロカバリングはそれとは異
なる目的たとえば器官補綴に用いられるコラー
ゲン格子に形状、強度、流体一体性またはその
他の特性を付与するのに用いられることもあ
る。 細胞の分配が完了したら、接種した格子が包
帯でカバーして保護する。 本発明のその他の実施態様 細胞は、本発明の方法により、実際上任意の化
学組成をもつた多孔性格子中に接種できる。米国
特許第4060081号（Yannas等1977）および同第
4280954号（Yannas等1981）に記載されたコラー
ゲン／GAG格子は、コラーゲンの生物学的相溶
性および物理的性質を改善する観点から、比較的
小百分率のグリコサミノグリカン（GAG）を含
有するものであるが、コラーゲン格子内にGAG
またはその他の物質と存在させることは、本発明
の目的に対し必要ではない。 また、本発明に到つた研究過程ではコラーゲン
を用いたが、本発明の細胞接種法はコラーゲンを
接種する方法に限定されるものではない。今後の
研究によつてその他の線維質蛋白、その他の重合
体分子または焼結セラミツクスもまた補綴材また
はその他の医療目的に対し適切であることが明ら
かになるかもしれない。もしそのようなその他の
分子を多孔性格子に形成し、これを本発明方法に
よつて接種するなら、そのような接種法およびそ
のような接種された格子は、本発明の範囲内であ
る。 本明細書では「格子」なる語を広義に用いるも
のであり、高度に多孔性でかつ透過性である構造
物の形態にあり、当該構造物中で細胞が泳動し増
殖できる任意の材料を含む。 「線維質格子」とは、マクロ的、ミクロ的また
は分子レベルにおいて線維状である材料を含むあ
らゆる格子を含むものと広義に解釈されるべきで
ある。たとえば、多くの重合体発泡体は、多数の
側鎖や高度の架橋をもつことがある長い有機分子
からなる。また、焼結セラミツク材は、多数の粒
子からなり、形の上でまたは質的にも線維質であ
るとみなすことができる。かような材料はいずれ
も、本発明の方法によつて細胞を接種できる格子
に形成されるなら、本発明の範囲内である。 任意の形状または形態の格子中に細胞を接種す
ることが可能である。たとえば、顔、手またはそ
の他の不規則表面の形に鋳型した二層膜を製造す
ることが可能である。かような格子は、本発明方
法によつて細胞を接種することができ、本発明の
範囲内である。 本発明のいろいろな方法を相互に組みあわせて
使用できる。たとえば、火傷した患者が最初に病
院に運びこまれたとき、接種すべき細胞を患者か
ら採取し、水性懸濁液中に解離しそして遠心力に
より二層膜中に接種し、その二層膜を最初の手術
で患者に適用する。利用できる健康な上皮細胞の
数が不充分なら、または遠心的に接種した細胞の
いくらが何らかの理由で群落と発生するに到らな
かつたなら、遠心接種した細胞からできる凝似表
皮によつて閉鎖された火傷の区域があるかもしれ
ない。閉鎖された火傷の区域は、膜の透明なシリ
コーン層を眼でしらべることにより同定できる。
かような区域は本発明の一つまたはそれ以上のそ
の他の実施態様により再接種できる。たとえば、
上皮被覆中の大きな間隙は、シリコーン層の部分
が除去し露出したコラーゲン格子上に細胞懸濁液
を噴霧または撒布することにより接種できる。ま
た上皮被覆中の小さな空隙は、細胞懸濁液を注射
器注入することにより接種できる。 線維質格子は、多くの型の細胞、たとえば体の
いろいろな器官からの細胞、骨からの細胞および
収縮または連結組織からの細胞の成長を支持でき
る。全部または一部が体から取出される器官また
は骨の代りに用いられる線維質補綴は、すべての
方向が何センチもの厚さをもつ。厚い補綴の内部
に細胞と接種するには、注射器注入または遠心力
の使用が極めて有用である。加えて、細胞懸濁液
は多孔性格子を透過でき、格子は過に似た作用
により細胞を保持する。 既述の如く、接種する細胞は、患者からまたは
