JPS58501772A - 遠心による繊維格子中への細胞の接種方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 遠心による繊維の格子中への細胞の接種政府の支持 ここに記載する発明は、ナショナル・インスチチューツ・オブ・ヘルス（　Ｎａ ｔｉｏｎａｌ　ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ）からの許可により 全部または一部分が支持されている。

技術分野 本発明は、医薬、外科、生物学、生化学およびポリマーの分野である。

背景の技術 皮膚への損傷またはその損失は、極端な痛み、奇形、断節、および死を生ずる、 非常に重大な傷であることがある。ひどく火傷をした人の薬剤および外科の処置 は、非常に時間を消費しかつ費用かかかり、複雑な装置と高度に熟練した人員を 必要とする。広範囲の搬痕および傷の拘縮は、生理学的、感情的および社会的な 損傷に導ひくことがある。

皮膚の損失または傷は、火または熱湯により、機械的または化学的な傷により、 あるいは皮膚の病変により、最も普通に引き起こされる。火傷は皮膚の最も普通 の原因であるので、火傷についてここで述べる。しかしながら、この分野の専門 家にとって起こりつる小さい例外を除いて、何らかの種類の傷または病気により 生ずる皮膚の損失または損傷ほの処置を本発明により実施できることを理解すべ きである。

火傷、傷、病気、あるいは皮膚または器官の全部または一部分の除去を受けた人 間または動物をここで「患青」と呼ぶ。組織が失なわれ、損傷され、病気となり 、あるいは外科的に除去された体の区域を、ここで「創傷」または「創傷床」と 呼ぶ。細胞を取り入れる無傷の皮膚または器官の区域、細胞銀行あるいは細胞を 取り入れまたは他の方法て板る組織培養物を、ここで１供与点」という。創傷上 の細胞の成長により再生される組織を゛、ここで「新真皮」、「新表皮」または 「新器官」の組織とい正常の、損傷を受けない皮膚は、いくつかの層から構成さ れている〔１〕。外層、通常上皮と呼ばれる、はいくつかの種類の上皮細胞から 構成される。それは神経のフィブリルを含有するが、血管を含有しない。上皮の 最外層、通常角質層５ｔｒａｔｖ、ｍ　ｃｏｒｎｅｕｒｎと呼ばれる、は典型的 な増殖速度が低い扁平（すなわち、比較的平らな）ｒｌ聞胞からなる。これらの 細胞は摩耗により徐々に脱ぎ落ち、下層からの細胞と置換される。次ぎの層は通 常淡明層５ｔｒａｔｕ＋ｒＬｌｕｃｉｄｕｍと呼ばれ、これはある区域において 存在しないことがある。扁平細胞の最下層は、通常顆ｐｔ　ｕｒｎ　ｇ　ｒ　ａ 　ｎｕ　ｌ　ｏ　ｓ　ｕｍ、と呼ばれる。それより下に２層の非扁平細胞すなわ ちマルピギ一層（ｓｔｒａｔｕｒｎｍ、ａｌｐｉｇｈｉｉ）　（または　ｒｅｔ ｅ　ｒｒｕｔｃｏｓｕｍ　および１１’−ｓｔｒａｔｕｍ　ｅｒｙｎｉｎａ、ｔ ｉｖｗｒｎが存在する。

表皮の基部（真皮の付近）に丑たはその付近に存在する細胞は、しばしば基底細 胞と呼ばれる。これらは増殖速度が比較的高く、そして他の基底細胞を生ずるこ とがあり、あるいは引き続いて増殖しない成熟上皮細胞を生じうる。上皮細胞は ケラ、チン、すなわち細胞壁中に分泌されあるいは含有されうるタンパク質を産 生ずる。このタンパク質は比較的固く、皮膚に靭性と強さを付与する。

上皮の下には、真皮と呼ばれ−る細胞および結合組織の層が存在する。この層は 間葉細胞からなり、線維芽細胞と血管および脈管の細胞を含む。毛包、脂肪腺お よび汗腺は真皮から皮膚表面へ延びる。このような腺および毛包は、上皮でライ ニングされている。

間葉細胞はコラーゲンすなわち線維のタンパク質を産生じかつ分泌する。このよ うなコラーゲンは細胞を取り囲みかつ含有する構造マ）　ＩＪノクスを形成し、 これは組織の強さを増加する。

真皮と上皮との間の界面は、平らであるよりはむしろ、折りたた寸れ、小突起状 をなしている。したがって、比較的平らな火傷に上皮の全部と多数の位置におけ る真皮の一部分を除去するが、損傷区域において散在する無傷の上皮細胞の群を 残す。多少深い火傷は上皮細胞の表面のすべて（および同様に真皮細胞の一部分 ）を除去するが、毛包、脂肪腺および汗腺をライニングする上皮細胞を破壊する 。これが起こった場合、毛包および腺からの上皮細胞は創傷より上方において増 殖しかつ移動することができ、上皮の浅い層をつくる。このような層はしけしは 不規則でありかつ薄く、そして創傷の適切な治ゆを妨害することがある。前述の 火傷のいずれも、第２度の火傷と分類される。上皮吉真皮の全厚さを破壊する火 傷は、毛包および腺をライニングする上皮を含み、「完全な厚さの」すηわち第 ３度の火傷として分類される〔２〕。

火傷の処置 広範な皮膚の損失丑たは傷を受けた患者は、感染および体液の過度の損失により 、直ちに危険にさらされる。

これらの要求の両者を解決するためには、ひどい皮膚の創傷はある種の寝て速や かに閉じなくてはならない。この要求を満たすために種々の試みがなされてきた 。パピルスまたは動物の皮膚については、西暦紀元前約１５００年に１でさかの ぼることができる。特別に準備されたブタの皮膚は、商業的に入手容易であるた め、今日外科医によりしげしげ使用をれている。これらの異檀移碩片（すなわち 、人間以外の源の膜）を創傷の上に約３〜５日問おおうことがてさる。しかしな がら　それは信者により拒否され、開いた創傷が残る。したがって、それは飲日 後通常除去讐たは交換され、患者の皮膚がゆっくり治ゆする間の１間ニ合わせの 役割をする〔３〕。

同種移植片、異型移植片とも呼ばれる、は人間の死体から得ることがてきる。し かしながら、それは供給に欠乏し、そして異種移植片と同様に、短期間抜通常拒 絶される。免疫抑制薬物を使用して、異種移植片または同種移植片の拒絶を減少 し、これによりそれらが創傷をおおうことができる期間を延長することができる 。しかしながら、免疫抑制薬物の使用は患者の感染に対する発病性を増加する〔 ４〕。

自己移植片は、患者の創傷を受けない区域あるいは可能ならば患者の一卵性双子 から除去した（”取り入れた”）皮膚の部分的厚さの断片である。異種移植片ま たは同種移植片に似ず、自己移植片は患者により拒絶されず、その代わり、創傷 へ永久的に付着し、増殖するようになり、これにより創傷を閉じる上皮および真 皮の新らしい層を提供する〔５〕。

取り入れ（ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ）手術は、皮膚切除器と呼ばれる器具を用いて 通常実施される。皮膚切除器は、振動する刃と、カットの深さおよび幅を調整す る調節装置を含有する〔６〕。角質層ｓｔｒａｔｕｍ　ｃｏｒｎｅｕｍ中の細胞 は通常秒速に再生しないＱで、事実上すべての取り入れ手術は顆粒ｓｔｒａｔｕ ｍ　ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍから細胞を除去する。皮膚の小突起状の性質Ｏため、 はとんどの取り入れ手前は寸する。

取り入れ手術は痛く、侵略的プロセスであり、傷跡を生ずる。したがって、それ は最小に保つべきである。さらに、ひどい傷を受ｖｙｉ舌者は体のほとんど全部 上の皮膚を失なうかあるいに預−することがある。これは自己６ 移植に有効な、健康な無傷の皮膚をきびしく制限しう仝。

これが起こったとき、異種移植片または同種移植片を創傷の表面全体に配置して 感染と脱水を抑制する。それらの移植片は、自己移植片が入手できるようになる につれて、徐々に交換する。自己移植片は、供辱点から反復して取り入れること ができる。このような手術において、異種移植片または同種移植片のある区域を 除去しかつ廃棄し、自己移植片と交換する。各供与点は、他の自己移植片をそれ から取る前に、治ゆさせなくてはならない。

これには実質的な遅延を要し、そして患者の回復を延長する。

自己移植法の１つの重要な変法において、あるパターンのスリットを取り入れた 皮膚の片において切る。これにより皮膚を伸長して網にし、これによりその皮膚 片によりおおうことができる創傷の面積を増加する〔７〕。移棟後、オートロー ガス細胞は移動し、増殖し、スリットで生じたすき間を満たす。究極的に、自己 移植片の助けにより、全創協区域は再生した皮膚の１脅によりおおわれる。この 層は、種々の問題、たとえば、肥大した傷跡、不快、および収縮不能、にさらさ れる。

