JPH05500455A - Ｂ群連鎖球菌用複合ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称： Ｂ群連鎖球菌用慢合ワクチン 発明の分野： 本発明は微生物学およびワクチン技術の分野に関連し、Ｂ群連鎖球菌による感染 に対する免疫を付与し得るワクチンの開発に関する。

発明の背景・ 連鎖球菌（ストレプトコッカス）属の細菌はヒトおよび動物の疾患の原因物であ ると考えられてきた。連鎖球菌は、その細胞表面上の特異的炭水化物抗原の存在 に基づいて、免疫学的な群に分類されている。現在、Ａ群から０群まで認識され ている（Ｄａｉｖｓ、　Ｂ、　Ｄ、等、“Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ”＋第３版 、６０９頁、　（Ｈａｒｐｅｒ　＆　Ｒｏｗ、　１９８０））　。連鎖球菌（よ ヒトの疾患を引き起こす最も一般的で最も重要な細菌の１種である。

Ｂ群の連鎖球菌は動物の疾患（例えばフンの乳腺炎）を伴うが、ストレプトコッ カス・アガラクチ、（Ｂ群連鎖球菌の１種）は、米国におけるヒト新生児の敗血 症の最も一般的な原因として問題（こなっており、年間６０００Å以上の死亡を もたらしていると考えられている（Ｈｉｌｌ、　Ｈ，Ｒ，等、５ｅｘｕａｌｌｙ 　Ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ、ＭｃＧｒａｗ　Ｈｉｌｌ。

３９７−４０７頁）。またＢ群連鎖球菌は、乳児の後発発症（ｌａｔｅ−ｏｎｓ ｅｔ）髄膜炎、分娩後の子宮内膜炎、および免疫的に弱体化した成人の感染の重 要な病原体でもある（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ、　Ｍ、　Ｊ、等、Ｂａｃｔ、Ｒｅｖ 、　４０ニア７４−７９２（１９７６））。この生物は抗生物質感受性であるが 、新生児敗血症および乳児髄膜炎の高い攻撃率と迅速な発症が、高い罹患率（５ ０％）と高い死亡率（２０％）をもたらしている（Ｂａｋｅｒ、　Ｃ，Ｊ、等、 　Ｎｅｗ　Ｅｎｇ。

Ｊ、　Ｍｅｄ、　（Ｅｄｉｔｏｒｉａｌ）　３１４（２６）　：１７０２−１７ ０４（１９８６）　；　Ｂａｋｅｒ、　Ｃ，Ｊ、等、Ｊ、１■ ｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、　１３６二１３７−１５２（１９７７））　。

Ｂ群連鎖球菌は、正常なヒトの膣内（ｖａｇｉｎａｌ）および結腸内線菌叢の一 般的な成分である。新生児感染の最も一般的な経路は分娩時膣からの転移増殖で あるが、新生児育児室における病院内感染も記述されている（Ｐａｔｔｅｒｓｏ ｎ、　Ｍ、　Ｊ、等、Ｂａｃｔ、Ｒｅｖ、　４０ニア７４−７９２（１９７６乃 。

しかしながら、Ｂ群連鎖球菌が転移増殖した乳児のうち重度の感染に進行する率 は僅かでしかない。転移増殖から感染への遷移において、宿主の因子と細菌のビ ルレンス（開力）決定要素の両方が果す役割はよく分かっていない。

Ｂ群連鎖球菌のい（っかのタンパク質はビルレンスおよび免疫性に関する役割を 有していると考えられている（Ｆｒｒｉｅｒｉ、　Ｐ、　、　Ｒｅｖ、　Ｉ＋＋ ４ｅｃｔ、Ｄｉｓ、　１０：Ｓ３６３（１９８ｇ））。１９７５年、ランセフイ ールド（Ｌａｎｅｅ４ｉｅｌｄ）は、防御的免疫を引き出すその能力によって、 Ｂ群連鎖球菌のＣタンパク質群を定義した（Ｌａｎｃｅｆｉｅｌｄ、　Ｒ，Ｃ， 、等、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ。

１４２：１６５−１７９（１９７５））。このタンパク質群は幾つかの異なるポ リペプチドおよび抗原決定基を含んでいると考えられている。これらの発見を考 慮して、Ｂ群連鎖球菌による感染を防ぐための努力が、予防的抗生物質の使用と Ｂ群連鎖球菌に対するワクチンの開発に注がれてきた（Ｂａｋｅｒ、　Ｃ，Ｊ等 、Ｒｅｖ、ｏｆｌｎ４ｅｃ、Ｄｉｓ、　７：４５８−４８７（１９８５）、　Ｂ ａｋｅｒ、　Ｃ，Ｊ等、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇ、Ｊ、Ｍｅｄ、（Ｅｄｉｔｏｒｉａｌ ）　３１４（２６）＋１７０２−１７０４　（１９８６乃。Ｂ群連鎖球菌に対す る多糖ワクチンは、カスバー（Ｋａｓｐｅｒ、　Ｄ。

Ｌ、：米国特許第４２０７４１４号および米国再発行特許ＲＥ３１６７２号、並 びに米国特許第４３２４８８７号、同第４３５６２６３号、同第４３６７２２１ 号、同第４３６７２２２号、同第４３６７２２３号）、カル口（Ｃａｒｌｏ、　 Ｄ、　Ｊ、　：米国特許第４４１３０５７号、欧州特許公開番号第３８２６５号 ）、並びにヤボルディオス等（Ｙａｖｏｒｄｉｏｓ、　Ｄ、等：欧州特許公開番 号第７１５１．５号）らによって記述されており、上記の文献はすべて本明細書 の一部を構成する。

