PL163277B1 - Method of obtaining peptides - Google Patents

Abstract

Sposób wytwarzania peptydów zawierajacych naturalny lub syntetyczny fragment czyn- nika uwalniajacego horm on wzrostu (G R F) kregowców z regionu obejmujacego reszty ami- nokwasowe 28 - 44 lub peptydów równowaznych antygenicznie lub immunologicznie, a takze soli tych peptydów, znamienny tym, ze zwiazek o ogólnym wzorze Y1-O H , w którym Y1 oznacza ugrupowanie identyczne z czesciowa N-terminalna sekwencja tych peptydów, poddaje sie reakcji ze zwiazkiem o ogólnym wzorze H -Y2, w którym Y2 oznacza pozostala czesc wyzej zdefiniowa- nych peptydów i obejmuje ugrupowanie stanowiace ich czesciowa C-terminalna sekwencje, przy czym reagenty o wzorach Y1-OH i H-Y2 ewentualnie zabezpiecza sie i/lub aktywuje, po czym ewentualnie z produktu usuwa sie grupy zabezpieczajace i przeprowadza sie go w wolny peptyd lub w jego sól. U rzad Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania peptydów aktywnych biologicznie.

Wicie hormonów peptydowych, takich jak hormony wzrostu, ma duże znaczenie w medycynie oraz w hodowli zwierząt. Hormony wzrostu występują u wszystkich zwierząt kręgowych. Wiadomo, że zwiększają one wzrost (somatogenezę) oraz produkcję mleka (laktogenezę).

Kontrola poziomu i uwalniania hormonu wzrostu (GH) zależy od innych hormonów lub „czynników, które mogą zwiększać lub obniżać wydzielanie hormonu wzrostu w organizmach kręgowców. Uwalnianie hormonu wzrostu jest zależne od wpływu peptydu uwalniającego hormon wzrostu, znanego jako „czynnik uwalniający hormon wzrostu (GRF), „hormon uwalniający hormon wzrostu (GHRH) lub somatokrynina.

W publikacjach prac własnych prowadzonych w Salk Institute(Rivier i wsp., 1982, Guillemin i wsp., 1982) opisany jest peptyd uwalniający hormon wzrostu z ludzkiego nowotworu trzustki zawierający do 44 aminokwasów. Uwalnia on selektywnie hormony wzrostu w dawkach fizjologicznych. Okazało się, że jest on identyczny z hormonem uwalniającym hormon wzrostu wytwarzanym normalnie w podwzgórzu i wykazującym aktywność na czynniki wzrostowe w przysadce. Przypuszcza się, że równowaga poziomu somatostatyny (czynnika hamującego somatotropinę) i GRF ma bezpośredni wpływ na przysadkę, dając u ssaków charakterystyczny profil uwalniania GH.

Dotychczas zostały opisane sekwencje aminokwasowe GRF z wielu gatunków (Felix i wsp., 1985). Są to peptydy złożone z 44 aminokwasów, przy czym region najbardziej konserwatywny znajduje się w resztach od 1 do 27, a obszar największych zmian występuje na resztach 31 - 44. Wykryto znaczną aktywność między gatunkową całej sekwencji, na przykład hpGRF-44 wykazuje dobrą odpowiedź immunologiczną u kozła (Hart i wsp., 1984). Stwierdzono również, że najważniejszy dla aktywności całej cząstki jest region od 1 do 27 reszty aminokwasowej i że wiele analogów z modyfikacjami w tym regionie wykazuje lepszą aktywność w próbach na gatunkach modelowych (Lance i wsp., 1984). Podobnie jak u ludzi, podanie bydłu hpGRF może zwiększyć produkcję mleka (Enright i wsp., 1986) oraz zwiększać retencję azotu (Moseley i wsp., 1987) na drodze uwalniania GH.

Sekwencje charakterystyczne dla gatunków (według Felix'a i wsp., 1985): Sekwencje wspólne 1 - 27: YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIN. Reszty 28 - 44 ludzkiego GRF: SRQQGESNQERGARARL-NH2; Reszty 28 - 44 świńskiego GRF: SRQQGERNQEQGARVRL-NH2; Reszty 28 - 44 bydlęcego GRF: NRQQGERNQEAGAKVRL-NH2; Reszty 28 - 44 koziego GRF: NRQQGERBQEQGAKVRL-NH2; Reszty 28 - 34 owczego GRF: NRQQGERNQEQGAKVRL-NH2.

163 277 3

Powyżej podane sekwencje aminokwasowe przedstawione są z użyciem standartowych jednoliterowych oznaczeń aminokwasów podanych w tabeli 4.

Naukowcy donoszą, że na aktywność hormonów mogą wywierać wpływ przeciwciała przeciw tym hormonom. W europejskim zgłoszeniu patentowym nr 137 234 podano, że przeciwciała przeciw hormonowi wzrostu wyizolowane i podane zwierzętom powodowały wzrost aktywności hormonu. Przeciwciała takie można również wytwarzać in situ poprzez szczepienie zwierzęcia będącego gospodarzem odpowiednimi fragmentami danego hormonu w sposób podany w europejskich zgłoszeniach patentowych nr 284 406 i 303 488.

Jednakże Armstrong i wsp. (1989) donoszą, że immunizacja przeciw całej cząsteczce GRF hamuje aktywność hormonu. Ponadto Reynolds i wsp. (1989) wykazali, że immunizacja przeciw niektórym fragmentom czynnika uwalniającego kortykotropinę (CRF) znosi jego aktywność, czego dowodem jest mniejsze stężenie glukokortykoidów w krwioobiegu.

Obecnie natomiast okazało się, że u kręgowców można zwiększać aktywność GRF przez podawanie im szczególnego fragmentu GRF, powodującego wytwarzanie przeciwciał przeciw natywnemu GRF. Przypuszcza się, że takie zwiększenie aktywności GRF będzie stymulowało wzrost, wytwarzanie tkanki mięsnej o polepszonej jakości, produkcję mleka i będzie wywoływało inne biologiczne efekty GH u kręgowców. Należy rozumieć, że termin „fragment*¹ nie dotyczy całej cząsteczki GRF.

Opracowano więc sposób wytwarzania peptydów zawierających odpowiedni fragment GRF.

