JPH05500007A

JPH05500007A - 組換えウシソマトトロピンにおけるアセチル化リジン残基に対するモノクローナル抗体

Info

Publication number: JPH05500007A
Application number: JP2513358A
Authority: JP
Inventors: エバンス，ダイアン・マリー; ウォーカー，ガスタバス・エイ
Original assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1989-08-04
Filing date: 1990-07-16
Publication date: 1993-01-14
Also published as: WO1991002080A3; WO1991002080A2; EP0485525A1; EP0485525B1; HK1000520A1; DE69012572T2; DK0485525T3; CA2062959C; US5849499A; CA2062959A1; ATE111531T1; ES2058935T3; DE69012572D1; AU6422990A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】組換えウシソマトトロピンにおけるアセチル化リジン残基に対するモノクローナル抗体発明の分野本発明は、ハイブリドーマ技術およびこの技術を用いたモノクローナル抗体の製造に関する。さらに詳しくは、本発明は、異種ポリペプチド、特に、組換えウシソマトトロピン（ｒｂＳ　ｔ）におけるアセチル化リジン残基に対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ、それにより生産されたモノクローナル抗体、および該モノクローナル抗体をｒｂｓｔのアセチル化リジン残基の検出および定量に用いる方法に関する。

発明の背景天然のタンパク質、すなわち、通常生体内で生産されるタンパク質におけるリジン残基のアセチル化は、宿主生物により誘導される翻訳後修飾である［オールフレイ・ブイ・シイ（＾１ｌｆｒｅｙ、　Ｖ、Ｇ、）ら、１９８３、「ポストートランスレーショナル・コバレント・モディフィケーション・オブ・プロテインズ（Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　ＣｏｖａｌｅｎｔＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）Ｊ　、ビイ・コンナー・ジョンソン（Ｂ、Ｃｏｎｎｅｒ　Ｊｏｈｎｓｏｎ）編、（アカデミツク０ブレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、ＮＹ）、頁１８１〜１９９；ウオルド・エフ（買ｏｌｄ、　Ｆ、）、１９８１、アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー（Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、５０ニア８３］　、この現象は、ヒストン［ミュラー・ニス（Ｍｕｌｌｅｒ、　Ｓ、）ら、１９８７、モレキュラー・イムノロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）　２４ニア７９］、タラミドモナス属のα−チューブリン［ビペルノ・シイ（Ｐｉｐｅｒｎｏ、　Ｇ、）ら、１９８５、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）ｌｏｔ　：２０８５　；エルＨヘルナウルト・ニス・ダブリｘ　 −（Ｌ’　Ｈｅｒｎａｕｌｔ。

Ｓ、　Ｗ、　）ら、１９８５、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　２４：４７３；エル・ヘルナウルト◆ニス・ダブリューら、１９８３、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー９７：２５８）］　：および低密度リボタンノｆり質（Ｌ　Ｄ　Ｌ）［ンユタインブレッカー・ニー・ピー（Ｓｔｅｉｎｂｒｅｃｋｅｒ、　ＩＪ、Ｐ、）ら、１９８４、ジャーナル・オブ・リビッド・リサーチ（Ｊ、　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　２５：１１０９）］において研究されている。

組換えつ／ソマトトロピン（すなわち、組換えＤＮＡ法により生産されるウシソマトトロピン）つまりｒｂＳｔは、ウシの乳汁分泌および成長を増大させるのに重要である。ｒｂＳｔでは、主として１５７位、１６７位、１７１位および１８０位にあるリジン残基がアセチル化されていると報告されている（米国特許出願筒０７／３２３．９０１号（１９８９年３月１５日付で出願）を参照；この米国特許出願は参考文献として、ここに援用する）。アセチル化は、他のｒｂＳｔ不純物（例えば、アミノ酸残基９９のアスパラギンがイソアスパラギン酸に置換されており、脱アミド化を受けているｒｂＳｔ）に加えて、このタンパク質の等電点（ｐｌ）を８．２から７．０に変化させる。アセチル化型ｒｂＳ’ｔは、ｒｂＳｔのｐｌ７．０バンドの６７％、つまり発酵により生産された全ｒｂＳｔの１５〜３０％を占める。さらに、公表された研究によれば、ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンのリジンを化学的にアセチル化すると、これら分子の体細胞性レセプタとの結合を低減化または阻害するのでＣチー・エル・シイ（Ｔｅｈ、　Ｌ、Ｃ，）ら、　１９８８゜バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｎｍ、）　１５０：３９１　；デ・う・エルローサ・ビー（ｄｅ　Ｉａ　Ｌｌｏｓａ、　Ｐ、）ら、１９８５、フェブズ・レターズぐＦｅｂｓ、　Ｌｅｔｔｅｒｓ）　１９１：２１１　；およびマルタル・ジェイ（Ｍａｒｔａｌ、　Ｊ、）ら、１９８５、フェブズ・レターズ１８０：２９５）］　、獣医学分野における薬剤としては望ましくない。したがって、ｒｂＳｔをアセチル化リジンの存在および量について試験する効率的で効果的な方法が望ましい。また、アセチル化ｒｂＳｔをアセチル化されていない天然種から精製するのが望ましいであろう。