Ｂ群連鎖球菌による母系の転移増殖および分娩期の他の危険因子を共に同定し得 る乳児の小さな副集団を除いて、予防的抗生物質の使用は、大多数のケースを防 ぐには実践的あるいは有効ではなかった（Ｂｏｙｅｒ、　Ｋ、　Ｍ、等、　Ｎｅ ｗ　Ｅｎｇ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３１４（２６）　＋　１６６５−１６６９（１ ９８６乃。分娩時の予防的化学療法は次の理由から広範囲には受け入れられなか った　（１）Ｂ群連鎖球菌による母系の転移増殖を、費用効率が高く迅速で信頼 のおける方法で同定することができなかった；　（２）新生児のケースの約４０ ％が危険率の低い状況でおこる。（３）すべての母親または潜在的に危険にさら されている新生児を防御および／または処置することが実践的であるとは考えら れなかった。（４）抗生物質予防療法は後発発症髄膜炎（米国において年間７２ ０ｏ例）または分娩後の子宮内膜炎（年間４５０００例）の予防には適さないと 思われた（Ｂａｋｅｒ、　Ｃ，Ｊ、等、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　 （Ｅｄｉｔｏｒｉａｌ）　３１４：１７０２−１７０４（１９８６））。

微生物の寄託 プラスミドｐＪＭｓ１およびｐ　Ｊ　Ｍ　Ｓ　２３は、本発明に従って使用し得 る抗原性連鎖球菌タンパク質をコードできるＤＮＡを含有しているプラスミドｐ ＵＸ　１２の誘導体である。プラスミドｐＵＸ１２はプラスミドｐＵｃ　ｌ　２ の誘導体である。プラスミドｐＪＭｓ１およびｐＪＭ２２３はアメリカンタイプ カルチャーコレクション（Ｒｏｃｋｖｉｌ　ｌ、　ＭＤ）に１９８９年９月１５ 日に寄託され、それぞれＡＴＣＣ４０６５９およびＡＴＣＣ４０６６０との命名 を受けた。

発明の要約 ストレブトコしカス・アガラクチェは米国における新生児敗血症の最も一般的な 原因であり、年間６０００〜１００００人の死亡の原因となっている。Ｂ群連鎖 球菌の型特異的多糖莢膜は免疫原性であり、重要な防御的抗原を持っているが、 多糖ワクチンの臨床的試験は低い応答率を示している（Ｂａｋｅｒ、　Ｃ，Ｊ、 等、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３１９：１１８０（１９８０）　 ；　Ｉｎ５ｅｌ、Ｒ，＾、１等、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　（Ｅｄ ｉｔｏｒｉａｌ）　３１９（１８）@： １２１９−１２２０（１９８８））。

本発明は、Ｂ群連鎖球菌からクローニングした遺伝子から発現した防御的タンパ ク質抗原を使用する、Ｂ群連鎖球菌（即ちストレプトコッカス・アガラクチェ） に対する複合ワクチン（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　ｖａｃｃｉｎｅ）に関する。この 新規複合ワクチンは、その担体タンパク質のアジュバント（佐剤）作用によって Ｔ細胞依存性の防御を引き出すと共に、クローニングしたＢ群連鎖球菌タンパク 賃上に存在する追加の防御的エピトープを提供するという利点を有している（　 Ｉｎ５ｅ１、　Ｒ，Ａ、等、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　（Ｅｄｉｔ ｏｒｉａｌ）　３１９（１８）　：１２１９−１２２０（１９８ｇ）@； Ｂａｋｅｒ、　Ｃ，Ｊ等、Ｒｅｖ、ｏｆ　Ｉｎｆｅｃ、Ｄｉｓ、７：４５８−４ ６７（１９８５））。

具体的には、本発明は、Ｂ群連鎖球菌による感染に対する宿主免疫を付与し得る 複合ワクチンであって、（ｂ）あるタンパク質：に結合した（ａ）多糖、からな り、その多糖およびタンパク質の両方がＢ群連鎖球菌特有の分子である複合ワク チンを提供する。

また本発明は、Ｂ群連鎖球菌がもたらす感染を防ぐか、もしくはそれを緩和する 方法であって、そのような感染の危険にあると推測される個体に、その感染に対 する宿主免疫を付与し得る混合ワクチンの有効量を投与することからなり、その ワクチンが（ｂ）あるタンパク質：に結合した（ａ）多糖；からなっていて、そ の多糖およびタンパク質の両方がＢ群連鎖球菌特有の分子であるワクチンである 方法に関する。

さらに本発明は、Ｂ群連鎖球菌がもたらす感染を防ぐか、もしくはそれを緩和す る方法であって、妊娠中の女性（雌）に、その女性（雌）の胎児にその感染に対 する免疫を付与し得る複合ワクチンの有効量を投与することからなり、そのワク チンが（ｂ）あるタンパク質；に結合した（ａ）多糖、からなっていて、その多 糖およびタンパク質の両方がＢ群連鎖球菌特有の分子であるワクチンである方法 に関する。

また本発明は、Ｂ群連鎖球菌がもたらす感染を防くか、もしくはそれを緩和する 方法であって、そのような感染の危険にあると思われる個体に、その感染に対す る宿主免疫を付与し得る複合ワクチンに別の個体をさらすことによって引き出さ れた抗血清の有効量を投与することからなり、該ワクチンが（ｂ）あるタンパク 質；に結合した（ａ）多糖：からなっていて、その多糖およびタンパク質の両方 かＢ群連鎖球菌特有の分子であるワクチンである方法に関する。

図の簡単な説明： 図１は、プラスミドｐＵＸ１２を作成するためのｐＵＣ１２の改変を表している 。

図２は、プラスミドｐＵＸ１２の制限地図および転写地図を示している。

図３は、＋１読み枠プラスミドｐＵＸ１２＋１を作成するため（Ａ）、および− １読み枠プラスミドｐＵＸ１２．−１を作成するため（Ｃ）、にｐＵＸ１２に施 した改変を示している。（Ｂ）は、−１読み枠プラスミドを付加的にもたらし得 る構築を示している。