二重層の膜 出願人は、皮膚の槓失または損傷の処置に有用である合成多層膜（以後、二層の 膜）の共同発明者（他の人を含む）である。米国特許第４，０６０．．０８１号 ＣＹａｎｎａ、５ｅｔａｌ、１９７７）および米国特許第４，２８０，９５４号 （Ｙａｎｎｓ　ｅｔ　ａｌ、　１９８１　）、それらの教示を引用によってここ に加える。参照。簡単に言えば、この膜の上層はシリコーンニジストマーのよう なポリマーからなる。

この層はいくつかの所望の物理的性質、たとえば引張り強さ、縫合可能性、水分 束の抑制、およびバクテリアおよびウィルスに対する不透過性を膜に付与する。

下層は、コラーゲンおよびグコサミノダリカンＣＧＡＧ、ムコポリサッカライド としても呼ばれる）から作られた、高度に多孔質の格子からなる。この材料中の 使用に適しうるＧＡＧの種々の形態は、コンドロイチン６−サルフェート、コン ドロイチン４−サルフェート、ヘパリン、ヘパランサルフェート、ケラタンサル フェート、デルマタンサルフエート、チチンおよびチトサンを包含する。

コラ〜ゲン／ＧＡＧ格子は、支持構造物もしくは「骨組み」構造物として効果的 に作用し、火傷からの上皮細胞および間葉刊暇はその内部または上部で生成しか つ増殖することかできる。その組成および構造は、移植片受容体による実質的な 免疫応答を誘発しないように内部さ２ｔ、そしてそれは体により利用または排除 さｌ″Ｌる無毒の物質に生分解される。

コーｙ−’ｙ’ン／ＧＡＧ格子のいくつが■パラメーター（主さして橋かけ密度 、多孔度およびＧＡＧ含量）を制御して、格子がコラゲナーゼおよび他の酵素で 生分解される速度を調整することが可能である。過度に狛速に生分解する格子は 十分な治ゆが起こる前に消失し、−勇退度にゆっくり生分解する格子は細胞の移 動を妨害しかつ格子を取り囲む細胞の線維形成層を形成する傾向がある。

はぼ３０日後に生分解する格子を火傷の患者に使用することが好ましいと、信じ られる。

火傷の患者が病院へ入れられるときに、完全に破壊されあるいはひどく損傷した 皮膚の区域は死んだ皮膚または損傷した皮膚、いわゆる「焼傭」をしげしげ含有 する。

焼軛を通常外科的に除去して、それか治ゆ過程を妨害することを防ぐ。損傷した 皮膚および死んだ皮膚を切除し、これによって無傷の上皮細胞が創傷の周辺に存 在するようにする。前述の二層の膜て創傷表面を注意して包み、創傷と頃との間 に空気ポケットが捕捉されるこさを防ぐ。

膜は通常、常用の技術により、無傷の皮屑へ置台する。

次いて、移植した区域を包帯でおおう。

コラーゲン／ＧＡＧ格子は創傷の収縮を減少することを、出願人は観測した。一 般に、創傷の収縮は、創傷中に存在する細胞および創傷の周辺の水平方向の兜き からなる。それは実質的な変形および傷跡を生ずるのて、その防１］：、または 減少は非常１て望ましい。

叡日の期間内て、創傷床からの健康な細胞は漠のコラーゲン／ＧＡＧ各子中に４ 勤しかつその内部て増殖し始める。間葉細胞および微小血管は、膜の平面に対し て垂直の方向に移動する。皮膚表面はここて水平と見なされるので、間葉皮膚の 成長方間はここて垂直と呼ぶ。上皮他心は格子表面を水平方向１Ｇ（すなわち、 膜平面に沿つて）移動する。火傷および他の皮膚の創傷は比較的浅い傾向をもつ ので、間葉細胞は新真皮をつくるために非常に遠くまで移動する必要はない。し かしながら、上皮細胞は、新上皮をつくりかつ創傷を閉じるために、大きい距離 を移動す・ることか必要であろう。

３０日以内に、上皮細胞は約Ｑ、７５ｃｒｎの距離を水平方向に移動しかつ増殖 することかできる。したかって、約１．５　ｃｍより大きくない水平方向の小さ い寸法をもつ創傷は、上皮細胞かすべての側面から割部を閉じると仮定すると、 約３０日以内に上皮移動により閉じら２″Ｌうるてあろう。しかしながら、広範 な火傷はしばしばすべての方向にｔ、りｃ−ｍを越える。たとえば、ひどく火傷 を受けた患者は、肩より下方における皮屑の事実上すべてを失なうことは異常て はない。したＩＱ、（つで、上皮細胞は数１００日を越える期間の間に正常の移 動により大きい創傷の中央区域へ到達することができない。非常に大きい創傷の とき、生分解速度か約３０日であるコラーゲン／ＧＡＧ格子は、上皮細胞か創傷 を閉じることり）できるだいぶ前に、完全に生分解されるであろう。

細胞の水性懸濁液の調製 皮膚の凝着片を液状溶液中の皮膚の生きている、再生する。翻胞の懸濁液（て解 離するためのいくつかの既知の技術が存在する［ｌＬｌつの普通の技術は、細胞 を他の細胞捷たは固体表面から分離させる、トリプ／ン、コラゲナーゼ、贅たは 他の酵素で、取り入れた皮膚片を処理す１０ ることからなる。皮膚片を１種寸たはそれ以上の酵素で処理した後、上皮層を除 去し、廃棄する。比較的高い速度て再生する基底細胞する残留組織を、十分な力 でかき寸ぜて細胞を破壊しないようにして分離する。たとえば、低速度のかきま ぜ、渦の形成、ピペッティングおよび他の形のイ昆合をこの目的して使甲できる 。秤胞を通電水溶液中しこ）腎部ぜせる。水容液は体液中１で存在する安質１で 似せた褌々の塩類を貧有する。この種の浴液は、しばしば生理的食塩水と呼ばれ るっそれをリン酸塩捷たは他の無毒の物質で緩衝させて、ｐＨをほぼ生理学的レ ベルに維持することができ、そして動物または人間の血清あるいはタンパク質重 たは他の栄養素源を榎充てきる。液体の密度を調整して、細胞の密度より低くす ることかてきる。

ｊ冒乞二５ｊ二 本発明は、遠心力を使用して生存しつる細胞を繊維の格子中に導入すること、な らびに遠心力を使用して細胞てシード（５ｅｅｄ）された線維の格子からなる。

種々の格子、たとえば、クリコザミノクリカンて橋かけさ２ｍだコラーゲン線維 からなる高度に多孔質の格子、を本発明の方ｉＫよりシードすることがてきる。

遠心作用を加える前に、無傷の組織片を供与点から取り入れる。それを１種寸た はそれ以上の物質、たとえばトリプシン寸たはコラ−ゲナーゼて処理して、組織 から細胞を解離する。次いで細胞を水溶液と混合して、細胞の水性懸濁液をつく る。線維の格子片を容器内に入れる。この容器は、ここで「バケット」といい、 遠心分離器による回転に適する。

細胞の水性懸濁を、格子と接触させて、バケット内に入れる。遠心力は、水溶液 よりを密である細胞を、比較的に均一な分布で格子中に強制的に入れる。種々の パラメーターを調節することにより、細胞を格子内の所望の位置にシードするこ とができる。遠心法によりシードされる格子を使用して、創傷において細胞の成 長および組織の発生を促進するこ吉がてきる。

図面の簡単な説明 図面は、本発明を構成する工程の順序を示す流れ図である。

明実施の最良の形態 不発明の１つの好ましい実施態様において、健康な、再生産性上皮細胞を火傷の 患者の供与点から取り入れる。

この上皮片をトリプシン、コラゲナーゼまたは他の適当な酵素で処理することに より、水性懸濁液中に解離する。

米、］’Ｆ＋許第４，０６０，０８１号（Ｙａｎｎｓ　ｅｔ　ａｌ、１９７７） に記載されている、二層膜片を、遠心分離器による回転に適する「揺動」型の底 部に入れ、あるいはこのようなバケット内の配置に適する試料ホルダー内に入れ る。膜はシリコーン層がバケットまたは試料ホルダーの壁に対してプレスされる ようにバケット内に配置し、そしてコラーゲン／ＧＡＧ格子がバケットの内部へ 暴露される。

細胞懸濁液をバケット中へ導入し、こうしてパケット内の溶液および細胞がコラ ーゲン／ＧＡＧ格子と接触する。

２ 次いでバケットを回転して、格子および懸濁液上に遠心力を発生させる。液体よ りも大きい密度を有する、懸濁液中の細胞は、バケットの壁に向かって押しやら れ、これによりコラーゲン／ＧＡＧ格子中に埋め込まれるようになる。

バケットの回転の速度および期間は、上皮細胞を格子中に所望の深さまたは深さ の範囲において埋め込むように、調節する。たとえび、バケットを十分に高い速 度て十分に長い時間回転させる古、実質的な数の細胞はコラーゲン／ＧＡＧ格子 の全深さを通して押しやられ、シリコーン層に対して静置されるようになる。容 器を低い速度であるいは短かい時間回転させると、実質的な数の細胞はコラーゲ ン格子内に種々の深さで埋め込丑れうる。

