JPH11140098A - 抗ペプチド抗体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】目的タンパク質と該タンパク質のアミノ酸配列
に類似するアミノ酸配列を有するタンパク質とを免疫化
学的に判別しうる抗体の製造法等を提供する。 【解決手段】（１）目的タンパク質の部分アミノ酸配列
であって10〜15アミノ酸残基からなり判別しようとする
タンパク質のアミノ酸配列と一致するアミノ酸残基を隣
接して3残基以上含まないアミノ酸配列を選抜し、
（２）前項（１）で選抜されたアミノ酸配列のうち、目
的タンパク質の分子モデルの表面に露出する領域に相当
するアミノ酸配列を選抜し、（３）前項（２）で選抜さ
れたアミノ酸配列のうち、免疫感作する動物に由来する
タンパク質の既知アミノ酸配列と比較して、相同性の低
いアミノ酸配列を選抜し、（４）前項（３）で選抜され
たアミノ酸配列を有するペプチドとキャリアとが結合さ
れてなる有効免疫抗原を調製し、該有効免疫抗原を投与
して動物を免疫感作する工程を含む抗ペプチド抗体の製
造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は抗ペプチド抗体の製
造法に関する。詳しくは、目的タンパク質と該タンパク
質のアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列を有するタン
パク質とを免疫化学的に判別しうる抗ペプチド抗体の製
造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】類似する機能を有するタンパク質、例え
ばチトクロムＰ４５０のように互いに重複した基質特異
性を有する多数の分子種から構成される酵素タンパク質
の場合、そのアミノ酸配列は分子種間において一般的に
類似している。このような機能とアミノ酸配列の類似す
るタンパク質の生体における分布や存在量を調べること
は、例えば各タンパク質の生体における役割を明らかに
し、それらのタンパク質が関与する薬物の代謝、効果、
毒性等を予測、評価する上で重要である。機能とアミノ
酸配列の類似するタンパク質の各々の分布や存在量を調
べるためにはこれらのタンパク質を判別する手段が必要
であり、その手段として例えばこれらのタンパク質のう
ちの特定のタンパク質を特異的に認識しうる抗体が用い
られる。上記のような機能とアミノ酸配列の類似するタ
ンパク質のうちの特定のタンパク質を特異的に認識しう
る抗体を製造するには、類似する他のタンパク質の混入
のない高純度のタンパク質標品を抗原として使用する必
要があるが、機能とアミノ酸配列が互いに類似するタン
パク質を通常の生化学的手法を用いて高純度にまで分離
精製することは非常に困難である。そこで、組換えＤＮ
Ａ技術を用いて、目的タンパク質にアミノ酸配列の類似
するタンパク質を本来高発現しない宿主細胞において目
的タンパク質の遺伝子を発現させ、該宿主細胞から目的
タンパク質を精製することにより、類似する他のタンパ
ク質の混入のない高純度のタンパク質標品を大量に調製
し、これを抗原として動物を免疫感作することにより、
目的タンパク質を特異的に認識する抗体が製造可能であ
る。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】ところが、タンパク質
によっては、宿主細胞における目的タンパク質遺伝子の
発現効率の低さ、目的タンパク質の宿主細胞における不
安定性、目的タンパク質の宿主細胞への悪影響等が原因
となり、必ずしも上記のような組換えＤＮＡ技術を用い
ることができない場合があり、目的タンパク質を特異的
に認識する抗体の新しい製造法の開発が望まれていた。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、こうした
状況を鑑み鋭意検討した結果、目的タンパク質を特異的
に認識する抗体の製造に用いられる抗原の調製法を見出
し、本発明に至った。すなわち本発明は、目的タンパク
質と該タンパク質のアミノ酸配列に類似するアミノ酸配
列を有するタンパク質とを免疫化学的に判別しうる抗ペ
プチド抗体の製造法であって、（１）目的タンパク質の
アミノ酸配列と、該タンパク質と判別しようとするタン
パク質のアミノ酸配列とを比較することにより、目的タ
ンパク質の部分アミノ酸配列であって10〜15アミノ酸残
基からなり判別しようとするタンパク質のアミノ酸配列
と一致するアミノ酸残基を隣接して3残基以上含まない
アミノ酸配列を選抜し、（２）前項（１）で選抜された
アミノ酸配列のうち、目的タンパク質の分子モデルの表
面に露出する領域に相当するアミノ酸配列を選抜し、
（３）前項（２）で選抜されたアミノ酸配列のうち、免
疫感作する動物に由来するタンパク質の既知アミノ酸配
列と比較して、相同性の低いアミノ酸配列を選抜し、
（４）前項（３）で選抜されたアミノ酸配列を有するペ
プチドとキャリアとが結合されてなる有効免疫抗原を調
製し、該有効免疫抗原を投与して動物を免疫感作する工
程を含む抗ペプチド抗体の製造法（以下、本発明製造法
と記す。）および該製造法に用いられる有効免疫抗原を
提供するものである。

【０００５】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。

【０００６】本発明製造法において、まず、目的タンパ
ク質のアミノ酸配列と、該タンパク質と判別しようとす
るタンパク質のアミノ酸配列とを比較することにより、
目的タンパク質の部分アミノ酸配列であって10〜15アミ
ノ酸残基からなり判別しようとするタンパク質のアミノ
酸配列と一致するアミノ酸残基を隣接して3残基以上含
まないアミノ酸配列を選抜する。アミノ酸配列を比較す
るには、例えば、比較対象のタンパク質のアミノ酸配列
のアラインメント（alignment）を作成し、各アミノ酸
配列の対応するアミノ酸残基が同一であるか否かを判定
すればよい。アミノ酸配列のアラインメントは、例え
ば、Genetyx（ソフトウエア開発株式会社製）等のアミ
ノ酸配列の解析が可能な市販のコンピュータソフトウエ
アを用いて作成することができる。このような比較の結
果に基き、目的タンパク質の部分アミノ酸配列であって
10〜15アミノ酸残基からなり、判別しようとするアミノ
酸配列と一致するアミノ酸残基が隣接して３残基以上並
ぶことのないアミノ酸配列を選抜する。

【０００７】次いで、前工程により選抜されたアミノ酸
配列のうち、目的タンパク質の分子モデルの表面に露出
している領域に相当するアミノ酸配列を選抜する。目的
タンパク質の分子モデルの表面に露出している領域に相
当するアミノ酸配列を選抜するには、例えば、目的タン
パクの分子モデルをホモロジーモデリング手法を用いて
コンピュータ上に構築し、この構築された分子モデルの
表面に露出している領域を特定し、前記工程で選抜され
たアミノ酸配列のうち、この特定された領域に含まれる
アミノ酸配列を選択すればよい。尚、コンピュータ上に
分子モデルを構築するには、例えば、ＭＳＩ(molecular
simulations)社製のＱｕａｎｔａ／ＣＨＡＲＭｍのPr
otein Pkg等のソフトウエアを用いることができる。