図４は、ＳｌおよびＳ２３に対するウサギの抗血清を使用したマウスの防御研究 の結果を示している。抗Ｓ１抗血清（ｐ＜０．　００２）または抗Ｓ２３抗血清 （ｐ＜ｏ、０２２）を移植したマウスに防御が認められた。使用した試料数のた めに、観測された統計的有意性に関するＳｌおよびＳ２３実験間のこの相違は有 意ではない。

この図では、試験総数あたりのマウス生存数がそれぞれの棒グラフ上に示されて いる。

Ｂ群連鎖球菌に対するワクチンによる母系免疫予防療法は、抗体の分娩期（ｐｅ ｒｉｐａｒｔｕｍ）転移によって、母親およびその若い幼児を感染から防御する ための潜在的方法として提唱されている（Ｂａｋｅｒ。

Ｃ，Ｊ、等、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　（Ｅｄｉｔｏｒｉａｌ）　 ３１４（２６）　：１７０２−１７０４（１９８６）　；　aａ ｋｅｒ、　Ｃ，Ｊ、等、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３１９　Ｊ１８ ０（１９８８）　；　Ｂａｋｅｒ、　Ｃ，Ｊ、　ｉ、　Ｊ、@Ｉｎｆｅｃ ｔ、Ｄｉｓ、７：４５８（１９８５））　。他の被包性細菌によるケースと同様 に、感染に対する感受性は型特異的抗体の欠如に相関している（Ｋａｓｐｅｒ、 　Ｄ。

Ｌ９等、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　７２：２６０−２６９（１９８ ３）、　Ｋａｓｐｅｒ、　Ｄ、　Ｌ、等＋　Ａｎｔ　１ｂｉ盾煤B Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、３５：９Ｏ−１００（１９８５））　。Ｂ群連鎖球菌に対 するオプソニン作用的に活性な型特異的抗莢膜抗体の欠如は、Ｂ群連鎖球菌の転 移増殖に続（疾患の進行にとって危険因子の１つである（Ｋａｓｐｅｒ、　Ｄ、 　Ｌ。

等、　Ｊ、　１ｎｆｅｃ、　Ｄｉｓ、　１５３：４０７−４１５（１９８６）） 。

精製した型特異的莢膜多糖を用いたワクチンの試みがあった。そのようなワクチ ンの製造法と、Ｂ群連鎖球菌に対して免疫化するためのそのようなワクチンの使 用は、カスパー（Ｋａｓｐｅｒ、　Ｄ、　Ｌ、　：米国特許第４２０７４１４号 および米国再発行特許ＲＥ３１６７２号、並びに米国特許番号第４３２４８８７ 号、同第４３５６２６３号、同第４３６７２２１号、同第４３６７２２２号、同 第４３６７２２３号）、カル口（Ｃａｒｌｏ、　Ｄ、　Ｊ、　：米国特許第４４ １３０５７号、欧州特許公開番号第３８２６５号）、並びにヤボルデイオス等（ Ｙａｖｏｒｄｉ。

ｓ、　Ｄ、等：欧州許公開番号第７１５１５号）らによって開示されており、上 記の文献はすべて本明細書の一部を構成する。

Ｂ群連鎖球菌の多糖莢膜はよく特徴づけられており、ビルレンスと免疫性の両方 について役割を果していることが示されているが（Ｋａｓｐｅｒ、　Ｄ、　Ｌ、 　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、　１５３：４０７（１９８６））　、特異的 莢膜型と宿主免疫系の因子の両者に依存して、これらの莢膜成分の免疫原性が多 様であることがわかっている（Ｂａｋｅｒ、　Ｃ，Ｊ、等、Ｒｅｖ、ｏｆ　Ｉｎ ｆｅｃ、Ｄｉｓ、７：４５Ｂ−４６７（１９８５））。最近完結したＢ群連鎖球 菌の莢膜多糖ワクチンを評価するための臨床試験は、全体と（−で６３％の応答 率を示し、そのようなワクチンか最適な免疫原ではなかったことを示した（Ｂａ ｋｅｒ、　Ｃ，Ｊ等、　Ｎｅｖ　Ｅｎｇ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３１９（１８）　 ：１１８ｌｌ８０−１１８５（１９８゜免疫原性の相違は他の細菌の莢膜多糖に も観測され−Ｃいる。例えば、Ｃ型髄膜炎閑莢膜に対するワクチンは高度に活性 であるが、８群髄膜炎菌多糖ワクチンは非免疫原性である（Ｋａｓｐｅｒ、　Ｄ 、　Ｌ、等、　Ｊ、　Ｉｎｆｅａｔ、　Ｄｉｓ、　＋５３：４０７−４１５（１ ，９８６乃。宿主免疫系のＴ細胞非依存性機能は、多糖抗原に対する抗体応答を 起こすためにしばしば必要とされる。多糖抗原に対するＴ細胞非依存性応答の欠 如は、Ｂ群連鎖球菌による感染か進行する子供の母親中に存在するＢ群連鎖球菌 に対する抗体レベルが低いことによるものであろう。さらに１８または２４月齢 より前の子供はＴ細胞非依存性抗原への免疫応答がよ（発達していない。