従来の研究報告では、ジアセチル化、モノアセチル化および非アセチル化のヒストンＨ４に結合するモノクローナル抗体（ＭＡＢ）の製造と、トリアセチル化Ｈ４およびジアセチル化Ｈ４と反応するポリクローナル抗体を含む抗血清の製造とについて述べられている［ミュラー（前出）を参照］。アセチル化型α−チューブリンについて特異的なＭＡＢが報告されている［ビベルノ（前出）を参照］。

また、アセチル化ＬＤＬに対して生じた抗体［シニタインプレッヒャー（Ｓｔｅｉｎｂｒｅｃｈｅｒ）（前出）］だけでな（、テトラアセチル化型のＨ４ヒストンを特異的に認識する抗体［フェノファー・ニー（Ｐｆｅｆｆｅｒ、　ＩＪ、）ら、１９８５、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）　２６１：２４９６コ　も調製されている。

アセチル化されたりジン残基自体に特異的な抗体がアセチル化度と無関係に利用できるのであれば、アセチル化の存在を検出するのは容易となろう。

情報の開示タンパク質におけるアセチル化リジンの存在および位置は、Ｎ末端配列決定法および高速原子衝撃（ＦＡＢ）質量分析法により決定されるが、これらの方法は、組換えＤＮＡ法により製造されたタンパク質ロ、ト中におけるアセチル化不純物を日常的に定量するには不同きである。

日常的なタンパク質修飾分析および定量用として、いくつかのモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体が開発されている。上記のミュラーらは、マウスをトリアセチル化ヒストンＨ４で免疫することにより、１０種類のＭＡＢを得ている。これらのＭＡＢは、いずれもアセチル化型Ｈ４に対して完全に特異的ではなく、トリアセチル化Ｈ４に対しては検出し得るような反応を示さない。さらに、ミュラーらは、トリアセチル化Ｈ４およびジアセチル化Ｈ４に対して強く反応する抗血清を教示している。該ミュラー抗体は、Ｈ４に特異的である。これらの抗体は、他のアセチル化タンパク質と交差反応を起こさない。ミュラーらは、一般的には組換えタンパク質、さらに詳しくはｒｂ、Ｓｔについて言及していない。

上記のビベルノらは、アセチル化型α−チューブリンに特異的であると思われる７種類のＭＡＢについて言及している。しかし、これらの抗体は、いずれもアセチル化リジンだけを認識するのではない。これらの抗体は、α−チューブリン分子の存在を必要とする。

ビベル／らは、ｒｂＳｔに関係するＭＡＢについて何も述べておらず、しかも組換えタンパク質に関係するＭＡＢについて何も一般的には述べていない。

上記のベソファーらは、クロマチンの特異的な領域を同定するのに用い得るポリクローナル抗体を教示している。この抗体はテトラアセチル化型Ｈ４を認識する。しかし、この抗体は他のアセチル化タンパク質とは交差反応を起こさず、ベノファーらはＭＡＢを教示していない。

また、上記のシュタインブレノヒャーも、アセチル化リジンに特異的なポリクローナル抗体を教示している。このポリクローナル抗体はＭＡＢに関するものではない。このポリクローナル抗体は組換えタンパク質と交差反応を起こさず、しかもｒｂＳｔに関するものではない。

発明の概要本発明は以下のものを提供する：（１）ｒｂＳｔのアセチル化リジン残基に対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ；（２）ＡＴＣＣ＃　ＨＢ−１０１８１である上記のハイブリドーマ；（３）ｒｂＳｔのアセチル化リジン残基に対するモノクローナル抗体であって、遊離のリジンアミノ酸のα〜ルアセチルとε−アセチル基とを区別することのできるモノクローナル抗体；（４）抗ｐ＋’７ｒｂｓｔ分子である上記のモノクローナル抗体；（５）ハイブリドーマＡＴＣＣ＃　ＨＢ−１０１８１により生産される上記のモノクローナル抗体；（６）ＩｇＧクラスに属する上記のモノクローナル抗体；（７）ａ）ｒｂＳ　ｔノアセチル化リジン残基に対するモノクローナル抗体をｒｂＳｔ試料に接触させ；ｂ）該ｒｂＳｔと接触している該モノクローナル抗体を、該モノクローナル抗体とｒｂＳｔのアセチル化リジン残基との間に免疫学的複合体を形成するのに充分な時間および条件下で保持し二次いでＣ）該接触により得られた該免疫複合体の量を検出する工程からなることを特徴とする組換えにより生産されたｂｓｔにおけるアセチル化の割合を定量する方法；（８）ａ）該モノクローナル抗体を該ｒｂＳｔ試料に接触させる前に、まず、該試料を固体担体上に固定化し：ｂ）該結合ｒｂＳｔ試料を次いで該モノクローナル抗体と接触させ：Ｃ）該モノクローナル抗体と結合ｒｂＳｔとの接触を、第１の免疫学的複合体を形成するのに充分な時間および条件下で保持し１次いでｄ）該第１の免疫学的複合体を、結合ｒｂＳｔと免疫学的複合体を形成していないモノクローナル抗体を洗い流すことにより検出し、該第１の免疫学的複合体を次いて第２の抗体と接触させて、第２の免疫複合体を形成させ、該第２の抗体には検出可能な指示薬が取り付けられている請求の範囲第７項に記載の方法：（９）ｒｂＳｔのアセチル化リジン残基に対するモノクローナル抗体がハイブリドーマＡＴＣＣ＃　ＨＢ−１０１８１により生産される上記の方法。

