JPH05500206A - Ｇｒｆペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＧＲＦペプチド 本発明は、生物活性ペプチドに関する。

多くのポリペプチドホルモン、たとえば成長ホルモンが、医薬的にまた畜産業に おいて重要になっている。成長ホルモンはすべてのを椎動物に見出され、たとえ ば成長を促進しく体形成）、また乳汁の産生を増大させる（催乳）ことが知られ ている。成長ホルモン（ＧＨ）の制御および放出は、を椎動物において成長ホル モンの量を増大もしくは減少させることができる他のホルモンまたは「因子」に 依存する。成長ホルモンの放出は、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）として知ら れる成長ホルモン放出ペプチド、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）または ソマトクリニンの作用に応答して行われる。

゛人−り研究所からの２つの最初の報告には、ヒト膵臓（ｈ　ｐ）腫瘍からの４ ４個までのアミノ酸を有する成長ホルモン放出ペプチドが記載されている（Ｒｉ ｖｅｒ　ｅｔ　ａｌｌ　９８２　；　Ｇｕｉｌｌｅｍｉｎ　ｅｔ　ａｌ　ｌ　９ ８２　）　ｏそれは、生理的用量で成長ホルモンを特異的に放出させ、正常動物 において視床下部から分泌され、下垂体成長ホルモン細胞でその活性を発揮する ＧＨ放出ホルモンと同一であることが明らかにされた。ツマトスチタン（ソマト トロフィン阻止因子）とＧＲＦのバランスが、下垂体に対する一次刺激となって 哺乳動物の特徴的なＧＨ放出像を与えるものと考えられている。

多くの種からのＧＲＦのアミノ酸配列か報告されている（Ｆｅｌｉｘ　ｅｔ　ａ ｌ、　ｌ　９８５　）　、これらは、４４アミノ酸ペプチドであり、最も高度に 保存されている領域は残基ｌ〜２７、最も変動かある領域は残基３１〜４４であ る。

完全配列にはかなりの種交差活性があって、たとえば、ｈｐＧＲＦ−４４はヤギ で良好な応答を誘導する（Ｈａｒｔｅｔａｌ１９８４）。さらに、その分子の最 も重要な活性は１〜２７の領域に局在すると考えられ、この領域の多くの類縁体 には、モデル種において活性の改善が認められている（Ｌａｎｃｅ　ｅｔ　ａｌ 　１９８４）　Ｏヒトでの使用と同様に、ｈｐＧＲＦのウシへの投与は、乳汁の 産生を改善しく８ｎｒｉｇｈｔ　ｅｔ　ａｌ　１９８６　）　、そのＧＨ放出活 性を介して窒素貯留を増大させる（Ｍｏｓｅｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ　１９　Ｂ　？ 　）ことができる。

種特異的配列（Ｆｅｌｉｘ　ｅｔ　ａｔ　１９８５より）１〜２７共通配列：　 ＹＡＤＡ［ＦＴＮＳＹＲＫＶＬＧＱＬＳＡＲＫＬＬＱＤＩＭ２８〜４４ヒトＧＲ Ｆ　：　５ＲＱＱＧＥＳＮＱＥＲＧＡＲＡＲＬ−ＮＨ２ブタＧＲＦ　：　５ＲＱ ＱＧＥＲＮＱＥＱＧＡＲＶＲＬ−ＮＨ。

ウシＧＲＦ　：　ＮＲＱＱＧＥＲＮＱＥＱＧＡＫＶＲＬ−ＮＨｔヤキＧＲＦ　： 　ＮＲＱＱＧＥＲＮＱＥＱＧＡＫＶＲＬ−ＮＨ２ヒツジＧＲＰ：ＮＲＱＱＧＥＲ ＮＱＥＱＧＡＫＶＲＬ−ＮＨ。

（アルファベットはアミノ酸の標準単一文字記号である。

付録１参照） ホルモンに対して励起された抗体によって、ホルモンの活性に影響を与えうろこ とが報告されている。すなわち、ＥＰ　Ａ−１３７−２３４には、成長ホルモン に対する抗体を単離し、動物に投与すると、そのホルモンの活性か増大すること が記載されている。これらの抗体は、ＥＰ　Ａ−２８４−４０６に示されている ように、その問題のホルモンの適当なフラグメントで宿主動物を免疫しかしなが ら、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ　（１９８９）は、すべてのＧＲＦ分子に 対する免疫処置は、このホルモンの活性を阻害することになると報告している。

さらに、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ　ｅｔ　ａｌ　（１９８９）は、コルチコトロピン放 出因子（ＣＲＦ）のある種のフラグメントに対する免疫処置は、循環グルココル チコイドの減少から明らかなように、その活性を消失させたと報告している。

これに反し、完全ＧＲＦに対する抗体を産生ずるＧＲＦの特定のフラグメントを を椎動物に投与することにより、そのを椎動物においてＧＲＦの活性を増強でき ることが発見された。このＧＲＦの増強は、そのを椎動物における成長、屠体組 成、乳汁産生およびＧＨの他の生物学的効果を刺激するものと考えられる。本明 細書で用いられる「フラグメント」の語は、全ＧＲＦ分子に対する言及を排除す るものである。

したがって第一の態様においては、本発明は、ＧＲＦの２８〜４４アミノ酸配列 をまたぐ領域（とくに、ＧＲＦの３１〜４４アミノ酸配列をまたぐ領域）と−次 構造ホモロジーを有するフラグメントもしくはその部分、それらと抗原的にもし くは免疫原的に均等なペプチドもしくは分子、またはそれらの塩を、を椎動物に 投与することによる、そのを椎動物における成長ホルモン放出因子の活性を増強 （上昇または促進）させる方法を提供する。

本明細書で用いられる「増強」の語は、フラグメントが直接または間接に、ホル モンの活性を上昇または促進するように働くことをいう。ペプチドは、天然の蛋 白質から誘導しても、また本技術分野において既知の方法を用い、化学的に合成 しても、組換え遺伝子産物として製造ｈｐＧＲＦの３１〜４４領域は次の通りで ある。

Ｃｈｘ−Ｃ１ｙ−（：Ｌｕ−８＠ｒ−Ａｍｎ−Ｇｉｎ−ＧＬｕ−＾ｒｇ−Ｇｕｙ −＾１ａ−＾ｒｇ−Ａｉｍ−Ａｒｇ−Ｌａｕ「−次構造ホモロジー」の語は、他 の種からのＧＲＦ分子の相当する領域を正確に複写するペプチド、および、その ペプチドから産生される抗体の性質を実質的に変化させないような１個または２ 個以上のアミノ酸の「保存的置換」を有する他のペプチドを意味する（「保存的 置換」の語は、前文において機能的に定義されている）。

この場合、保存的である置換の例には、元のアミノ酸残基と実質的に同じ疎水性 、サイズ、電荷、および／または芳香性を有する置換が包含される。このような 置換および修飾はすべて、ペプチド化学の技術分野における熟練者には一般的に よく知られている。たとえば、候補となる置換としては、グリシンに対するプロ リンおよびその逆、グリシンに対するアラニンまたはバリンならびにその逆、ロ イシンまたはメチオニンに対するイソロイシンおよびその逆、チロシンに対する トリプトファンおよびその逆、リジンに対するヒスチジンおよびその逆、アスパ ラギンに対するセリンおよびその逆、システィンに対するスレオニンおよびその 逆、スレオニンに対するセリンまたはアラニンおよびその逆、アスパラギンに対 するグルタミンおよびその逆を挙げることができる。