Ｂ群連鎖球菌におけるビルレー４７（］冑東性ヱ梓（（丙王Ｂ群連鎖球菌には、 共通の群特異的多糖抗原を有して（する５種の抗原型がある。しかしなから、こ の群抗原の抗体（ま動物モデル中では防御的ではない。ランセフ（−Ｊレドは最 初、沈降素枝体ｊを用（Ａで、Ｂ群連鎖球菌を４種の抗原型（Ｉａ、　ｌｂ、Ｉ Ｉ、およびｌ１ｌ）　ｉ二分類した。続いて、それぞれの抗原型に特有の型特異 的莢膜多糖の組成および構造が決定された（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ、　Ｈ，Ｊ等、　 Ｂｉｑｃｈｅｍ、　２２：１２５８−１２６４（１９８３）、　Ｋａｓｐｅｒ、 Ｄ、Ｌ等、　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃ、　Ｄｉｓ、　１５３：４０７−４１５（１９８ ６）、　ＶｅＳｓｅｌｓ、　ＭＲｌ等、　Ｔｒａｎｓ、　Ａｓ５ｏｃ、　Ａｍｅ ｒ、　Ｐｈｙｓ、　９８：３８４−３９１（１９８５））　ｏ　ウィルキン゛ノ ン（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ）は、Ｉｂ抗原型株のすべてとＩａ型莢膜を有する（１ く・つかの株上に存在するタン／　ＮＨり質抗原（最初ｉまＩｂｃタンＢり質と １手ばれた）を同定することにより、第５の抗原型（Ｉｃ）を定義した（買１１ ｋｉｎｓｏｎ、　Ｈ，１ｉ等、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ１．９７：６２９−６３４ （１９６９）、　Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ、）１．１１゜等、　Ｉｎｆｅｃ、ａｎｄ 　１ｍｍｕｎ、４：５９６−６０４（＋９７１））　ｏ後（ここのタン、＜り質 （よ、抗原型の異なるＢ群連鎖球菌の間でそのビルレンスカく異なり、ｌａ抗原 型には無いことが明らかになった（ｌｏｈｎｓｏｎ、　Ｄ、　Ｒ，等、　Ｊ、　 ＣＩ　ｉｎ、　Ｍｉｃｒ。

ｂｉｏｉ、　１９：５０６−５１０（１９８４））。

最近、Ｂ群連鎖球菌の抗原型をその莢膜型特異的多糖のみによって分類するため にこの命名法か変更を受け、第５の莢膜型もＩＶ型と記述されるようになった（ Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ、　Ｄ、　Ｇ、等、　Ｒｅｖ、　Ｉｎｆｃｃ、　Ｄｉｓ、　 １０（８）５３６７−５３７１（１９８８））。したがって、もはやＢ群連鎖球 菌株の分類は、現在Ｃタンパク質と呼ばれている抗原性１ｂｃタンパク質には基 ついていない。ｌｃ型株は、その莢膜多糖組成、並びにそれかＣタンパク質をも 有しているという追加情報に基つき、ｌａ抗原型と再分類されている。

免疫学的データ、疫学的データおよび遺伝子データは、型特異的莢膜かＢ群連鎖 球菌感染に対する免疫に重要な役割を果していることを示唆している。型特異的 莢膜多糖の組成および構造、並びにビルレンスおよび免疫性に関するそれらの役 割は、集中的な研究の対象となってきた（Ｆｅｒｒｉｅｒｉ、　Ｐ等、　１ｎｆ ｅｃ、　１ｍｍｕｎ、　２７：１０２３−１０３２（１９８０）。

Ｋｒａｕｓｅ、　Ｒ，Ｌ等、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１４２：　１６５− １７９（１９７５）、　Ｌｅｖｙ、　Ｎ、　Ｊ、等、Ｊ、１獅■ ｅｃ、Ｄｉｓ、１４９：８５１−８６０（１９８４）、　Ｗａｇｎｅｒ、Ｂ、等 、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１１８：９５−１０５（１９８０）、　Ｗ ｅｓｓｅｌｓ、Ｍ、Ｒ，等、　Ｔｒａｎｓ、　Ａｓ５ｏｃ、　Ａｍｅｒ、　Ｐｈ ｙｓ、　９８：３８４−３９１i１ ９８５））。

細胞表面上の型特異的およびＢ群連鎖球閑多糖の構造的配置、型特異的多糖内の 免疫学的に重要な決定因子、および莢膜が決定するＢＲ連鎖球閑のビルレンスの 機構に関して論争があった（Ｋａｓｐｅｒ、　Ｄ。

Ｌ等、　Ｊ、　１ｎｆｅｃ、　Ｄｉｓ、　１５３：４０７−４１５（１９８６） ）　、莢膜がビルレンスに果す役割を研究するた吟に、ルーベンス（Ｒｕｂｅｎ ｓ）等はトランスポゾン変異処理法を用いて、ＩＩＩ型Ｂ群連鎖球菌の非被包件 の同遺伝子型株を作成した（Ｒｕｂｅｎｓ、　Ｃ，Ｅ、等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４　ニア２０ｇ−７２１２（１９ ８７））。彼らは、莢膜発現の欠如によって、新生ラットモデルにおけるビルレ ンスが有意に欠如することを立証した。しかしながら、同様の莢膜組成を有する 臨床的な単離物のビルレンスは広範囲にわたって多様である。このことは、莢膜 に加えて他の細菌ビルレンス因子がＢ群連鎖球菌の発生病理に役割を担っている ことを示唆している。

ビルレンスと免疫性に果す役割が明確になっていないＢ群連鎖球菌中のい（つか のタンパク質と他の細菌性産物として、ＣＡＭＰ　（クリスチン・アドキンス− マツチ・ビーターラン（Ｃｈｒｉｓｔｉｎ　Ａｔｋｉｎｓ−ｋｌｕｃｈ　Ｐｅｔ ｅｒｓｏｎ）因子、色素（おそらくカロチノイド）、Ｒ抗原、Ｘ抗原、抗食細胞 因子、およびよく定義されていない“肺毒素”か記述されている（Ｆｅｒｒｉｅ ｒｉ、　Ｐ、等、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１５１：５６−６８（１９８０）、　Ｆ ｅｒｒｉｅｒｉ、Ｐ、等、Ｒｅｖ、ｌｎｆ、Ｄｉｓ、１０（２）：１００４−１ ０７１（１９８８）、　Ｈｉｌｌ、Ｈ，Ｒ，等、５ｅｘｕａｌ　ｌｙ　Ｔｒａｎ ｓｍｉｔｔｅｄ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ、　ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉ　１１．３９７−４ ０７頁）。以下に、Ｃタンパク質について議論する。