患者の双子の兄弟から採取した細胞に限定してき
た。これは植皮技法の現在の状態を反映したもの
である。現在の技術による限りこれら以外の細胞
に対しては火傷部が拒絶反応をおこす傾向があ
る。だが、細胞の分類および選出、表面もしくは
分泌された抗原もしくはその他の分子を除去また
は不活化する細胞処理、免疫抑制剤およびその他
の技法における今後の進歩が前記の問題を低減ま
たは解決して、前記以外の細胞でも失つた組織、
骨または器官の再構成に適切るあるようになるか
もしれない。このようにして選出された処理され
た細胞はいずれも本発明の方法により線維質格子
中に接種するのに適切であろう。かような細胞は
本発明の範囲内である。 いろいろな型の線維質格子が、体の多く個所、
たとえば皮膚、血管、骨、連結組織、収縮組織お
よび器官において一次的な補綴具として適切に使
用できる。かような格子は、殆んどあらゆる型の
細胞がその中で成長し、泳動しかつ増殖できる構
造系を与える。格子は体の実質上任意の個所に外
科的に施用でき、適当な型の細胞を適正に接種す
るなら、新しい組織の再生が可能である。たとえ
ば患者のある器官が損傷したり病気に犯されたな
ら、その器官の一部を除去する必要がある。器官
の一部を除去した場所に線維質格子を適用する。
その器官の別の個所から相溶性のあるドナーから
採取した充分な数の健康な細胞を本発明の方法に
より格子中に接種するなら、器官の回復および再
生を大いに促進することが可能である。かような
使用は、本発明の範囲内である。 採取した組織または懸濁した細胞を数日間比較
的冷たい（たとえば４℃）水溶液中に保存するこ
とが可能である。このようにすれば、ドナー部か
らの組織の採取を好ましい時に行える。たとえ
ば、火傷から痴を除去するまたはコラーゲン
GAG膜を火傷に適用する予備手術の際に健康な
表皮を採取できる。いずれの場合も患者には全身
麻酔を施しておくのが普通である。採取した表皮
は保存しておき、上皮増殖を促進するのに充分な
間葉細胞および血管がコラーゲン格子中に成長し
た後に、コラーゲン格子に適用する。 細胞を採取後コラーゲン格子に接種する前にこ
れをインビトロで培養することも可能である。細
胞培養にはいくつかの明白な利点がある。たとえ
ば、接種に供し得る細胞の数を増加させ、ひいて
は火傷被覆のために採取しなければならない組織
の量を少くできる。加えて細胞バンクの使用も考
えられる。たとえば、危険度が高い職業の人は、
インビトロで培養できる細胞を供与しておくこと
ができ、事故または傷害がおこつた際にその細胞
を線維質格子中に接種するのに使用できるように
するのである。保存１または培養した細胞を本発
明方法により線維質格子に準備することは本発明
の範囲内である。細胞バンクおよび接種のために
所望の種類の細胞を取出す組織培養物は、本発明
の目的に対し「ドナー部」なる語に含まれる。 細胞と、ある種の細胞の増殖速度を増加するい
ろいろな物質と接触させる技法は数多く知られて
いる。たとえば、表皮成長因子〔10〕、フイブロ
ネクテン〔11〕、環状ヌクレオチド〔12〕、クロレ
ラトキシン〔13〕、血小板から誘導した成長因子
〔14〕、組織脈管形成因子〔15〕および各種のその
他の物質〔16〕が、一種またはそれ以上の型の細
胞の増殖速度および／または表面粘着性を増加で
きることは知られている。本発明方法によつて細
胞をコラーゲン格子上に接種する前に、かような
細胞の増殖速度を増加することが従来知られてい
るまたは今後知られるであろう任意の物質に細胞
を接触させること可能である。かような前接種処
理は、接種に利用できる細胞の数を増すために、
または接種後細胞がより迅速に増殖するようにす
るために活用できる。かような前接種処理や凝似
真皮表面処理は本発明の範囲内である。 接種したコラーゲン格子の特性 本発明は、線維質格子中または格子上に細胞を