Sposób wytwarzania peptydów zawierających naturalny lub syntetyczny fragment czynnika uwalniającego hormon wzrostu (GRF) kręgowców z regionu obejmującego reszty aminokwasowe 28 - 44 lub peptydów równoważnych antygenicznie lub immunologicznie, a także soli tych peptydów polega na tym, że związek o ogólnym wzorze Y¹-OH, w którym Y¹ oznacza ugrupowanie identyczne z częściową N-terminalną sekwencją tych peptydów, poddaje się reakcji ze związkiem o ogólnym wzorze H-Y², w którym Y² oznacza pozostałą część wyżej zdefiniowanych peptydów i obejmuje ugrupowanie stanowiące ich częściową C-terminalną sekwencję, przy czym reagenty o wzorach Y¹-OH i H-y2 ewentualnie zabezpiecza się i/lub aktywuje, po czym ewentualnie z produktu usuwa się grupy zabezpieczające i przeprowadza się go w wolny peptyd lub w jego sól.

Peptydy można wytwarzać zgodnie z metodą Stewarta i wsp. (1989) lub metodami opisanymi przez Marglin'a i Merrfield'a (1979) i w późniejszych publikacjach.

Przykładowo peptydy i ich sole można wytworzyć przez sekwencyjne sprzęganie odpowiednich aminokwasów stosując albo klasyczne metody syntezy peptydów albo procedury w fazie stałej. Peptydy można również wytwarzać na drodze syntezy podjednostek peptydowych i następnego ich sprzęgania. Reakcje te prowadzi się np. aktywując grupy karboksylowe aminokwasów biorących udział w reakcji i zabezpieczając niereagujące grupy aminowe i karboksylowe. Szczegółowe dane dotyczące grup aktywujących i zabezpieczających (maskujących) i odpowiednich warunków reakcji (zarówno reakcji sprzęgania jak i usuwania grup zabezpieczających) dających minimum racemizacji są podane w wyżej cytowanej literaturze.

Peptydy wytwarzane sposobem według wynalazku umożliwiają potęgowanie (zwiększanie lub wzmaganie) aktywności czynnika uwalniającego hormon wzrostu z kręgowców przez podawanie tym kręgowcom fragmentu łańcucha aminokwasowego wykazującego pierwszorzędową homologię strukturalną z regionem od 28 do 44 reszty aminokwasowej GRF// lub z jego częścią lub peptydów albo cząsteczek równoważnych pod względem antygenowym lub immunogenicznym albo soli tych związków. Termin „potęgowanie oznacza, że fragment działa bezpośrednio lub pośrednio w kierunku zwiększenia lub wzmożenia aktywności hormonu.

W hpGRF region od 31 do 44 aminokwasu zawiera: Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-GluArg-Gly-AIa-Arg-Ala-Arg-Leu.

Przez peptydy wykazujące „pierwszorzędową homologię strukturalną rozumie się peptydy będące dokładnymi duplikatami odpowiednich regionów cząsteczek GRF z innych gatunków oraz inne peptydy, które posiadają „konserwatywne podstawienia jednego lub większej liczby aminokwasów, wykazujące właściwości wytwarz.ania przeciwciał o niezmienionych zasadniczo właściwościach. Termin „podstawienie konserwatywne oznacza podstawienie funkcyjne tak, jak w poprzednim zdaniu. Jako przykłady podstawień, które mogą być konserwatywne w tym znaczeniu, można podać podstawienia o zasadniczo takiej samej hydrofobowości, rozmiarach, ładunku i/lub

163 277 zawartości reszt aromatycznych jak w reszcie oryginalnego aminokwasu. Wszystkie te podstawienia i modyfikacje są ogólnie znane w chemii peptydów. Do takich podstawień należą na przykład: prolina zamiast glicyny i odwrotnie; alanina lub walina zamiast glicyny i odwrotnie, izoleucyna zamiast leucyny lub metioniny i odwrotnie, histydyna zamiast lizyny i odwrotnie, seryna zamiast asparyginy i odwrotnie, treonina zamiast cysteiny i odwrotnie, seryna lub alanina zamiast treoniny i odwrotnie, glutamina zamiast asparaginy i odwrotnie.

Termin „równoważnik antygenowy oznacza peptyd lub jego równoważnik specyficznie rozpoznawany przez przeciwciała, które powstając w odpowiedzi na peptydy wytwarzane według wynalazku lub części tych peptydów będą działać w kierunku potęgowania aktywności biologicznej czynnika uwalniającego hormon wzrostu u tego samego lub podobnego kręgowca.

Termin „równoważny immunogenicznie oznacza, że dany peptyd w odpowiedniej formie leku może być użyty do wytworzenia przeciwciał u kręgowca, przy czym te przeciwciała działają w kierunku potęgowania aktywności czynnika uwalniającego GH u tego kręgowca.

W szczególności antygenowo lub immunogenicznie równoważne peptydy są nieco krótsze lub dłuższe od wspomnianego regionu albo zasadniczo pokrywające się z tym regionem. Są to zwłaszcza antygenicznie równoważne peptydy o łańcuchu krótszym od omawianego fragmentu. Odchylenia od sekwencji własnego GRF danego zwierzęcia mogą dawać większą odpowiedź immunologiczną przy jednoczesnym zachowaniu zdolności wytwarzania przeciwciał rozpoznających własny GRF lub docelowy GRF (na przykład wprowadzony z zewnątrz przez implantację). Może być zatem korzystne podawanie małego peptydu pochodzącego ze zwierzęcia należącego do innego gatunku niż ten, do którego należy zwierzę, któremu podaje się ten peptyd (np. podanie owczego peptydu świni) lub łączenie nienaturalnych lub niekonserwatywnych podstawników aminokwasowych w podawanym peptydzie.

Ponadto użyteczne są peptydy, w których przedlub po syntezie tego peptydu została chemicznie zmodyfikowana jedna lub większa liczba reszt aminokwasowych, pod warunkiem, że funkcja tego peptydu, to znaczy wytwarzanie specyficznych przeciwciał in vivo pozostała zasadniczo niezmieniona. Do takich modyfikacji zalicza się tworzenie soli z kwasami lub z zasadami, zwłaszcza z kwasami lub zasadami organicznymi lub nieorganicznymi dopuszczalnymi fizjologicznie, tworzenie estru lub amidu w reakcji z końcową grupą karboksylową, jak również przyłączanie grupy zabezpieczającej grupę aminową, takiej jak grupa N-butoksykarbonylowa. Modyfikacje te mogą chronić peptyd przed zmetabolizowaniem in vivi. Peptydy te można podawać w formie pojedynczych kopii lub peptydów wielokrotnych, na przykład tendemowo powtarzających się jednostek, takich jak (31-44) + (31-44) albo (31-44) + (44-31).