遠心は没階的に実施できる。たとえば、コラーゲン／Ｇ　Ａ、　Ｇ格子はバケッ ト中に取り付け、そして細胞懸濁液をバケノトニカロえる。バケットを前もって 決定した時間回転させ、次いて停止できる。第２体積の細胞懸濁液をバケノ）・ 内に入れ、そしてバケットを再び回転することかできる。この二段階の遠心を用 いて、単一段階よりも大きい均一性をもって厚い格子中へ細胞を接種することか できる。この方法は、何回も反復することができる。

格子内の細胞の接種（５ｅｅｄ♂ｎｇ）密度は、懸濁液内の細胞の濃度、すなわ ち、所定体積内の細胞の数を調節することにより、あるいは内部に入れる懸濁液 の量を調節することｌ／ｉ（より、主として水平面積に関してばかりてなく、か つまた格子の厚さに関して、調節することができる。

遠心的に接種された膜を創傷床上へ移植された後、生存している細胞は再生産し 、細胞の多数のコロニーを形成するであろう。各コロニーは、隣接するコロニー と出合う１て、容易に成長するてあろう。このようにして、接種された細胞は成 長して合流し、創傷を閉じる。

細胞が膜内に比較的密な面積のパターンで接種されると、すなわち、接種された 細胞が膜の平面、ここで水平と呼ぶ、において−緒に密である古、創傷をより急 速に閉じることができる。適当な面積密度は、通常多数の特別の因子、たとえば 創傷および患者の状態に依存するてあろう。一般に、所定の大きさの創傷の閉じ る時間は、接種Ｅ度および取り入れた皮膚の大きさに逆に関係する。

遠心技術を用いて、１種より多い細胞格子中に埋め込むことがてきる。現在の細 胞培養技術状態のもとて、上皮１ｒｔＥ　雁は、線維芽輔胞または他の開業細胞 と細胞間の連絡シであるとき、より速く増殖する傾向かあると信じられる５９″ Ｊｏ接種しない二層膜を創傷」二へ移植した後、シリコーン層を除去しかつオー トロガス細胞層を格子上へ縫合する前に、通常数日間の遅延を要する。この遅延 の１つの目的は、開音、ｆｌ１１．＠および血管が創傷床から格子中へ垂直に成 長させることである。しかしながら、開業細胞を患者から取り入れ、創傷上へ移 植する前に、格子中へ遠心力により接種する場合、この遅延を回避しあるいは減 少することができる。本発明の１つの実施態様にお乙１１４ て、上皮細胞および開業細胞を同じ液体懸濁液内で混合し、同時に格子中へ遠心 力により接種することがてきる。

本発明の別の実施態様において、上皮細胞をコラーゲン格子中に遠心力により入 れ、シリコーン層中へ埋め込み、次いで開業細胞を格子中へ遠心力により入れる ことができる。いす、れの実施態様においても、開業細胞の少なくとも一部分は 、膜が創傷上へ移植されるとき、上皮細胞より下に（すなわち、創傷表面に近接 して）存在し、そして上皮細胞の再生産は非常に急速に始まることができる。他 の実施態様において、開業細胞および／または上皮細胞は、上皮が格子上へ自己 移植される前に要する遅延を減少するために、格子中へ遠心力により入２するこ とができる。

患者が病院へ入れられるとすぐに、取り入れ、解離および遠心の作業を開始する ことが可能である。これらのすべて３つの手順は、数時間の間隔で完結すること ができる。患者が入院の手術中の１だ全身麻酔にある間、焼軛が創傷から除去さ れている間に、完全に接種された膜を準備し、患者へ移植することができる。こ Ｏようにして、単一の手術は、創傷を清浄し、創傷が完全に閉じるのを促進でき る細胞接種（ｃｅｌｌ−ｓｅｅｄｅｄ）合成膜でそれを置換するために十分であ る。これにより、創傷上へ異種移植片または異型移植片を配置し、それらが拒絶 される前にそれらを除去し、究極的にそれらを自己移植片が入手できるようにな るとき交換するための、長くかつ痛い一連の手術の必要性が排除される。

筐た、遠心分離手順は、二層膜のコラーゲン格子からシリコーン層を除去すると き生じうる困難を軽減または排除する。数週間または数カ月間の期間（これはコ ラーゲン格子のあるパラメーターを調節することにより変えることができる）Ｖ Ｃわたって、コラーゲンの格子は究極的に生分解される。それは格子内で成長す る細胞により生産されかつ分泌されるコラーゲンにより置換される。

このコラーゲンは湿潤条件下に生産されかつ分泌され、そしてシリコーン層には 付着するようにならない。乾燥コラーゲンの格子へ初め結合されていたシリコー ン層は、コラーゲンの格子とシリコーン層との間に上皮細胞が成長するとき、コ ラーゲンから自発的に剥れる。これにより、シリコーン層の外科的除去筐たは剥 離の必要性が排除される。

遠心接種の重要な利点は、制限された数の細胞の増殖により急速に閉じることが できる創傷の面積筐たは体積を大きく増大するためにそれを使用てきるというこ とである。これは２つの明確な利点を提供する。第１に、非常に制限された量の 無傷の組織がひどい火傷を受けた患者上に存在する場合、制限された数の有効な 細胞を用いて接種てきる格子の面積または体積を大きく増加するために遠心法を 使用できる。第２に、所定の面積または体積の格子を細胞で接種することが必要 である場合、供与点から取り入れることが必要な無傷の組織の量を大きく６ 減少することができる。特定の用途のための最適なシーディング密度は、当業者 により日常実験により決定てきる。

線維の格子または二層膜の片は遠心パケット中に、あるいは遠心パケット中に取 り付けられている試料ボルダ−中に、直接入れることができる。試料ホルダーは ポリカーボネート、アルミニウム、または他の材料から製作することができ、こ れらはオートクレーブ処理丑たは他の方法により好都合に滅菌することができる 。典型的には、試料ホルダーは１片の格子または膜を取り付けることができる１ またはそれ以上のくぼみすなわち「溜め」を含有するてあろう。

潜在的問題は、格子のへりと試料ホルダー寸だにｉ遠心バケットの壁との間のギ ャップに関して存在する。遠心力により駆動されているとき、水性懸濁液中の細 胞は接近可能な一番下または一番外の区域へ移動するであろう。

大きいギヤノブが格子のへりと試料ホルダーの壁との間に存在するとき、大きい 数の細胞は格子中１て適切１て接種されるよりはむしろギャップ中に集められる であろう。

この潜在的問題は、次のものを含む、種々の方法て回紳または軽減される。

第１に、−片の膜または格子を同じ大きさの溜めの中に入れるこ吉がてきる。壁 の大きさが異なる種々の試料ホルダーを保持して、種々の大きさの壁の膜捷たは 格子を収容することがてきるてあろう。膜または格子を遠心接種した後、それを 適当な大きさにトリミングして創傷中へ配置することがてきる。未使用の区域中 へ接種された細胞の大部分は、必要に応じて、絞りまたは遠心分離のような技貞 により除去するこ吉ができる。接種された二層膜から細胞を遠心除去するために 、回転軸へ向かって水分制御層を配向させて、試料ホルダーまたは遠心バケット 内に膜を配置することがてきる。

別法として、格子を取り囲むギヤノブに、接種すべき格子と厚さか同しであるか あるいは大きい不透過性材料を充填することができる。これを達成するいくつか の方法が存在する。たとえば、試料ホルダーと壁の犬ききが同じであるＩＭｉの 不透過性プラスチックシートを貯蔵しておくことかてきる。１片の格子をトリミ ングして創傷の中へ配置する。次いで、トリミングした格子を不透過性プラスチ ックシートの上部に配置することがてきる。

トリミングした格子の周辺ＩＣ沿ってプラスチックシートを切り、プラスチック ノートから同じ大きさのプラスチック片を除去し、次いてトリミングした格子を 試料ホルダーまたは遠心・バケットの中へ入れることかてきる。

本発明に関連して種々の遠心技術を用いることがてきる。たとえば、ある量の細 胞懸濁液の連続流を、格子が回転されている間に、格子へ投与し、あるいはそれ から抜き出すことがてきる。

発明実施の別の形態 細胞は、本発明の方法シでより、事実上のいがなる化学ｌ８ 的組成の多孔質格子中にも接種することができる。米国特許第４０６０．０８１ 号（Ｙａｎｎａｓ　ｅｔ　ａｌ、１９７７　）および米国特許第４，２８０．９ ５４号（Ｙａ、ｎｎａｓ　ｅｔ　ａｌ。

１９８１）中に開示されているコラーゲン／ＧＡＧ格子は比較的小さい重量係の グリコサミノグリカンＣＧＡＣ：）を含有して７ラーゲンの相溶性および物理的 性質を改良しているが、コラーゲン格子内のＧＡＧ−ｆたは他の物質の存在は本 発明の目的１（対して不必要である。