溶血毒が欠失したＢ群連鎖球菌同遺伝子型株は新生ラットモデルにおいてビルレ ンスの減少を示さなかった（Ｊｅｉｓｅｒ、　Ｊ、　Ｎ、　Ｔｐ、　Ｉｎｆｅｃ 。

ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ、５５：２３１４−２３１６（１９８７乃。溶血毒とノイラ ミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）は共に、感染を伴う臨床的単離物中 に常に存在する訳ではない。ＣＡＭＰ囚子は、Ｂ群連鎖球菌の分子５１２３５０ ０クルトンの細胞外タンパク質であって、ブドウ球菌ヘータ毒素（スフインコミ エリナーゼ）の存在下で赤血球膜の溶解を導く。Ｂ群連鎖球菌中のＣＡＭＰ因子 の遺伝子は最近クローニングされ、大腸菌内て発現した（　Ｓｃｈｎｅｅｗ　ｉ 　ｎｄ、　Ｏ，等、１ｎｆｅｃ、ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ、５６：２１７４−２１７ ９　（１９８８））。Ｂ群連鎖球菌の発生病理に関する、ＣＡＭＰ因子、Ｘおよ びＲ抗原および上記の他の因子の役割は、仮にあったとしても、先行技術には開 示されていない（Ｆｅｈｒｅｎｂａｃｈ、　Ｆ、　Ｊ、等、”Ｂａｃｔｅｒｉａ ｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｔｏｘｉｎｓ”、Ｇｕｓｔａｖ　Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｖｅｒ ｌａｇ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ（１９８８）；　Ｈｉｌｌ、Ｈ，Ｒ。

等、　５ｅｘｕａｌｌｙ　Ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ、　Ｍｃ Ｇｒａｗ−Ｈｉｌｌ、　ＮＹ、　３９７−４０７頁（１９８４））。

Ｃタンパク質はＢ群連鎖球菌の細胞表面結合性タンパク質抗原の一群であって、 ウィルキンソン等によって初めてＢ群連鎖球菌から抽出された＋Ｊｉｌｋｉｎｓ ｏｎ、　Ｈ，Ｌ等、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、９７：６２９−６３４（１９６９ ）、　Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ、　Ｈ，Ｗ、等、Ｉｎｆｅｃ、ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ、 ４：５９６−６０４（１９７１））　５彼らは熱塩酸（ＨＣＩ）を用いて細胞壁 を抽出し、トリクロロ酢酸（Ｔ　ＣＡ）を用いてタンパク質抗原を沈殿させた。

抗原性の異なる２種類のＣタンパク質集団が記述されている。（１）ペブンンに よる減成ニは感受性であるが、トリプシンによる減成には感受性てなく、ＴＲ（ トリプシン耐性）またはαと呼ばれるタンパク質群、（２）ペブンンおよびトリ プシンによる減成に共に感受性であり、ＴＳ（トリプシン耐性）またはβと呼ば れるもう１つのタンノｆり質ｕ　（Ｂｅｖａｎｇｅｒ。

Ｌｌ等、　Ａｃｔａ　Ｐａｔｈ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ、５ｃａｎｄ　５ｅｃｔ、Ｂ 、８７：５ｌ−５４（１９７９）、　Ｂｅｖａｎｇｅｒ、Ｌ、等、Ａｃｔａ　Ｐ ａｔｈ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ、５ｃａｎｄ、５ｅｃｔ、Ｂ、８９：２０５−２０９ ぐ１９８１）、Ｂｅｖａｎｇｅｒ、　Ｌ等、　Ａｃｔａ　Ｐａｔｈ、Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏ、５ｃａｎｄ、５ｅｃｔ、Ｂ、９１＋２３１−２３４（１９８３）＋　Ｂ ｅｖａｎｇｅｒ、　Ｌ、等＋　Ａｃｔａ　Ｐａｔｈ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ、５ｃａ ｎｄ、５ｅｃｔ、８．９３：１１３−１１９（１９８５）、　Ｂｅｖａｎｇｅｒ ル１等、　Ａｃｔａ　Ｐａｔｈ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、５ｃｎ ａｄ、５ｅｃｔ、Ｂ、９３：１２１−１２４（１９８５）、　Ｊｏｈｎｓｏｎ、 Ｄ、Ｒ，等、　Ｊ、Ｃ１１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１９：５０６−５１０（１ ，９８４）、　Ｒｕ５ｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓ、　Ｇ、　Ｊ、等、　Ｊ、Ｅｘｐ、 Ｍｅｄ、１６０：１４７６−１４８４（１９８４））。

１９７５年、ランセフイールド等はウサギ中に生じた抗血清によるマウスの防御 研究を用いて、同様のタンノＸ＋り質抗原を保持するＢ群連鎖球菌株に対する防 御的免疫性を付与する能力について、Ｃタンパク質を機能的に定義した（Ｌａｎ ｃｅｆｉｅｌｄ、　Ｒ，Ｃ，等、　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１４２・１６５−１７ ９（１９７５））。数多くの研究者が、ＨＣＩまたは界面活性剤を用いるＢ群連 鎖球菌細胞壁からの抽出によって、Ｃタン、（り質と呼ばれているＢ群連鎖球菌 の抗原性タンパク質の粗調製物を得ている（Ｂｅｖａｎｇｅｒ、　Ｌ、等、　Ａ ｃｔａ　Ｐａｔｈ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ、　５ｃａｎｄ、　５ｅｃｔ、　Ｂ、　 ８９：２０５−２０９i１ ９８１）、　Ｂｅｖａｎｇｅｒ、　Ｌ等、　Ａｃｔａ　Ｐａｔｈ、　Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏ、　５ｃａｎｄ、　５ｅｃｔ、　Ｂ、　９３：１１３|１ １９（１９８５）＋　Ｒｕ５ｓｅｔ　１−Ｊｏｎｅｓ、　Ｇ、　Ｊ等、　Ｊ、　 Ｅｘｐ　Ｍｅｄ、　１６０：１４７６−１４８４（１９８４j。