発明の詳細な説明組換えウシソマトトロピン（ｒｂＳ　ｔ）におけるリジンのアセチル化は、宿主のイー・コリー（Ｅ、ｃｏｌｉ）により翻訳後修飾として導入された組換えタンパク質中の不純物である。タンパク質におけるアセチル化リジンの存在および位置は、Ｎ−末端配列決定法およびＦＡＢ質量分析法により決定できるが、これらの方法は組換えタンパク質口ｙｈにおけるアセチル化不純物の日常的な定量には不向きである。

本発明は、品質管理を目的として、ｒｂＳｔロットを日常的にスクリーニングおよび定量し、そのリジン−アセチル化度を決定する簡単で効果的な手段を提供する。

ハイブリドーマ細胞により生産される単一の抗体として定義されるモノクローナル抗体は、化学的にアセチル化したｒｂＳｔでＣＡＦ／Ｊマウスを免疫することにより生産される。ｒｂＳｔのアセチル化は無水酢酸を用いて行われる。標準的なハイブリドーマ法を実施した後、ＩｇＧＭＡＢを単離する。好適な方法は、イー・コリーで調製されたｒｂＳｔの製造ロットから精製されたアセチル化ｒｂＳｔを用いることである。

アセチル化ｒｂＳ　ｔ（ｐＩ　７．０）の定量は、間接的で非競合的な酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて行われる。ｒｂＳｔ試料は、ポリスチレン類のマイクロタイタープレート上に固定化され、このプレートにＭＡＢが添加される。結合ＭＡＢはベルオキシダーセ標識ウサギ抗マウスＩｇＧにより検出される。

本発明によるＭＡＢの特異性は、様々な合成ｒｂＳｔペプチドを化学的にアセチル化し、それらを競合ＥＬＩＳＡにおける阻害剤として評価することにより、特徴づけられる。

本発明は、以下の実施例により、さらに詳しく例示される。

実施例ＩＡ部　ｒｂＳｔの化学的アセチル化ｒｂｓｔ試料は確立された手順を用いて化学的にアセチル化される。

例えば、［ミーンズ・シイ・イー（Ｍｅａｎｓ、　Ｇ、Ｅ、）ら、１９７１、ケミカル・モディフィケーションズ・オブ・プロテインズ（ＣｈｅｍｉｃａｌＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｒ＋ｓ）、ホールデン・ケイ・インク（ＨｏｌｄｅｎＣａｙ、　Ｉｎｃ、　）、オークランド、カリフォルニア、２１４頁、およびフレンケルーコンラノト・エイチ（Ｆｒａｅｋｅｌ−Ｃｏｎｒａｔ、　Ｈ，）、１９５９、メリンス・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　４：２４７］を参照。水０．１ｍｌ中のｒｂＳｔ約１０ｍｇを、０．１ｍｌの飽和酢酸ナトリウム緩衝Ｍ（ｐＨ９，６）［／グマ（Ｓｉｇｍａ）］　と混合する。タンパク質を可溶化するたぬに、０．１２ｇの塩酸グアニジン（Ｇｄｎ−ＨＣｌ）　［シュワルツ／マン・バイオチク（Ｓｃｈｗａｒｚ／Ｍａｎｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）］を加えて、最終濃度を６ＭＧｄｎ−ＨＣｌとする。この混合物を水上で３０分間冷却する。２μｌの無水酢酸［マリンクロソド（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）］を、０°Ｃにて、１時間にわたって、１０分ごとに添加する。

４°Ｃにてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して４８時間透析することにより、無水酢酸およびＧ　ｄｎ−ＨＣｌを除去する。化学的にアセチル化されたｒｂＳｔは、凍結乾燥され、−２０００で保存される。ｒｂｓｔ分子の様々な断片を含む合成ｒｂＳｔペプチドも同様にしてアセチル化される。

８部　ｐＩ　７．０　ｒｂＳｔの精製ｒｂＳｊのｐＩ　７．０画分は、クロマトフォーカ／ング法により単離／精製される。３０ｍ１の膨潤ＰＢＥ−９４ゲル［ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）］を１×：３０ｃｍのカラムに詰め、１２ベツド容量（約３００　ｍｌ）の０．０２５Ｍエタノールアミン−酢酸緩衝液（ｐＨ９，４，）を用いて平衡化／洗浄する。ｒｂＳｔをエタノールアミン緩衝液に溶解した１　５　、４　ｍｇ／ｍｌ＠ｉ（ｔをＰＢＥカラムに加え、ボリバ、ファー９６（ファーマシア）の１７１０希釈液を用いて、２６　ｍｌ／ｈｒの流量で溶出させる。画分（各１．５ｍ１）をガラス製試験管に収集しくＴＳＣＯフラクションコレクタ）、ＵＶモニタ（Ａ　Ｉａｏ＋　Ｉ　Ｓ　ＣＯ）によるタンパク質検出を行う。２〜３ベツド容量（約１００ｍ１）の１．０Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣ１）溶液を用いて、上記カラムを再生ずる。ｐｚ’、ｏの画分をプールし、ポリバッファ両性電解質を硫酸アンモニウム沈澱により除去する。硫酸アンモニウム（ＮＨ，ＳＯ，）を、２５°Ｃで飽和度が９０％になるように、固体のままでｐＩ７．０画分に添加する。この溶液を室温で２時間撹拌し、次いで３２．ＯＯＯｒｐｍ［ツルバール（Ｓｏｒｖａ、ｌ）］て遠心分離する。沈殿物を飽和ＮＨ，ＳＯ４溶液で３回洗浄し、毎回１０、　ＯＯＯｒｐｍで遠心分離する。