接種するいくつかの方法に関する。本発明はま
た、本発明方法により細胞を接種した線維質格子
である組成物に関する。この組成物をさらに明ら
かにする目的で、コラーゲン格子に関する参考文
献として既に引用した米国特許第4060081号
（Yannas等1977）および同第4280954号（Yannas
等1981）を指摘する。 適用したコラーゲン格子に対する火傷の生理学
的応答は、独立の因子として作用する格子の単一
の特性よりもむしろ格子の諸特性の組みあわせに
依存する。それ故、単一の特性についての最適数
値は特定しないのがよい。かわりに多くの特性に
ついてはその他の特性がすべて同時に適切な範囲
内にあると仮定した場合の数値範囲を特定でき
る。またパラメーターと特性との間の前記の相関
関係はすべてではなく、最も直接的な相関関係の
みを言及したものであることは了解されたい。 １ 制御可能な生物分解性 創傷表面と生化学的に接触された場合、コラ
ーゲン格子はコラゲナーゼまたは他の天然の酵
素によつて無毒性物質に生物分解され、この物
質は通常の身体作用によつて消化され、利用さ
れまた消失される。この格子は、失われ除去さ
れた組織を再生するのに十分な数の細胞が再生
産されるまで構造上の一体性を保つ。もしも格
子がこれよりも早く生物分解されるならば、創
傷が治ゆされる前に液状化し、役に立たなくな
つてしまう。一方、発明者の研究によれば、格
子があまりにゆつくり生物分解されるならば、
格子を取囲む緻密なサツクの形成が促進されが
ちであることが判つている。 二層膜の研究によれば、理想的な生物分解速
度はほぼ25〜30日であることが判つている。こ
のことは格子全体が30日以内に生物分解されな
ければならない、ということを意味しない。む
しろ、相当な量の生物分解が約30日以内に始ま
り、格子の残りが数ケ月またはそれ以上残存し
ても良い、ということを示すものである。当業
者の日常的実験によれば、この生物分解速度
は、細胞を移植した格子または人工皮膚以外の
目的に使用される格子に関しては若干変更しな
ければならないことが判つている。 コラーゲン格子の生物分解速度は、コラーゲ
ンの架橋密度を増大させ、コラーゲンと架橋さ
れているGAGの含量を増加させ、または格子
の気孔率を減じることによつて、減じることが
できる。すなわち、創傷上に施用後より長時間
格子が維持される。 二層膜のうちシリコン層は生物分解性ではな
い。しかしながら、このことは問題ではなく、
むしろ好しいことである。何故ならば、シリコ
ン層は新たな上皮組織がその層の下に再生され
た後に、外科的除去を必要とせずに自発的に排
除される。 ２ 非抗原性および非炎症性 同種異系または同種同系移植片および移植さ
れた器官は、患者の免疫系により異物として認
識される細胞を普通含有している。典型的な免
疫応答では、抗体およびリンパ球のようなある
種の細胞は、免疫抑制剤を使用して抗体または
防御用細胞の形成を抑制しない限り、異種細胞
を認識し、攻撃する。しかしながら、そのよう
な薬剤の使用により、患者は感染に対して発病
しやすくなる。もし、移植された物質が抗原性
または炎症特性を持たなければ、そのような薬
剤の使用を不要にできる。 本発明者等によつて共同で発明されたコラー
ゲン／GAG格子は、該コラーゲンおよびGAG
分子の化合物含量と交叉結合構造を調節するこ
とによつて抗原性あるいは炎症特性を有しない
のものを製造することができる。適切に製造さ
れれば、上記格子は患者による拒絶なしに受傷
表面に容易に受容される。 ３ 受傷表面に対する親和性 コラーゲン格子は受傷表面に対して充分な親
和性を有して効果的に該表面を湿潤せしめ該表
面との接触を維持しなければならない。この親
和性は通常界面の表面張力または表面エネルギ
ーによつて表わされ、これは力／面積として測
定される。受傷部分とコラーゲン格子との界面
の表面エネルギーは該受傷部分と雰囲気との間