「抗原的に均等」の語は、本発明のペプチドまたはその部分に対して励起された 場合、そのを椎動物または類似のを椎動物において、成長ホルモン放出因子の生 物活性の増強作用を示す抗体によって特異的に認識されるペプチドまたはその均 等体を意味する。「免疫原的に均等」の語は、そのペプチドが、適当な処方でを 椎動物に抗体を励起するために使用できて、その抗体はそのを椎動物において放 出因子の活性を増強する作用を有することを意味する。

とくに、抗原的にまたは免疫原的に均等なペプチドとしては、上述の領域よりわ ずかに短いかもしくは長いペプチド、または上述の領域と実質的に重複するペプ チドを使用できる。とくに、上述のフラグメントより短い、抗原的に均等なペプ チドが使用できる。その動物自身のＧＲＦの配列からの変動はより大きな免疫応 答を惹起することがあり、一方、その動物自身のＧＲＦまたは標的ＧＲＦ　（た とえば、移植組織を介して外因的に導入されたＧＲＦ）をなお認識できる抗体を 産生ずる。したがって、投与される動物以外の種からの本発明の小ペプチドを投 与するか（たとえばヒツジペプチドのブタへの投与）または投与されるペプチド に非天然もしくは非保存的アミノ酸置換を結合することが有利である。

さらに、ペプチドの合成前または後に、アミノ酸残基の１個または２個以上を化 学的に修飾したペプチドが、そのペプチドの機能、すなわち特異的な抗体のｉｎ 　ｖｉｖ。

での産生能を実質的に変化することなく残存している限り、使用できる。このよ うな修飾には、酸もしくは塩基とくに生理的に許容される有機もしくは無機酸お よび塩基による塩の形成、末端カルボキシル基のエステルもしくはアミドの形成 、ならびにＮ−ｔ−ブトキシカルボニルのようなアミノ保護基の結合が包含され る。このような修飾は、ペプチドをｉｎ　ｖｉｖｏにおける代謝から保護できる 。ペプチドは、単一コピーとして存在しても、また多重体たとえば（３１〜４４ ）＋（３１〜４４）または（３１〜４４）＋（４４〜３１）のような縦列反復配 列として存在してもよい。このような縦列または多重配列は、それ自身十分に抗 原性であり、担体の使用を省略できる場合がある。

ペプチドをＮ末端とＣ末端か互いに連結したループとして形成させること、また は１個もしくは２個以上のシスティン残基を末端に付加させることは、抗原性の 増大および／またはジスルフィド結合の形成を可能にする利点がある。ペプチド を、担体、好ましくはポリペプチドに共有結合で連結する場合には、本発明のペ プチドがループを形成するような配置が好ましい。適当には、そのペプチドを、 Ｃ末端でアミド化し、付加的アミノ酸たとえばシスティンをＮ末端に加えると、 接合が促進され、または潜在的な免疫原性が改善される。

本発明の第二の態様は、本発明の第一の態様のペプチド１種または２種以上と担 体およびアジュバント機能を与える手段からなる医薬用抗原性組成物を提供する 。

現在の免疫理論によれば、免疫系を刺激するためまたは免疫系の刺激を促進する ため、免疫原性処方中には担体機能を存在させなければならない。担体は、ヘル パーＴ細胞エピトープを具現（または担体とともに創製）すると考えられている 。ペプチドは、たとえば架橋により、別個の担体たとえばアルブミン、ミオグロ ビン、細菌トキシンおよびキーホールリンペットヘモシアニンと組み合わせても よい。

さらに最近になって開発された、免疫応答においてＴ細胞の助けを誘発する担体 としてＢ型肝炎コア抗原（ヌクレオキャプシド蛋白質とも呼ばれる）、推定Ｔ細 胞エピトープたとえばＴｈｒ−Ａｌａ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｖａ　１−Ａｌａ−Ｇ ｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ　−Ｃｙｓ、β−ガラクトシダーゼおよびインタ ーロイキン−１の１６３〜１７１ペプチドがある。後者の化合物は、担体ともア ジュバントとも、またその両者とも、様々に考えることができる。また、同種ま たは異種の本発明のペプチドの数個のコピーを互いに架橋させることもできる。

この場合には、別個に担体自体がなくても、このような架橋て担体機能か与えら れる。適当な架橋剤としては、Ｓ　ｉ　ｇｍａおよびＰｉｅｒｃｅのカタログに ある試剤、たとえばゲルタールアルデヒド、カルボジイミドおよび４−（Ｎ−マ レイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジルエステルを 挙げることができる。

最後に挙げた試剤は、Ｃ末端のシスティン残基があれば、その−３Ｈ基を利用す る。

ＭＢＳ　（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）または ゲルタールアルデヒドを用いる架橋または接合は、適当には、ポリペプチドたと えばそのペプチド自体、Ｔ細胞エピトープ、最も適当にはキーホールリンペット ヘモシアニンに行われる。

ペプチドを、適当な宿主中で、適当なヌクレオチド配列の発現によって製造する 場合には、そのペプチドは、Ｔ細胞を介助するかまたは担体として作用するペプ チド配列との融合生成物として発現させるのが宥和である。

Ｋａｂｉｎｇｅｎの“Ｅｃｏｓｅｃ”システムは、このような配列の例である。

“Ｅｃｏｓｅｃ”は商標名である。

適当なアジュバントは、ワクチンの分野の熟練者にはよく知られている。たとえ ば、フロイントの完全もしくは不完全アジュバント、水酸化アルミニウム、サポ ニン、ＤＥＡＥ−デキストラン、ムラミルジペプチド、鉱油、中性油（たとえば 、ミグリオール）、植物油（たとえば、落花生油）、″［ｓｃｏｍｓ’　、リポ ソーム、Ｎｏｖａｓｏｍｅｓもしくは類似の製品、Ｐｌｕｒｏｎｉｃポリオール 、またはＲｉｂｉアジュバントシステム（たとえば、ＧＢ−Ａ−２１８９１４１ 参照）がある。“Ｐｌｕｒｏｎｉｃ″は登録商標である。

本発明のペプチドは、他の抗原に連結して、二相性効果をもたせることもできる 。たとえば、ペプチドをソマトスタチンの全分子もしくは部分に連結して、抗− ＧＲＦ抗体に加えて、成長を促進する抗−ソマトスタチン抗体を創製するか、ま た同時に免疫去勢を付与する性ホルモンの全分子もしくは部分に、または黄体形 成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）の部分もしくは全分子に連結するか、また 成長ホルモン作用の同時増強を付与する成長ホルモンの全分子もしくは部分、あ るいは成長もしくは屠体の改良に関与する他の任意のペプチドホルモンに連結さ せることができる。

ペプチドならびにアジバントおよび／または担体は、既知のまたは今後発見され る送達ビヒクルおよび基準を用い、本技術分野の熟練者によって創案される任意 の適当な方法で処方することができる。とくに、この処方は、生物学的分解ポリ マー、たとえば、ＥＰ−Ａ−５８４８１（ＩＣＩ）に記載されたラクチドグリコ リド共重合体のようなポリマーをベースとすることができる。本発明のペプチド は（他の抗原に連結されていてもいなくても）、他のペプチドを増強する他の免 疫処置操作（たとえば細菌、ウィルスまたは寄生虫感染に対する）と組み合わせ て使用することもできる。