最終的な沈殿物をＯ，１ＭＮａＨＣ○、（ｐＨ９，５）で復元し、４℃にて、同緩衝液に対して一晩透析する。精製ｐｉ　７．ＯｒｂＳｔの一部を、１．５ｍｌのエノベンドルフ蓋付遠心管に採り、−２０℃で保存する。精製ｐ１７．０のタンノくり質濃度は、係数１４４６が６　、３　ｍｇ／ｍｌに対応することを用いて、波長２８０ｎｍで分光光度法により決定された。精製ｐＩ７．０の等電点電気泳動（ＩＥＦ）分析によると、ｐＩ６．７〜７．２に４つの濃いバンドの果まり（大部分はｐＩ６．９〜７．０に集中していた）と、ＰＩ５８〜６．７に一連のかすかなバンドとか見られた。この試薬「精Ｖｐ＋７．Ｑｊは、タンパク質のｐＩを８．２領域から７．０領域に変化させるｒｂＳｔ不純物（例えば、アセチル化型、脱アミド化型、および／またはＩ　５ｏ−Ａ　５ｐ−９９型のｒｂＳ　ｔ）から構成されている。

精製ｐ１７．０のｒｂＳｔおよび精製ｐ＋８．２のｒｂＳｔの他の型は、共に、９９位の通常のアスパラギンをグリシンに置換して製造されたｒｂＳｔロットから単離される（米国特許出願系０７／２９９．１０７号（１９８９年１月１９日付で出願）を参照、この米国特許出願は参考文献として、ここに援用する）。このような置換により、アスパラギンからインアスパルテート９９への塩基触媒による再配列（すなわち、ｌ５ｏ−Ａｓｐ−９９ｒｂＳ　を不純物）が防止される。この発酵から得られるｐＩ７．０画分子ｇｌｙ−９９ｐエフ、　Ｏｊは、アセチル化型ｒｂＳｔおよび脱アミド化型ｒｂｓｔからなる。ｒＧｌｙ−９９ｐＩ　８．２　Ｊは対応のｐＩ８２画分である。これら２つのタンパク質は、凍結乾燥された固体および適当な緩衝液中で復元されたものとして供給される。

ｒｂＳｔ、精製ｐＩ７．０１ｇ１ｙ−９９ｐＩ　７．０およびｇｕｙ−９９ｐＩ８２の等電点電気泳動は、ＰＨＡＳＴＩＥＦ系（ファーマンア）を用いて行われる。ＰＢＳ中のタンパク質試料（３μｍの２〜３　ｍｇ／ｍｌ溶液）を、予め固まらせた０、３５ｍｍポリアクリルアミドＰｈａｓｔＧｅｌＩＥＦｐＨ３〜９ゲル（ファーマ／ア）上に加え、５２０ＶＨ（１９１０Ｖ／２．５ｍＡ／３５Ｗ／１５°Ｃ）で等電点電気泳動に付す。

広範囲のｐＩ補正キｙト（ｐＨ３〜１０）（ファーマンア）を１）Ｉ標準として用い、ｐＨ勾配を定める。分離されたタンパク質の存在および位置を可視化するために、ＩＥＦゲルは、ファストシステム・ディベロノブメントーチクニック（ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）Ｎｏ、　２００に概説されている、高速クーマ／−ブルー染色法により直接染色される。

０部　モノクローナル抗体の製造フロイント完全アジュバント［ディフコ（Ｄｉｒｃｏ）］に乳化させた化学的アセチル化ｒｂｓｔ５０μｇをＣＡＦ、／Ｊマウス［ジャクソン・ラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）］に腹腹膜腔内絡することにより、これらの動物を免疫する。第２および第３の追加免疫については、化学的にアセチル化されたｒｂＳｔ２５μｇをフロイント不完全アジュバントに乳化させ、４週間ごとに腹膜腔内投与することにより行われる。体細胞ハイブリダイゼーションの４日前に行われる最終的な追加免疫では、精製ｐｌ　７．０　ｒｂＳｔ　１０ｇｇをＰＢＳ（１０ｍＭ　ＮａＰＯ，，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７，３）に溶解したものを静脈内（ＩＶ）投与する。最も高い力価の抗−アセチル化ｒｂＳｔで免疫されたマウスから得られた肺臓細胞を、確立された手法［レーン・アール・ディ（Ｌａｎｅ、　Ｒ，Ｄ、　）、　１９８５＋　ジャーナル・オブ・イム１０ジカル・メリンス（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ）　８：２２３）］に従って、５ｐ−２７０マウス形質細胞腫の細胞系と融合させる。アセチル化ｒｂＳｔ（ｐＴ７．０）およびｐ１８．２特異的免疫グロブリンを生産する培養物を、スクリーニングＥＬＴＳＡを用いて検出し、マイクロタイタープレート［コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）］中で標準的な限界希釈法を用いて、１個のウェルあたり１個の細胞の割合でクローン化する。選択された陽性のウェルについて、再度クローン化を行い、確立された粒子濃度蛍光免疫学的検定法（ＰＣＦＩＡ）を用いて、モノクローン性および（ＩｇＧ＋のような）イソタイプを確認する。モノクローナル抗体を生産する興味あるハイブリドーマを大規模に培養し、細胞系を長期間にわたって凍結保存するために、ストック溶液を凍結する。