Takie układy tendemowe lub wielokrotne mogą być wystarczająco antygenowe, aby nie wymagać użycia nośnika.

Może okazać się korzystne przygotowanie peptydu w formie pętli, z połączonymi ze sobą aminokwasami N-terminalnymi i C-terminalnymi lub też dodanie jednej lub więcej reszt cysternowych do końca łańcucha w celu zwiększenia antygeniczności i/lub wytworzenie mostków dwusiarczkowych. Jeśli peptyd jest kowalencyjnie związany z nośnikiem, korzystnie z polipeptydem, to korzystne jest aby peptyd wytwarzany sposobem według wynalazku występował w formie pętli. Dogodnie, peptydy poddaje się amidowaniu przy reszcie C-terminalnej a do końca N-terminalnego przyłącza się dodatkowy aminokwas, np. cysteinę w celu ułatwienia konjugacji lub dla polepszenia potencjalnej immunogeniczności.

Można wytwarzać kompozycję antygenową zawierającą jeden lub więcej peptydów wytwarzanych sposobem według wynalazku w połączeniu z nośnikiem i adjuwantami.

Według ostatnich teorii immunologicznych, w każdym preparacie immunologicznym powinien być obecny nośnik w celu stymulowania lub wzmagania stymulacji układu immunologicznego. Przypuszcza się, że nośniki wcielają (lub łącznie z antygenem tworzą) epitopy komórek pomocniczych T. Peptydy wytwarzane sposobem według wynalazku można asocjować, np, przez sieciowanie, z odpowiednim nośnikiem, takim jak albuminy surowicy, mioglobiny, toksoidy bakteryjne i hemocyjanina pijawki.

Do opracowanych ostatnio nośników indukujących komórki pomocnicze T w reakcji odpowiedzi immunologicznej zalicza się antygen rdzeniowy wirusa zapalenia wątroby typu B (zwany

163 277 również białkiem nukleopaksydowym), przypuszczalne epitopy komórek T, takie jak Thr-Ala-SerGly-Val-Ala-Glu-Thr-Thr-Asn-Cys, /3-galaktozydaza oraz peptyd 163-171 z interleukiny-1. Ten ostatni związek można zmiennie traktować jako nośnik lub jako adjuwant lub może on pełnić obie te funkcje. Alternatywnie, można wzajemnie sieciować kilka kopii tego samego lub różnych peptydów wytwarzanych sposobem według wynalazku. W tym przypadku nie wprowadza się osobnego nośnika, bowiem funkcję nośnika pełni samo usieciowanie peptydu. Jako środki sieciujące stosuje się odczynniki zamieszczone w katalogu Sigma and Pierce, np. aidehyd glutarowy, karodwuimid i4-/N-maleimidometylo/cykłoheksano-karboksylan-l sukcynimidylu, przy tym ten. ostatni odczynnik wykorzystuje grupę -SH w C-terminalnej reszcie cysteinowej (o ile taka występuje).

Sieciowanie lub sprzęganie z użyciem MBS (m-maleimidobenzoilo-N-hydroksy-sukcynimid) lub aldehydu glutarowego stosuje się w stosunku do poiipeptydu, np. w przypadku sieciowania samych polipeptydów, łączenia z epitopem komórek T lub najdogodniej, z hemocyjaniną pijawki.

Odpowiednie adjuwanty są znane w dziedzinie szczepionek. Przykładami są tu: kompletny i niekompletny adjuwent Freunda, wodorotlenek glinowy, saponiny, dekstran-DEAE, dwupeptydy muramylowe, oleje mineralne, oleje obojętne (takie jak olej „miglyor), oleje roślinne (takie jak olej arachidowy), odczynniki „Isconis, lipozomy, lipozomy o nazwie handlowej „Movasomes“ lub podobne, poliole „Pluronic lub układ adjuwantowy „Ribi“ (patrz np. brytyjskie zgłoszenie patentowe nr 2 189 141). „Pluronic“ jest zarejestrowaną nazwą handlową.

Peptydy wytwarzane sposobem według wynalazku można łączyć z innymi antygenami uzyskując podwójny efekt. Przykładowo, można je łączyć z częścią lub z całą cząsteczką somatostatyny, dla wytworzenia, poza przeciwciałami przeciw GRF, również przeciwciał somatostatycznie, które będą wzmagać wzrost, albo można je łączyć z częścią lub z całą cząsteczką hormonu płciowego, wywołując jednoczesną kastrację, albo z częścią lub z całą cząsteczką hormonu uwalniającego hormon luteinizujący (LHRH) albo można je wiązać z. częścią lub z całą cząsteczką hormonu wzrostu, zwiększając przez to jednocześnie działanie hormonu wzrostu albo łączyć z innymi hormonami peptydowymi biorącyrni udział w procesach wzrostu i modulowania składu tkanki mięsnej.

Peptydy, adjuwanty i/lub nośniki można przygotowywać w formie preparatów dowolnym sposobem uznanym przez specjalistę, z zastosowaniem znanych i jeszcze nie odkrytych nośników podawania i kryteriów. Preparaty te można zwłaszcza sporządzać w oparciu o biodegradujące się polimery, takie jak kopolimery laktydowo-glikolidowe, np. ujawnione w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 58481 (ICI). Peptydy wytwarzane sposobem według wynalazku (związane lub niezwiązane z innym antygenem) można podawać łącznie z innymi procedurami immunizacji (np. przeciw infekcjom bakteryjnym, wirusowym lub robaczycowym) zwiększając aktywność innych peptydów.

Peptydy wytwarzane sposobem według wynalazku można podawać normalnym lub nienormalnym kręgowcom w celu zmiany właściwości biologicznych tych kręgowców, a zwłaszcza właściwości biologicznych związanych z aktywnością hormonu wzrostu (GH). Przykładowo, wzrost tych kręgowców można zwiększać lub wzmagać powyżej przeciętnego poziomu lub można zwiększać szybkość wzrostu lub przyspieszać nienormalnie powolny wzrost, uzyskując normalny wzrost. Podobnie, można zwiększać lub wzmagać produkcję mleka oraz inne biologiczne skutki aktywności GH, takie jak skład tkanki mięsnej. Tym sposobem można przykładowo zwiększać retencję azotu i proporcję mięsa chudego do tłuszczu, termin „kręgowce obejmuje ludzi i zwierzęta.