本発明の他の態様では、２８〜４４からなる領域からのＧＲＦ配列に対する抗Ｇ ＲＦ−抗体（とくにＧＲＦ３１〜４４または３５〜４４のフラグメントに対する 抗ＧＲＦ−抗体）、またはそれらと抗原的にもしくは免疫原的に均等なペプチド 、またはそれらの塩を提供する。適当には、これらの抗ＧＲＦ−抗体は、ＧＲＦ または本発明のＧＲＦフラグメントと複合体を形成させることができる。

本発明のさらに他の態様では、正常または異常を椎動物を、その生物学的特性と くにＧＨに関連した生物学的効果を変えるために、上述の小ペプチドもしくは抗 原性組成物、または抗ＧＲＦ−抗体（適当には、ＧＲＦまたはＧＲＦのフラグメ ントと予め複合体化した抗ＧＲＦ−抗体）で処理する方法を提供する。たとえば 、そのを椎動物の成長は、正常レベルを越えてもしくは加速された速度で上昇も しくは増大し、また、異常に低いレベルの成長はそれを正常まで高めることかで きる。同様に、乳汁の産生は、ＧＨに関連した他の生物学的効果たとえば屠体組 成とともに向上もしくは増大する。たとえば、窒素貯留および赤肉対脂肪比もこ のような方法の利用により増大する。「を推動物」の語には、ヒトおよびヒト以 外の動物が包含される。

本発明の小ペプチドおよび抗原性組成物は通常、静脈内、皮下または筋肉内に投 与されるが、本発明の一部の処方は経鼻、経皮、経口および経直腸投与にも適し ている。抗原はまた、宿主を推動物中で複製される遺伝子操作細菌、酵母または ウィルスによる融合蛋白質としての発現によって投与することもできる。とくに 、本発明の小ペプチドおよび抗原は、本技術分野で知られている方法を用いる細 菌担体の利用により、たとえばサルモネラ菌の二重ａｒｏ変異体を用いて（国際 特許出願Ｐ　ＣＴ　／、ＧＢ８８１０１１４３、国際公告第Ｗｏ８９１０５８５ ６号として公告、参照）提供できる。処方は通常、滅菌され、（非経口投与の場 合）実質的にパイロジエンを含まないように精製され、単位用量は通常、本発明 の小ペプチド１〜１０００μｇ、典型的には１０〜５００μｇ、好ましくは５０ μｇもしくはそれ未満を包含する。免疫学の分野ではよく知られているように、 １回または２回以上の反復免疫処置か有利である。この処方は一般的に、医師ま たは獣医師の経験または裁量によって調製および／または投与される。

本発明のさらに別の態様によれば、上述のペプチドの一つをペプチド合成の既知 の方法または天然ＧＲＦ分子の適当な切断によって製造する方法を提供する。ペ プチドの合成は、Ｓｔｅｗａｒｔ　ｅｔ　ａｌ　（７９６９）の一般的方法、あ るいはＭａｒｇｌｉｎ　＆　Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　（１９７０）およびそれ以 後の文献に記載された方法により達成される。

たとえば、一つのアプローチでは、ペプチドおよび塩は、ペプチド合成の古典的 方法もしくは固相法による適当なアミノ酸の連続的なカップリング、またはまず ペプチドのサブユニットを合成しついでそれらのカップリングにより形成させる ことができる。この反応は、たとえば導入するアミノ酸の反応させるカルボキシ ル基を活性化し、反応させないアミノおよびカルボキシル基を保護して行われる 。ラセミ化を最小限に抑える適当な活性化剤および保護（遮断）基、ならびに適 当な反応条件（カップリング反応および保護基の除去の両者）の詳細は、上に引 用した文献に記載されている。

すなわち、ペプチドおよびその塩は、反応試剤（Ｉ）Ｙ’　−ＯＨ（１） （式中、Ｙｌは上記ペプチドの相当するＮ末端部分ラジカル配列と同じ部分ラジ カル配列である）を、試剤（ＩＩ）Ｈ−Ｙ’、　（ＩＩ） （式中、Ｙ２は上述のペプチド生成物の残部と同一で、そのＣ末端部分ラジカル 配列を包含する）を、試剤（Ｉ）および（Ｉｆ）の必要な位置を所望により適宜 保護および／または活性化して反応させ、ついで生成物を適宜脱保護し、次に生 成物を適宜、遊離のペプチドまたはその塩に変換することによって製造される。

固相法および類似の技術によるペプチド合成の確立された方法は通常、大規模な 製造には適しておらず（将来は適するようになるとしても）、シたがって、ペプ チドの工業的製造は通常、所望のペプチドをコードするポリヌクレオチド配列で 形質転換した適当な生物体の培養によって行われる。したがって、本発明の別の 態様には、この場合のポリペプチド、この種のポリペプチドをもつ形質転換およ び発現ベクター、それで形質転換された生物体、ならびにそのような生物体の培 養方法を包含する。

したがって、本発明はさらに別の態様として、本技術分野で知られている組換え ＤＮＡ方法による本発明のペプチドの製造方法を包含する。この方法は、たとえ ば、（ｉ）　本発明のペプチドをコードする遺伝子が導入され、宿主細胞におけ るそのペプチドの発現を可能にするベクターで宿主細胞を形質転換し、 （ｉｉ）　形質転換細胞をそのペプチドが発現されるように培養し、ついで （ｉｉｉ）そのペプチドを回収する、各工程からなる。

任意の適当な宿主−ベクターシステムが使用できる。

ベクターはプラスミドであってもよい。この場合、細菌または酵母宿主も使用で きる。別法として、ベクターはウィルスベクターであってもよい。この場合、ペ プチドの発現を起こさせるためには、哺乳動物の細胞のトランスフェクションを 用いることもできる。本発明のさらに他の態様には、本発明の方法によって改変 された特性を存するを推動物も包含される。

次に、本発明の実施例を、添付の図面を参照しながら記述する。

図１は、抗−ＧＲＦＩ−１４抗血清で免疫処置されたヒツジにおけるＧＲＦ応答 の弱化を示す。

図２は、抗−ＧＲＦ３１〜４４抗血清で免疫処置されたヒツジにおけるＧＲＦ応 答の増強を示す。

図３は、抗−ＧＲＦ３５〜４４抗血清で免疫処置されたヒツジにおけるＧＲＦ応 答の増強を示す。

図４は、免疫処置動物における抗−ＧＲＦ応答の発生を示す滴定曲線である。

図５は、ＧＲＦに対するヒツジの生物学的応答への、４時間にわたるＧＲＦ　１ 〜１４．３１〜４４または３５〜４４に対する抗体の作用を一覧する。

図６は、初期６０分間におけるＧＲＦＩ−１４，３１〜４４または３５〜４４に 対する抗体の作用をとくに強調する図である。

とくに指示のない限り、すべてのペプチドは固相ペプチド合成のＦｔｎｏｃ−ポ リアミド法で合成した。一時的なＮ−α−アミノ基の保護は９−フルオレニルメ チルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基で行う。この、塩基に著しく不安定な保護 基の反復切断はＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド中２０％ピペリジンを用いて行わ れる。

側鎖の官能基は、そのブチルエーテル（セリン、スレオニンおよびチロシンの場 合）、ブチルエステル（グルタミン酸およびアスパラギン酸の場合）、ブトキシ カルボニル誘導体（リジンおよびヒスチジンの場合）、トリチル誘導体（システ ィンの場合）および４−メトキシ−２，３，６−ドリメチルベンゼンスルホニル 誘導体（アルギニンの場合）として保護される。グルタミンまたはアスパラギン がＣ末端残基である場合は、側鎖アミン官能基の保護に４．４′−ジメトキシベ ンズヒドリル基が使用される。