【０００８】次に、前工程で選抜されたアミノ酸配列
と、免疫感作する動物由来のタンパク質の既知アミノ酸
配列とを比較することにより、前工程で選抜されたアミ
ノ酸配列のうち、比較したアミノ酸配列と相同性の低い
アミノ酸配列を選抜する。このような比較を行なうに
は、例えば、相同性検索用コンピュータープログラムを
用いて比較対象のアミノ酸配列の相同性を算出するとよ
い。この算出結果に基づいて、比較したアミノ酸配列と
約５０％以下の相同性を示すアミノ酸配列を選抜すれば
よい。相同性検索プログラムとしてはFASTA、BRASTAなど
の市販のソフトウエアを用い、例えば、EMBL,PIR,DDBJ,
SWISS-PROTまたはNCBIなどにおいて公共に公開されてい
るタンパク質アミノ酸配列データベースに対し検索を行
うことができる。尚、ここで、免疫感作する動物由来の
タンパク質の既知アミノ酸配列と一致するアミノ酸残基
を隣接して３残基以上含まないアミノ酸配列を選ぶと、
抗体の製造により有利である。

【０００９】さらに、前工程で選抜されたアミノ酸配列
を有するペプチドを化学合成し該合成ペプチドとキャリ
アとが結合されてなる有効免疫抗原を調製し、該有効免
疫抗原を投与することにより動物を免疫感作する。ここ
で、キャリアとは、ペプチドと結合させて免疫感作に有
効な抗原を調製するために用いられうる高分子の物質で
あって、具体的には、後述のキャリアタンパク質、枝分
かれ構造を有するポリリジンペプチドなどをあげること
ができる。選抜されたアミノ酸配列を有するペプチドを
化学合成し該合成ペプチドとキャリアとが結合されてな
る有効免疫抗原を調製する方法としては、例えば、選抜
されたアミノ酸配列を有するペプチドを化学合成しこれ
とキャリアタンパク質とを結合させる方法、リジン残基
のαおよびεアミノ基に次のリジン残基のカルボキシル
基が結合されて形成される枝分かれ構造を有するポリリ
ジンペプチドのアミノ末端に、選抜されたアミノ酸配列
を有するペプチドのカルボキシル末端が結合されてなる
多抗原ペプチドを化学合成する方法などがあげられる。
ペプチドを化学合成するには、「固相合成法」（E. Ath
erton & R. C. Sheppard "Solid phase peptide synthe
sis : a practical approach" IRL PRESS at Oxford Un
iversity Press 1989 D. Richwood, B. D. Hames編 p25
-161）等に記載される固相合成法等の通常の方法を用い
ることができる。また、市販のペプチド合成機、例えば
Pharmacia LKB社製のBiolynxや島津製作所製のPSSM-8型
等を用いることにより、ペプチドを固相合成することも
できる。合成されたペプチドを用いて有効免疫抗原を調
製するには、該合成ペプチドをキャリアタンパク質と結
合させる。キャリアタンパク質としては、例えばアルブ
ミン、ミオグロビンまたはヘモシアニン等を用いること
ができる。合成ペプチドとキャリアタンパク質の結合
は、例えば、Jean-phlippe Defoort et al.,（1992） P
roc Natl. Acad. Sci.USA, 89, 3879-3889等に記載され
る方法により行うことができる。また、多抗原ペプチド
を化学合成するには、例えば、Tam J.P., (1988) ProcN
atl. Acad. Sci. USA, 85, 5409-5413、David N. Posne
tt et al.,（1988）J.B. C., 263(4), 1719-1725、Jame
s P. Tam et al., (1989) J. Immumo. Methods. 124 53
-61等に記載されるMAP合成法に準じてペプチド合成を行
うことができる。具体的には、ペプチドの固相合成に際
し、樹脂にリジンを結合させ、このリジンのαおよびε
アミノ基にそれぞれ次のリジンのカルボキシル基を結合
させる工程を繰り返すことにより枝分かれ構造を有する
ポリリジンペプチドを合成する。例えば、リジンのαお
よびεアミノ基にそれぞれ次のリジンのカルボキシル基
を結合させる工程を２回繰り返すと４本の、３回繰り返
すと８本の枝分かれ構造が形成される。次いで、該枝分
かれ構造を有するポリリジンペプチドのアミノ末端のリ
ジン残基のαおよびεアミノ基に、選抜されたアミノ酸
配列を構成するアミノ酸をカルボキシル末端側から順次
結合させることにより、多抗原ペプチドを合成すること
ができる。このような多抗原ペプチドの合成には、例え
ばTAKO8−WTG（島津製作所販売）等の市販のMAP用樹脂
（既に枝分かれ構造を有する）を用いてもよい。このよ
うにして合成された多抗原ペプチドは、さらにキャリア
タンパク質に結合させることなく有効免疫抗原として使
用できる。

【００１０】目的タンパク質がヒト由来のチトクロムＰ
４５０の２Ｃファミリーに属する分子種である２Ｃ８の
場合には、例えば配列番号１で示されるアミノ酸配列を
有するペプチドとキャリアとが結合されてなる有効免疫
抗原を調製し動物に投与するとよい。同様に、目的のタ
ンパク質がヒト由来のチトクロムＰ４５０の２Ｃファミ
リーに属する分子種である２Ｃ９の場合には、例えば配
列番号２で示されるアミノ酸配列を有するペプチドが結
合されてなる有効免疫抗原を、２Ｃ１８の場合には、例
えば配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するペプチ
ドが結合されてなる有効免疫抗原を、２Ｃ１９の場合に
は、例えば配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する
ペプチドが結合されてなる有効免疫抗原を調製し動物に
投与すればよい。また、目的タンパク質がヒト由来のチ
トクロムＰ４５０の１Ａファミリーに属する分子種であ
る１Ａ１の場合には、例えば配列番号５〜７で示される
アミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチ
ドが結合されてなる有効免疫抗原を調製すればよい。配
列番号５、６または７で示されるアミノ酸配列を有する
ペプチドがキャリアと結合されてなる有効免疫抗原のい
ずれかを単独で動物に投与してもよいし、これらを適宜
混合して投与してもよい。また、配列番号５〜７で示さ
れるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を有する２
種または３種のペプチドとキャリアとが結合されてなる
有効免疫抗原を調製し、これを動物に投与してもよい。