の表面エネルギーより低くなければならない。
この基準は本発明者等によつて共同で発明され
たコラーゲン／GAG格子では満たされている。 ４ 引張り強さ 補綴装置の合成膜は、裂けることなしに縫合
できて包帯を巻いたり医療上の処置あるいは患
者の動きによつて生じる偶発的圧迫にさらされ
た場合裂けるのを防止あるいは制限するに充分
な程強靭でなければならない。格子の強さのも
つとも重要な２つの示標は引張り強さ（既知の
横断面積を有する標本を引き裂くのに要する
力）および裂壊エネルギー（一定の大きさの裂
け目をつくるに要する仕事量）である。コラー
ゲン／GAG膜は約50ないし1000psiの引張り裂
け及び約１×10⁵ないし約５×10⁶エルグ／cm³の
裂壊エネルギーを有する。この格子の強さは交
叉結合密度を増大させるか格子の多孔性を低下
させることによつて増大せしめることができ
る。 ５ 組織 一般に、“組織”とは格子内の繊維の大きさ
と空間配置に関する。それ自体は、格子内の繊
維間の開口の大きさ、形および空間配置に関す
る“多孔性”の反対であると見なされる。 補綴装置として役立つ合成コラーゲン格子
は、再生されるタイプの組織内に天然に存在す
るコラーゲンマトリツクスに似ていなければな
らない。この空間配置によつて損傷を受けてい
ない組織に似た秩序正しいパターンで細胞成長
を促し瘢痕化を減らし再生された組織の本来の
機能を促進することができよう。 多孔性コラーゲン格子の重要な組織特性は次
のとおりである： (a) 繊維の容積分数 これは繊維によつて占められる容積を格子
の全容積で割つたものである。この分数は多
孔性に反比例し、この点は後述の如く検討す
る。 (b) 平均アスペクト比 これは繊維の平均長さ対平均巾の比であ
る。長く薄い繊維から構成される格子は平均
アスペクト比が高い。 (c) 繊維軸の平均配向 これは、繊維がすべての方向にでたらめに
配向しているのが、それとも大部分の繊維が
格子内の１つまたはそれ以上の軸に沿つて大
体平行に配向しているのかを示す。 (d) 線維軸間の平均距離（これは、隣接する線
維がどれだけはなれているかを示す）。 この特性は気孔の大きさに直接関係する。出
願人らによつて共同発明された多孔性コラーゲ
ン／GAG格子は通常、哺乳動物の真皮中に存
在するコラーゲンマトリツクスに似た形態学的
特徴を有すると思われる。従つて、前記の格子
は毀損あるいは損傷皮膚の再生を促進させる補
綴材料として極めて好適である。研究によれ
ば、その他のタイプの組織も同様な形態学的特
徴を有することが確認されているので、前記の
コラーゲン／GAG格子による再生は十分に可
能であろう。更に、研究によれば、その他のタ
イプの組織中に存在するコラーゲンマトリツク
スに似たコラーゲン格子の形態学的特徴を変更
する方法が示唆された。このような格子に、本
発明の方法により細胞を移植した場合、該格子
も本発明の範囲内に含まれる。 ６ 多孔度 多孔度の四種類の相関的側面は細胞移動速度
およびコラーゲン格子中の再生速度を左右す
る： ａ 多孔度（気孔率ともいう）。これは、格子
の容量は等しい１よりも小さい値である。こ
の値を100倍することによつて百分率にかえ
ることができる。多孔度は高い方が望まし
い。なぜなら、多孔度が高ければ細胞が生長
し、そして、増殖できる空間がそれだけ大き
くなるからである。多孔度をかえることによ
つて生分解速度およびコラーゲン格子の曲げ
剛性をコントロールすることができる。 二層膜に関する研究によれば、細胞移動お
よび格子の表面中または表面上における再生
を促進するには多孔度は少なくとも約90％で
あることが望ましいことが示された。出願人
による別の研究では、多孔度が少なくとも約
95％である場合、上皮細胞はコラーゲン／
GAG格子と膜のシリコーン層最上部間を移
動しやすいことが判明した。このことは極め
て望ましい。なぜなら、新生表皮がシリコー