固相支持体は、３種のモノマー、ジメチルアクリルアミド（骨格モノマー）、ビ ス−アクリロイルエチレンジアミン（架橋リンカ−）およびアクリロイルザルコ シンメチルエステル（官能化剤）から構成されるポリジメチルアクリルアミドポ リマーをベースとする。使用されるペプチド−樹脂の切断可能な連結剤は酸に不 安定な４−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸誘導体である。

すべてのアミノ酸誘導体は予め形成させた対称無水物誘導体として添加されるが 、アスパラギンとグルタミンは例外で、反転Ｎ、Ｎ−ジシクロへキシルカルボジ イミド／ｌ−ヒドロキシベンゾトリアゾール介在カップリング法を用いて添加さ れる。

すべてのカップリングおよび脱保護反応は、ニンヒドリン、トリニトロベンゼン スルホン酸またはイソチン試験法を用いてモニタリングされる。

合成完了後、ペプチドは、５％スカベンジャーミックス含有９５％トリフルオロ 酢酸で処理して樹脂支持体から切断され、同時に側鎖の保護基か除去される。一 般に用いられるスカベンジャーは、エタンジチオール、フェノール、アニソール および水であり、厳密な選択は合成されるペプチドの構成アミノ酸に依存する。

トリフルオロ酢酸を真空中で蒸発させて除去し、ついでジエチルエーテルで磨砕 すると粗製のペプチドが得られる。存在するスカベンジャーは単純な抽出操作で 除去され、水相を凍結乾燥するとスカベンジャーを含まない粗製のペプチドが得 られる。

精製は、クロマトグラフ法、たとえばサイズ排除クロマトグラフィー、イオン交 換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（たとえば適当なモ ノクローナル抗体を使用）および逆相高速液体クロマトグラフィーのいずれかま たは組み合わせによって行われる。

ペプチドの分析は、薄層クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー 、酸分解後のアミノ酸分析を用い、また高速原子衝撃（ＦＡＢ）マススペクトル 分析によって実施できる。

ペプチド３．０■を３００μｍのジメチルホルムアミドに溶解した。Ｄｕｌｂｅ ｃｃｏのリン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）中１０ｍｇ／ｍｌのオバルブミン１５０ μｍを加え、完全に混合した。新たに調製した０、０４Ｍゲルタールアルデヒド ２５０μｍを、１０分間を要して攪拌下に徐々に加え、ついで、さらに６０分間 、攪拌を続けなから室温に放置した（ＳＰ［ＲＡＭｒＸ、　Ｄｅｎｌｅｙ　Ｉｎ ｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）。

ＰＢＳｌ、Ｏｍｌを加え、ついて、さらに上述の０．０４Ｍゲルタールアルデヒ ド１００μｍを加えた。これを室温に６０分間放置したのち、ＰＢＳに対して一 夜＋４°Ｃて透析した。

ペプチド５■を、Ｐｉｅｒｃｅ　ａｎｄ　Ｗａｒｒｉｎｅｒ　（ＵＫ）　Ｌｔｄ 、。

Ｃｈｅｓｔｅｒ、　Ｅｎｇｌａｎｄから供給されたｍ−７レイミドベンゾイルー Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−ＭＢＳ法（Ｌｅｒｎｅｒ　ＲＡ　ｅｔ　ａｔ　 １９８１）を用いるか、またはランダムゲルタールアルデヒド法を用いて、キー ホールリンペットヘモシアニンに接合した。後者は次のように実施した。ｈｐＧ ＲＦペプチド５■を、ＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）　２５０　ｔ、ｔ　１に溶解 し、ＰＢＳ中１０■／ｍ１ＫＬＨ５００μｌと混合した。０．０４Ｍゲルタール アルデヒド（Ｓｉｇｍａ　）　５００μｍを攪拌下に滴下した。

これを室温で６０分間回転した。さらに、ＰＢＳｌ、５ｍｌを加え、ついて、０ ．０４Ｍゲルタールアルデヒド５００μｌを上述のように加え、混合物を３０分 間回転した。反応混合物を、１　ｋＤａカットオフの５ｐｅｃｔｒｏｐｏｒ透析 膜を用い、ＰＢＳ　１００容量に対して一夜透析した。

３、架橋 ペプチド１．４■を１４０μｌのジメチルホルムアミドに溶解し、０゜０４Ｍゲ ルタールアルデヒド１７０μｌを上述のように加えた。他は上述の通りである。

架橋も接合も必要でない場合は、ペプチドをジメチルホルムアミドに溶解し、Ｐ ＢＳ中に分散させたが、透析はし上記に対する陰性対照パラレルは、ペプチドを 用いないでオバルブミン（またはＫＬＨ）を使用し、またはポリリジン（分子量 １０００〜２０００　Ｄａ）を用い、上述のように架橋して調製した。

４、アジュバントおよび投与−（「フロイント」）透析後、上記プレバレージョ ンの容量をＰＢＳで４．５ｍｌとし、２容のフロイント完全アジュバント（Ｄｉ ｆｃｏまたはＳｉｇｍａ　ＦＣＡ　）を用いて油中水型乳化液を調製した。これ は、冷却下超音波処理によりまたはＰｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｎホモジナイ ザーを用いて実施した。乳化液は、氷表面上での分散（または不存在）により試 験した。

注射は、Ｃｈｅｖｉｏｔヒツジ（９〜１２週齢、去勢雄、３０〜３５ｋｇ）の２ 部位（各腹側部に１箇所）に皮下投与した。各部位に１ｍｌ投与した。２回目の 同様な免疫処置は、フロイント、の不完全アジュバント（ＦＩＡ、　Ｄｉｒｃｏ またはＳｉｇｍａ　）に乳化するほかは同じ方法で接合した、新たな調製ペプチ ドを使用し、２８〜４２日後に完了した。

以後の免疫処置も同様であるが、２８日日間上した。マウスには、同じ間隔で、 ブレバレージョン０．１ｍｌを腹腔内に投与した。

５、アジュバントおよび投与−（その他）ＤＥＡＥ−デキストラン（二回蒸留水 中で一夜完全に水和Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）　、サポニン（ｓｉｇｍａ　）およ び水酸化アルミニウム（「Ａ１−ヒドロゲル」）を、単独でまたは組み合わせて 使用した。透析後、３．１ｍＩＰＢＳ＋７ｍ１５％ＤＥＡＥ−デキストン（Ｄａ ）　＋２．８ｍｌの５■／ｍｌサポニン；または、５．９ｍＩＰＢＳ＋７ｍｌ　 ５％Ｄａ：または、１０．１ｍＩＰＢＳ＋２．８ｍｌの５１０ｇ／ｍｌサポニン の添加を行った。水酸化アルミニウム（ｒＡｌｏＨＪ　）は必要に応じて最終濃 度１．０ｍｇ／ｍｌで使用した。乳化の必要はないが、生成物を均一な懸濁状態 に維持するように注意を払った。上述のようにして、１■をヒツジに投与した。

免疫処置は同じ間隔で実施した。

６、血液サンプル（ヒツジ） 試験下のヒツジから、投与直前および以後適当な間隔て、頚静脈静脈穿刺によっ て血液サンプル１０ｍ１を採取した。室温に放置して血餅を生成させ（３〜５時 間）、ついて、抗体検出ラジオイムノアッセイ用に血清を遠心分離により分離し た。もっと大量の血清サンプルを同様にして、約１５０〜２００ｍ１の血液から 採集し、−２０°Ｃて凍結し、ついてＩｇＧ分画に分画化してアッセイに使用し た。