【００１１】このように調製された有効免疫抗原を抗原
として動物を免疫感作することにより、所望の抗体を製
造することができる。免疫感作する動物としては、例え
ば、マウス、ハムスター、モルモット、ラット、ウサ
ギ、イヌ、ヤギ等の哺乳類やニワトリ等の鳥類の動物が
あげられ、これらの動物を免疫感作するには、例えばJ.
ASSOC.OFF.ANAL.CHEM 70(6) 1025-1027 (1987)等に記載
される通常の方法を用いて、抗原を１回以上投与する。
例えば、７〜３０日、好ましくは１０〜２１日間隔で２
〜３回投与する。投与量は１回につき、例えば、抗原
０．０５〜約２ｍｇ程度を目安とする。投与経路は、皮
下投与、皮内投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投
与等を選択することができ、静脈内、腹腔内または皮下
に行われる注射が好ましい投与形態である。なおこの場
合、抗原は適当な緩衝液、例えばＣＦＡ(Complete Freu
nd's Adjuvant)、ＲＡＳ〔MPL(Monophosphoryl Lipid
A)+TDM(Synthetic Trehalose Dicorynomycolate)+CWS(C
ell Wall Skeleton)アジュバントシステム] 、水酸化ア
ルミニウム等の通常用いられるアジュバントの１種を含
有するナトリウム系リン酸緩衝液、生理食塩水等に溶解
して用いられるが、投与経路や条件等によっては、上記
のようなアジュバントを使用しないこともある。ここで
アジュバントとは抗原とともに投与したとき、非特異的
にその抗原に対する免疫反応を増強する物質を意味す
る。そして、上記の抗原を投与した動物を０．５〜３ケ
月間飼育した後、該動物の血液を静脈等から少量サンプ
リングし、抗体価を測定する。抗体価が上昇してきた
ら、状況に応じて抗原の投与をさらに適当回数実施す
る。例えば０．１μｇ〜１μｇ、好ましくは０．０５μ
ｇ〜０．５ｍｇの投与量で抗原を投与する。最後の投与
の１ないし２ケ月後にこの動物から通常の方法により血
液を採取して、該血液を、例えば遠心分離、硫酸アンモ
ニウムまたはポリエチレングリコールを用いることによ
る沈澱、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロ
マトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の
クロマトグラフィー等の通常の方法によって分離・精製
することにより、ポリクロナル抗血清として抗体を得る
ことができる。該血清は、たとえば、５６℃で３０分間
処理することによって補体系の不活性化を実施してもよ
い。尚、上記の免疫感作した動物から免疫適格Ｂ細胞を
単離し、該免疫適格Ｂ細胞を連続的に細胞分裂し得る腫
瘍細胞と融合させ、生成する融合物を単離し、そして選
択の後、所望のペプチド抗体を産生するハイブリドーマ
細胞をクローン化し、そしてモノクロナル抗体を製造す
るために該ハイブリドーマ細胞を試験管内または生体内
で培養することにより、高度の特異性および親和性を有
する抗モノクロナル抗体を製造することもできる。

【００１２】このようにして製造された抗体（以下、本
抗体と記す。）は、目的タンパク質と該タンパク質のア
ミノ酸配列に類似するアミノ酸配列を有するタンパク質
とを免疫化学的に判別し得る。目的タンパク質のアミノ
酸配列とこれに類似するアミノ酸配列を有するタンパク
質に対して、交差反応性が約１／２００未満であるよう
な選択的認識が実質的に可能である。ここで、交差反応
性の程度は、例えば、後述するイムノブロット法によっ
て検出することができる目的タンパク質の最低蛋白質濃
度を１とした時に、類似タンパク質が同方法によって検
出されてくる最低濃度がＣであれば、１／Ｃのように決
定される。

【００１３】本抗体の利用としては、目的タンパク質を
免疫学的に検出する方法、例えば、目的タンパク質に結
合させた本抗体または該抗体に対する抗体を、それら抗
体が有する標識によって検出する方法をあげることがで
きる。具体的には、例えば、イムノブロット法、免疫沈
降による分離法、ELISA法、細胞または組織の免疫学的
染色法等によって目的タンパク質を分析する方法をあげ
ることができる。これらの方法は、例えば、下記の手順
によって行うことができる。

【００１４】Ｉ．イムノブロット法 固体支持材に結合される試料に存在する目的タンパク質
を本抗体によって認識させ、目的タンパク質と結合した
本抗体を検出する方法である。試料を結合させる固体支
持材としては、膜、シート、フィルター等の形状になっ
たニトロセルロースが一般的に使用されるが、試料の吸
着がよくかつその試料に存在する目的タンパク質の抗原
性を消失させないものであれば特に制限はない。ニトロ
セルロースを使用する場合、試料をニトロセルロースへ
の結合させるには、例えばリン酸緩衝生理食塩水等の適
当な緩衝液に試料を溶解して得られた溶液をニトロセル
ロース上にスポットする。なお、定量化のためのスポッ
ト量は、抗原である目的タンパク質に対する本抗体の量
が過剰になるような量が望ましく、液量は１μｌ／３ｍ
ｍ平方程度がよい。このようにしてスポットし、ニトロ
セルロースを約１分間〜約２４時間、適当な湿度条件下
でインキュベートする。インキュベート後、スポットし
た部位以外への非特異的な吸着を防止するために、試料
を結合させた固体支持材を本抗体によって認識されない
高分子量担体分子、すなわち、本抗体の製造において用
いられない高分子量担体分子（ヤギ、ウシ等の別種の動
物の血清アルブミンやスキムミルク）を含む溶液と約２
０分間〜約２４時間、室温下でインキュベートすること
によって該高分子量担体分子で固体支持材の表面を覆
う。インキュベート後、得られた固体支持材をよく洗浄
して遊離状態にある上記の高分子量担体分子を除去す
る。このように調製した固体支持材を本抗体を含む調製
液と混合した後、約１０分間〜約３時間、振とうしなが
らインキュベートする。なお本抗体を含む調製液とは、
本抗体が遊離の状態で蒸留水、緩衝液、生理食塩水等の
溶液中に存在しうる調製液をいう。このようにして、試
料に含まれる目的タンパク質に本抗体を結合させる。つ
ぎに、目的タンパク質に結合した本抗体を検出する方法
について説明する。本抗体が、例えばペルオキシダー
ゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、炭酸
アンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチ
ーム、マレートデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−ホ
スフェートデヒドロゲナーゼ等の酵素等であらかじめ標
識されている場合には、本抗体を含む調製液と固体支持
材をインキュベートした後、遊離の状態にある本抗体を
洗浄によって除去してから、固体支持材に対して上記の
標識酵素の基質を作用させて発色等で反応を測定するこ
とによって、目的タンパク質を介して固体支持材に結合
した本抗体を検出することができる。例えば、本抗体が
ペルオキシダーゼで標識されている場合には、基質とし
て過酸化水素、発色試薬としてジアミノベンジジンまた
はＯ−フェニレンジアミンを用いることにより褐色また
は黄色を呈する。本抗体がグルコースオキシダーゼで標
識されている場合には、基質として、例えば２，２'−
アシド−ジ−（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スル
ホン酸）（ＡＢＴＳ）等を用いる。また、本抗体の検出
に、本抗体（第１抗体）を認識しかつ本抗体に結合す
る、酵素またはラジオアイソトープ等で標識された第２
抗体を使用する場合には、本抗体を含む調製液と試料を
結合させた固体支持材をインキュベートした後、遊離の
状態にある本抗体（第１抗体）を洗浄によって除去して
から、固体支持材を第２抗体とインキュベートする。こ
の酵素等で標識された第２抗体としては、例えばペルオ
キシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラク
トシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコアミラー
ゼ、炭酸アンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラー
ゼ、リゾチーム、マレートデヒドロゲナーゼ、グルコー
ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ等の酵素を結合
した、本抗体（第１抗体）を認識可能な抗体をあげるこ
とができる。具体的な例としては、本抗体（第１抗体）
としてウサギ血清を使用する場合、第２抗体としては、
アルカリホスファターゼを結合した抗ウサギ免疫グロブ
リン（ＩｇＧ）ヤギ免疫グロブリン（ＩｇＧ）を用いる
ことができる。尚、該抗ウサギＩｇＧヤギＩｇＧは市販
されている。酵素等で標識された第２抗体の検出は、上
記の標識された本抗体（第１抗体）の場合と同様な方法
で行うことができる。