不発明に導ひいた研究はコラーゲンを含んだが、本発明の細胞接種法はコラーゲ ンの接種法に限定されない。

引き続く研究によると、線維のタンパク質重たは他のポリマー分子も人工器官や １世の医学的目的に適することが明ら力・にされた。このような他の分子を多孔 質格子に成形し、これを本発明の方法に成形すると、このようなｊ種法およびこ のような接種された格子は本発明の範囲内に入る。

「格子」さいう語ｊは、不発明において広義に解釈し、細胞が移動しかつ増殖て きる、高度に多孔質かつ透過性の構造の形状である、いがなる材料をも包含する 。

「線維Ｏ格子−］とは、巨視的、微視的または分子のレベルて線維状である材料 を含む、すべての格子を包含するように、広く解釈すべきである。たとえば、多 くのポリマーのフオームは長い分子からなり、これらの分子は多数の側鎖や広範 な橋かけを含むことができる。あるいは焼結されたセラミック材料は、形状寸た は性質が線維質であると見なすことのできる多数の粒子からなる。このような材 料は、いずれも、本発明の方法により細胞で接種される格子として形成される場 合、本発明の範囲内ｌ（入る。

いかなる形状または立体的配置の格子にも細胞を接種するこ吉ができる。たとえ ば、面、手、寸たけ他の不規用１０表面の成形さ２″Ｌだ二層膜をつくることが 可能てあろう。このような格子は本発明の方法により細胞を接種することがてき 、そして本発明の範囲内に入る。

本発明の方法は、細胞を線維の格子中へ接種する他の方法と組み合わせて用いる ことができる。たとえば、火傷の患者が１ず入院されると、オートロガス細胞を 患者から取り入れ、水性懸濁液中へ解離し、遠心作用により二層膜中へ接種し、 この膜を初期の手術の間に患者上へ移植する。健康な上皮細胞の数が不十分であ るとき、あるいは遠心作用に暴露したｉ＋＋１＠の一部分か何らかの理由でコロ ニーを発生しないとき、創傷の区域は遠心接種された１汀昭から増殖した新上皮 により閉じられないてあろう。閉じられない創傷の区域は膜の透明なシリコーン 層を視的に監視することにより同定することがてきる。これらの区域は、別の親 の出願の米国特許出願第号、その教示を引用によってここに加える、の主題であ る方法の１丑たはそれ以上によって再接種することができる。たとえば、上皮の おおい中の大きい空隙は、シリコーン層のある区域を除去し、そしである量の細 胞０ 懸濁液のある量を露出したコラーゲン格子上へ噴霧するかあるいは広げることに よって、接種することができる。

上皮のおおい中の小さいギャップは、注射器で細胞懸濁液を配置することにより 接種できる。

前述のオートロガス細胞は、患者または患者の一卵性双子からの細胞に制限され た。これは現在の移植技術の状態を反映する。現在の技術を用いると、非オート ロガス細胞は創傷により拒絶される傾向がある。しかしながら、細胞の型の分類 および合致、表面または分ｌ、された抗原または他の分子を除去または不活性化 するための細胞処理、免疫抑制剤、および他の技術における引き続く発展１ｃよ り、この問題は軽減または排除さＩｚ、こうして非オー）ｏガス細１泡を失なわ れた組織、骨丑たは器官の再構成に適するものとすることがてきる。このような 方法で合致されあるいは処理された、このような細胞は本発明の方法により線維 の格子中への吸種に適するであろう１．このような細胞は本発明の範囲内である 。

種々の型Ｏ勝維の格子は、体の）・１とんどの区域、たとえば皮膚、血管、骨、 粘合組織収縮組織２よぴ器官、内の人工器官装置としての使用に適する。このよ うな格子は、事実上いかなる種類の細胞も成長し、移動しかつ増殖てきる構造系 を提供する。それらは事実上体のいかなる区域内にも外科的に包封することがで き、そして適切な型の細胞て適当に接種された場合、新らしい組織の再生を許す ことができる。たとえば、器官の損傷を受けるかあるいは病気にかかった場合、 その器官の一部分を除去することが必要であろう。線維の格子を器官の一部分の 除去によりつくられた位置において包封することかてきる。その器官の他の部分 から、あるいは適合性の供与体からの、十分な数の健康な細胞を本発明の方法に より格子中へ接種する場合、器官の回復および再生を太きく促進するこさができ る。このような使用は、本発明の範囲内に入る。遠心力は、すべての方向におい て厚さが数センチメートルであることかできる。このような格子全体に細胞を接 種するために有用である。

細胞の取り入れ後、線維の格子中への接種前に、細胞をインビトロで培養するこ とがてきる。こ２″Ｌはいくつかの明確な利点を提供するであろう。たとえば、 それを用いて接種に有効な細胞の数を増加することができ、それてより創傷をお おうために取り入れなくてはならない組織の量を減少することができる。さらに 、これにより細＠「銀行」を使用することがてきる。たとえば、危険か多い職業 の人は細胞を供与することかてき、この細胞をインビトロて培養し、これを、事 故が起こったとさあるいは傷を受けたさき、線維の格子中への接種に１吏用する ことかてきる。ここに開示する方法による保存されあるいは培養された細胞の線 維の格子中への接種は、本発明の範囲内である。接種のために所望の種類の細胞 を取る、細胞銀行および組織の培養物は、本発明の目的１で対して「供与点」吉 いう用語内に包含される。

２２ ある種の細胞の増殖速度を増加する、細胞と種々の物質との種々の接触技術が知 られている。たとえば、上皮成長因子〔１０〕、フィブロネクチン〔１１〕、環 式ヌクレオチド［１２］、コレラトキシン（１３，］、血小板誘導成長因子〔１ ４〕、組織脈管形成因子〔１５〕、および種々の他の物質〔１６〕は、１種捷た はそれ以上の細胞の増殖速度および／または表面付着を増加できることが知られ ている。細胞を繊維の格子中へ本発明の方法により接種する前に、このような細 胞の増殖速度を増加することが知られている物質あるいは後に発見された物質と 、このような細胞を接触することがてきる。このような接種前の処理を用いて、 接種に有効な細胞の数を増加すること、あるいは細胞の接種後、細胞の急速な増 殖を誘発することができる。このような接種前の処理あるいは新真皮表面処理は 、本発明の範囲内である。

接種されたコラーゲン格子の特性 ここに記載する発明は、線維の格子の中へあるいはその上へ細胞を遠心接種する 方法からなる。葦だ、この発明は、本発明の方法により細胞を接種された線維の 格子である組成物からなる。その組成物をさらに定義するために、米国特許第４ ，０６０，０８１号（Ｙａｎ、ｎａｓ　ｅｔ　ａｌ。

１９７７）および米国特許第４，２８０，９５４号（Ｙａｎｎｓｅｔａｌ、１９ ８１）、それらの教示を引用によってここに加える、中にさらに記載されている コラーゲン／ＧＡＧに関する情報を、以下に説明する。

移植されたコラーゲン格子への創傷の生理学的応答は、別々の因子として作用す る単一の特性よりもむしろ、格子の特性の組み合わせに依存する。したがって、 単一の特性の最適ケ数値を特定しないことが好ましい。その代わり、ある範囲の 値をほとんどの特性について特定することがてき、すべての他の特性は同時に適 当な範囲内にあると仮定する。寸だ、パラメーターと特性との間て述べられる関 係は余す所なく述べられていないことに注意すべきである。その代わり、最も明 確な相関関係を述べる。

１、調整可能な生分解性 コラーゲン格子は、創傷表面と生化学的に連絡すると、コラゲナーゼおよび他の 自然酵素により究極的に無毒の物質に生分解され、このような無毒の物質は正常 の体の過程により消化され、利用され、あるいは排除される。

格子は適切な数の細胞が格子内で増殖して失なわれあるいは除去された組織を再 生する１て、その溝造的一体性を保持しなくてはならない。格子がこイｔより速 く生分解されると、それは創傷が冶ゆされる前に、液化し、無用となるであろう 。他方に２いて、出願による研究は、格子が非常にゆっくり生分解すると、それ が格子を取り囲む密な線維形成サックの形成を促進する傾向をもつことを示す。

このサックは、創傷の治ゆを妨害し、傷跡を一層悪化する傾向がある。

二層膜を用いる研究によると、理想的生分解速度はお４ おまかにほぼ２５〜３０日に等しいことが示される。このことは、全格子が３０ 日以内に生分解すべきであることを意味しない、。その代わり、そのことは、生 分解の有意な量が約３０日以内に開始するが、格子の残部は数か月間以上存続し うろことを示す。当業者による日常実験は、この生分解速度が１細胞て接種すべ き格子について、あるいは合成皮膚以外の目的に使用する格子について多少変更 すべきであることを示すであろう。