血液サンプル（マウス） 後眼窩経路からまたは尾静脈切開により小量の血液サンプル（０，２５〜０．５ ｍ１）を採取し、ヒツジの場合と同様に処理した。大量の血清サンプルは採取し なかった。

７、ラジオイムノアッセイ とくに指示のない限り、成長ホルモン放出因子にも結合するペプチドへの抗体の 検出は、すでに報告されているように（Ａｓｔｏｎｅｔａｌ　１９８５　；Ｃｈ ａｒｄ　１９８７）液相直接結合で定量した。

以下の配列を、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｌｓ。

Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　Ｅｎｇｌａｎｄによって合成し、ＨＰＬＣで精製して、 ８０％以上の純度のペプチドを得た。

Ｃｙｇ−Ｇｌｎに１ｙ−ＧＬｕ−５＠ｒ−＾ａｎ−Ｇｌｎ−ＧＬｕ−Ａｒｇ−に ｌｙ−＾Ｌａ−Ａｒｇ−＾１蟲−＾ｒｇ−Ｌａｕ−Ｎｌ１２このペプチドは、位 置４４かアミド化され、位１ｔ３０にシスティン残基が付加されて、ＭＢＳを用 いる接合か容易になり（下記参照）、免疫原性が改善されていることに注意すべ きである。

ペプチド５■をｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド法ま たはランダムゲルタールアルデヒド法を用いてキーホールリンペットヘモシアニ ンに接合させた。両液合体とも容量を５ｍｌに調整した。フロイント完全アジュ バンｌ−（Ｆ　ＣＡ−Ｓｉｇｍａ　）　１０ｍｌを加えた。これを０°Ｃに冷却 し、予め冷却したプローブを用いて超音波処理で乳化した。

２群のマウスおよびヒツジの免疫処置には完全プレバレージョンを使用した。ヒ ツジには、２箇所の皮下部位に１ｍｌを投与し、総ペプチド用量を６６７μｇ／ 匹とした。各プレバレージョンあたり１８月齢のＮｏｒｔｈＣｈｅｖｉｏｔ去勢 ヒツジ５匹を使用した。各ブレバレージョンあたり６匹のマウス（Ｂａｌｂ／Ｃ ）を使用し、それぞれにＦＣＡ中１００μｇのペプチドを腹腔的投与した。

４週後に全動物から血液サンプルを採取し、直ちに、前述したと類似の投与（ブ ースター）を行った。ただし、総ペプチド負荷は半量とし、乳化液はフロイント の不完全アジュバント（Ｆ　Ｉ　Ａ−Ｓｉｇｍａ　）を用いて調製した。

全動物から１５日後に血液サンプルを採取し、ヒツジのみは以後毎週採血を行っ た。最初の増強後２８日にＦＩＡ中さらに追加用量を投与した。これらの血液サ ンプルからの血清について、３−　（１２’Ｉ）ヨードチロノル１０成長ホルモ ン放出因子１〜４４アミド（Ａｍｅｒｓｈａｍ。

Ｂｕｃｋｓ、　ＵＫ　）　、および抗−マウスまたは抗−ヒッジ５ａｃ−Ｃｅｌ 　（ｒｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｌｔｄ、　）を用いた競合的ラジオ イムノアッセイ法により、抗−ＧＲＦ抗体の存在を試験した。この系の予備的陽 性対照としては、ウサギ抗−ＧＲＦ抗体（Ｍｅｔａｃｈｅｍ　Ｄｉａｇｎｏｓｔ ｉｃｓ　Ｌｔｄ、、　Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ。

ｔＪＫ）を、抗−ウサギ５ａｃ−Ｃｅｌ　とともに使用した。ＩｇＧのための大 量ヒツジ血液サンプルの調製およびその特性結果は、少なくとも２つの試験血液 で陽性抗体反応を示した生存動物の百分率として表に示した。

ＭＢＳ　３３％　４０％ ゲルタール　４０％　６０％ アルデヒド　（５／６）　（５１５） Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｃａｍ ｂｒｉｄｇｅ。

Ｅｎｇｌａｎｄにより下記の配列を合成し、ＨＰＬＣで精製して、純度８０％以 上のペプチドを得た。

Ｃｙ属＋１−１４： （り　Ｃｙｓ−τｙｒ　−ｄａ−Ａｓｐ−＾１ａ−１１ｓ−Ｐｈａ−Ｔｈｒ−Ａ ｇｎ−５ｅｒ−丁７Ｆ−＾ｒｇ−ＬｙトｖａＬ−１ａｕ１５−２７＋Ｃｙ＋”： （工Ｉ）　Ｇ１７−Ｇｉｎ−Ｌａｕ−５ｓｒ−ＡＬａ−Ａｒ３−Ｌｙｓ−Ｌ＠ｕ −Ｌ・ｕ−Ｇｉｎ−Ａｔｐ−Ｅｌｓ−Ｍｅｔ−Ｃ）ｎＣｙｓ　＋２２−３５： （Ｉ工Ｉ）　Ｃｙｓ−Ｌａｕ−Ｌａｕ−ＧＬｎ−Ａｓｐ−Ｘ１＊−Ｍｓｅ−５＊ ｒ−＾ｒｇ−にｕｎ−に１ｎ−Ｇ１７−（：ｌｕ−５ａｒ−`ｇｎ （工Ｖ）　Ｃｙａ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｉｎ−ＧＬｕ −Ａｒｇ−ＧＬｙ−Ａｌａ−＾ｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−（Ｖ）　Ｃｙｇ−Ｇｉｎ −Ｇｌｙ−Ｃ１ｕ−５自ｒ−＾ｇｎ−Ｃ１ｎ−にＬｕ−＾ｒｇ−Ｇ１ｙ３１−３ ９； （Ｖτ）　Ｇｉｎ−Ｇｕｙ−ＧＬｕ−５ｅｒ−＾ｇｎ−に１ｎ−Ｇｌｕ−＾ｒｇ −ＧＬｙ（ＶＨ）　Ｃｙｓ−＾ｍｎ−ＧＬｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｃ１ｙ−＾１ａ −Ａｒｇ−＾１ａ−Ａｒｇ−Ｌａｕ−ＮＨ２Ｃ７ｇ２９＋３０−４１＋Ｌｙｍ” Ｎ１（２：（ＶＺＩ　Ｚ　）Ｃｙｓ　−Ｇ　ｉｎ　−Ｇｌｎ−Ｇ　ｌｙ−Ｃ１ｕ −Ａｒｇ　−Ａｓｎ−Ｇｉｎ−ＧＬｕ−Ｇｉｎ−Ｃｒｙ−＾１ａ−Ａｒ■|Ｖａ ｌ− Ａｔｇ　−Ｌ７ｇ　−Ｎ１（ｚ　。

これらのペプチドはすべて５０ｍＭリン酸緩衝食塩溶液（ｐＨ７，２，ＰＢＳ） 中に溶解し、上述のランダムゲルタールアルデヒド法を用いて、等重量ベースで 、キーホールリンペットヘモシアニ：／　（ＫＬＨ，Ｓｉｇｍａ’、　Ｐｏｏｌ ｅ。