【００１５】ＩＩ．免疫沈降による分離法 試料中に存在する目的タンパク質に本抗体を結合させる
ことにより本抗体と目的タンパク質からなる免疫複合体
を形成させ、該免疫複合体を試料から分離することによ
って試料から目的タンパク質を分離し、分離した目的タ
ンパク質をゲル電気泳動法、酵素活性測定、イムノブロ
ット法等の方法を用いて検出することにより、試料中の
目的タンパク質を検出する。まず、試料と目的タンパク
質に対する本抗体を、たとえば、約１時間〜約２４時
間、４℃で攪拌しながら混合することによって免疫複合
体を形成させる。この際の試料と本抗体との混合比とし
ては、例えば１：８程度をあげることができるが、試料
中に存在する目的タンパク質の量と本抗体の抗体価等に
よって適宜増減される。つぎに形成された免疫複合体
に、抗体に特異的に結合し、かつ抗体および抗体と結合
している目的タンパク質からなる免疫複合体を溶液中か
ら分離することができる２次試薬を添加し、この混合物
をインキュベートすることによって、上記免疫複合体と
２次試薬からなる複合体を形成させ、これを回収する。
ここで２次試薬としては、例えば、プロテインＡ、プロ
テインＧ等の抗体と結合する細菌細胞壁蛋白質、または
抗免疫グロブリン抗体等があげられる。なお、これら２
次試薬は不溶性の支持材に結合されたものを用いると免
疫複合体と２次試薬からなる複合体の回収、洗浄等がき
わめて容易である。不溶性の支持材は、非常に広範囲の
デザインを有し、そして使用に際して意図された特定の
目的に応じて非常に異なる形状を有することができる。
例えば、ビーズ、皿、球、プレート、小型ロッド、セ
ル、小型ボトル、小型チューブ、ファイバー、ネット等
をあげることができる。具体的な例としては、アガロー
ス等の多糖体（たとえば、セファロース、バイオゲル
等）からなるビーズや透明プラスチック材料、例えばポ
リ塩化ビニルまたはポリスチレンからなるミクロタイタ
ープレート、ポリスチレンおよびポリスチレンラテック
スからなる小球、チューブまたはロッド等が使用可能で
ある。次に、回収された複合体に加熱処理等の操作を施
すことによって目的タンパク質を遊離させる。そして遊
離の状態にある目的タンパク質をゲル電気泳動法、酵素
活性測定、イムノブロット法等の方法によって検出すれ
ばよい。

【００１６】ＩＩＩ．ELISA法 例えば、固体支持材に結合される目的タンパク質標品と
試料中に含まれる測定すべき遊離の目的タンパク質との
本抗体に対する競合に基づいて、試料中に含まれる遊離
の目的タンパク質の量を測定することができる。目的タ
ンパク質は直接または間接的に固体支持材へ結合させ
る。固体支持材としては、たとえばミクロタイタープレ
ートまたは試験管のプラスチック表面、ポリスチレン、
ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ガラスまたはプラス
チック等からなるビーズ表面、ろ紙、デキストラン、セ
ルロースもしくはニトロセルロースまたはその他の類似
の材料の細片の表面等をあげることができる。固体支持
材の具体的な例としては、ポリスチレン製の９６穴ミク
ロタイタープレートをあげることができる。これらの固
体支持材に、目的タンパク質標品を直接または間接的に
結合する（以下、コーティングと記す。）には、例え
ば、あらかじめ、グルタルアルデヒドまたは臭化シアン
等を用いる通常の方法によって固体支持材の活性化を行
う。次いで、活性化された固体支持材を目的タンパク質
を含む溶液（以下、コーティング液と記す。）と一定時
間インキュベートすることにより、コーティングを行う
ことができる。ここでコーティング液としては、例えば
１４０ｍＭの塩化ナトリウムを含む約１０ｍＭのリン酸
緩衝液（ｐＨ 7.4）等をあげることができる。コーティ
ングの条件として、例えば目的タンパク質のコーティン
グ液内の濃度は、約０．０５μｇ／ml〜約１μｇ／mlが
好ましく、コーティング時間は、例えば約６時間〜２４
時間をあげることができる。尚、固体支持材に本抗体を
間接的に結合する場合には、スペーサーおよび／または
抗体によって認識されない高分子量担体分子を介して固
体支持材と本抗体とを結合させるとよい。ここで、本抗
体によって認識されない高分子量担体分子とは、本抗体
の製造において用いられるキャリアタンパク質を除く高
分子量担体分子のことである。このようにして得られる
目的タンパク質を直接または間接的に結合した固体支持
材を、測定すべき目的タンパク質を含む試料および本抗
体を含有する試験溶液と混合し、該混合物をインキュベ
ートする。約１０分間〜約２時間のインキュベート後に
該試験溶液を除去して固体支持材を洗浄した後、該固体
支持材を本抗体（第１抗体）を認識し酵素等で標識され
た第２抗体と約１０分間〜約２時間インキュベートす
る。この本抗体（第１抗体）を認識し酵素等で標識され
た第２抗体としては、例えばペルオキシダーゼ、アルカ
リホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコ
ースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、炭酸アンヒドラ
ーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、マレ
ートデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−ホスフェート
デヒドロゲナーゼ等の酵素を結合した、本抗体（第１抗
体）を認識する抗体をあげることができる。具体的な例
としては、本抗体（第１抗体）としてウサギ血清を使用
する場合、第２抗体としては、ペルオキシダーゼを結合
した抗ウサギ免疫グロブリン（ＩｇＧ）ヤギ免疫グロブ
リン（ＩｇＧ）を用いることができる。なお、該抗ウサ
ギＩｇＧヤギＩｇＧは市販されている。インキュベート
の後、上記第２抗体を除去して固体支持材を洗浄した
後、固体支持材を発色試薬と反応させることにより、固
体支持材に結合した第２抗体を検出する。第２抗体がペ
ルオキシダーゼで標識されている場合には、基質として
過酸化水素、発色試薬としてジアミノベンジジンまたは
Ｏ−フェニレンジアミンと反応させることにより褐色ま
たは黄色を呈する。第２抗体がグルコースオキシダーゼ
で標識されている場合には、基質として、例えば２，
２'−アシド−ジ−（３−エチルベンゾチアゾリン−６
−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）等を用いる。このように固
体支持材に結合される目的タンパク質と試料中に含まれ
る遊離の目的タンパク質との本抗体に対する競合に基づ
いて、試料中に含まれる遊離の目的タンパク質の量を測
定する方法では、試料中の検出すべき目的タンパク質の
濃度が高いほど、固体支持材に結合する第２抗体の量は
減少する。尚、試料中の検出すべき目的タンパク質の濃
度の測定には、目的タンパク質の精製標品を用いてあら
かじめ同様の試験を行い検量線を作成するとよい。また
本抗体を用いた上記方法の利用の形態として、目的タン
パク質の免疫学的検出・分析用キットをあげることがで
きる。該試験キットは、たとえば次の構成成分を含有し
得る：(1) 目的タンパク質を直接または間接的に結合す
る固体支持材、(2) 本抗体を含有する試薬、(3)本抗体
に対する標識された抗体を含有する試薬、すなわち本抗
体（第１抗体）を認識し、そして結合する酵素等で標識
された第２抗体を含有する試薬。さらに補助的に、(4)
目的タンパク質の標準溶液、(5) 緩衝液、(6) 非特異的
吸着および凝集体の形成を防止するポリペプチド、界面
活性剤等の添加剤、および(7) ピペット、反応容器、計
算曲線等を含めるとよい。上記の固体支持材は、非常に
広範囲のデザインを有し、そして使用に際して意図され
た特定の目的に応じて非常に異なる形状を有することが
できる。例えば、皿、球、プレート、小型ロッド、セ
ル、小型ボトル、小型チューブ、ファイバー、ネット等
をあげることができる。具体的な例としては、透明プラ
スチック材料、たとえばポリ塩化ビニルまたはポリスチ
レンからなるミクロタイタープレート、ポリスチレンお
よびポリスチレンラテックスからなる小球、チューブま
たはロッド等が使用可能である。他方、試料中に含まれ
る測定すべき目的タンパク質と酵素であらかじめ標識さ
れた目的タンパク質標品との、一定量の本抗体に対する
競合に基づいて、試料中に含まれる目的タンパク質の濃
度を測定することもできる。測定すべき目的タンパク質
の量が多くなると、酵素で標識された目的タンパク質の
抗体への結合が阻害される。この場合、固体支持材に結
合させた本抗体に対して、測定すべき抗原である目的タ
ンパク質を含む試料および酵素で標識された目的タンパ
ク質を同時に反応させる。次いで、固体支持材を洗浄し
て遊離の状態にある目的タンパク質を除去し、固体支持
材に結合した標識酵素の活性を測定する。試料中の測定
すべき目的タンパク質の濃度が高いほど、固体支持材に
結合する酵素の活性は低くなる。この方法の他の態様と
して、試料中に含まれる測定すべき目的タンパク質、あ
らかじめ酵素で標識された目的タンパク質標品および本
抗体を溶液中で反応させた後、該反応物を固体支持材に
結合させた本抗体を認識する抗体（第２抗体）と反応さ
せることにより、標識された目的タンパク質と本抗体の
複合体を固体支持材に結合させた第２抗体に結合させ、
固体支持材を洗浄の後、固体支持材に結合した標識酵素
の活性を測定する方法もある。