Ｖａｌｔｏｎｅｎ、　Ｍ、　Ｖ、等、Ｍｉｃｒｏｂ、Ｐａｔｈ、ｌ：１９１−２ ０４（１９８６）、　Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ、Ｈ，Ｗ等。

１ｎｆｅｃ、ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ、４：５９６−６０４（１９７１））　ｏこれ らの抗原について報告されたサイズは、１０〜１９０キロダルトンの間で多様で あり、単一タンパク貫挿は単離または特徴っけがなされていない（Ｆｅｒｒｉｅ ｒｉ。

Ｐ６等、　Ｒｅｖ、　Ｉｎｆ、　Ｄｉｓ、　ｔｏ（２）　：　１００４−１０７ １（＋９８８））。

防御的抗血清を用いるスクリーニングによって、Ｃタンパク質は臨床的Ｂ群連鎖 球菌単離物の約６０％に検出することができ、すべての抗原型にＣタンパク質が 認められるが、その頻度は異なっている（　Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ｄ、　Ｒ等、　 Ｊ、Ｃ１１ｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１９：５０６−５１０（１９８４））　 。個々のＢ群連鎖球閑単離物はＴＲおよびＴＳ抗原を共に有していることもある し、またはこれらの抗原１つだけを含むか、あるいはどちらをも含まないことも ある。部分精製した抗原が防御的免疫を引き出す能力以外には、これらの抗原の 発生病理に関する役割はインビトロで研究されていなかった。Ｃタンパク質を保 持するＢ群連鎖球菌株を用いたインビボ研究は、Ｃタンパク質がオプソニン作用 に対する耐性に寄与しており（Ｐａｙｎｅ、　Ｎ、　Ｒ，等、　Ｊ、　１ｎｆｅ ｃ、　Ｄｉｓ、　１５１　：６７２−６８１（１９８５））　、Ｃタンパク質が 食菌作用に続くＢ群連鎖球菌の細胞内殺菌を阻害しているのであろう（Ｐａｙｎ ｅ、　Ｎ、　Ｒ等、　Ｉｎｆｅｃｔ、　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ、　５５：１２４３ −１．２５１（１９８７））　、という幾つかの証拠を提供している。Ｃタンパ ク質を保持しているＢ群連鎖球閑のＩＩ型株は、新生ラット敗血症モデルにおい てビルレンスがより強いことが示されている（　Ｆｅｒｒ　ｉｅｒ　ｉ。

Ｐ３等、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　２７二１Ｑ２３−１０３２（１９８ ０）、　Ｆｅｒｒｉｅｒｉ、　Ｐ等、　Ｒｅｖ、　１ｎ４Ｄｉｓ、　１０（２） ：１００４−１０７１（１９８８））　。Ｃタンパク質に関する遺伝子テークか 無いので、Ｃタンパク質が欠如した同遺伝子型株は過去において研究されていな かった。ＴＳ（またはβ）Ｃタンパク質の１つかＩｇＡに結合するという証拠か ある（Ｒｕｓｓｅｌ　１−Ｊｏｎｅｓ、　Ｇ、　Ｊ、等、　Ｊ、　ＥｘｐＭｅｄ 、　１６０：１４７６−１４８４（１９８４））　、しかしながら、Ｃタンパク 質によるＩｇＡの結合がビルレンスに関して有している役割は、仮にあるとして も、開示されていない。

１９８６年、バルトネン（Ｖａｌｔｏｎｅｎ）等は、マウスモデルの防御を引き 出した培養上清からＢ群連鎖球菌タンパク質を単離した（Ｖａｌｔｏｎｅｎ、　 Ｍ、　Ｖ等、　Ｍｉｃｒｏｂ、　Ｐａｔｈ、　Ｉ：１９１−２０４（１９８６） ）　、彼らは、１４０００ダルトンの分子量を有するトリプシン耐性Ｂｌ連鎖球 菌タンパク質を同定し、部分精製した。ウサギ中てこのタンパク質に対して生じ た抗血清は、これに続＜Ｉｂ型Ｂ群連鎖球菌を用いた抗原投与に対してマウスを 防御したく８９％防御）。このタンパク質は、ランセフイールドの定義によると 、Ｃタンパク質である。しかしながら、このタンパク質に対して生じた抗血清を Ｂ群連鎖球菌抗原抽出物の免疫沈降に使用した時、より高分子量のタンパク質の いくつかが反応性であることがわかった。このことは、分子量１４０００のこの タンパク質がいくつかのＢ群連鎖球菌タンパク質に共通なエピトープを表してい るか、もしくはこのタンパク質がＢ群連鎖球菌培養物の上清中に発見された減成 生成物であることを示唆し得る。細胞壁および上清から単離されたＣタンパク質 のサイズの多様性は、これらのＣタンパク質か一遺伝子族（ファミリー）を表現 しており、免疫系に対する防御機構とじでの抗原性の多様性を維持していること を示唆し得る。

報告された分子量の範囲と個々のＣタンパク質を精製する際に直面する困難は、 Ａ群連鎖球菌のＭタンパク質を単離する際に多くの研究者が直面した問題と類似 している（Ｄａｌｅ、　Ｊ、　Ｂ、等、　１ｎｆｅｃ、　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ、 ４６（１）：２６７−２６９（１９８４）、　Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ、’／、Ａ等 、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１４４：３２−５３（１９７６）、　Ｆｉｓｃ ｈｅｔｔｉ、　Ｖ、　Ａ、等、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ　１４６：１１０８− １１２３（１９７７））。

Ｍタンパク質の遺伝子は現在クローニングされ、配列決定されており、いくつか の繰り返しＤＮＡ配列を含んでいることがわかっている（Ｈｏｔ　ｌｉｎｇｓｈ ｅａｄ、　Ｓ、　Ｋ等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６１：１６７７−１６８６ （１９８６）、　Ｓｃ。