コラーゲン格子の生分解速度は、コラーゲンの橋かけ密度を増加することにより 、コラーゲンと橋かけするＧＡＧの含量を増加することにより、あるいは格子の 多孔度を減少することにより、裁少することができる（すなわち、格子は、創傷 上への移植後、より長い期間にわたって耐久性をもつであろう）。

二層膜のシリコーン層は、生分解性てはない。しかしながら、この層は新上皮が その下で再生された後自発的に分離する（外科的転位筐たは除去を必要としない ）ので、満足すべきものであり、し〃・も好寸しいことさえある。

２、非抗原性および非炎症性 異種移植片、異型移植片、および移植された器官は、患者の免疫系により異質物 質として認識されない細胞を通常含有する。典型的な免疫応答において、抗体お よびある種の細胞たとえばリンパ球は、免疫抑制剤を使用して抗体や防御的細胞 の形成を抑制しないかきり、異質細胞を同定し、攻撃に参加する。しかしながら 、このような薬物の使用は、患者を感染に対して発病性とする。このような薬物 の使用は、移植された物質が抗原性や炎症性をもない場合、不必要である。

出願人と共同に発明されたコラーゲン／ＧＡＧ格子は、コラーゲン分子および６ ４０分子の化学的含量および橋かけされた構造の配置を調整することにより、そ れが抗原性や炎症性をもたないように製造することができる。

それは、適切に製造されると、患者による拒絶反応を誘発しないで、創傷表面に より容易に受け入れられる。

３、創傷表面に対する親和性 コラーゲン格子は創傷表面に対して十分な親和性をもち、効率よく表面をぬらし かつそれとの接触を維持しなくてはならない。この親和性は、通常、力／面積で 測定された、界面の表面張力または表面エネルギーとして表わされる。創傷とコ ラーゲン格子との間の界面の表面エネルギーは、創傷と大気との貫の界面の表面 エネルギーよりも低くあるべきである。この規準は、出願人と共面発明されたコ ラーゲン／ＧＡＧ格子により満足される。

４、引張り強さ 合成膜もしくは人工器官装置は、十分に強靭てありかつ強くて、縫合に裂けない て耐え、かつ包封や医学的操作によりあるいはは患者の動きにより生じた偶発的 応力に暴露されたとき、引き裂きを防止しあるいは制限すべきである。格子の強 さの２つの最も重要な指標は、引張り強さくこれは、既知の横断面積をもつ試料 を引っ張って離すために要する力がどれだけであるかを測定する）および引き裂 きエネルギー（これは所定大きさの引き裂きをつくるために要する仕事がどれだ けであるかを測定する）である。コラーゲン／ＧＡＧ膜は、はぼ５０〜ｌ、・Ｏ ＯＯｐｓｉの引張り強さの範囲およびほぼｌＸｌ０’〜約５　Ｘ　１−０’エル グ／ｃｒｒ？　■引き裂きエネルギーの範囲を有する。格子の強さは、橋かけ密 度を増加することにより、あるいは格子の多孔度を減少することにより、増加す ることができる。

５、形態 一般に、「形態」は、格子内の線維の大きさおよび空間的配置に関係する。それ 自体ては、「多孔度」の逆と見なすことができ、この多孔度は格子内の線維間の 開口空間の大きさ、形状および空間的配置に関係する。

人工器官の装置としての役目をする合成コラーゲン、６子は、再生すべき型の組 織内に自然に存在するコラーゲンのマトリックスに類似ナベきである。この空間 的目装置は、損傷を受けない組織に類似する規則的パターンでの細胞の成長を促 進し、これにより傷跡を減少しかつ再生された組織の適切な機能を促進する。

多孔質コラーゲン格子の重要な形態学的特性には、次のものが包含される： ａ、線維の体積分率。これは、線維が占有する体積を格子の合計体積で割ったも のに等しい。この分率は、後述する多孔度の逆数である。

ｂ、平均のアスペクト比。これは、線維の平均の長さ対平均の幅の比である。長 くかつ細い線維で構成された格子は、大きい平均のアスペクト比をもっであろう 。

Ｃ８線維軸の平均の配向。これは、線維がすべての方向に不規則に配向している かどうか、あるいは実質的な数の線維が格子内の１またはそれ以上の軸に沿って おおよそ平行な方向に配向されているがどうが、を示す。

ｄ、線維軸間の平均距離。これは、隣接する線維がどれだけ離れているかを示す 。この特性は、孔大きさに直接関係する。

本願人と共同発明された多孔質コラーゲン／ＧＡＧ格子は、哺乳動物の皮膚、角 膜および朧の中に通常存在するコラーゲンのマトリックスに類似する形態学的特 性を有すると、信じられる。したがって、前述の格子は、失なわれたあるいは損 傷された皮膚、角膜および膿の再′生を促進する人工器官の装置として、非常に 適する。研究により、肋の型の組織も同様な形態学的特性をもち５　こうして前 述のコラーゲン／ＧＡＧ格子による再生によく適することを、示すことができる 。さらに、研究により、コラーゲン格子の形態学的特性を変更して、他の型の組 織中に存在するコラーゲンのマトリックスに類似させる方法を示すことができる 。このような格子は、本発明の方法１τより細胞を接種した場合、本発明の範囲 内に入る。

８ 多孔度の４つの相互に関係する面は、コラーゲン格子内の細胞の移動および増殖 の速度に影響を及ぼす。

ａ、多孔度。これは、化分率とも呼ばれ、格子の体積に等しい分率である。この 分率は１００を掛けて百分率に変換することができる。高い多孔度は、細胞が成 長しかつ増殖するためのより大きい空間を提供するので、望ましい。多孔度を変 更して、コラーゲン格子の生分解速度および曲げ剛性を調節するこさができる。

二層膜を含む研究によると、少なくとも約９０係の多孔度は格子の内部および表 面上の細胞の移動および増殖を助けるために望才しいことが示される。出願人の 追加の研究によると、多孔度が少ｌくとも約９５俤であると、上皮細胞は膜のコ ラーゲン／ＧＡＧ格子と上のシリコーン層との間に移動する傾向があることが示 される。これは、シリコーン層が新上皮のその下の再生と同時に分離されうるよ うＫするのて、非常に望ましい。

ｂ、孔の杉犬および分布。これらは孔の形状あ−よび崎維の配向に関係する。

Ｃ９孔の大きさ。Ｃれは平均の孔の直径を示す。コラーゲン格子内の孔は、踊砲 かその中て成長しかつそ２″Ｌを通して移動できるために十分な大きさてなくて はならない。出願人の研究によると、はぼ５０μｍの平均の孔大きさは、満足す べき細胞の移動および増殖を助ける傾向があることが示される。当業者による日 常実鹸により、平均の大きさ、および可能ならば平均付近に孔大きさの９ 分布を変更して、コラーゲン格子の棹々■使用のため、細胞の移動および増殖を 促進すべきであることが、示されうるであろう。

ｄ、結合性。これは、透過性とも呼ばれ、孔が隔離されている力・、あるいは゛ 相互に結合しているかを意味する。

閉じたセルのフオームは流体や他の物質の通過を許さず、各気泡は捕捉されてい る。この型Ｏ格子は、ｄ胞の移動のために不適当てあろう。これと対照的に、古 過性略子は相互に結合した孔を含有し、これは孔の間の流体や細胞Ｏ＠きを許す 。コラーゲンＱ線維の性質、および本発明においてｌ吏用する格子をつくるため に用いる凍結乾・繰去は、格子が十分に透過性であって１．、ｆｆｌ砲の移動を 許す１ＪＩＪ傷の収縮は、通常、創傷の中およびその１つの周辺上の１（Ｉｉ胞 Ｏ＠、勅を含む。たとえば、小さい片の皮膚か励物讐たは人間から失なわれるか ｉ）るいは除去でれるとき、周囲の皮１“はファンア（ｆａｓｃｉａ）を横切っ て吻いてＪＩＪｍを閉じようとする。その結果、創傷床区域の変形および傷跡の 形成が起こり、そしてそれらは正常の機能に精確にもどすため【は非窓に悪影響 を及ぼす。出願人の研究によると、二層膜の適切な製造および配置は創傷の収縮 を遅延しかつ減少し、これによって傷跡の形成および収縮の変形は減少し、そし て新上皮の再生および適切な機能が促進されることが、示される。

３０ ｆｉｉＬ傷表面と接触させて配置するとき、コラーゲン格子は十分に柔軟であっ て、創傷床と格子との間に空気ポケットが捕捉されるのを防ぐべきである。この ような連行された空気のトラップ（Ｊ、シばしば死空間と呼ばれ、流体で充填さ れるようになり、しばしばバクテリアの増殖および感染の点に進展し、それゆえ 避けるべきである。