Małe peptydy i kompozycje antygenowe sporządzane z użyciem peptydów wytwarzanych sposobem według wynalazku podaje się zazwyczaj dożylnie, podskórnie lub domięśniowe, jakkolwiek w przypadku niektórych form dogodne jest podanie drogą doriosową, transdermalną, doustną lub rektalną. Antygen może być również podany w postaci białka fuzyjnego wydzielanego przez zmodyfikowaną genetycznie bakterię, drożdże lub wirusa replikującego się w organizmie gospodarza-kręgowca. Do tego celu można użyć nośnik bakteryjny i znane techniki, na przykład można zastosować podwójny mutant aro bakterii Salmonella (międzynarodowe zgłoszenie paten towe PCT GB88) 01 143 opublikowane pod nr WO 89 (05856).

163 277

Preparat jest sterylny, a jeśli jest przeznaczony do podawania pozajelitowego, to jest również apirogenny. Dawka jednostkowa wynosi 1 - 1000/ug małego peptydu, na ogół 10 - 500/zg, a korzystnie około 50//g lub mniej. Może być korzystne przeprowadzenie jednej lub kilku powtarzających się immunizacji, co jest sprawą znaną dla immunologów. Preparaty mogą być w zasadzie przygotowane i podawane przez lekarza lub weterynarza, zgodnie z jego wiedzą i doświadczeniem.

Wynalazek opisano bardziej szczegółowo poniżej powołując się na rysunki, na których: figura 1 przedstawia osłabioną odpowiedź na GRF u owiec immunizowanych antysurowicą przeciw GRF 1-14; fig. 2 - wzmożoną odpowiedź na GRF u owiec immunizowanych antysurowicą przeciw GRF 31 -44; fig. 3 - wzmożoną odpowiedź na GRF u owiec immunizowanych antysurowicą przeciw GRF 35-44; fig. 4 - krzywe miareczkowania obrazujące powstawanie odpowiedzi na anty-GRF u immunizowanych zwierząt; fig. 5 sumarycznie działanie przeciwciał na GRF 1-14,31-44 lub 35-44 na odpowiedź biologiczną owiec na GRF w okresie czterech godzin; fig. 6 - działanie przeciwciał na GRF 1-14, 31-44 i 35-44 w okresie pierwszych 60 minut.

Metody ogólne.

1. Wytwarzanie peptydów . O ile nie wskazano inaczej, wszystkie peptydy syntetyzuje się techniką Fmoc-poliamid w fazie stałej.

Czasowe zabezpieczenie grupy A-aminowej uzyskuje się przez podstawienie grupy 9fluorenylometyloksykarbonylowej F9moc). Powtarzalne rozszczepienie tej wysoce wrażliwej na zasady grupy ochronnej prowadzi się przy użyciu 20% piperydyny w N,N-dwumetyloformamidzie.

Grupy funkcyjne łańcuchów bocznych zabezpiecza się w formie eterów butylowych (w przypadku seryny, treoniny i tyrozyny) estrów butylowych (w przypadku kwasu glutaminowego i asparaginowego), pochodnych butyloksykarbonylowych (w przypadku lizyny i histydyny), pochodnych trójfenylometylowych (w przypadku cysteiny) i pochodnych 4-metoksy-2,3,6-trójmetylobenzenosulfonylowych (w przypadku argininy). W przypadku gdy reszty C-terminalne stanowią glutamina lub asparagina, do ochrony amidowych grup funkcyjnych łańcuchów bocznych stosuje się grupę 4,4'-dwumetoksybenzhydrylową.

Nośnikowa faza stała ma budowę opartą na polimerze polidwumetyloakryloamidowym złożonym z trzech monomerów dwumetyloakryloamidowych (monomer podstawowy), bis-akryloiloetylenodwuaminy (środek sieciujący) i estru metylowego akryloilosarkozyny (środek wprowadzający grupy funkcyjne). Jako rozszczepiany środek wiążący peptyd z żywicą stosuje się wrażliwą na kwas pochodną kwasu 4-hydroksymetylofenoksyoctowego.

Wszystkie pochodne aminokwasowe stosuje się w formie ich symetrycznych bezwodników z wyjątkiem asparaginy i glutaminy, które dodaje się do reakcji prowadzonej metodą odwróconego sprzęgania z użyciem odczynnika dwucykloheksylokarbodwuimid/l-hydroksybenzotriazol.

Wszystkie reakcje sprzęgania i usuwania grup ochronnych monitoruje się wykonując próby analityczne: ninhydrynową, z kwasem trójnitrobenzenosulfonowym lub izotynową.

Po zakończeniu syntezy peptydy odszczepia się z żywicy z jednoczesnym usunięciem grup blokujących łańcuchy boczne przez działanie 95% kwasem trójfluorooctowym z dodatkiem 5% środka wiążącego. Jako środki wiążące powszechnie stosuje się etanoditiol, fenol, anizol i wodę, przy czym wybór odpowiedniego środka zależy od składu aminokwasowego syntetyzowanego peptydu. Kwas trójfluorooctowy usuwa się przez odparowanie pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość rozciera się z eterem etylowym uzyskując surowy peptyd. Środki wiążące usuwa się przez ekstrakcję. Po liofilizacji fazy wodnej uzyskuje się surowy peptyd wolny od środka wiążącego.

Surowy peptyd oczyszcza się metodami chromatograficznymi, takimi jak chromatografia z rozdziałem według wielkości cząstek, chromatografia jonowymienna, chromatografia powinowactwa (np. z użyciem przeciwciał monoklonalnych) lub wysokosprawna chromatografia cieczowa z odwróconymi fazami, ewentualnie łącząc takie metody. Analizę peptydów prowadzi się steczową z odwróconymi fazami, analizę aminokwasów po hydrolizie kwasowej lub metodą spektroskopii masowej FAB.

163 277

Ί

2. Sprzęganie peptydów. (a). Sprzęganie z albuminą jaja. Ilość 3,0 mg peptydu rozpuszcza się w 300/L/1 dwumetyloformamidu, do roztworu dodaje się 150//1 roztworu (10 mg/ml) albuminy jaja w solance buforowanej fosforanem. Dulbecco (PBS) i całość dokładnie się miesza. Do tej mieszaniny dodaje się powoli, podczas mieszania w ciągu 10 minut 250//1 świeżo sporządzonego 0,04 M roztworu aldehydu glutarowego i pozostawia się w temperaturze pokojowej na dalsze 60 minut przy ciągłym mieszaniu (mieszanie w aparacie SPIRAMIX, Danley Instruments).