ｔｔ、　Ｊ、　Ｒ，等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８２ ：１８２２−１８２６（１９８６）、　５ｃｏｔｔ、Ｊ。

Ｒ等、　Ｉｎｆｅｃ、　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ、　５２：６０９−９１２（１９８ ６））　ｏ　これらの繰り返し配列は、生産されたＭタンパク質のサイズの多様 性をもたらす転写後のプロセフソングによるものであろう。これが起こる機構は 理解されていない。Ｂ群連鎖球菌のＣタンパク質について記述された分子量の範 囲は、同様のプロセスからもたらされるのかもしれない。

クリート（Ｃ１ｅａｔ）等は、ベバンガー（Ｂｅｖａｎｇｅｒ）から得たＢ群連 鎖球菌に対する２種類の抗血清調製物（αおよびβ）を使用して大腸菌中のＢ群 連鎖球菌ＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、Ｃタンパク質 のクローニングを試みた（　Ｂｅｖａｎｇｅｒ。

Ｌｌ等、　Ａｃｔａ　Ｐａｔｈ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１ｍｍｕｎｏ１．５ ｃａｎｄ、　５ｅｃｔ、　Ｂ、　９３：１１３−１１９（１X８ ５）、　Ｃ１ｅａｔ、　Ｐ、　Ｈ等、　Ｉｎｆｅｃ、　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ、　 ５５（５）　：１１５１−１１５５（１９８７）　；これらの文献は本明細書の 一部を構成する）。これらの研究者達は、抗連鎖球菌抗体に結合するタンパク質 を産生ずる２つのクローンについて記述した。しかしながら彼らは、クローニン グしたそのタンパク質か防御的抗体を引き出す能力を有するか否か、あるいはこ れらの遺伝子の優勢が、Ｃタンパク質を保持することがわかっているＢ群連鎖球 菌株と相関しているか否かを決定することができなかった。

クローニングされた遺伝子配列の、Ｂ群連鎖球菌のビルレンスに関する役割は研 究されなかった。Ｃタンパク質は防御的抗体を引き出すその能力によって定義さ れているので、この研究は、そのクローンがＣタンパク質をコードしているか否 かの証拠を提供し得なかった。

本発明の複合ワクチン（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ｖａｃｃｉｎ）本発明は、莢膜 多糖かタンパク質骨格に共有結合している複合ワクチンの開発によって、上に議 論したＢ群連鎖球菌に対する先行ワクチンの欠如を克服する。この方法は、莢膜 多糖抗原に対するＴ細胞依存性抗体応答の発生を支援し、抗体生産のためのＴ細 胞非依存性の必要条件を回避する（Ｂａｋｅｒ、　Ｃ，Ｊ、等、Ｒｅｖ、ｏｆ　 Ｉｎｆｅｃ、Ｄｉｓ、７：４５８−４６７（１９８５）、　Ｋａｓｐｅｒ、　Ｄ 、　Ｌ、等、　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃ、　Ｄｉｓ、　１５３：４０７−４１５（１９ ８Ｂ）　：これらの文献は本明細書の一部を構成する）。

複合ワクチンでは、Ｂ群連鎖球菌の莢膜多糖（上述）などの抗原性分子か“担体 °゛タンパク質たはポリペプチドに共役結合的に結合している。この結合は結合 した分子の抗原性を増大させるよう作用する。抗原性分子および°“担体゛タン パク質またはポリペプチドから複合ワクチンを形成する方法は、当該技術分野に おいて知られている（Ｊａｃｏｂ、　Ｃ，Ｏ等、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ ｏｌ、　１６：１０５７−１０６２（１９８６）　：　Ｐａｒｋｅｒ、　Ｊ、　 Ｍ、　Ｒ，等、“Ｍｏｄｅｒｎ　Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ　ｔｏ　Ｖａｃｃｉｎｅ ｓ”、　Ｃｈａｎｏｃｋ、　Ｒ，Ｍ、等編。

１．３３−１３８頁、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ（１９８３）　；　 Ｚｕｒａｗｓｋｉ、　Ｖ、　Ｒ，等、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１２１°１２ ｌ２２−１２９（１９７；　Ｋ１１ｐ唐■ ｅｉｎ、　Ｆ、　Ａ、等、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　３７：５５０−５ ５７（１９８２）　；　Ｂｅ５ｓｌｅｒ、　Ｗ、　Ｇ、　、@１ｍｍｕｎ ｏｂｉｏ１．１７０：２３９−２４４（１９８５）；　Ｐｏ５ｎｅＬｔ、Ｄ、Ｎ 　等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６３：１７１９−１７２５（１９８８）　； 　Ｇｈｏｓｅ、　Ａ、　Ｃ，等、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　２５：２ ２３−２３０（１９８０）　：■ 記の文献はすべて本明細書の一部を構成する）。

複合ワクチンの原型は、インフルエンザ閑に対して開発され（Ａｎｄｅｒｓｏｎ 、　Ｐ、　、　１ｎｆｅｃ、　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ、　３９：２２３−２３８（ １９８３）　；　Ｃｈｕ、　Ｃ，等、　Ｉｎｆ■モ煤B Ｉｍｍｕｎ、　４０　：２４５−２５６（１９８３）　；　Ｌｅｐｏｗ、　Ｍ、 　、　Ｐｅｄｉａｔ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、　Ｊ、　U：８０４−８ ０７（１９８７）　：上記の文献は本明細書の一部を構成する）、このモデルを 本発明の新規ワクチンの構築に使用することができる。このような複合ワクチン 製造の別法は、アングーラン等（Ａｎｄｅｒｓｏｎ、　Ｐ、　Ｗ等２欧州特許公 開番号第２４５０４５号；　Ａｎｄｅｒｓｏｎ、　Ｐ等、米国特許番号第４６７ ３５７４号および同第７６５１２８３号）、フランク等（Ｆｒａｎｋ、　Ｒ，等 、米国特許番号第４７８９７３５号；欧州特許公開番号第２０６８５２号）、コ ードン（Ｇｏｒｄｏｎ、　Ｌ、　Ｋ、　、米国特許番号第４６１９８２８号）、 ビーチエイ（Ｂｅａｃｈｅｙ、　Ｅ、　Ｈ，、米国特許番号第４３８４５３７号 ）（上記の文献はすへて本明細書の一部を構成する）によって開示されている。