効率よい湿潤は、比較的低い剛性の格子の使用を必要とする。

曲げ剛性は、格子の形状および材料の弾性率の関数である。人工皮膚として使用 する膜の剛性は、膜の厚さを（或少することにより減少てきるが、器官や骨の人 工器官は特定の形状に拘束されるであろう。弾性率（しばしばヤング率と呼ばれ る）は、コラーゲン格子の曲げ剛性を許容さ、れうるレベルに減少するために十 分に低いが、ゆがみを起こさないて適度の圧縮力に耐えるためｒ七分に高くある へきである。ヤング率か約１〜約１００　ｐｓｉ（格子の厚さおよび形状に依存 する）である材料は、好ましい。コラーゲン格子のヤング率は、多孔度を減少す るかあるいは橋かけ密度を増加することにより、増加てきる。

９、水分束 水分束は、ｇ／ｃｎ？／時葦たは同様な用語で表わした、所定時間内に膜の所定 面積を透過する水または他の液体ぎると、多過ぎる流体は創傷を去り、そして創 傷床および膜は脱水され、膜の収縮およびわん曲が生ずるであろう。他方におい て、膜の水分束か低過きると、流体は膜の下に蓄積し、所望の生理学的プロセス を混乱させる。

このような流体の蓄積は通常滲出液または浮腫み呼ばれる。いずれの極端な場合 をも避けるために、合成皮膚として使用する、膜の水分束は正常の皮膚の水分束 に近似させるべきである。

コラーゲン／ＧＡＧの水分束は、／リコーン層の厚さを変更することにより容易 に調節することかてきる。はぼ０．１〜１．０　ｍｍのシリコーン層は、適当な 範囲の水分束を提供することがわかった。

牛の皮からのコラーゲンＣＭ、Ｋｏｍａｎｏｗｓｋｙ　ｅ　ｔ　、　ａｌ　。

Ｊ、Ａｍｅｒ、Ｌｅａｔｈｅｒ　Ｃｈ、ｅｍ、ｉｓｔ　Ａｓ５ｎ、、　６９　： 　＋　９　、　ｐ、　４１０−４２２（１９７４）に記載される方法に従い調製 した）ヲ、イースターン・レジオナル・リサーチ・センター（Ｅａｓｔｅｒｎ　 Ｒｅｇｉｏｎ、ａｌ　Ｒｅ５ｅｒｃｈ　Ｃ１ｎｔｅｒ、Ｕ、Ｓ、Ｄｅｐａ、ｒ− ｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｖｌｔｕｒｅ、Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈ、ｉａ、Ｐ Ａ）から供与された。それをライレイ・ミル（Ｗｉｌｅｙ　ｍ１ｌｌ）（Ａ、Ｈ 。

Ｔｈｏｍｎｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）ＶＣより、 ２０メツシユのふるいを用いて粉砕し、液体窒素で冷却した。

各膜を調製するために、０．５５．９　（水和重量）の粉砕したコラーゲンを、 ２００ｍｔの０．０５モルの水性酢酸に卯２ えた。この溶液を氷ジャケット付きブレンダーＣＥｂｅｒｂａｃｈＣｏｒｐ、　 、Ａｎｎ　Ａ、ｒｂｏｒ、Ｍｌ　）内で２速度動カ装置（ＷａｒｉｎｇＣｏｍ、 ｐａｎ、ＬＩｉａｒｔｆｏｒｄ、ＣＴ）上において高速度で、６０ポルＨＣ低下 させたライン電圧において、６０分間がきまぜた。

／ヤーク・カーティレイジ（ｓｈａ、ｒｋ　ｃａｒｔｉｌａｇｅ）　（ナトリウ ム形咋、Ｃ型、５１ｇｍ、ａ　Ｃｈｅｍｕ’、ｃａｌ　、Ｓｔ　、Ｌｏｕｉｓ　 。

Ａｆｏ　）から得た０、０４４ｇ０コンドロイチン６−サルフェート（水和重量 ）を、４Ｑｍｌの０．０５モルの酢酸中に溶かした。５分間かけて、前記のＣ６ 、Ｓ’溶液を配合の間にコラーゲンの分散液Ｖ′Ｃ卯えた。この混合物をさらＩ Ｃ１０分間配合し、次いて１５００．９において１時間冷却遠心憬ＣＣＲＵ−５ ０００型、Ｉｎ、ｔｃｒｎａＪ、ｉｏｎ、ａ、（ｆＺ’ｑ７ｔｔ’、ｐｒｎ、ｅ ｎｌ、。

Ｎｅｅｄｈａ、ｍ、　Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＭＡ）、４℃に維持された、により遠心 分離した。分散液を遠心機から取り出し、１４０ｍ１の上澄み液を、遠心分離し た分散液の各２４０ｍ１について、テカントした。次いて濃縮さ２ｔた分散液を 、エベルバノハ（ｊｖ’ｂｅｒｂａｃｈ　）ブレンダ−により高速ヴのセットて ６０ポルＩＩｃおいて配合した。次いで分散液を凍結トレー中に注き、２ｍｌの 分散液をトレー表面の各１平方インチへＪ用した。トレーを一４５℃に維持され た予備冷却凍結棚ＣＩＯ−ＭＲ−ＰＣ型、Ｖｉｒｔｉｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｇａ 、ｒｄｎｅｒ。

＃ｙ）上に１４いた。トレーを凍結させ、約１時間棚温度吉平衡させた。次いて 室内の圧力を１００　ミＩＪ　）ルより小に低下させ、トレーを１時間静置した 。棚温度を０°Ｃに上げた。試料を２４〜４８時間凍結乾燥した。

生ずる泡を取り、アルミニウムはくて包み、１０５°Ｃおよび５０　ミＩＩ　） ルに維持された真空炉内に約２４時１間維持した。炉から取り出した後、泡をデ シケータ−内に貯蔵するか、あるいは冷却し、シリコーン接着剤て被覆した。

シリコーン接着剤（医薬縁、ｆ）ｏｗ　５ｉｌａｓｔン、Ｃカタログ号←　８　 ９　１　、　ＤｏｌＪＪ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍ、ｐａｎｙ、、へＪｉ　ｄ 　ｌ　ａ、ｎｄ　、Ｍ　Ｉ　）　を・冷却したフオームの全表面ヒにｍｆｆした 。シリコーンを、凍結トレーと接触しないフオーム表面の一ヒに被覆した。

シリコーンをスパチュラでほぼ０．１〜０．５　ｍｍの厚さに適用した。この二 １者をシリコーン側を下１でして０．０５モルの酢酸中に室温において２４時時 間性て、シリコーンを硬化させた。次いてこの膜を回転させてシリコーン側を上 にして、０．０５モルの酢峨中で２４時間室温において再水和した。酢酸を除去 し、０．２５容量係のグルタルアルデヒド（工業銘柄、力ｌロクナ８＝、Ｖ７５ ２、Ｊ、Ｔ。

Ｂａｋｅｒ　Ｃｈｃｍ、１ｃａｌ　Ｃｏ、ＰＪｒｉＨｉｐｓｂｕ、ｒｇ、、＼’ Ｊ）を含有する０、０５モルの酢酸で置換した。このダルタルアルデヒドの橋か け処理を、室温において２４時間続けた。グルタルアルデヒドの溶液を除去し、 材料を蒸留した脱イオン水て２回洗浄した。泡を室温て２４時間水中に貯蔵し、 次いて貯蔵容器へ移した。それを４℃の水中の７０チのイノプロパツール浴液中 に、使用前短時間貯蔵した。

これらの方法によって製造された膜の典型的な特性を、３４ 実施例１に記載するようにし て製造した二層膜の特性 引張り強さ Ｃ／ＧＡＧ格子　２〜５×１０４ニユ一トン／ｍ２二層膜　７〜１０×１０４ニ ユートン／ｒｒＬ２平均の孔直径 湿潤前のＣ／ＧＡＧ＠子　８０ミクロン平均の多孔度 湿潤前のＣ／ＧＡＧ格子　９６％ 水分束 二層膜　１〜１０ｍ９／ＣＴｎ２／時 幅Ｉｃｍのストリップの曲げ剛性 Ｃ／ＧＡＧ格子　５〜１５０ｘ　１Ｏ−９＝ニー　）ソーｍ２二層膜　１０〜５ ００Ｘ１０−９＝ニー）ノーｍ２抗原性　非膚に低い ピロゲン・ｌイ１−　塗出てきず 有意の生分解性　２５〜３０日 繊維軸の平均の配向　不規則 実施例２　水性１′、胞懸濁液の調製 オートロガス細胞を、モルモットの背中からあるいは人体から、皮膚切除器を用 いて、あるいはモルモットの耳の切り取りから、取り入れることがてきる。取り 入れた細胞を、カルシウムやマグネシウムを含寸ない、冷（４℃）リン酸塩緩衝 生理的食塩水ＣＰＢＳ）（カタログ＋　１７−５１５　Ｂｓ　Ｍ、Ａ、Ｂｉｏｐ ｒｏｄｕｃｔｓ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌ　ｌｅ。