Do mieszaniny dodaje się 1,0 ml PBS i następnie 100μ1 0,04 M roztworu aldehydu glutarowego, jak poprzednio. Mieszaninę pozostawia się na 60 minut w temperaturze pokojowej, po czym dializuje przez dobę w temperaturze + 4°C wobec PBS. (b) Sprzęganie z homocyjaniną pijawki (KLH). Sprzęganie 5 mg peptydu z hemocyjaniną pijawki prowadzi się metodą z zastosowaniem m-meleimidobenzoilo-N-hydroksysukcynimidu (MBS), opisaną przez Lernera R. A. i wsp. (1981) w aparaturze dostarczonej przez Pierce Warriner Ltd, Chester, Wielka Brytania, albo metodą losową z użyciem aldehydu glutarowego. w tej drugiej metodzie postępuje się następująco: ilość 5 mg peptydu hpGRF rozpuszcza się w 250 μ1 PBS (Dulbecco) i miesza z 500 //1K LH (10 mg/ml) w PBS. Do tej mieszaniny wkrapla się 500//10,04 M aldehydu glutarowego (Sigma) podczas mieszania. Całość miesza się w temperaturze pokojowej w ciągu 60 minut, po czym dodaje się następną porcję 1,5 ml PBS, a następnie 500//1 0,04 M aldehydu glutarowego jak poprzednio i mieszaninę miesza się przez 30 minut. Mieszaninę reakcyjną dializuje się przez błonę dializacyjną Spectropor o zdolności rozdzielczej 1 kDa, przez dobę wobec 100 objętości PBS.

3. Sieciowanie. Ilość 1,4 mg peptydu rozpuszcza się w 140//1 dwumetyloformamidu i dodaje się 1Ί0μ1 aldehydu glutarowego (0,04 M) jak poprzednio. Jeśli nie jest wymagane sieciowanie ani sprzęganie, wówczas peptyd rozpuszcza się w dwumetyloformamidzie, dysperguje w PBS ale nie dializuje.

4. Preparaty z adjuwantem Freunda i ich stosowanie. Po dializie, doprowadza się powyższe preparaty do objętości 4,5 ml roztworem PBS i sporządza się emulsje „woda w oleju stosując dwie objętości kompletnego adjuwanta Freunda (Difco lub Sigma, FCA). Prowadzi się to przez działanie ultradźwiękami w niskiej temperaturze lub w homogenizatorze Potter-Elvehjen. Emulsje testuje się obserwując dyspersję (lub jej brak) na powierzchni wody.

Owcom rasy Cheviot w wieku 9-12 miesięcy, samcom, kastratom o wadze 30-35 kg podaje się podskórnie przez iniekcję w dwóch miejscach (z każdego boku) po 1 ml preparatu. Drugą podobną immunizację prowadzi się po28-42 dniach stosując świeżo przygotowany peptyd, sprzężony w taki sam sposób ale zemulgowany z niekompletnym adjuwantem Freunda (FIA, Difco lub Sigma). Wszystkie następne immunizację prowadzi się w odstępach 28 dniowych w podobny sposób. Myszy otrzymują po 0,1 ml tych preparatów dootrzewnowo w podobnych odstępach czasu.

5. Preparaty z innymi adjuwantami i ich podawanie.

DEAE-dekstran (moczony przez noc w wodzie podwójnie destylowanej, Pharmacia), Saponinę (Sigma) i wodorotlenek glinowy (,,Al-hydrogel“) stosuje się pojedynczo i w mieszaninach. Do próbek po dializie dodaje się po 3,1 ml PBS i Ί ml 5% DEAE-dekstranu (Dd) oraz 2,8 ml saponiny (5 mg/ml) albo 5,9 ml PBS plus Ί ml 5% Dd albo 10,1 ml PBS plus 2,8 ml saponiny (5 mg/ml). Wodorotlenek glinowy („ALOH) stosuje się w końcowym stężeniu 1,0 mg/ml. Nie jest wymagane emulgowanie ale należy, zwracać uwagę aby zawiesina składników pozostawała homogeniczna. Ilości po 1 ml sporządzonych preparatów podaje się owcom jak poprzednio. Immunizację prowadzi się w tych samych odstępach czasu.

6. Próbki krwi (owce). Przez nakłucie żyły szyjnej pobiera się od testowanych owiec próbki krwi po 10 ml tuż przed pierwszym podaniem preparatu i w odstępach czasu po podaniu. Po wytworzeniu się skrzepów w temperaturze pokojowej (po około 3-5 godzinach) oddziela się surowicę przez wirowanie i przeznacza do radioimmunologicznej próby wykrywania przeciwciał. Pobiera się również większe próbki krwi, około 150 - 200 ml i uzyskaną z nich w ten sam sposób surowicę przechowuje się w stanie zamrożonym, w temperaturze -20°C do następnego frakcjonowania frakcji IgG do użycia w próbach biologicznych.

Próbki krwi (myszy). Małe próbki krwi (0,25-0,5 ml) pobiera się z żyły zaoczodołowej albo przez sekcję żyły ogonowej i poddaje obróbce w taki sam sposób jak próbki krwi owcy. Nie pobiera się większych próbek.

163 277

7. Próba radioimmunologiczna. O ile w opisie nie podano inaczej przeciwciała przeciw peptydom, które mogą się również wiązać z czynnikiem uwalniającym hormon wzrostu, oznacza się metodą bezpośredniego wiązania w fazie ciekłej opisaną przez Astona i wsp., (1985) i Charda (1987).

Przykład I. Wytwarzanie antysurowicy.

Ia. Immunizacja myszy i owiec na hpGRF 31-44 i wykrywanie przeciwciał przeciw pgGRF.

W zestawie Cambridge Research Biochemicals, Cambridge, Wielka Brytania, prowadzi się syntezę następującej sekwencji:

35 40 44

Cys-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2 i oczyszcza się ją metodą HPLC, uzyskując peptyd o czystości ponad 80%.

Należy zauważyć, że peptyd ten jest zamidowany w pozycji 44, a w pozycji 30 dodana jest reszta cysternowa dla ułatwienia sprzęgania z MBS (patrz poniżej) lub dla zwiększenia potencjalnej immunogenności.