抗ｐ１７モノクローナル細胞系および抗ｐ＋８．２モノクローナル細胞系について、０．５ｍｌのブリスタン［２，６，１，Ｏ，ｌ　４−テトラメチルペンタデカン；シグマ・ケミカル・コーポレーション（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）］を、ＣＡＦ、／ＪＴウスに腹膜腔内注射することにより、腹水を生産する。７日後、１０７個のモノクローナルハイブリドーマ細胞を、マウスに腹膜腔内注射する。腹水は１〜２週間後に採取される。

抗ｐｒ７モノクローナル抗体および抗ｐ＋８．２モノクローナル抗体は、不ズミの腹水から硫酸アンモニウム分画法により精製され、次いでタンパク質Ａクロマトグラフィーに付される。まず、８ｍｌの飽和硫酸アンモニウム溶液（シグマ）を、４℃で、８ｍｌの腹水に滴下し、氷上で１時間撹拌する。この懸濁液を、微小遠心分離機［５４１５型、ブリンク？　７−インスツルメンツ（Ｂｒｉｎｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）］を用いて、ｌ　３．　ＯＯＯｒｐｍで遠心分離する。該ペレｙｈを８ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、ｐＨ８，５で０゜０５　ｍＭ　Ｎ　ａ　２　Ｐ○、に対して一晩透析する。

タンパク質Ａクロマトグラフィーについては、５ｍｌの膨潤したアフィゲル−プロティン・エイ（Ａｆｆｉｇｅｌ−Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ）　［）璧イオーラノド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｓ）］を、ｌＸ１０ｃｍのカラム（ノマイオーラノド）に詰め、（脱イオン化／蒸留水１００ｍ１あたり３４１ｇとして調製した）２５ｍｌのｐＨ９，０バイオーラ・ノド結合緩衝液で洗浄する。

６ｍｌの透析試料を等容量の結合緩衝液と混合し、カラムに加える。このカラムを５０ｍ１の結合緩衝液で洗浄する。（脱イオン化蒸留水１００ｍ１あたり２．２ｇとして調製した）ｐＨ３，０ノぐイオーラノド溶出緩衝液を添加してＭＡＲを溶出させ、ＵＶモニタ（Ａｔ、０、ｌ５ＣＯ）でタンパク質検出を行いつつ、２ｍｌずつの両分として採取する（ＩＳＣＯフラクションコレクタ）。この精製手順を腹水試料の各々について繰り返した後、抗ｐ１７ＭＡＢおよび抗ｐＩ８．２ＭＡＢに対する溶出画分を別々にプールし、ＩＭのトリス緩衝液（ｐＨ９，０）を用いてｐＨ７に中和し、そしてマイクロ−プロディコン・コンセントレイター（Ｍｉｃｒｏ−Ｐｒｏｄｉｃｏｎ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）　［）＼イオモレキュラー・タイナミクス（Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ）］で濃縮／透析する。精製抗ｐＩ７ＭＡＢおよび抗ｐ１８．２　ＭＡＲのタンパク質濃度は、Σｌ、８４ｏ＠により、それぞれ１１　、４　ｍｇ／ｍｌおよび６　、６　ｍｇ／ｍｌであると決定される。精製ＭＡＢは、０．５ｍｌのエッペンドルフ蓋付遠心管（パイオーラッド）に分注され、−２０°Ｃで保存される。

精製抗ｐ１７ＭＡＢおよび抗ｐＩ８．２ＭＡＢの特異性は、スクリーニングＥＬＩＳＡを用いて確認されるが、その力価は、それぞれ１：ｌ、６００，０００および１・１０，０００である。抗ｐ１７ＭＡＢおよび抗ｐｌ　８．２　ＭＡＢは、さらに特徴づけられ、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に付すと、重鎮（約５０，０００ダルトン）および軽鎖（約２２，０００ダルトン）を示すことがわかる。ＩＥＦ試験によると、各ＭＡＢについて４〜６個のバンドの集まりが見られ、抗ｐ１７ＭＡＢおよび抗ｐＩ　８．２　ＭＡＢに対する平均的なｐＩは、それぞれ５．８±０１６および６４ ±０１６である。