Ｅｎｇｌａｎｄ　）に接合した。このプレバレージョンは、フロイント完全アジ ュバントに乳化し、ヒツジ（Ｓｏｕｔｈ　ＤｏｗｎｘＫｅｎｔ）に、各腹側部そ れぞれの２部位に１ｍｌずつ皮下投与した。総初期用量はペプチド約５００μｇ ／匹とした。ＫＬＨのみの陰性対照群を含めて、各処置群は５匹とした。さらに 類似の免疫処置を、初期投与後２８および７０日に実施した。これらは、それぞ れペプチド約５０および５μｇとした。

すべての動物について、頚静脈静脈穿刺によって、日−５，＋１４．　＋２７． 　＋３５．　＋４２．　＋５６．　＋６３、＋７０．＋８４．　＋９１３および ＋１１２（最初の免疫処置の日に対して）に、血清“Ｍｏｎｏｖｅｔｔｅ”チュ ーブに血液サンプルを採取した。さらに、以後の抗体の製造のために、適当な時 期に２００ｍ１までの大量サンプルを採取した。全サンプルから血清を分離し、 抗−（ヒト）ＧＲＦ−抗体の存在を上述のように競合的ラジオイムノアッセイで 試験するまで一２０℃に保存した。

結果 すべてのヒツジが、免疫処置実験を通して生存した。

表には、少なくとも２つの試験採血で陽性抗体反応を生じた動物数を掲げた。

ペプチド　陽性反応％ ペプチドＶｌｌｌはヒトＧＲＦ配列からかなりかけ離れていて、むしろヒツジ／ ウシ／ブタのＧＲＦ配列によく類似している。ドツト−プロット（Ｈａｒｌｏｗ 　＆　Ｌａｎｅ。

１９８８）分析により、この抗原に対する抗体は６０％の動物に生成していて、 ヒツジおよび他のＧＲＦを認識するらしいことが明らかになった。

結論 ＧＲＦ配列からのある範囲のペプチドに対して抗体が励起され、これらは、それ が誘導された完全分子および／または元の免疫原を認識する。

２、抗血清のｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ＧＲＦ−増強活性ヒツジ脳下垂体を用いたほか はＭａｃｈｉｉｎ　ｅｔ　ａｌ　（１９７４）の記載に基づく、ｉｎ　ｖｉｔｒ ｏシステムを使用し、ヒツジ抗血清の異型の存在下または非存在下での、ＧＲＦ の作用を調へた。試験メジウム中のＧＨは、標準を適当なｉｎ　ｖｉｔｒｏメジ ウムに溶解させ、担体／二重抗体系に代えて抗−モルモット″５ａｔ−ｅｅｌ　 ’　（ＷｅｌｌｃｏｍｅＤｉａｇｎｏｓｔｌｉｃｓ）を使用したほかは、Ｈａｒ ｔ　ｅｔ　ａｔ　（１９７５）の方法によって検定した。

１ｏ００μｓ／ｍｌおよびそれ未満のｈｐＧＲＦを適宜含有する（または含まな い）抗血清（５μｍ）を、コンフルーエンドな下垂体細胞と、ウシ胎児血清を省 いた新鮮なメジウム１ｍｌを含むウェルに四重に添加した。４時間、３７°Ｃに 置いたのち、メジウムを除去し、次のＧＨ検定まで一２０°Ｃで凍結した。

で検出されたＧＨの量を示す。この値は、μｇＧＨ／ｍ１１５ｈｒメジウム士標 準偏差で表す。

ヒツジ抗血清　抗血清に添加したＧＲＦＩ〜４４（μｇ／ｍ１）０　１．０　１ ０．０　１００．０　１０００．０ｈｐＧＲＦ１〜２９ ０■：オバルブミン、Ｇニゲルタールアルデヒド結論 これらの結果は、ＧＲＦ分子の領域３０〜４４への抗体がｉｎ　ｖｉｔｒｏでそ の活性を増強できること、一方、領域１〜２９に対して励起された抗体は、添加 したＧＲＦの活性を低下させることを示している。これらのデータが示す増強は 約７〜１０倍である。

３、抗血清からの抗体の精製 一部のヒツジを用いて大量の採血実験で得られた血清を精製して、主要な抗体分 画を得、以後のｉｎ　ｖｉｖｏ実験に使用できた。これは、Ｈａｒｌｏｗ　＆　 Ｌａｎｅの記載に基づくもので、２段階の硫酸アンモニウム分画化で半精製分画 を得て、これを５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６，５）に対して透析し、ついて ＤＥＡＥマトリックスを用いてバッチ精製を行った。最終製品を再検定し、防腐 剤を加えないで、−２０°Ｃて凍結して保存した。

４、抗−ＧＲＦ抗体のｉｎ　ｖｉｖｏ　Ｇ　ＲＦ−増強活性平均体重４８ｋｇの ヒツジ（未経産スコツトランド雑種雌ヒツジ）１５匹に、−側性の頚動脈および 頚静脈内カテーテルを設置し、２４時間後に最初の実験を実施した。

動物は、２週間、体重の３．５％の、１６％粗蛋白、完全、ペレット化飼料で飼 育してきた。実験のサンプリング相の１８時間前およびその相の間は、絶食させ た。

３種の基本処置の各ヒツジにおける処置の順序は、ラテン方路法の基準デザイン によった。３種の処置は次の通りである。

（１）ＧＲＦ（ヒト１〜４４アミド、ＣａｍｂｒｉｄｇｅＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　）単独、Ｉμｇ／ｋｇ（２）抗体のみ（ＧＲＦ用量の 約１０倍過剰に相当）（３）抗体（上述のように１０倍過剰）と室温で静かに１ 時間混合して予め複合体化したＧＲＦ　１μｇ／ｋｇＧＲＦ配列１〜４４．３１ 〜４４または３５〜４４に対する３種の抗血清からの抗体を、試験に用いたヒツ ジに無作為に割り付け、各群５匹とした。

血液サンプルは、頚動脈カテーテルから「時間０」にＧＲＦおよび／または抗血 清プレバレージョンを投与（および注入）する前に、１ｏ分間隔で頚静脈カテー テルから採取した。さらに、６個の静脈血サンプルを、５分間隔で（ｔ＋３０分 まで）、１０分間隔でｔ＋６０分まで、および最後に８個のサンプルを、３０分 間隔で（ｔ＋２４０分まで）採取した。静脈血５ｍｌをヘパリン加チューブに取 る前に、最初の２ｍｌは捨てた。サンプルを遠心分離し、血漿を分けて、ラジオ イムノアッセイ（Ｈａｒｔ　ｅｔ　ａｌ　１９７５）による成長ホルモンレベル の検定まで一２０°Ｃて保存した。このデザインの処置は７および１４日後に完 了した。

統計処理 各ＧＲＦレベルの平均は、各時点て計算し、分散分析およびＦ−保護を一検定で 分析した。各曲線（またはその部分）下の面積は、シンプソンの定積分の公式を 用いて計算し、これらは同様に比較した（ＳＡＳ、１９８５）。

結果 ＧＲＦ　１〜４４．３１〜４４および３５〜４４に対して励起された抗体プレバ レージョンそれぞれの各処置群の平均応答を図１〜３にそれぞれ示す。明瞭にす るため、統計的パラメーターは省略した。

ＧＲＦは、投与数分内に応答し、試験期間内にほぼ正常レベルに復するＧＨ応答 曲線を与えることがわかる。

ＧＲＦ　１〜４４抗体は、複合体プレバレージョンにおけるこの応答を消失させ 、単独で投与したときは、ＧＨ放出の主期間を伴わなかった。これとは著しく異 なり、ＧＲＦと配列３１〜４４または３５〜４４に対する抗体との複合体は、常 にＧＲＦ単独の場合より高い血漿ＧＨレベルを与える。さらに、これらのＧＨレ ベルの上昇期間も、図３におけるように、約９０〜２１０分間維持された。