Ilość 5 mg peptydu sprzęga się z hemocyjaniną pijawki metodą z użyciem m-maleimidobenzoilo-N-hydroksy-sukcynimidu i metodą losową z aldehydem glutarowym. Obydwie mieszaniny doprowadza się do objętości 5 ml i dodaje się do nich 10 ml kompletnego adjuwanta Freunda (FCA-Sigma). Całość chłodzi się do temperatury 0°C i emulguje ultradźwiękami stosując wstępnie oziębioną sondę.

Powyższe preparaty stosuje się do immunizycji dwu grup myszy i owiec. Owce otrzymują po 1 ml preparatu w dwu podskórnych iniekcjach z boków, czyli całkowitą dawkę peptydu wynoszącą 667 pg/owcę. Każdy preparat podaje się pięciu kastrowanym baranom w wieku 18 miesięcy, rasy North Cheviot. Każdy preparat podaje się także sześciu myszom Balb/C, przy czym każda mysz otrzymuje 100pg peptydu w FCA, dootrzewnowo.

Po 4 tygodniach od zwierząt pobiera się próbki krwi i natychmiast podaje się im podobną dawkę wzmacniającą, podobną do opisanej powyżej, z tym, że całkowite obciążenie peptydem zostaje zmniejszone do połowy a emulsje przygotowuje się z użyciem niekompletnego adjuwanta Freunda (FIA-Sigma).

Po 15 dniach od wszystkich zwierząt pobiera się próbki krwi, a od owiec jeszcze po tygodniu. Wszystkie zwierzęta otrzymują następną dawkę wzmacniającą w niekompletnym adj u wancie Freunda po 28 dniach od pierwszej dawki wzmacniającej.

Surowice uzyskane z pobranych próbek krwi testuje się na obecność przeciwciał anty-GRF kompentycyjną metodą radioimmunologiczną stosując amid 3-/²⁵J/jjodotyrozylo¹⁰ czynnika uwalniającego hormon wzrostu 1-44 (Amersham, Bucks, Wielka Brytania) oraz anty-mysie i anty-owcze przeciwciała Sac-Cel (Immunodiagnostics Ltd).

Jako pozytywną kontrolę w tym układzie stosuje się przeciwciała anty-GRF królika (Metachem Diagnostics Ltd, Northampton, Wielka Brytania) z anty-króliczym odczynnikiem Sac-Cel. Pobiera się próbki krwi owiec z przeznaczeniem do przygotowania preparatu IgG i do następnej analizy własności.

Wyniki przedstawiono w tabeli 1. Podano w niej procent zwierząt, które przeżyły dając dodatnią odpowiedź na przeciwciała z co najmniej dwu prób krwi.

Tabela 1

Metoda sprzęgania	Myszy Bdlb/C (procent zwierząt które pizezyły)	Owce Cheviot (piocent zwierząt które przeżyty)
MBS	33%	40%
	/6/6/	/5/5/
Aldehyd glutarowy	40%	60%
	/5/6/	/5/5/

163 277

Ib. Immunizacja owiec na szereg sekwencji aminokwasowych będących pochodnymi GRF.

Następujące sekwencje syntetyzuje się w zestawie Cambridge Research Biochemicals, Cambridge i oczyszcza się metodą HPLC, uzyskując peptydy o czystości ponad 80%.

Cys°+l-14;

(I) Cys-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu 15-27 + Cys^M;

(II) Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Cys-Cys21 + 22-35;

(III) Cys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn Cys30 + 31-44NH2;

(IV) Cys-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NHg;

Cys³⁰ + 31-39;

(V) Cys-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly 31-39;

(VI) Gln-Gly-GIu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly Cys³⁴ + 35-44NH₂;

(VII) Cys-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NFb Cys²⁹ + 30-43 = Ly^NHa;

(VIII) Cys-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-G-n-Gly-Ala-Arg-VaI-Arg-Lys-NH2.

Wszystkie te peptydy rozpuszcza się w solance buforowanej 50 mM fosforanu (pH = 7,2 PBS) i poddaje się sprzęganiu na zasadzie równej wagi z hemocyjaniną pijawki (KLH, Sigma, Poole, W. Brytania) opisaną powyżej metodą z aldehydem glutarowym. Preparaty emulguje się z kompletnym adjuwantem Freunda i podskórnie podaje owcom rasy South Down x Kent, dzieląc 1 ml i podając przez iniekcję z obydwu boków każdej owcy. Całkowita dawka początkowa wynosi 500/7g peptydu na owcę. Każdy peptyd podaje się 5 owcom, włączając w to grupę kontroli negatywnej, której podaje się jedynie KLH. Po dawce inicjującej prowadzi się następne podobne immunizacje w 28 i 70 dniu. Preparaty zawierają odpowiednio 50pg i 5pg peptydu na owcę.

Od wszystkich zwierząt pobiera się próbki krwi do probówek surowiczych „Monovette“, nakłuwając żyłę szyjną w -5, + 14, + 27, + 35, + 42, + 56, + 63, + 70, + 84, + 98 i + 112 dniu w stosunku do pierwszej immunizacji. Ponadto, w odpowiednich momentach pobiera się większe próbki krwi, do 200 ml, potrzebne do przygotowania przeciwciał. Ze wszystkich próbek zbiera się surowiec i przechowuje się je w temperaturze -20°C, po czym analizuje je na obecność przeciwciał przeciw ludzkiemu GRF opisaną powyżej kompetycyjną metodą radioimmunologiczną. Wszystkie zwierzęta przeżyły immunizację. W tabeli 2 podano ilość zwierząt, u których powstała pozytywna odpowiedź w postaci produkcji przeciwciał w co najmniej dwu próbkach krwi.

Tabela 2

Peptyd	Procent zwierząt z pozytywną odpowiedzią immunologiczną
	I	40
	II	20
	III	40
	IV	60
	V	40
	VI	20
	VII	60
	VIII	0
Kontrola negatywna	0

Peptyd VIII jest znacznym odchyleniem od sekwencji ludzkiego GRF i bardziej przypomina sekwencje GRF owcy, bydlęcą lub świńską. Analiza metodą hybrydyzacji (,,dot-blot“) Harlow i Lane (1988) ujawnia, że przeciwciała na ten antygen powstają u 60% zwierząt i mogłyby prawdopodobnie rozpoznawać GRF owcy i innych gatunków.

Wnioski: W stosunku do szeregu peptydów pochodzących z sekwencji GRF mogą powstawać przeciwciała, które mogą rozpoznawać negatywną cząsteczkę od której pochodzą i/lub oryginalny immunogen.