ン層の下に再生される場合、シリコーン層は
自然に排除されてしまうからである。 ｂ 気孔形状および分布。これは、気孔の形状
および線維の配向に関連する。 ｃ 気孔の大きさ。これは平均または中間気孔
の直径を示す。コラーゲン格子中の気孔は細
胞が該気孔中で生長し、そして、該気孔中を
移動するのに十分な大きさでなければならな
い。出願人の研究では、平均気孔サイズが約
50μｍであれば細胞の移動および再生を促す
のに申し分のないことが確認された。当業者
による日常的試験では、平均サイズ、および
できれば、平均値付近の気孔サイズの分布を
変化させて、コラーゲン格子の様々な用途に
ついて細胞移動および再生を高めなければな
らないことが示された。 ｄ 結合性（通気性ともいう）（気孔が独立し
ていようと、あるいは連続していようと問わ
ない）。独立気泡フオームは流体あるいはそ
の他の材料が該フオームを通して移動するこ
とを不可能にする。各気泡はとらえられてい
る。このタイプの格子は細胞移動には適さな
いであろう。これに対して、通気性格子は連
続した気孔を有する。この気孔は、流体また
は細胞が気孔間を移動することを可能にす
る。コラーゲンの線維性および本発明で使用
される格子を創成するのに使用される凍結乾
燥法は、該格子を、細胞が移動できるのに十
分なほど通気性にする。 ７ 傷収縮の減少 傷収縮は普通傷の円周の内部および円周上の
セルの移動を含む。例えばもし皮膚の少片は動
物又は人間から失なわれ又は除去されるなら
ば、まわりの皮膚は、その傷を閉鎖するために
筋膜をわたつて動く傾向する。これは傷のつい
た区域をゆがみを生じさせそして普通の機能に
正確にもどるのに非常に有害である。適用者に
よる研究は、その二層膜の適当な創告および定
置が傷収縮を遅らせそして減少させる傾向にあ
ることを示し、二層膜は、収縮変形を減少さ
せ、新生表面皮膚の再生および適当な機能を増
進させる。 ８ たわみの硬直 傷表面の接触させた時、コラーゲン格子は、
その傷のついた床およびその格子間でトラツピ
ングから空気のポケツトを防ぐために十分にた
わみ性である。同伴された空気のこのようなポ
ケツトは、しばしば死の空間と呼ばれ、そして
流体で充たされ、しばしばバクテリアの増殖お
よび感染の部位内に生じ、そしてそれがためそ
のようなポケツトは避けるべきである。効果的
な湿りは、比較的に低い硬直性を持つた格子の
使用を必要とする。 たわみの硬直性はその格子の鋭さの機能であ
り、そしてその物質の弾力性のモジユラスであ
る。人工の皮膚として知られた膜の硬さは、そ
の膜の厚さを減少させることに減少できる。し
かしながら、臓器および骨の充填は特別な形に
押し込められる。弾性モジユラス（しばしばヤ
ング モジユラスと呼ばれる）はコラーゲン格
子のたわみ性の硬さを受けられる水準まで減少
させるために十分に低くなければならず、しか
しゆがみなしに普通の圧縮強さに耐えるため十
分に高くなければならない。約１〜100間のヤ
ングモジユラス（その格子の厚さおよび形に依
存する）を持つた物質は、好ましい。そのコラ
ーゲン格子のヤングモジユラスはその架橋密度
を増加させるか又は孔を減少させることによつ
て増加できる。 ９ 水分流れ 水分流れは、ｇｍ／cm²／hr又は同様な用語で
表わされた与えられた期間与えられた膜の区域
を通る水および他の液体の量に関する。合成皮
膚として使用された膜の水分流れが高すぎるな
らば、多すぎる流体がその傷に残りそしてその
傷床およびその膜は脱水され、その膜の収縮お
よびカールを起す。一方もしその膜の水分流れ
が低すぎるならば、流体はその膜の下に蓄積
し、所望な生理学的な処理を分裂させる。この
ような流体の蓄積は通常浸出又は浮腫と呼ばれ
る。両極端を避けるために、合成皮膚として使
用した膜の水分流れは普通の皮膚の水分流れに
近接すべきである。 そのコラーゲン／GAG膜の水分流れはその