実施例２Ａ部　抗ｐＩ抗体の特徴つけｒｂＳｔまたは精製ｐｌ　７．Ｏｒｂｓｔを固体支持体くマイクロタイタープレート、ニトロセルロース）に固定化した場合や、ｇｌ、ｙ−９９ｐＩ７．０ｒｂＳｔを溶液の阻害剤として用いた場合には、抗ｐＩ７ＭＡＢが最もよく機能する。抗ｐＩ７ＭＡＢを含む溶液の阻害剤としてのｒｂＳｔは、１．．０００μｇ／ｍｌの濃度であっても、プレート上に固定化されたそれ自身またはｇｌｙ−９９ｐｌ　７とは競合しない。同様の結果は、精製ｐｌ　７．０　ｒｂＳｔを溶液の阻害剤として用いた場合に得られる。これに対して、ｇｌｙ−９９ｐＩ　７．０は、ｇｌｙ−９９ｐＩ　７．０およびｒｂＳｔに対して、それぞれ２　、４μｇ／ｍｌおよび１８．８　μｇ／ｍｌという平均的な５ｏ％阻害点を与える。ｒｂＳ　ｔ／精製ｐＴ７．０は、タンノくり質の立体配座を乱す非イオン系の界面活性剤であるノニデ、ト（Ｎｏｎｉｄｅｔ）　Ｐ　−４０（Ｎ　Ｐ　−４０）を溶液相に導入した場合にのみ競合する。０．５％ＮＰ−４０の存在下では、ｒｂＳｔは、プレート上（こ固定化された精製ｐ１７．０と競合する（５０％阻害点は５００μｇ／ｍｌ）のに対しＮＰ−４０が存在しなければ、２．　ＯＯＯμｇ／ｍｌのｒｂＳｔであっても、阻害は起こらない、さらに、ｇｌｙ−９９ｐＩ　８．２　ｒｂＳｔは、ＮＰ−４０の有無にかかわらず、抗ｐＩ７ＭＡＢと相互作用しない。

１、免疫プロット抗ｐ１７ＭＡＢおよび抗ＰＩ　８．２　ＭＡＢの免疫プロ・２ト分析（ま、確立された手順で行われる［）１ミルトン・アール・シイ（Ｈａｍｉ　１ｔｏｎ＋Ｒ，Ｇ、　）ら、１９８７、ハイブリドーマ（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）　６：２０５；　ジョンスト・／ティアー・アイ（Ｊｏｎｓｄｏｔｔｉｒ、１．）ら、１９８４、フェツス・レターズ６７：１５；およびファストシステム・ディベロ・ノブメント・テクニ・ツク・ファイル（ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　Ｆｉｌｅ）　Ｎｏ、２２０．１．９８７、ファーマシア・ファストンステム・オーナーズ・マニュアル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｐｈａｓｔｓｙｓｔｅｍ　Ｏｗｎｅｒ’ｓ　Ｍａｎｎｕａｌ）、トラ仁ノコンタクト（Ｔｒｙｃｋｋｏｎｔａｋｔ）、ウプサラ、スウェーデン］。拡散プロ、２ト法については、ニトロセルロース（パイオーラッド）を、ＩＥＦケルよりもわずかに大きい寸法に切断し、ＰＢＳに５分間予備浸漬し、モしてずへての気泡を排除するようにしてＩＥＦゲルの上に慎重に戴置する。続いて、１枚の（厚い）プロット用濾紙（バイオーラ・ノド）を、ニトロセルロースの頂部上に戴置し、ケルーニトロセ）しＯ−スーツ０　。

ト用濾紙の全体をゲル乾燥器（パイオーラッド）上に倒置して（プロット用濾紙を下側にして）、真空下、室温にて、−晩インキユベートする。

免疫学的検定法については、ニトロセルロースをμルから剥離し、ＰＢＳ（ｐＨ７，３）中の００５％ツイーン−２０（ノマイオーラノド）を用いて、回転ブラットフオーム振盪機しアメリカン・ラボ（ＡｍｅｒｉｃａｎＬａｂ）］上で、室温にて２時間ブロックする。ＰＢＳ中で３回洗浄した後、上記のニトロセルロースを、希釈していない抗ｐＩ７ＭＡＢまたは抗ｐ＋　８．２　ＭＡＢの細胞培養物上清と共に、均一に撹拌しなから、室温で２時間インキュベートする。このメンブレンを、ＰＢＳ中で３回？！ＩＣ浄し、ＰＢＳ中に１：２．０００の割合で希釈されたペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスｒｇに浸漬し、そして室温で２時間撹拌する。ＰＢＳ中で３回洗浄した後、新しく調製したＤＡ１３基質（クエン酸−リン酸緩衝液中における０　、　５　ｍｇ／ｍｌの３−３′ジアミノベンジジン（Ｓｉｇｍａ）および０．５　ａ　ｌ／ｍｌの３０％）１，０．）中で、上記のニトロセルロースを室温にて３０分間インキュベートすることにより、結合ＭＡＢを検出する。この緩衝液には、１リツトルあたり、２９４ｇのクエン酸二水素ナトリウムと、１３．８ｇのＮ　ａ　ＨｔＰ　Ｏ、−Ｈ，○が含まれている（ｐＨ７，５）。このメンブレンを水中ですすいで、風乾することにより、反応を停止させる。抗ｐＩ７ＭＡＢは、ｐＩ７およびｒｂＳｔの試料におけるｐＩ７およびより酸性のバンドに結合するが、ｒｂＳｔまたはｇｌｙ−９９ｐＩ　８．２の試料のｐＩ８〜８．２のバンドとは反応性を示さなかった。これに対して、抗ｐ１８．２ＭＡ、Ｂは、すべての試料中のｐＩ８．２およびｐＩ７のバンドと交差反応を起こした。