ＭＤ）中に入れる。皮膚をトリプシンで処理する前に、それを温かい（約３０℃ ）ＰＢＳへ移す。次いで、皮膚を、カルシウムやマグネシウムを含１ないハンド （ｆｆａｎｄ）のバランスさせた食溶液中の２．５％のトリプシン溶液（カタロ グ＋　１７−１６０　Ｈ，Ｍ、Ａ、Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ＰＢＳで０．２ ５％のトリプシンに希釈した、中で３７℃において４０分間保温する。保温後、 上皮層を真皮層から分離し、廃棄する。比較的大きい数の増殖性基底細胞を含有 する。真皮層を組織培養基（Ｄｕｌｂｅｃｃｏのグルタミン不含変性イーグル培 地、カタログ≠１２−７０７Ｂ％Ｍ　、　Ａ、。

Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、使用の短時間前に子牛の血清とＬ−グルタミンを補充 する）に移す。次いで、この溶液を１５分間渦形成によりかき１ぜて、組織から 基底細胞を解放する。次いで、この！ご濁液を滅菌ガーゼで濾過して、大きい組 織断片を除去する。

細胞濃度を、細胞計数室または電子粒子計算器により、測定する。細胞め生存能 力は、細胞のアリコートをトリバンブＡ／　−（Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ　Ｂ ｉｏｌｏｇｉｃａ、ｌ　ＣｏｒｎｐａｎＪ。

Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、ＮＹ）で着色するこさにより、測定する。

細胞密度は、組織培養基の添加により、はぼ１０’の生存細胞／　ｍｌに調整す る。

（実施例１１で記載のよう１（シて製造した）表面積が略々６ １．５Ｘ３．１５ｃｍで厚さが約１〜２龍である二層膜片を、混練ポリカーボネ ート製の試料ホルダーにいれた。次いてそのホルダーおよび膜を揺動遠心分離バ ケノ（Ｉ　ｎｔｅｒｎｔｚ　−ｔｉｏｎａｌ　Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ　Ｍｏｄｅｌ 　３５８−Ｓ　、　Ｎｅｅｄｈａ、ｍＲｉ　ｇｈ　ｔ　ｓ　、ＭＡ　）中におい た。膜のシリコーン層を試料ホールグーの底面に面させ膜のコラ−７７７０４０ 層が自由表面となるようにした。（実施例２に記載のようにして製造した）細胞 の水性懸濁液約１．３ｍＪをピペットてもって格子の上に供給した。これは、Ｃ ｍ２当り約０．２９　Ｘ　１０６個の細胞なる接種密度にあたる。バケノを冷凍 遠心分離装置（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ、ｌ　Ｅｑｕｉｐｍ、ｅｎｔ　！ｌ１ ｏｄｅｌ　ＣＲＶ　−５０００、Ｎｅｅｄｈａｒｎ、　Ｈｉｇｈｔｓ　、ＭＡ） に乗せ、約４　”ＣＫ　維持して約５０，９て約１５分間回転した。

接種した膜をバケノから取り出した。骨膜から約１．５Ｘ　Ｏ，１５ＣＩｎの条 片をとり、生物学的分析に供した。、、接種した膜の残りを、ギイ・アピノグの 背につけた１、５　Ｘ　３．０酬の火傷上して→合した。この操作を約２０匹の ギ不アピノグに実施した。この操作によって表皮細胞かう−まく膜中に接種され 、繁殖して細胞の群落になった。大部分の供試ビッグは、細胞群落が火傷部を完 全にふさぐ前に殺して組織学的検素に供した。だが、火傷閉鎖に殺さなかったビ ッグでは、細胞群落が成長して合流し、永久的な擬似表皮の機能ＩＷＩになった 。擬似表皮区域ては毛のう、脂肪腺または汗腺がないのが普通であったが、擬似 表皮層は、火傷をいえるが壕−１に収縮させた場合のまたは従来の自己植皮法に よった場合の擬似表皮に比べ、より滑らかで、鍛痕になりにくくかつ線維組織の 増殖が少いのが一般であった。適正に接種したコラーゲン／ＧＡＧ格子によって 助成した火傷部の閉鎖は、約７ないし１４日でおこるのが普通であった。

いくつかのパラメーターの重要性を調べるために、前例の繰作を、いろいろ変更 して実施した。一つの変更例ては、細胞懸濁液中の生きている細胞数を約３Ｘ１ ０’個／ｍ７！に増加した。１．３　ｍｌの懸濁液を４．５ＣＴｎ２の膜に適用 した。この場合の接種密度はＣｍ２当り０．８７Ｘ１０６個の細胞となる。だが 、このように接種密度を上げても火傷閉鎖速度に実質的な向上はなくかつ１４日 ｌ１Ｃおける再生表皮の外観も大巾によくなることはなかった。

第二の変更例では、膜および懸濁液を遠心分離装置に乗せ、５００ｇで１０分間 回転した。こＯ数値は、試験管内の生きて乙）る細胞数はこの程度の遠心力およ び処理時間によってｊま悪影響を受けるものてないという報告かあったのて、選 んだ値である。た′ＩＪ）、５００ｇ　１０分間の遠心操作で接種した膜による 火傷部の閉鎖は、５０９　１５分間の遠心操作で接種した＋７４　Ｆよる火傷部 の閉鎖に比べ、実質的１で劣るものであった。

接種した膜内における細胞群落は、火傷部の周辺からの細胞の体動またはＭ殖に よるものではなく、接種した細胞によって形成されたものであるという事実を確 認す３８ る目的で、数匹のギネアピノグの５Ｘ６ｃｍの火傷部内にＩＸ２（ｍの接種した 膜を何枚か円く点々と島状に適用した。各島には表皮細胞の群落が成長して疑似 表皮組織になったが、組織は他のいずれの上皮細胞源からも単離さ本発明は、線 維質の蛋白質系格子を用いて細胞および組織の成長を促進する点に産業上の有用 性をもつものである。

均等 当業者は、本明細書に記載した具体的操作と均等な多くの方法および本明細書記 載の接種した・格子と均等な多くの物を認識し、かつ日常の実験を越えない試行 によってそれらの均等方法および均等物を確認できるであろう。

かような均等方法および均等物は本発明の範囲内であると思われ、以下の請求の 範囲にカバーされる。

ｔｏ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏ　ｏ　ｔｈｅ　３ｋｉｎ（Ｆ、Ａ、Ｄａｖｉｓ　Ｃｏ 、。

（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９７４　）　：Ｈ，Ｇ ｒａｙ。

Ａｎａｔｏｍ’／、Ｄｅｓｃｒｉ　ｔｉｖｅ　ａｎｄ　Ｓｗｒｇｉｃａｌ、第１ ５版。

Ｐ、１１３５　ｅｔ　ｓｅｑ、（Ｂｏｕｎｔｙ　Ｂｏｏｋｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ 。

１９７７）参照。

２、たとえば、Ｈ，Ｃ，Ｐｏ１ｋ　Ｊｒ、ｅｔ　ａｌ　ｅｄｉｔｏｒｓ。

ＣｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙＢｕｒｎ　Ｍａｎａｇｅｍｅｎ’ｔ、ｐ、３４５　ｅ ｔ　ｓｅｑ。

ＣＬｉｔｔｌｅ、Ｂｒｏｗｎ　＆　Ｃｏ、、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ　１９７１　） 参照。

３、たとえＪｄ、ｐｏｌｋ　ｅｔ　ａｌ、５ｕ７）ｒａ注２　、　ｐ、４１２ｅ ｔ　ｓｅｑ、参照。

４、たとえば、Ｊ、Ｆ、Ｂｕ、ｒｋｅ　ｅｔ　ａｌ、Ａｎｎ、Ｓｕｒｇ、１８２ （３）：ｐ、１８３−１９５（１９７５）参照。

５、たとえば、Ｐｏ１ｋ　ｅｔ　ａｌ、５ｕｐｒａ注２．ｐ、８６２ｅｔ　ｓｅ ｑ、参照。

６、たとえば、Ｐｏ１ｋ　ｅｔ　ａｌ、５ｕｐｒａ注２．ｐ、３８５ｅｔ　ｓｅ ｑ、参照。

７、ｆｎえば、Ｐｏ１ｋ　ｅｔ　ａｌ、５ｕｐｒａ注２．ｐ、３８３ｅｔ　ｓｅ ｑ、参照。

８、たとえば、Ｍ、Ｐｒｕｎｉｅｒａｓ、Ｊ、ＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅＤｅ ｒｍａｔｏｌｏｇ’／　６７：　ｐ、５８　ｅｔ　ｓｅｑ、（Ｗｉｌｌｉａｍｓ 　＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａ１ｔｉｎｃｏｒｅ、　１９７６　）参照。

Ｖｉｔｒｏ　８　：４５１（１９７３）；／ζＨ，Ｋａｈｎ　ｅｔ　ａｌ、Ｊ。

Ｎａｔ’ｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、５８　：１４７１　（１９７４）：Ｍ。

Ｒｅｇｎｉｅｒ、Ａｃｔａ　Ｄｅｒｍｎｔｏｖｅｎｅｒ（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ） ）５３　：２４１　ｅｔ　ｓｅｑ、Ｃ１９７３）’；　Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ　ｅ ｔ　ａｌ、Ｃｅ１１６　：３１７（１９７５）参照。