【００１７】ＩＶ． 細胞または組織の免疫学的染色法 固定された細胞または組織標本中に存在する目的タンパ
ク質を本抗体によって認識させ、その抗体を検出する方
法であり、目的タンパク質の細胞または組織中の存在
量、局在状態を調べるのに役立つ。調べたい細胞または
組織を固定し、光学顕微鏡または電子顕微鏡等の観察が
可能な標本を作製する。細胞または組織の固定に使用す
る試薬は、顕微鏡下での観察に適したもので、かつ抗原
である目的タンパク質を認識する本抗体の能力を消失さ
せないものであれば特に制限はなく、例えば３．７％ホ
ルマリン液、１００％メタノール、１００％エタノー
ル、４％パラホルムアルデヒド溶液、１％グルタールア
ルデヒド溶液等があげられる。そして固定された細胞ま
たは組織標本と本抗体を約３０分間〜約２４時間、４℃
でインキュベートすることによって、固定された細胞ま
たは組織標本中に存在する目的タンパク質に本抗体を結
合させる。つぎに、目的タンパク質に結合した本抗体を
検出する方法について説明する。本抗体が、例えばペル
オキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコアミラ
ーゼ、炭酸アンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラー
ゼ、リゾチーム、マレートデヒドロゲナーゼ、グルコー
ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ等の酵素等で標
識されている場合には、インキュベート後、遊離の状態
にある本抗体を洗浄によって除去してから、上記の標識
酵素の基質を作用させて、発色等で反応を測定すること
によって本抗体を検出することができる。例えば、本抗
体がペルオキシダーゼで標識されている場合には、基質
として過酸化水素、発色試薬としてジアミノベンジジン
またはＯ−フェニレンジアミンを用いることにより褐色
または黄色を呈する。本抗体がグルコースオキシダーゼ
で標識されている場合には、基質として、例えば２，
２'−アシド−ジ−（３−エチルベンゾチアゾリン−６
−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）等を用いる。また、本抗体
（第１抗体）を認識しかつ結合する酵素等で標識された
第２抗体を使用する場合には、インキュベート後、遊離
の状態にある本抗体（第１抗体）を洗浄によって除去し
てから、第２抗体とインキュベートする。この酵素等で
標識された第２抗体としては、例えばペルオキシダー
ゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、炭酸
アンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチ
ーム、マレートデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−ホ
スフェートデヒドロゲナーゼ等の酵素を結合した本抗体
（第１抗体）に対する抗体をあげることができる。具体
的な例としては、本抗体（第１抗体）としてウサギ血清
を使用する場合、第２抗体としては、ペルオキシダーゼ
を結合した抗ウサギ免疫グロブリン（ＩｇＧ）ヤギ免疫
グロブリン（ＩｇＧ）を用いることができる。なお、該
抗ウサギＩｇＧヤギＩｇＧは市販されている。第２抗体
の検出としては、上記の標識された本抗体（第１抗体）
の場合と同様な方法をあげることができる。

【００１８】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、
本発明は下記の実施例に限定されるものではない。