シリコーン層の厚さを変性させることによつて
容易にコントロールできる。約0.1〜1.0mmのシ
リコーン層が適当な範囲内に入る水分流れを提
供することが発見された。 実施例 １ 二層膜の調製 「J.Amer.Lether Chemists Assn.」69、No.９、
p410−422（1974）のM.コマノウスキイ等によつ
て発表された方法で調製したウシ皮革コラーゲン
を用いた。このものは、米国ペンシルベニア州フ
イラデルフイアの米国濃務省東部地区研究センタ
ーから寄贈された。これを、液体窒素で冷却した
ウイリイ（Wiley）ミル（米国ペンシルベニア州
フイラデルフイアのA.H.トーマス・カンパニイ
製）で20メツシユのスクリーンを用いて磨砕し
た。各膜を調製するために、0.55ｇ（水和重量）
の磨砕コラーゲンを、0.05M酢酸水溶液200mlに
加えた。この溶液を、高速の方にセツトして供給
電圧を60ボルトにまで下げた２速式電力ユニツト
（コネクチカツト州ハートフオードのワーリン
グ・カンパニイ）に連結した氷冷ジヤケツト付き
ブレンダー（ミシガン州アン・アーバーのエバー
バツク・コーポレーシヨン）で60分間撹拌した。 サメ軟骨から得た0.044ｇ（水和重量）のコン
ドロイチン６−サルフエート（ナトリウム塩形：
ミズリイ州セントルイスのシグマ・ケミカル社の
タイプＣ）を、40mlの0.05M酢酸に溶解した。５
分間にわたり、このC6S溶液を、上記撹拌中のコ
ラーゲン分散液に加えた。この混合物をさらに10
分間混せ合せた後、４℃に維持した冷却遠心分離
機（ミネソタ州ニーダム・ハイツのインターナシ
ヨナル・エクイツプメント社、モデルCRU−
5000）で１時間1500Gで遠心分離した。分散液を
遠心分離機から取り、遠心分離の分散液の各240
mlにつき140mlの上澄液をデカンテーシヨンで取
り除いた。この濃縮された分散液を、次いで、上
記の高速にセツトして60ボルトのエバーバツク製
ブレンダーで15分間撹拌した。次いでこの分散液
を凍結用皿に注ぎ込んだが、その際に皿の表面１
平方インチ当り２mlの分散液を施用した。それら
の皿を、−45℃に維持した予備冷却凍結棚（ニユ
ーヨーク州カードナーのバーチス・カンパニイ、
モデル10−MR−RC）に置いた。これらの皿を
約１時間で凍結させ、凍結棚温度と平衡化させ
た。その凍結棚室中の圧力を次いで10ミリトール
以下に減圧し、皿を１時間放置した。凍結棚温度
を０℃にまで上昇させた。それらの試料を24〜48
時間凍結乾燥した。 得られた発泡体を取り出し、アルミニウム箔で
包み、105℃および50ミリトールに維持した真空
炉中に約24時間入れて置いた。この炉から取り出
した後、発泡体を、デシケーター中に保存する
か、あるいは冷却し、シリコーン接着剤を被覆す
るかした。 シリコーン接着剤（ミシガン州ミドランドのダ
ウ・ケミカル・カンパニイの医薬級Dow
Silastic カタログNo.891）を、上記冷却発泡体の
表面全体にわたつて塗布した。シリコーンは、凍
結用皿と接触したかつた発泡体表面に塗布した。
シリコーンは、スパチユラを用いてほぼ0.1〜0.5
mmの厚さに施用した。この二層膜を、0.0M酢酸
中にそのシリコーン側を下にして、室温で24時間
入れて置きシリコーンを硬化させた。次いで膜を
裏返えしにしてシリコーン側を上にして、0.05M
酢酸中で室温において24時間にわたり再水和させ
た。その酢酸を除き、その代りに0.25容隆％のグ
ルタルアルデヒド（ニユージヤージイ州フイリプ
スバーグのJ.T.ベイカー・ケミカルCo.、商業級、
カタログNo.８−M752）を含む0.05M酢酸を置き
換えた。このグルタルアルデド架橋結合処理を室
温で24時間続けた。そのグルタルアルデヒド溶液
を取り除き、その膜材を蒸留脱イオン水で２回す
すぎ洗いした。この発泡体を室温で24時間水中に