１０、たとえば、Ｒ，Ｏ，Ｇｒｅｐｐ、ｅｃｅｎｔ　Ｐｒｏ　ｒｅｓｓ　１ｎＨ ｏｒｒｎｏｎｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　８０　：　５３３　ｅｔ　ｓｅｑ、（Ａｃ ａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９７５　）　；　Ｒ，Ｈ，５ｔ ａｒｋｅ’／　ｅｔ　ａｌ。

７７６（１９７７）参照。

１２、たとえば、Ｄ、Ｍ、Ｐｒｅｓｃｏｔｔ　、編、　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏ ｎｏｆ　Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｃｅ１ｌｓ、ｐ、１０７　ｅｔ　ｓｅｑ、ＣＡ ｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９７６　）参照。

１３、たとえば、Ａ、Ｗ、Ｂｅｒｎｌｌｅｉｍｅｒ、編、Ｍｅｃｈａ、ｎ１ｓｒ ｎｓ　１ｎＹｏｒｋ　１９７６　）　：　Ｄ、Ｍ、Ｇｉ　ｌ　ｌ　、Ａｄｖ、（ ）ｉｃ　ｌ　ｉｃ　Ｎ７ｔｃ　ｌ、Ｒｅｓ。

８　：８５ｅｔＳｅｑ（１９７７）参照。

１４、Ｈ，Ｎ、Ａｎｔｏｎ、１ａｄｅｓ　ｅｔ　ａ、ｌ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｉ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ参照。

１６、たとえば、Ｉｉ、Ｇｒｅｅｎ、、Ｃｅ１ｌ　１５　：　８０１　、８０５ （１９７８）参照。

浄書（内容Ｇ二′ｉ更なし） 逮心揄檜去り工程１示亨麦良図 手続補正書（方式） １．事件の表示 シー・、１→る経箸ろ群トｔ′＼偽臂銘・）１−斜３、補正をする者 事件との関係　出　願　人 ＩｎｆｓｒＩｌａｌ　ａｎａｌ＾ｐｏ１．ｅａｕｏ。Ｎｏ、ｐｃｒ／ｕｓ　８． ！１０１５＋４第１頁の続き

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、α、細胞よりも低い密度を有する液体中の細胞の懸濁液をつくり、 ｂ、遠心回転に適する容器内に線維の格子を入れ、Ｃ０細胞の前記懸濁液を前記 容器内へ投与し、ｄ、実質的な数の細胞を前記格子中へ埋め込むために十分な速 度および期間において、前記容器を回転する、工程からなる、細胞を線維の格子 中に接種する方法。 ２、ａ、細胞よりも低い密度を有する液体中の細胞の懸濁液をつくり、 ｂ、遠心回転に適する容器内に線維の格子を入れ、Ｃ１細胞の前記懸濁液を前記 容器内へ投与し、ｄ、実質的な数の細胞を前記格子中へ埋め込むために十分な速 度および期間において、前記容器を回転し、ｅ、前記格子を前記容器から取り出 し、そしてｆ、＠記格子を！ＨＪと接触させて固定する、工程からなる５損偏ま たは除去された組織Ｏ置換を促進する方法。 ３、＠記細胞は、上皮細胞１間葉細胞、内皮細胞、骨細胞、結合組繊細胞、収縮 組繊細胞および器官細胞から成る群より選ばれた１種またけそれ以上である、請 求の範囲１または２に記載の方法。 ４、細胞の第１懸濁液を前記格子中に接種し、そして少なくとも１種の異なる細 胞を含有する第２懸濁液を前記２ ５、前記第１懸濁液は表皮細胞を含有し、そして前記第２懸濁液は間葉細胞を特 徴する請求の範囲４に記載の方法。 ６、前記細胞はオートロガス細胞からなる、請求の範囲２に記載の方法。 ７、前記格子を透水制御層へ添付する、請求の範囲１捷たは２に記載の方法。 ８、＠記格子はコラーゲン分子からなる、請求の範囲１捷たは２に記載の方法。 ９、前記格子はグリコサミノグリカンと橋かけしかつ共有結合したコラーゲン分 子からなる、請求の範囲１または２に記載の方法。 １０、前記グリコサミノグリカンは、コンドロイチン６−サルフェート、コンド ロイチン４−サルフェート、ヘパリン、ヘパリンサルフェート、ケラタンサルフ ェート、デルマタンサルフエート、キチンおよびキトサンから成る群より選ばれ る、請求の範囲９に記載の方法。 庄　−′重砲を前記格子中へ接種する前に、前記−雁の増殖速度を増加する物質 と前記Ｚ田胞を接触させる、請求の範囲１寸たは２の方法。 風　前記物質は、表皮成長因子、環式ヌクレオチド、コレラトキンン、血小板誘 導成長因子、および組織の脈管形成因子から成る群より選ばれる。請求の範囲１ １に記載の方法。 ４３ のへつと前記容器の１寸たはそれ以上の壁との間に配置する、請求の範囲１また は２に記載の方法。 １４、α１体の酵素の存在下に制御可能に生分解性であり、ｂ、創傷中へ移植ま たは内植したとき、炎症に対する実質的な免疫応答を誘発せず、 Ｃ１細胞の移動および増殖を許すために十分に高い多孔性、孔大きさおよび透過 性を有し、そしてｄ、創傷上へ移植するとき、引裂きおよびつぶれに対して十分 に高い強さを有する、 線維の格子を用いる方法において、遠心力により前記格子中ＩＦ−細胞を接種す ることを特徴とする方法。 ぢ０選択した種類の組織のタンパク質の細胞間マ）　ＩＩノクスの形態学的特注 【実質的に類似する１丑たはそれ以上の形態学的特性を有する線維あ格子を用い る方法において、前記種類の組織から取った細胞を遠心力により前記格子中へ接 種することを特徴きする方法。 １６、￥Ａ記形態学的特性は、線維の体積分率、平均のアス被りｌ・比、線維軸 の平均の配向、および線維軸間の平均距離から成る群より選ばれる、請求の範囲 １５に記載の方法。 １７、前記格子と創傷床との間の界面の表面エネルギーは。 前記創傷床と大気との間の界面の表面エネルギーより小ざい、請求の範囲１また は２に記載の方法。 区　遠心力により細胞を接種されだ線維の格子。 肛　グリコサミノグリカンと橋かけしかつ共有結合したコラーゲン分子からなる 請求の範囲１８に記載の線維の格子。 ２０、α０体の酵素の存在下に制御可能に生分解性てあり、ｂ、創傷中へ移植寸 たは内植したとき、実質的な免疫応答ないし炎症を誘発せず、 Ｃ０細胞の移動および増殖を許すために十分に高い多孔性、孔大きさおよび透過 性を有し、そしてｄ、創傷上へ移植するとき、引裂きおよびつぶれに対して十分 に高い強さを有し、そして遠心力により細胞を接種された、線維の格子。 ２１、細胞を取った種類の組織のタンパク質の訓胞間マトリックスＯ形態学的に 実質的Ｖ′Ｃ類似する１またけそれ以上の形態学的特性をもつ線維材料からなり 、かつ遠心力により、ｌａ胞を受種された線維の格子。 ２２、前記形態学的特性は、線維の体積分率、平均のアス扱りト比、線維軸の平 均Ｏ配向、および線維間Ｏ平均距離から成る群より選ばれる請求の範囲２１に記 載の線維の格子。 ２３、ａ、細胞よりも低い密度を有する液体中の細胞の懸濁液をつくり、 ｂ、遠心回転に適する容器内に、繊維の格子と接触させて細１抱の前記懸濁液を 入れ、 Ｃ９実質的な数の細胞を前記格子中へ埋め込むために十分な速度および期間にお いて、前記容器を回転し、ｄ、＠記格子を創傷と接触させて固定し、ｅ．前記格 子の内部および上部における細胞の成長を監視し、 ｆ．遠心力で接種された細胞が適切に成長しない前記格子の区域の中へまたは上 に、所望の種類の前記細胞の水性懸濁液のある量を分布させる、 工程からなる、損傷または除去された組織の再生を促進する方法。 ２４．前記水性懸濁液は、その中へハケを浸漬し、前記懸濁液からハケを取り出 し、そしてハケを前記格子上にこすりつけることにより、前記格子上に分布させ る、請求の範囲２３に記載の方法。 ２５．前記水性懸濁液は、その滴を前記格子へ仮与し、そして前記懸濁液を前記 烙子中へ浸透きせることにより、前記格子の中または上に分布させる、請求の範 囲２３に記載の方法。 ２６．前記水性懸濁液を前記格子上へ噴霧により分布させる、請求の範囲２３に 記載の方法。 ２７．前記水性懸濁液は、ある量の前記懸濁を前記露出した格子へ投与し、そし て前記格子の表面を横切って広げ装置を動かして、前記量の懸濁液を前記格子を １黄切って広げることによって、前記格子上に分布させる、請求の範囲２３に記 載の方法。