【００１９】実施例１ ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｃサブファミリーに属
する分子種である２Ｃ８、２Ｃ９、２Ｃ１８および２Ｃ
１９のアミノ酸配列のマルチプルアラインメントを作成
した。アラインメント作成用ソフトウェアはGenetyx
（ソフトウエア開発株式会社製）のclastal Vを用い
た。上記分子種のアミノ酸配列を比較することにより、
各分子種について、10〜15アミノ酸残基からなり他の分
子種のアミノ酸配列と一致するアミノ酸残基を隣接して
3残基以上含まない部分アミノ酸配列を選抜した（図
1）。各分子種において選択されたアミノ酸配列を以下
に挙げる。 ２Ｃ８： １）Asn Leu Asn Thr Thr Ala Val Thr Lys Gly Ile Val Ser Leu Pro Pro Ser Tyr Gln Ile Cys Phe、 ２）Arg Gly Asn Ser Pro Ile Ser Gln Arg Ile Thr Lys Gly ２Ｃ９： １）Ser Leu Glu Asn Thr Ala Val Asp Leu Phe Gly ２Ｃ１８： １）Ser Leu Ile Ala Thr Val Thr Asp Met Phe Gly、 ２）Asn Lys Ile Ala Glu Asn Phe Ala Tyr Ile Lys Ser Tyr Val Leu Glu、 ３）Lys Asp Ile Asp Ile Thr Pro Leu Pro Met His Leu Val Gly Val Pro ２Ｃ１９： １）Asn Leu Ala Phe Met Glu Ser Asp Ile Leu Glu、 Asn Leu Val Ile Thr Ala Ala Asp Leu Leu Gly ヒト由来のチトクロムＰ４５０１Ａサブファミリーに属
する分子種である１Ａ１と１Ａ２のアミノ酸配列のマル
チプルアラインメントを作成した。アラインメント作成
用ソフトウェアはGenetyx（ソフトウエア開発株式会社
製）のclastal Vを用いた。両分子種のアミノ酸配列を
比較することにより、１Ａ１について、10〜15アミノ酸
残基からなり１Ａ２のアミノ酸配列と一致するアミノ酸
残基を隣接して3残基以上含まない部分アミノ酸配列を
選抜した（図２）。選択されたアミノ酸配列を以下に挙
げる。 １Ａ１： １）Phe Gly Arg Arg Tyr Asp His Asn His Gln Glu Leu Leu、 ２）Asp Ser Leu Ile Glu His Cys Gln Glu Lys Gln Leu Asp Glu Asn Ala Asn Val Gln Leu Ser Asp 、 ３）Leu Thr Pro Asp Gly Ala Ile Asp Lys Val Leu Ser、 ４）Ser Leu Asn Ala Phe Lys Asp Leu Asn Glu Lys Phe Tyr Ser Phe Met Gln Lys Met Val Lys、 ５）Asn Leu Asn Asn Asn Phe Gly Glu Val Val Gly Ser Gly

【００２０】実施例２ 実施例１でアミノ酸配列を比較した各々のチトクロムＰ
４５０分子種について、既にＸ線結晶構造解析がなされ
分子座標が決定されているチトクロムＰ４５０ｃａｍの
構造（Protein Data Bank ID No.2CPP）を基に、ホモロ
ジーモデリング手法を用いてコンピュータ上に分子モデ
ルを構築した。モデル構築に際しての分子モデリング用
ソフトウェアは、Quanta/CHARMmのProtein Pkg(MSI社)
を使用した。構築された分子モデルから、分子モデル表
面に露出している領域を特定した。そして実施例１にお
いて選抜されたアミノ酸配列の中から前記の特定された
領域に相当するアミノ酸配列を選抜することにより、チ
トクロムＰ４５０２Ｃ８の場合には配列番号１で示され
るアミノ酸配列、チトクロムＰ４５０２Ｃ９の場合には
配列番号２で示されるアミノ酸配列、チトクロムＰ４５
０２Ｃ１８の場合には配列番号３で示されるアミノ酸配
列、チトクロムＰ４５０２Ｃ１９の場合には配列番号４
で示されるアミノ酸配列、そしてチトクロムＰ４５０１
Ａ１の場合には配列番号５、６、７で示されるアミノ酸
配列を選抜した。

【００２１】実施例３ 実施例２で選抜された各々のチトクロムＰ４５０分子種
の部分アミノ酸配列について、ＮＣＢＩの蛋白質アミノ
酸配列データベースを検索の対象とし、相同性検索プロ
グラムFASTAを用いて、免疫感作する哺乳動物(ウサギ)
に構成的発現している蛋白質の既知アミノ酸配列との相
同性を検討した。その結果、いずれのアミノ酸配列につ
いても、５０％を超える相同性を示すウサギタンパク質
のアミノ酸配列は見い出されなかった。そこで、実施例
２で選抜されたアミノ酸配列を有するペプチドを有効免
疫抗原の調製に用いることとした。

【００２２】実施例４ 有効免疫抗原の合成および抗体
の調製 島津製作所PSSM-8型ペプチド合成機を用い、MAP用樹脂
である島津製作所販売のTAKO８−ＷＴＧ（７個のリジン
残基からなる枝分かれ構造を有し、計８単位の抗原ペプ
チドを固相合成法により導入できる。）を用いて、有効
免疫抗原として実施例３で決定された各々のチトクロム
Ｐ４５０分子種における免疫抗原領域３次候補のアミノ
酸配列と同等のアミノ酸配列を有するペプチドが８個結
合されてなる多抗原ペプチドを調製した。ヒト由来のチ
トクロムＰ４５０２Ｃ８に対する抗体作製用には配列番
号１で示されるアミノ酸配列を有するペプチドが結合さ
れてなる多抗原ペプチドを、２Ｃ９に対する抗体作製用
には配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するペプチ
ドが結合されてなる多抗原ペプチドを、２Ｃ１８に対す
る抗体作製用には配列番号３で示されるアミノ酸配列を
有するペプチドが結合されてなる多抗原ペプチドを、２
Ｃ１９に対する抗体作製用には配列番号４で示されるア
ミノ酸配列を有するペプチドが結合されてなる多抗原ペ
プチドを、１Ａ１に対する抗体作製用には配列番号５、
６または７に示されるアミノ酸配列を有するペプチドが
それぞれ結合されてなる多抗原ペプチドを、各々合成し
た。合成された多抗原ペプチドは、カラムPD-10(Pharma
cia Biotech社)を用いて２Ｍ酢酸にて溶出する簡易ゲル
ろ過クロマトグラフィーにより精製した。このようにし
て調製された各々のチトクロムＰ４５０分子種の多抗原
ペプチド（有効免疫抗原）を１mg／mlの濃度になるよう
に生理食塩水に溶解した。この水溶液２mlにあらかじめ
４２℃から４３℃にインキュベートしたＲＡＳ〔MPL(Mo
nophosphoryl Lipid A)+TDM(Synthetic Trehalose Dico
rynomycolate)+CWS (CellWall Skeleton)アジュバント
システム〕（Sigma社製）４０μｌを加え、よく混合し
た。得られた混合物をニュージーランドホワイト種ウサ
ギ（雌、１４週齢、平均２．４kg）一羽あたり１mlを投
与した。その内訳は、１００μｌずつ背部１０か所に皮
下投与した。該投与の３週間後、５週間後にそれぞれ初
回の１／２量の抗原を同様に投与した。この間ウサギの
耳静脈から少量の血液をサンプリングし、抗体価を測定
した。３回目の投与後に抗体価が上昇したため、３回目
投与の約２週間後に免疫感作したウサギの頚動脈から全
採血し、得られた血液をセパラピットチューブ（積水化
学社製）に入れ、３７℃で２時間インキュベートした
後、遠心分離（3000rpm 、20min 、室温）して上清を回
収することにより、抗血清を得た。さらに該抗血清を５
６℃で３０分間処理し、補体系の不活性化を行った。