163 277

Przykład II. Aktywność potęgująca GRF w antysurowicach in vitro. Stosując system in vitro oparty na systemie opisanym przez Machlin'a i wsp. (1974) ale stosując przysadki owiec śledzi się działanie GRF z i bez różnych typów antysurowicy owcy. GH w podłożu testowym analizuje się metodą Harta i wsp. (1975) z tym, że standardy rozpuszcza się w pożywce odpowiedniej dla układu in vitro i zamiast opisanego układu: nośnik-podwójne przeciwciało stosuje się odczynnik przeciwśwince morskiej „Sac-cel“ (Wellcome Diagnostics).

Antysurowice (5μ1) zawierające hpGRF w stężeniu 1000pg ml i mniejszym, gdy jest to wskazane, dodaje się do zestawów po 4 wgłębienia zawierających połączone roztwory komórek przysadki i 1 ml świeżej pożywki, do której nie dodano płodowej surowicy bydlęcej. Po 4 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C usuwa się pożywkę i zamraża się ją w temperaturze -20°C z przeznaczeniem do dalszych oznaczeń GH. Wyniki przedstawiono w tabeli 3. Podano w niej ilości wykrytego GH w pożywkach in vitro metodą radioimmunologiczną. Wyrażone są one w ilości pg GH/ml/5 godzin z odchyleniami standardowymi.

Tabela 3

Anlvsurowica owcy w stosunku do hpGRF 129 sprzężony z albuminą jaja metodą z aldehydem glutarowym	GRF 1-44 dodany (pg/ml) w antysurowicy
0 1,0	1,0 1,0	10,0 1,0	100,0 14,9 ±11,0	1000,0 25.6 ±9,4
Nośnik sieciowany z albuminą jaja	1,0	30,2	61,7	82,9	103,4
metodą z aldehydem glutarowym		±7,9	±8,6	±16	±11,1
hpGRF Cys + 30-44-NH2Sprzężonnzalbuminąjaja	10	63,1	79,2	101,3	99,7
metodą MBS		±9.1	±10,9	±10,1	±14,3

Wnioski: Powyższe wyniki wskazują, że przeciwciała w stosunku do regionu 30-44 cząsteczki GRF mogą wzmagać aktywność GRF in vitro, podczas gdy przeciwciała w stosunku do regionu 1-29 obniżają aktywność dodanego GRF. Dane wykazują około 7 do 10-krotny wzrost aktywności GRF.

Przykład III. Oczyszczanie przeciwciał z anty-surowicy.

Surowicę uzyskaną z dużych próbek krwi pobranych od niektórych owiec oczyszcza się otrzymując pierwszą frakcję przeciwciał, która może być użyta do następnych prób in vitro, opartych na próbach opisanych przez Harlowa i Lane (1988). Po dwustopniowym frakcjonowaniu siarczanem amonowym uzyskuje się półczystą frakcję, którą dializuje się wobec 5mM fosforanu sodowego (pH = 6,5), po czym oczyszcza się na aktywność i przechowuje w stanie zamrożonym w temperaturze -20°C w PBS bez środków konserwujących.

Przykład IV. Aktywność potęgowania działania GRF przeciwciał anty-GRF w próbach in vivo.

Piętnastu owcom (niepokrytym samicom rasy Scottish) o średniej wadze 48 kg zakłada się jednostronne katetery z połączeniem z tętnicą i żyłą szyjną na 24 godziny przed pierwszym doświadczeniem. Owce przystosowuje się przez dwa tygodnie do tabletkowanego pokarmu o zawartości 16% nieoczyszczonego białka podawanego w ilości 3,5% wagi ciała. Na 18 godzin przed i podczas pobierania próbek krwi nie podaje się jedzenia.

W podstawowym założeniu, każdą owcę traktuje się metodą kwadratu łacińskiego, stosując trzy podstawowa iniekcje: (1) sam GRF (amid ludzkiego RGF 1-44, Cambridge Research Biochemicals) w ilości 1 /rg/kg; (2) tylko przeciwciała (równoważne około 10-krotnemu nadmiarowi w stosunku do dawki GRF!, (3) GRF w dawce 1 pg/kg uprzednio skompleksowany z przeciwciałami (w 10-ktotnym nadmiarze, jak powyżej) przez łagodne mieszanie przez godzinę w temperaturze pokojowej. Stosuje się przeciwciała z trzech różnych anty-surowic skierowanych przeciw sekwencjom 1-14, 31-44 i 35-44 GRF, które losowo podano testowanym owcom, po 5 zwierząt w grupie.

Przez kateter żylny pobiera się próbki krwi w odstępach dziesięciominutowych przed podaniem (i w czasie podania) preparatów GRF i/lub anty-surowicy przez kateter tętniczy w czasie „0“. Sześć następnych próbek krwi żylnej pobiera się w odstępach 5-minutowych (do t + 30 minut), w odstępach 10-minutowvch (do t + 60 minut) i w końcu 8 próbek w odstępach 30-minutowych (do

163 277 czasu t + 240 minut). Przed pobraniem 5 ml próbek krwi żylnej do heparynizowanych probówek odrzuca się początkowo 2 ml. Próbki wiruje się, oddziela się plazmę i przechowuje ją w temperaturze -20°C do czasu analizy metodą radioimmunologiczną na poziom hormonu wzrostu (Hart i wsp. 1975). Następne traktowanie zwierząt według schematu prowadzi się po 7 i 14 dniach.

Analiza statystyczna: Średnią z poszczególnych poziomów G H wylicza się dla każdego punktu czasowego i analizuje stosując analizę wariancyjną i test t-Studenta z F-blokadą. Pole powierzchni pod każdą krzywą wylicza się stosując regułę całkowania Simpsona i porównuje się otrzymane wartości (SAS, 1985).

Wyniki: Uśrednione odpowiedzi w każdej traktowanej grupie, dla każdego podanego preparatu przeciwciała wytworzonego w odpowiedzi na sekwencje 1-14, 31-44 i 35-44 są przedstawione odpowiednio na fig. 1-3. Dla jasności pominięto parametry statystyczne.

Jest widoczne, że GRF daje krzywą odpowiedzi w poziomie GH w czasie kilku minut po podaniu, po czym poziom GH powraca do poziomu bliskiego poziomu kontrolnego w czasie trwania testu. Przeciwciała przeciw sekwencji 1-14 GRF znoszą tą odpowiedź w kompleksowych preparatach i okazuje się, że nie są związane ze zwiększonym wydzielaniem GH jeśli są podane same. Odwrotnie, kompleks GRF i przeciwciał przeciw sekwencjom 31-44 lub 35-44 daje znacznie podwyższony poziom GH w plazmie w stosunku do samego GRF. Dodatkowo, czas utrzymywania się tych podwyższonych poziomów GH również się znacznie przedłuża, co jest widoczne na fig. 3 aż do 90-210 minut.