抗−ＧＲＦ応答の発現は、免疫処置動物についての滴定曲線により図４に示す。

図５には、これらの活性パターンを各試験動物に由来する図１〜３の曲線上面積 の平均としてまとめた。この図はまた、ＧＲＦ３５〜４４に対する抗体がＧＨの パルスを引き起こす固有の能力をもちことを際立たせている。

図６は、処置後最初の６０分間の活性を強調したものであり、１〜４４および３ １〜４４抗血清間の平均血漿ＧＨレベルの有意な差、ならびに３１〜４４および ３５〜４４に対する抗体との複合ＧＲＦの類似の、同じく著しく統計的に存意な （ｐ＜０．０１）増強効果を示している。

総括 ＧＲＦ配列の領域１〜４４に対する抗体はＧＲＦの作用を阻害するようであるが 、これに反し驚くべきことに、ＧＲＦ分子の残基３１および４４の間の領域に対 して励起された抗体は、ＧＲＦの生物活性を阻害しないばかりでなく、内因性起 源または外因性投与にかかわらず、ＧＲＦの成長ホルモン放出能を上昇させるた めに使用することができる。持続性放出デバイス等における使用または付加的Ｇ ＲＦもしくはＧＨ遺伝子を発現するトランスジェニック動物における使用も包含 される。

付録１ アミノ酸　三文字記号　単一文字記号 アラニン　Ａｌａ　Ａ アルギニン　Ａｒｇ　Ｒ アスパラギン　Ａｓｎ　Ｎ アスパラギン酸　Ａｓｐ　Ｄ システィン　Ｃｙｓ　Ｃ グルタミン　Ｇｉｎ　Ｑ グルタミン酸　Ｇｌｕ　Ｅ グリシン　Ｇｌｙ　Ｇ ヒスチジン　Ｈｉｓ　Ｈ メチオニン　Ｍｅｔ　Ｍ フェニルアラニン　Ｐｈｅ　Ｆ トリプトファン　Ｔｈｐ　Ｗ チロシン　ｔｙｒ　Ｙ バリン　Ｖａｌ　Ｖ 引用文献 Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ、　Ｊ、Ｄ、、　Ｅｓｂｅｎｓｈａｄｅ、　Ｋ、Ｌ、、　Ｃ ｏｆｆｒｅｙ、　Ｍ、Ｔ、。

Ｈｅｉｍｅｒ、Ｅ、、Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｒ，、Ｍｏｗｌｅｓ、　Ｔ、　ａｎｄ 　Ｆｅ１ｉｘ。

Ａ、　（１９８９）、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｉｎ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｒ ｅｇｕｌａｔｉｏｎ。

Ｅｄｉｔｏｒｓ、Ｒ，Ｂ、　Ｈｅａｐ、Ｃ，Ｇ、Ｐｒｏｓｓｅｒ　ａｎｄ　Ｇ、 Ｅ。

ＬＬａｍｍｌｎ、　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｂｙ　Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ　＆　 Ｃｏ、、　Ｌｔｄ。

Ａｓｔｏｎ、Ｒ，、Ｃｏｏｐｅｒ、　Ｌ、、　Ｈｏ１ｄｅｒ、　Ａ、Ｔ、、Ｉｖ ａｎｙｉ、Ｊ。

ａｎｄ　Ｐｒｅｅｃｅ、　Ｍ、Ａ、（１９８５）　Ｍｏ１ｅｃ、［ｍｍｕｎｏｌ 、　旦２７１−２７５Ｃｈａｒｄ、　Ｔ、（１９８７）、　Ａｎ　Ｉｎｔｒｏｄ ｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｒａｄｉｏ−ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａ ｔｅｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、３ｒｄ　Ｅｄｉｔｏｎ。

Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ。

Ｅｎｒｉｇｈｔ、　Ｗｊ、、　Ｃｈａｐｉｎ、　Ｌ、Ｔ、、　Ｍｏ５ｅｌｅｙ、 　Ｗ、Ｍ、、　Ｚｉｎｎ。

Ｓ、Ａ、、ａｎｄ　Ｔｕｃｋｅｒ、Ｈ，Ａ１１ｅｎ（１９８６）。

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｄａｉｒｙ　５ｃｉｅｎｃｅ　６９　：３４４−３５１ ゜Ｆｅ１ｉｘ、Ａ、Ｍ、、Ｉ（ｅｉｍｅｒ、　Ｅ、Ｐ、、　ａｎｄ　Ｍｏｗｌｅ ｓ、　Ｔ、Ｆ、。

（１９８５）。

Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　ｉｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ　２０：　１８５−１９２゜Ｇｕｉｌｌｅｍｉｎ、　Ｒ，、Ｂｒａｚｅａｕ、 　Ｐ、、　Ｂｏｈｌｅｎ、　Ｐ、、　Ｅｓｃｈ、　Ｆ、。

Ｌｉｎｇ、　Ｎ、、　ａｎｄ　Ｗｅｈｒｅｎｂｅｒｇ、　Ｗ、Ｂ、　（１９８２ ）。

Ｈａｒｌｏｗ、Ｅ、ａｎｄ　Ｌａｎｅ、Ｄ、（１９８８）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ ｓ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｂｙ　Ｃｏ１ ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

Ｈａｒｔ、［、Ｃ，、Ｆｌｕｘ、Ｄ、Ｓ、、Ａｎｄｒｅｗｓ、Ｐ、、ａｎｄ　Ａ 、Ｓ。

ＭｃＮｅｉｌｌｙ　（１９７５）。

Ｈｏｒｍｏｎｅ　ａｎｄ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　７　（１） ：３５−４０゜Ｈａｒｔ、［、Ｃ，、Ｊａｍｅｓ、Ｓ、、Ｐｅｒｒｙ、Ｂ、Ｎ、 、ａｎｄ　Ｓｉｍｍｏｎｄｓ。

Ａ、Ｄ、（１９８４）、９ Ｌａｎｃｅ、Ｖ、Ａ、、Ｍｕｒｐｈｙ、Ｗ、Ａ、、５ｕｅｉｒａｓ−Ｄｉａｘ、 Ｊ、、ａｎｄＣｏｙ、Ｄ、Ｈ，（１９８４）。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ 　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ１１９　（１）：２６５−２７２゜ Ｌｅｒｎｅｒ、Ｒ，Ａ、、Ｇｒｅｅｎ、Ｎ、、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ、Ｈ，、Ｌｉ ｕ、Ｆ−Ｔ、。

５ｕｔｃｌｉｆｆｅ、Ｊ、Ｇ、、ａｎｄ　５ｈｉｎｎｉｃｋ　（１９８１）、Ｔ 、Ｍ、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７８　：３４０３−３４０７゜Ｍａｃｈ ｌｉｎ、Ｌｊ、、Ｊａｃｏｂｓ、Ｌ、Ｓ、、Ｃ１ｒｕｌｉｓ、Ｎ、、Ｋｉｍｅｓ 。

Ｒ，、ａｎｄ　Ｍｉｌｌｅｒ、Ｒ，（１９７４）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ 　９５　：１３５０−１３５７゜ Ｍａｒｇｌｉｎ　ａｎｄ　Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９７０）、Ａｎｎ、Ｒｅｖ 、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