【００２３】試験例 イムノブロット法による目的タン
パク質の分析 １０種類のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種（１Ａ
２、２Ａ６、２Ｂ６、２Ｃ８、２Ｃ９、２Ｃ１８、２Ｃ
１９、２Ｄ６、２Ｅ１および３Ａ４）に対し、実施例４
で得られた２Ｃ８、２Ｃ９、２Ｃ１８、２Ｃ１９の４種
類の抗体を用いてイムノブロッティングを行った。ま
た、上記１０種類に加え１Ａ１を含む１１種類のヒト由
来のチトクロムＰ４５０分子種（１Ａ１、１Ａ２、２Ａ
６、２Ｂ６、２Ｃ８、２Ｃ９、２Ｃ１８、２Ｃ１９、２
Ｄ６、２Ｅ１および３Ａ４）に対し、実施例４で得られ
た１Ａ１の抗体を用いてイムノブロッティングを行っ
た。まず、ヒトチトクロムＰ４５０１Ａ２、２Ａ６、２
Ｂ６、２Ｃ８、２Ｃ９、２Ｃ１８、２Ｃ１９、２Ｄ６、
２Ｅ１および３Ａ４のそれぞれ0.5pmolをＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲルで電気泳動（40mA、1時間）した。
このゲルにニトロセルロース膜を重ね、転写用緩衝液
（25mM Tris、192mM グリシン、20% メタノール）中に
浸した状態で、Bio-Rad社製のブロッティング装置によ
り、4℃、20mA、15時間処理し、泳動されたタンパク質
をニトロセルロース膜へ転写した。同じ試料を泳動し転
写したニトロセルロース膜を４枚調製し、TBS＋Tween20
溶液（50mMTris-HCl(pH 7.5)、200mM NaCl、0.05% Twee
n20）で洗浄した後、3%のゼラチンを含むTBS＋Tween20
溶液中で、37℃、40分間インキュベートした。次いで、
該ニトロセルロース膜をそれぞれ、1%ゼラチンを含むTB
S＋Tween20溶液で1000倍希釈した抗２Ｃ８抗体、200倍
希釈した抗２Ｃ９抗体、400倍希釈した抗２Ｃ１８抗体
または400倍希釈した抗２Ｃ１９抗体と、37℃、１時間
反応させた。また、上記１０種類の分子種と１Ａ１のそ
れぞれ0.5pmolをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電
気泳動（40mA、1時間）し、上記と同様に、泳動された
タンパク質をニトロセルロース膜へ転写し、得られた膜
を400倍希釈した抗１Ａ１抗体と反応させた。反応後、
各ニトロセルロース膜をTBS＋Tween20溶液で4回洗浄し
た後、3%のゼラチンを含むTBS＋Tween20溶液中で、37
℃、20分間インキュベートし、その後、1%ゼラチンを含
むTBS＋Tween20溶液で2500倍希釈した¹²⁵I標識Protein
A（アマシャム社製）中で、37℃、1時間反応させた。反
応後、各ニトロセルロース膜をTBS＋Tween20で4回洗浄
後、風乾し、富士フィルム社製のイメージングプレート
に対して１５時間露光し、富士フィルム社製のBAS2000
システムにてシグナルを検出した。実施例４で得られた
各々の分子種に対する抗体は、ヒト由来のチトクロムＰ
４５０のうち、目的とする分子種のみを特異的に認識し
た（図３〜図７）。

【００２４】

【発明の効果】本発明により、目的タンパク質と該タン
パク質のアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列を有する
タンパク質とを免疫化学的に判別しうる抗体を製造する
ことが可能となる。

【００２５】

【配列表】

<110> Sumitomo Chemical Co.Ltd. <120> Process for producing anti-peptide antibody <130> P149512 <150> JP 09/0218458 <151> 1997-08-13 <160> 7 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asp Ile Asp Ile Thr Pro Leu Pro Met His Leu Val Gly Val 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Phe Gly Arg Arg Tyr Asp His Asn His Gln Glu Leu Leu 5 10 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 His Cys Gln Glu Lys Gln Leu Asp Glu Asn Ala Asn Val Gln Leu 5 10 15 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｃサブファミ
リーに属する分子種（２Ｃ９、２Ｃ１９、２Ｃ８、２Ｃ
１８）とチトクロムＰ４５０ｃａｍ（CAM）のアミノ酸
配列のマルチプルアラインメントを示す。アミノ酸は１
文字表記法で表されている。ヒト由来チトクロムＰ４５
０２Ｃ８、２Ｃ９、２Ｃ１８および２Ｃ１９の各分子種
のアミノ酸配列のうち、一重または二重下線を付した領
域は実施例１で選抜されたアミノ酸配列、二重下線を付
した領域は実施例２で選抜されたアミノ酸配列を示す。

【図２】ヒト由来のチトクロムＰ４５０１Ａサブファミ
リーに属する分子種（１Ａ１、１Ａ２）とチトクロムＰ
４５０ｃａｍ（CAM）のアミノ酸配列のマルチプルアラ
インメントを示す。アミノ酸は１文字表記法で表されて
いる。ヒト由来チトクロムＰ４５０１Ａ１分子種のアミ
ノ酸配列のうち、一重または二重下線を付した領域は実
施例１で選抜されたアミノ酸配列、二重下線を付した領
域は実施例２で選抜されたアミノ酸配列を示す。

【図３】本発明製造法で製造された抗体（抗２Ｃ８抗
体）を用いて、イムノブロット法によりヒト由来のＰ４
５０各分子種を分析した結果を示す。各レーンに泳動し
た試料はそれぞれ次の通りである。レーン１：Ｐ４５０
１Ａ２、２：Ｐ４５０２Ａ６、３：Ｐ４５０２Ｂ６、
４：Ｐ４５０２Ｄ６、５：Ｐ４５０２Ｅ１、６：Ｐ４５
０３Ａ４、７：Ｐ４５０２Ｃ８、８：Ｐ４５０２Ｃ９、
９：Ｐ４５０２Ｃ１８、１０：Ｐ４５０２Ｃ１９