保存してから貯蔵容器へ移した。それは使用直前
まで70％イソプロパノール水溶液中に貯蔵した。 これらの方法で調製した各膜の典型的な特性を
表１に示す。

【表】 実施例 ２ 人に対する自己移植法 体表面積（BSA）の50％乃至90％にわたつて
焼傷深度３度の焼傷を受けている年令３才から60
才までの範囲の患者10人を実施例１で述べたよう
に調製した二層膜を用いて治療した。６人の患者
についてはマサチユーセツツ・ジエネラル病院
（Massachusetts General Hospital）で、また４
人の患者はボストン（Boston）のシユライナー
ズ・バーン・インステイチユート（Shriner′s
Burn Institute）で治療した。 全患者とも治療は痂皮を即座に切除して行つた
が、その切除は必要によつては段階的に行つた。
各切除手術はBSAの15〜20％に限つた。各手術
においては、傷は手術中に採取したメツシユ状自
己移植用片で閉鎖した。利用可能の移植用片を全
部使用してから、切除された傷を切除に続いて直
ちに二層膜で閉鎖した。二層膜は４×６インチの
シートにして与えた。二層膜は存在する傷に合う
ように作られ、かつ５−０の三酸化クロム酸処理
腸線の断続縫合線を用いて適所に縫合した。細心
の注意をはらつて焼傷を受けていない皮膚と二層
膜の間に縫合線を作り、一時閉鎖を達成した。膜
はしわが寄らないようにわずかな張力をかけて縫
合した。もし術後期間中にしわができたら、しわ
の隆線を辺縁切除し、そしてその下に集まつた漿
液を抜き出した。ほとんどの膜はキルテイング法
を用いて仕上げた。多数のステイツチが膜と傷床
（woundbed）との間のずれ運動を減少させるよ
うに深い筋膜に延びていた。 コラーゲン／GAG格子は間葉細胞（線維芽細
胞および血管を含む）の浸潤を支持してネオエル
ミス（neoermis）を合成する型としての働きを
した。この格子の血管化は３〜５日後に指圧を加
えるときに生ずる白化によつて明らかにされた。 自己移植用片供与部位が再採取に適していると
きは、患者を手術室に戻し、そして供与部位を深
さ0.004インチの皮膚節のセツトで再採取した。
これで真皮の小さな不規則斑点を持つ表皮を主と
して含む非常に薄い植接用片を得た。次に、コラ
ーゲン／GAG格子からシリコーン層を剥ぎ取つ
た。毛管出血は食塩パツクを用いて制御した。コ
ラーゲン／GAG格子を次に表皮自己移植片で被
覆した。シートと３対１のメツシユ状植接用片の
両者を使用した。これら植接用片を縫合し、常法
で仕上げた。 これら手術の結果を第２表に示す。二層膜の助
けで再生された再形成皮膚は傷の縮小で、または
常用の自己移植で再生された組織よりなめらか
で、均一で、また柔軟である一方、線維症が少な
く、また傷痕も少なかつた。 コラーゲン／GAG格子に適用されたメツシユ
状自己移植用片で治療された傷において、間質組
織の生長は表皮だけでなく、実質的な真皮も含む
普通に採取されたメツシユ状自己移植用片から期
待される速度で進んだ。しかしながら、二層膜を
利用している自己移植用片は初期表皮閉鎖後にメ
ツシユパターンの微候をごくわずかしか示さなか
つた。数カ月後に非常に注意深く観察してメツシ
ユパターンが検出できるに過ぎなかつた。さら
に、非常に薄い表皮層の採取は繰り返して採取さ
れた領域においても供与部位の速やかな回復、通
常は採取後１週間以内での回復を見込めるように
した。

【表】 果
実施例 ３ 水性細胞質サスペンジヨンの製造 本発明の種々の態様の幾つかを使用するため、
オートロガス細胞の水性サスペンジヨンを製造す
る必要がある。かかる細胞はデルマトームを使用
してモルモツトの脊又は人体から又はモルモツト
の耳のヘリから採取される。 採取された皮膚をカルシウムあるいはマグネシ
ウムを含有しない冷（４℃）リン酸バツフアー塩
水（PBS）（カタログ＃17−515B、M.A.