Rozwijanie się odpowiedzi przeciw-GRF jest przedstawione na krzywych miareczkowania (fig. 4) immunizowanych zwierząt. Na fig. 5 podsumowane są powyższe wykresy aktywności w postaci średnich pól powierzchni pod krzywymi na fig. 1-3, wyliczone dla każdego testowanego zwierzęcia. Ta figura uwypukla zdolność przeciwciał przeciw sekwencji 35-44 GRF do naturalnego uwalniania GH. Na fig. 6 przedstawiona jest aktywność podczas pierwszych 60 minut po traktowaniu z uwdocznieniem znamiennej różnicy (p<0,01) średnich poziomów GH w plazmie między antysurowicami przeciw sekwencjom 1-14 i 31-44, jak również podobne wzmocnienie działania GRF w postaci kompleksu z przeciwciałami przeciw sekwencjom 31-44 i 35-44, które jest również wysoce statystycznie znamienne (p <0,01).

Tabela 4

Aminokwas .	Symbole aminokwasów
Symbol tr	zyliterowy	Symbol jednoliterowy
Alanina	Ala		A
Arginina	Arg		R
Asparagina	Asn		N
Kwas asparaginowy	Asp		D
Cysteina	Cys		C
Glutamina	Gin		Q
Kwas glutaminowy	Glu		E
Glicyna	Gly		G
Histydyna	His		H
Izoleucyna	Ile		I
Leucyna	Leu		L
Lizyna	Lys		K
Metionina	Met		M
Fenyloalanina	Phe		F
Prolina	Pro		P
Seryna	Ser		S
Treonina	Thr		T
Tryptofan	Trp		W
Tyrozyna	Tyr		Y
Walina	Val		V

163 277

Wnioski końcowe. Przeciwciała przeciw regionowi 1-14 sekwencji GRFhamują działanie GRF, natomiast nieoczekiwanie przeciwciała przeciw regionom cząsteczki GRF pomiędzy resztami 31 a 44 nie tylko nie hamują tej aktywności ale zwiększają biologiczną aktywność GRF. Przeciwciała te mogą być użyte do zwiększania zdolności uwalniania hormonu wzrostu przez GRF zarówno ze źródeł endogennych lub przez podanie z zewnątrz, w tym przez stosowanie form o przedłużonym działaniu i podobnych albo hodując transgeniczne zwierzęta, w których zachodzi ekspresja genów GRF lub GH.

Literatura Armstrong J. D., Esbenshade K. L., Coffrey Μ. T., Heimer E., Campbell R., MowlesT. i Felix A (1989): Biotechnology in Growth Regulation, pod red. R. B. Heap, C. G. Prosser i G. E. Lamming, Butterworth and Co Ltd.

Aston R., Cooper L., Holder A. T , Ivanyi J. i Preece M. A. (1985): Molec. Immunol. 22, 271-275.

Chard T. (1987), An Intruduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, Wydanie 3, Elsevier, Ansterdam.

Enright W.J., Chapin L. T., Moseley W. M., Zinn S A. i Tucker H. Allen (1986), Journal of Dairy Science 69, 344-351.

Felix A. M., Heimer E P., i Mowles T. F. (1985) Annual Reports im Medicinal Chemistry 20, 185-192.

Guillemin R., Brazeau P., Bohlen P., Esch F., Ling N. i Wehrenberg W. B. (1982): Science 218, 585-587.

Harlow E. i Lane D. (1988): Antibodies: A. Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, New York.

Hart I. C., Flux D. S., Andrews P i A. S. Mc Neilly (1975): Hormone and Metabolic Research 7 (1), 35-40.

Hart I. C., Jamex S., Perry B. N. i Simmonds A. D. (1984): Journal of Endocrinology 103, 173-178.

Lance V. A., Murphy W. A., Sueiras-Diaz J i Coy D. H. (1984) Biochemical and Biophysical Research Communication 119 (1), 265-272. '

Lerner R. A., Green N., Ale.xander H., Liu F-T., Sutcliffe J. G. i Shinnick T. M. (1981): Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78 3403-3407. Machlin L J , Jacobs L. S., Cirulis N , Kimes R., i Miller R. (1974): Endocrinology 95, 1350-1357.

Marglin i Merrifield (1970). Ann. Rev. Biochem., 39 841-866, 862

Moseley W M , Huisman J. i Wcerden E. J. (1987) Domestic Animal Endocrinology 4 (I), 51-59.

Reynolds C. Μ. M., Butlery P. J., Haynes N. B., i Huskisson N.,(1989): Biotechnology in Growth Regulation, pod red. R. B. Heap, C G Prosser i G. E. Lamming, Butterworth and Co Ltd.

Rivier J., Spiess J., Thorner M. i Vale W. (1982) Naturę, London 300, 276-278.

SAS (1985) SAS User's Guide: Statistics, wersja 5, SAS Institute Inc., Cary, N. C., USA.

Stewart et al (1969): Solid Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman, San Francisco.

F/g. 6

Fig. 5

Fig.l·

Fig. 3

Fig. 2

Fig..

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena ^{10 000} zł

Claims (1)

1. Zastrzeżenie patentowe

   Sposób wytwarzania peptydów zawierających naturalny lub syntetyczny fragment czynnika uwalniającego hormon wzrostu (GRF) kręgowców z regionu obejmującego reszty aminokwasowe 28 - 44 lub peptydów równoważnych antygenicznie lub immunologicznie, a także soli tych peptydów, znamienny tym, że związek o ogólnym wzorze Y¹-OH, w którym Y¹ oznacza ugrupowanie identyczne z częściową N-terminalną sekwencją tych peptydów, poddaje się reakcji ze związkiem o ogólnym wzorze H-Y2, w którym Y² oznacza pozostałą część wyżej zdefiniowanych peptydów i obejmuje ugrupowanie stanowiące ich częściową C-terminalną sekwencję, przy czym reagenty o wzorach Yi-OH i H-Y2 ewentualnie zabezpiecza się i/lub aktywuje, po czym ewentualnie z produktu usuwa się grupy zabezpieczające i przeprowadza się go w wolny peptyd lub w jego sól.