【図４】本発明製造法で製造された抗体（抗２Ｃ９抗
体）を用いて、イムノブロット法によりヒト由来のＰ４
５０各分子種を分析した結果を示す。各レーンに泳動し
た試料はそれぞれ次の通りである。レーン１：Ｐ４５０
１Ａ２、２：Ｐ４５０２Ａ６、３：Ｐ４５０２Ｂ６、
４：Ｐ４５０２Ｄ６、５：Ｐ４５０２Ｅ１、６：Ｐ４５
０３Ａ４、７：Ｐ４５０２Ｃ８、８：Ｐ４５０２Ｃ９、
９：Ｐ４５０２Ｃ１８、１０：Ｐ４５０２Ｃ１９

【図５】本発明製造法で製造された抗体（抗２Ｃ１９抗
体）を用いて、イムノブロット法によりヒト由来のＰ４
５０各分子種を分析した結果を示す。各レーンに泳動し
た試料はそれぞれ次の通りである。レーン１：Ｐ４５０
１Ａ２、２：Ｐ４５０２Ａ６、３：Ｐ４５０２Ｂ６、
４：Ｐ４５０２Ｄ６、５：Ｐ４５０２Ｅ１、６：Ｐ４５
０３Ａ４、７：Ｐ４５０２Ｃ８、８：Ｐ４５０２Ｃ９、
９：Ｐ４５０２Ｃ１８、１０：Ｐ４５０２Ｃ１９

【図６】本発明製造法で製造された抗体（抗２Ｃ１８抗
体）を用いて、イムノブロット法によりヒト由来のＰ４
５０各分子種を分析した結果を示す。各レーンに泳動し
た試料はそれぞれ次の通りである。レーン１：Ｐ４５０
１Ａ２、２：Ｐ４５０２Ａ６、３：Ｐ４５０２Ｂ６、
４：Ｐ４５０２Ｃ８、５：Ｐ４５０２Ｃ９、６：Ｐ４５
０２Ｃ１８、７：Ｐ４５０２Ｃ１９、８：Ｐ４５０２Ｄ
６、９：Ｐ４５０２Ｅ１、１０：Ｐ４５０３Ａ４

【図７】本発明製造法で製造された抗体（抗１Ａ１抗
体）を用いて、イムノブロット法によりヒト由来のＰ４
５０各分子種を分析した結果を示す。各レーンに泳動し
た試料はそれぞれ次の通りである。レーン１：Ｐ４５０
１Ａ１、２：１Ａ２、３：Ｐ４５０２Ａ６、４：Ｐ４５
０２Ｂ６、５：Ｐ４５０２Ｃ８、６：Ｐ４５０２Ｃ９、
７：Ｐ４５０２Ｃ１８、８：Ｐ４５０２Ｃ１９、９：Ｐ
４５０２Ｄ６、１０：Ｐ４５０２Ｅ１、１１：Ｐ４５０
３Ａ４

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】目的タンパク質と該タンパク質のアミノ酸
   配列に類似するアミノ酸配列を有するタンパク質とを免
   疫化学的に判別しうる抗ペプチド抗体の製造法であっ
   て、（１）目的タンパク質のアミノ酸配列と、該タンパ
   ク質と判別しようとするタンパク質のアミノ酸配列とを
   比較することにより、目的タンパク質の部分アミノ酸配
   列であって10〜15アミノ酸残基からなり判別しようとす
   るタンパク質のアミノ酸配列と一致するアミノ酸残基を
   隣接して3残基以上含まないアミノ酸配列を選抜し、
   （２）前項（１）で選抜されたアミノ酸配列のうち、目
   的タンパク質の分子モデルの表面に露出する領域に相当
   するアミノ酸配列を選抜し、（３）前項（２）で選抜さ
   れたアミノ酸配列のうち、免疫感作する動物に由来する
   タンパク質の既知アミノ酸配列と比較して、相同性の低
   いアミノ酸配列を選抜し、（４）前項（３）で選抜され
   たアミノ酸配列を有するペプチドとキャリアとが結合さ
   れてなる有効免疫抗原を調製し、該有効免疫抗原を投与
   して動物を免疫感作する工程を含むことを特徴とする抗
   ペプチド抗体の製造法。
2. 【請求項２】目的タンパク質がチトクロムＰ４５０であ
   る請求項１記載の抗ペプチド抗体の製造法。
3. 【請求項３】目的タンパク質がチトクロムＰ４５０２Ｃ
   ファミリーに属するタンパク質である請求項１または２
   記載の抗ペプチド抗体の製造法。
4. 【請求項４】目的タンパク質がチトクロムＰ４５０１Ａ
   ファミリーに属するタンパク質である請求項１または２
   記載の抗ペプチド抗体の製造法。
5. 【請求項５】有効免疫抗原が配列番号１で示されるアミ
   ノ酸配列を有するペプチドとキャリアとが結合されてな
   る有効免疫抗原である請求項1〜３記載の抗ペプチド抗
   体の製造法。
6. 【請求項６】有効免疫抗原が配列番号２で示されるアミ
   ノ酸配列を有するペプチドとキャリアとが結合されてな
   る有効免疫抗原である請求項1〜３記載の抗ペプチド抗
   体の製造法。
7. 【請求項７】有効免疫抗原が配列番号３で示されるアミ
   ノ酸配列を有するペプチドとキャリアとが結合されてな
   る有効免疫抗原である請求項1〜３記載の抗ペプチド抗
   体の製造法。
8. 【請求項８】有効免疫抗原が配列番号４で示されるアミ
   ノ酸配列を有するペプチドとキャリアとが結合されてな
   る有効免疫抗原である請求項1〜３記載の抗ペプチド抗
   体の製造法。
9. 【請求項９】有効免疫抗原が配列番号５〜７で示される
   アミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチ
   ドとキャリアとが結合されてなる有効免疫抗原である請
   求項1、２または４記載の抗ペプチド抗体の製造法。
10. 【請求項１０】配列番号1で示されるアミノ酸配列を有
    するペプチドとキャリアとが結合されてなるヒト由来の
    チトクロムＰ４５０２Ｃ8特異的抗ペプチド抗体製造用
    の有効免疫抗原。
11. 【請求項１１】配列番号２で示されるアミノ酸配列を有
    するペプチドとキャリアとが結合されてなるヒト由来の
    チトクロムＰ４５０２Ｃ９特異的抗ペプチド抗体製造用
    の有効免疫抗原。
12. 【請求項１２】配列番号３で示されるアミノ酸配列を有
    するペプチドとキャリアとが結合されてなるヒト由来の
    チトクロムＰ４５０２Ｃ１8特異的抗ペプチド抗体製造
    用の有効免疫抗原。
13. 【請求項１３】配列番号４で示されるアミノ酸配列を有
    するペプチドとキャリアとが結合されてなる特徴とする
    ヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ｃ１９特異的抗ペプチ
    ド抗体製造用の有効免疫抗原。
14. 【請求項１４】配列番号5〜7で示されるアミノ酸配列か
    ら選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドとキャリアと
    が結合されてなるヒト由来のチトクロムＰ４５０１Ａ１
    特異的抗ペプチド抗体製造用の有効免疫抗原。