２１間接的な非競合的ＥＬＩＳＡアセチル化されたｒｂＳ　ｔ（ｐ’ｌ　７．　Ｏ）の定量は、ポリスチレン製のマイクロタイタープレート上に固定化されたｒｂＳｔ試料を用いた間接的な非競合的ＥＬＩＳＡにより行われ、結合ＭＡＢはペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇＧにより検出される。固定化タンパク質（例えば、ｐｌ　７、ｐ　Ｉ　８．２、ｒｂＳ　ｔ、化学的にアセチル化されたｒｂＳｔ）の検量線は、まずこのタンパク質を重炭酸緩衝液（ｐＨ９，８）中に２０μｇ／ｍｌまで希釈することにより調製される。この溶液を、ポリエチレン製の遠心管（コーニング）中で、重炭酸緩衝液を用いて、順次２倍に希釈し、得られた希釈液を、引き続いてＩｍｍｕｌｏｎ　１１マイクロタイタープレートの各カラムに、各ウェルあたり１００μｌの割合で移す。ベルオキシターゼ抗マウスＩｇＧ複合体の適当な希釈率（１：３，０００月ま、様々な濃度について試験し、結合抗体が存在しない場合のバックグランド（負の対照）の応答がＬＴｏ、１　０Ｄであるのに対し、ｒｂＳｔの検量線に対して最大（最も高感度）のＯＤ値を与えるものを選択することにより、決定される。

検定は、０．１５〜２．５μｇ／ｍｌの範囲内にわたって直線的である。

基準としたｒｂＳｔのうち、約３２％はｐｌ７．０であったが、相対的な標準偏差（Ｒ３Ｄ）は１３％であった。１０個の異なるｒｂｓｔロットを、３日間の各々の日に、基準のものに対して検定すると、２１．３〜３８．７％がｐ＋　７．０であり、平均のＲ８Ｄは６４８％である。

３、競合的ＥＬ　Ｉ　ＳＡＭＡＢの特異性／エピトープの特徴づけは、様々な合成ｒｂｓｔペプチドを化学的にアセチル化し、それらを競合的ＥＬ　Ｉ　ＳＡの阻害剤として評価することにより、調べられる。イムロン（Ｉｍｍｕｌｏｎ）Ｉｔマイクロタイタープレートのウェルを、精製抗ｐＩ７．０またはｒｂＳｔの１０μｇ／ｍｌ溶液で被覆し、引き続いて、ＰＢＳ（ｐＨ７，３）中の１％ゼラチン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、室温で１．５時間プロ、りする。適当な初期濃度の阻害剤（通常、供給量に依存して、１〜１０ｍｇ／ｍｌ）を、重炭酸緩衝液（１５ｍＭ　Ｎａ、ＣＯ２，３５ｍＭ　ＮａＨＣＯ３，ｐＨ９，６）中に調製し、１％ゼラチン−ＰＢＳ緩衝液（通常、各遠心管あたり２．０ｍｌ、および／または阻害剤を１；ｌＯに希釈するのに必要な容ＩＩ）を含むポリプロピレン製の遠心管中で、同じ緩衝液を用いて、順次２倍に希釈する。抗ｐＩ　７　ＭＡＢの１．６μｇ／ｍｌ溶液を、１％セラチン−ＰＢＳ中に調製し、既知量（通常、各２５０μｍ）を、阻害剤− １％ゼラチン−ＰＢＳ混合物を含む各遠心管に移す。これらの遠心管をポルテソクススターラにかけ、室温で４５分間インキュベートする。阻害剤が存在しない場合にはＯＤ約１，０を与える濃度として、適当なＭＡＢ希釈率を選択した。検定用の負の対照を作成するには、抗ｐＩ７ＭＡＢを正常なマウス血清（ＮＭＳ）または１％セラチン−ＰＢＳで置き換え、阻害剤を重炭酸緩衝液で置き換える。

検定用の正の対照は、阻害剤を含まない溶液（添加された重炭酸緩衝液のみ）中の抗ｐ１７ＭＡＢからなる。４５分間インキュベートした後、固定化された精製ｐＩ７またはｒｂｓｔを含む、ブロック化され、かつ洗浄されたマイクロタイタープレートの各カラムに、（各ウェルあたり１００μｌの）ＭＡＢ−阻害剤溶液を移す。これらのプレートを室温で２時間インキコベートする。３回洗浄した後、１％ゼラチン−ＰＢＳ中に比率１：３０００で希釈されたペルオキシダーゼ標識抗マウスＴｇＧｒサザーン・バイオチク（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）］の１００μｍを、室温で２時間にわたって各ウェルに添加する。結合抗体の検出を行う前に、０．４μｌ／ｍｌの３０％Ｈ２０、（マリンクロ・７ト）を含む０．１Ｍのクエン酸−に、ＨＰ○４緩衝液（ｐＨ４，５）中の０　、４　ｍｇ／ｍｌオルト−フェニレンシアミン（シグマ）を、各ウェルあたり２００μｌ添加することにより、プレートを４回洗浄する。暗所にて、室温で３０分間インキュベートした後、２．５Ｍ　Ｈ，５ｏ４（マリンクロット）を各ウェルあたり５０μｌ添加することにより、反応を停止させる。データ記憶および分析用のＩ　ＢＭ−ＰＣＸＴＣＸ−ン［ファウンタイン（Ｆｏｕｎｔａｉｎ）］に接続したマイクロタイタープレート読取器［ＥＬ３１０型、バイオチク（Ｂｉｏｔｅｋ）］を用いて、４９０ｎｍにおけるウェルの光学密度を測定する。