３９　８４１−８６６　ａｔ　８６２゜Ｍｏ５ｅｌｅｙ、　Ｗ、Ｍ、、　Ｈｕｉ ｓｍａｎ、　Ｊ、、　ａｎｄ　Ｗｅｅｒｄｅｎ、　Ｅ、Ｊ。

Ｒｅｙｎｏｌｄｓ、Ｃ，Ｍ、ＩＪ、、Ｂｕｔｔｅｒｙ、Ｐ、Ｊ、、Ｈａｙｎｅｓ 、　Ｎ、Ｂ、、　ａｎｄＨｕｓｋｉｓｓｏｎ、Ｎ、（１９８９）、Ｂｉｏｔｅｃ ｈｎｏｌｏｇｙ　ｉｎ　ＧｒｏｗｔｈＲｅｇｕｌａｔｉｏｎ、Ｅｄｉｔｏｒｓ、 Ｒ，Ｂ、Ｈｅａｐ、Ｃ，Ｇ、Ｐｒｏｓｓｅｒ　ａｎｄＧ、Ｅ、ＬＬａｍｍｌｎ、 Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｂｙ　Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ　＆　Ｃｏ、Ｌｔｄ。

Ｒｉｖｉｅｒ、Ｊ、、５ｐｉｅｓｓ、Ｊ、、Ｔｈｏｒｎｅｒ、Ｍ、、ａｎｄ　Ｖ ａｌｅ。

Ｗ、（１９８２）。

Ｎａｔｕｒｅ、Ｌｏｎｄｏｎ　３００：２７６−２７８゜５ＡＳ（１９８５）Ｓ ＡＳ　Ｕｓｅｒ’ｓ　Ｇｕｉｄｅ：５ｔａｔｉｓｔｉｃｓ、Ｖｅｒｓｉｏｎ　５ ゜Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｂｙ　ＳＡＳ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　Ｉｎｃ、、Ｃａｒ ｙ、　Ｎ、Ｃ，、Ｕ、Ｓ、Ａ。

Ｓｔｅｗａｒｔ　ｅｔ　ａｌ　（１９６９）、Ｉｎ：　５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ 　ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｂｙ　Ｗ、Ｈ，Ｆ ｒｅｅｍａｎ、５ａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ。

ＲＩＡによる血漿成長ホルモン（ｎｇｓ／ｍＤ〜 ＲＩＡＩ’：よる血漿成長ホルモン（ｎｇｓ／ｍＤＲＩＡＩ’：よる血漿成長ホ ルモン（ｎｇｓ／ｍｌ）　（ＪＪ総活性に対′１６％とじての結合　、ト平均面 １ｔＧ、Ｈ，ｎｇｓ／ｍＬ　Ｇ）手続補正書（睦） 平成４年２月１０日

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．脊椎動物成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）の位置２８〜４４の領域の天然も しくは合成フラグメント、それらの抗原的にもしくは免疫原的に均等なペプチド 、またはそれらの塩からなるペプチド。
2. ２．成長ホルモン放出因子の位置２８〜４４をまたぐ領域におけるアミノ酸残基 配列、それらと抗原的にもしくは免疫原的に均等なペプチド、またはそれらの塩 と一次構造ホモロジーを有する「請求項１」記載のペプチド。
3. ３．ＧＲＦのフラグメント：（ａ）ＧＲＦ３１〜４４、または（ｂ）ＧＲＦ３５ 〜４４に相当し、この場合、ＧＲＦは、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ 、ネコ。 トリまたはサケ起源であるペプチド、それらと抗原的にもしくは免疫原的に均等 なペプチド、またはそれらの塩。
4. ４．「請求項３」記載のペプチドと一次構造ホモロジーを有するペプチドまたは その塩。
5. ５．さらに、接合の増強および／または促進、および／または潜在的免疫原性の 改善を可能にする付加的残基を有する「請求項１〜４」のいずれかに記載のペプ チド。
6. ６．付加的残基は、末端システイン残基である「請求項５」記載のペプチド。
7. ７．抗原に接合している「請求項１〜６」のいずれかに記載のペプチド。
8. ８．（ａ）それ自体、（ｂ）「請求項１〜７」のいずれかに記載の他のペプチド （ｃ）Ｔ細胞エピトープ、または（ｄ）ソマトスタチンもしくは成長ホルモン分 子またはそれらの部分に接合している「請求項１〜７」のいずれかに記載のペプ チド。
9. ９．「請求項１〜６」のいずれかに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチ ド配列。
10. １０．「請求項１〜９」のいずれかに記載のペプチドと、アジュバントおよび担 体機能を与える手段からなる医薬用抗原性組成物。
11. １１．ペプチドは担体に連結している「請求項８」記載の組成物。
12. １２．担体に連結しているまたは連結していないペプチドが抗原と混合されてい る「請求項１０または１１」記載の組成物。
13. １３．微生物によってコードされる蛋白費に融合している「請求項１〜１２」の いずれかに記載のペプチド。
14. １４．ＧＲＦ配列の２８〜４４からなる領域のＧＲＦ配列、それらと抗原的にも しくは免疫原的に均等なペプチド、またはそれらの塩に対する抗−ＧＲＦ抗体。
15. １５．ＧＲＦ３１〜４４またはＧＲＦ３５〜４４のフラグメント、それらと抗原 的にもしくは免疫原的に均等なペプチド、またはそれらの塩に対する抗−ＧＲＦ 抗体。
16. １６．ＧＲＦまたは「請求項１〜４」に記載のＧＲＦフラグメントと複合体を形 成した「請求項１４または１５」記載の抗−ＧＲＦ抗体。
17. １７．脊椎動物に「請求項１０〜１６」のいずれかに記載の組成物を投与するこ とからなる脊椎動物の生物学的特性を変化させる方法。
18. １８．体形成、乳汁産生または屠体組成を向上させる「請求項１７」記載の方法 。
19. １９．「請求項１４〜１６」のいずれかに記載の抗体を含有する脊椎動物。
20. ２０．「請求項１７または１８」記載の方法で生物学的特性を変化させた脊椎動 物。
21. ２１．脊椎動物成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）の位置２８〜４４からなる領域 の天然または合成フラグメントからなるペプチド、それらと抗原的にもしくは免 疫原的に均等なペプチド、またはそれらの塩を製造するにあたり、反応試剤（Ｉ ） Ｙ１−ＯＨ（Ｉ） （式中、Ｙ１は上記ペプチドの相当するＮ末端部分ラジカル配列と同じ部分ラジ カル配列である）を、試剤（ＩＩ）Ｈ−Ｙ２（ＩＩ） （式中、Ｙ２は上述のペプチド生成物の残部と同一で、そのＣ末端部分ラジカル 配列を包含する）を、試剤（Ｉ）および（ＩＩ）の必要な位置を所望により適宜 保護および／または活性化して反応させ、ついで生成物を適宜脱保護し、次に生 成物を適宜、遊離のペプチドまたはその塩に変換する上記ペプチドの製造方法。
22. ２２．脊椎動物成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）の位置２８〜４４からなる領域 の天然または合成フラグメントからなるペプチド、それらと抗原的にもしくは免 疫原的に均等なペプチド、またはそれらの塩を製造するにあたり、（ｉ）上記ペ プチドをコードする遺伝子が導入され、宿主細胞におけるそのペプチドの発現を 可能にするベクターで宿主細胞を形質転換し、（ｉｉ）形質転換宿主細胞をその ペプチドが発現されるように培養し、ついで（ｉｉｉ）そのペプチドを回収する 、各工程からなる上記ペプチドの製造方法。