Bioproducts、Walkersville、MD）につける。
皮膚をトリプシンで処理する前に、暖PBS（約30
℃）に移す。ついで、この皮フを、PBSで0.25％
トリプシンに稀釈されたカルシウム又はマグネシ
ウムを含まないHandの均合塩溶液（カタログ
＃17−160H、M.A.Bioproducts）の2.5％トリプ
シン溶液中で37℃で40分間インキユベーシヨンす
る。インキユベーシヨンについで、比較的多数の
再生産性基礎細胞を含む外皮を組織培養媒地（使
用直前に10％の牛の胎児の血清およびＬ−グルタ
ミンが補充されたDulbccoの変性制媒地カタログ
＃12−707B、M.A.Bioprducts）に移す。つい
で、この溶液を1.5分間撹拌して組織から基礎細
胞を除去する。ついでサスペンシヨンを無菌ガー
ゼを通して過して大きな組織片を除去する。 細胞濃度は細胞計数チヤンバー又は電子粒子カ
ウンターを使用して定量した。細胞生存能力はト
リパンブルー（Grand Island Biological
Canpany、Grand Island、NY）で細胞のアリコ
ートを着色して決定する。細胞密度は組織培養媒
地を添加して約10⁶生存能力可能細胞／mlに調製
する。 実施例 ４ 細胞懸濁液を移植する方法 損傷床に縫い合わせたコラーゲン／GAG格子
に水性に懸濁液を分散させる種々の方法は、総計
約30匹のてんじくねずみと約30匹のねずみに使用
された。代表的な操作において、表皮および真皮
からパニクラスカルノサスまでを含む裂け目ある
いは全層の動物皮膚を動物の背中のある部分から
除去する。ほとんどのこの切除は1.5×3.0cmであ
つた。皮膚を外科的に除き、実施例１に記載され
たように作られた一片の二層膜で置換した。その
膜を傷に合わさるように、従来技術を用いてわず
かの張力下でその場所に縫い合わせる。目視観察
すると、コラーゲン／GAG格子は約５ないし７
日間以内に血管状となつた。７ないし10日の期間
後、シリコン層の注意深く損傷床から剥ぎ、血管
状のコラーゲン／GAG格子の区域を暴露した。
実施例３に記載されたように調製された自己細胞
の水性懸濁液を以下のいずれかの技術により暴露
した格子に施用した： ａ 第４図に示したシリコン被覆プラスチツク手
段により、格子にわたつてある量の懸濁液を散
布すること； ｂ 小びん上に位置するバネ負荷手段により、格
子にわたつてある量の懸濁液を噴霧すること； ｃ 格子上にある量の懸濁液を移し、液体を格子
内に浸透させること； ｄ 皮下注射器を用いてある量の懸濁液を水分制
御層を経てコラーゲン／GAG格子へ注入する
こと。 前記全ての技術は、細胞のコロニーへと増殖し
た上皮細胞を植え付けることに成功した。細胞の
コロニーが完全に傷口をふさぐ前に、ほとんどの
動物は組織学研究のための犠性にした。しかし、
傷口がふさぐまで犠性とされなかつたこれらの動
物に関し、細胞のコロニーは成長して集合し、永
久的かつ機能的な新表皮層を形成した。この新表
皮層域は毛嚢、皮脂腺、あるいは汗腺に欠ける傾
向があつたが、傷の収縮あるいは意図しない治療
により生成した新エピエルミスよりも、新表皮層
はよりなめらがで、傷跡があまり残らず、および
あまり繊維状でなかつた。適当に移植したコラー
ゲン／GAG格子により助成された傷は通常約10
ないし14日以内にふさがつた。 産業上の利用性 本発明は細胞および組織の成長を促進するため
の繊維質蛋白質格子を使用することに産業上の利
用性がある。 同等の方法 当業者であれば通常の実験操作により、ここで
特定された手法に対して多数の同等の方法および
ここに記載された移植された格子を確認し、また
突き止めることができる。このような同等の方法
は本発明の範囲にあるものとみなされ、次の特許
請求の範囲の記載はそれらを権利範囲内にあるも
のとする。 参考文献 １ R.H.Sims等著“An Introduction to the
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