阻害剤は、様々な合成ｒｂＳｔペプチドと、単一のリジン基を様々な隣接アミノ酸と共に含む市販ペプチドとのアセチル化工および非アセチル化型からなる。合成ｒｂＳｔペプチドは、［メリフィールド・アール（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　Ｒ，）、１９６３、ジャーナル・アメリカン・ケミカル・ソサイエテ４　（Ｊ、　Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、）　８５：２１５４］に従って調製される。ゼノブンン、エロドイシンおよび血清胸腺因子（ＳＴＦ）は、ケマローグ（Ｃｈｅｍａ　ｌｏｇ）から購入され、二二−ロテン／ン、両ブラジキニン、リジン、α−アセチルリジンおよびε−アセチルリジンは、ングマから購入され：そして、セルバ（Ｓｅｒｖａ）からは、ｒ　Ｆ　ｏ−ｐｈｅ−ｍｅｔ−ｐｈｅ−１ｙｓ　Ｊが供給される。

合成ｒｂｓｔペプチド阻害剤およびその５０％阻害点を、応答が減少する順番に並へると、ｒｂＳｔアミノ酸残基１５２〜１７７（０３９μｇ／ｍｌ）＞　ｒｂＳ　ｔアミノ酸残基１３０〜１５０（７，８μｇ／ｍり＞ｒｂＳｔアミノ酸残基１７９〜１９１（１８，８μｇ／ｍｌ）となる。阻害度は、アセチル化リジン残基の数に対して相関を示す。これらペプチドの正常な非アセチル化型は、５００ μｇ／ｍｌであっても、検定において競合を起こさない。エピトープをさらに明確にするためには、単一のリジンを様々な隣接アミノ酸と共に含む様々な市販のペプチドをアセチル化し、阻害剤として評価する。得られたデータによると、ＭＡＢは、タンパク質中の少なくとも１個の単一アセチル化リジン残基の存在に特異的であるだけでなく、α−アセチルリジンとε−アセチルリジンとを遊離のアミノ酸として区別し得る。

本発明の好適なハイブリドーマおよびモノクローナル抗体は、ハイブリドーマＶＨ２５−ＩＦ５−２Ｄ１−２８８（ｐｌ　７　０またはアセチル化リジン抗体）により生産される。このハイブリドーマは、ＵＣＩｌＨＢ−２１と名づけられ、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の規定に基づき、１９８９年７月１４日付で、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシタン［１２３０１バークローン・ドライブ（Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ）、ロックビル、ＭＤ　２０８５２、ＵＳＡ］に寄託されている。受託番号はＨＢ−１０１８１である。

膚驚臘審輔牛

Claims

【特許請求の範囲】

１．ｒｂＳｔのアセチル化リジン残基に対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ。
２．ＡＴＣＣ＃ＨＢ−１０１８１である、請求の範囲第１項に記載のハイブリドーマ。
３．アセチル化リジン残基に対するモノクローナル抗体であって、遊離のリジンアミノ酸のα−アセチル基とε−アセチル基とを区別することのできる抗体。
４．抗ｐＩ７ｒｂＳｔ分子である、請求の範囲第３項に記載の抗体。
５．ハイブリドーマＡＴＣＣ＃ＨＢ−１０１８１により生産される、請求の範囲第３項に記載のモノクローナル抗体。
６．ＩｇＧクラスに属する、請求の範囲第３項に記載のモノクローナル抗体。
７．ａ）ｒｂＳｔのアセチル化リジン残基に対するモノクローナル抗体をｒｂＳｔ試料に接触させ；ｂ）該ｒｂＳｔと接触している該モノクローナル抗体を、該モノクローナル抗体とｒｂＳｔのアセチル化リジン残基との間に免疫学的複合体を形成するのに充分な時間および条件下で保持し；次いでｃ）得られた該免疫複合体の量を検出する；工程からなることを特徴とする組換えにより生産されたｂＳｔにおけるアセチル化の割合を定量する方法。
８．ａ）該モノクローナル抗体を該ｒｂＳｔ試料に接触させる前に、まず、該試料を固体支持体上に固定化し；ｂ）該結合ｒｂＳｔ試料を次いで該モノクローナル抗体と接触させ；ｃ）該モノクローナル抗体と結合ｒｂＳｔとの接触を、第１の免疫学的複合体を形成するのに充分な時間および条件下で保持し；次いでｄ）該第１の免疫学的複合体を、結合ｒｂＳｔと免疫学的複合体を形成していないモノクローナル抗体を洗い流すことにより検出し、該第１の免疫学的複合体を次いで第２の抗体と接触させて、該第２の抗体と該第１の免疫学的複合体とからなる第２の免疫複合体を形成させ、該第２の抗体には検出可能な指示薬が取り付けられている、請求の範囲第７項に記載の方法。
９．ｒｂＳｔのアセチル化リジン残基に対するモノクローナル抗体がハイブリドーマＡＴＣＣ＃ＨＢ−１０１８１により生産される、請求の範囲第７項に記載の方法。