インフルエンザ閑ワクチンなどの複合ワクチンのためのタンパク質骨格には、細 菌性莢膜多糖の供給源である標的生物と抗原性を共有しないタンパク質が利用さ れてきた（Ｗａｒｄ、　Ｊ、等、　”Ｖａｃｃｉｎｅｓ”、Ｐｌ。

ｔｋｉｎ、　Ｓ、　Ａ、等ＭＡ、　５ａｕｎｄｅｒＳ、　Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈ ｉａ、　３００頁（１９８８））。

これとは対照的に、本発明の複合ワクチンは、Ｂ群連鎖球菌の免疫原性タンパク 質を複合ワクチンの骨格として使用する。このような方法はより効果的なワクチ ンを導くと確信される（　Ｉｎ５ｅｌ、　Ｒ，Ａ、等。

Ｎｅｗ　Ｅｎｇ、　Ｊ、Ｍｅｄ、　（Ｅｄｉｔｏｒｉａｌ）　３１９（１８）： １２１９−１２２０（１９８８））　。本発明の複合（タンパク質−多糖）ワク チンは、まず、複合ワクチン中に使用し得るＢ群連鎖球菌タンパク質を特異的に 特徴づける。Ｂ群連鎖球菌特有のタンパク質はいずれも本発明の複合ワクチンに おけるタンパク質として使用し得る。しかしながら、この目的のためにはＢ群連 鎖球菌のＣタンパク質を使用することか好ましい。以下により詳細に議論するよ うに、プラスミドｐＪＭｓ１およびｐＪＭＳ２３は連鎖球菌Ｃタンパク質をコー ドするＤＮＡを含有している。最も好ましいＣタンパク質は、このようなりＮＡ の細菌内での発現によって得られたものである。

前述のように、本発明は防御的Ｂ群連鎖球菌タンノくり質抗原をコードする遺伝 子のクローニングと発現に関する。これらの細菌に対する複合タンパク質を形成 するためにＢ群連鎖球菌の莢膜多糖を結合し得るタンパク質骨格として、このよ うなタンノテク質を使用することが好ましい。加えて、これらのタン／　＜り質 がＢ群連鎖球菌のビルレンスおよび免疫性に果す役割を、Ｂ群連鎖球菌感染に対 する追加の療法を開発するために利用することができる。細菌由来のこれらの遺 伝子の単離および特徴づけによって、複合ワクチンのポリペプチド骨格／担体の アジ−バント性および抗原性を共に最適化するためにその遺伝子産物を操作する ことが可能になる。

したがって本発明は、Ｂ群連鎖球菌のＣタンパク質のクローニング、ビルレンス および免疫性に関するそれらの役割、およびＢ群連鎖球菌に対する複合ワクチン の免疫原として作用するそれらの能力連鎖球菌の多（の群のクローニングについ て数多くの文献が利用可能であるにもかかわらず、Ｂ群連鎖球菌については限ら れた遺伝子操作しか達成されていない（Ｍａｃｒｉｎａ、　Ｆ、　Ｌ、　、　Ａ ｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　３８：１９３−２１９（１９８４） 、　Ｖａｎｇｅｒ、Ａ、Ｒ，等、　１ｎｆｅｃ、　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ、　５５ ：１．１７０−１１７５（P ９８７）　）。Ｂ群連鎖球菌について最も広く使用されてきた技術は、Ｔｎ９１ ６の開発およびトランスポゾン変異処理法におけるその使用であった（Ｒｕｂｅ ｎｓ、　Ｃ，Ｅ等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ 　８４ニア２０８−７２１２（１９８７）、　Ｖａｎｇｅｒ、Ａ、Ｒ，等、　Ｒ ｅｓ、　Ｙｅｔ、　Ｓｃｉ、　３８：２０２−２０８（１９８５））　。しかし ながら、Ｃタンパク質の遺伝子は複数あり、防御的抗血清は幾つかのタンパク質 に結合するように思われるので、トランスポゾン変Ｘ　処理法によるＣタンパク 質遺伝子のスクリーニングは非現実的である。

本発明は、新規プラスミドベクターを使用することによって、Ｃタンパク貫くお よびＢ群連鎖球菌のビルレンスに関与するか、もしくはＢ群連鎖球菌に対する宿 主免疫に影響を及ぼす他のタンパク質）′のクローニングを達成する。この目的 のためには、天然に誘導されたＢ群連鎖球菌に対する抗体に結合するタンパク質 の発現を迅速にスクリーニングできるクローニングベクターを使用することか望 まし２い。このような抗体は異種のポリクローン抗体であって、単クローン抗体 ではないので、目的の遺伝子を同定するためには、多くの陽性クローンから容易 にスクリーニングされ得るベクターを使用する必要があった。

特異的抗血清に結合する抗原の発現に関してクローンをスフ１ノーニングするた めに、いくつかの技術が使用可能であった（Ａｒｕｆｆｏ、　Ａ。

等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　８４：８５７３−７ ５７７（１９８７））　、最も広く使用された系であるλＧＴＩＩはヤング（Ｙ ｏｕｎｇ）とディビス（Ｄａｖｉｓ）によって開発された（Ｈｕｙｎｈ、　Ｔ、 　Ｖ等１“ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃ ｈ”、第１巻（Ｇｌｏｖｅｒ、　Ｄ、　Ｍ編）、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、胃ａｓ ｈｉｎｇｔｏｎ、　４９−７８頁（１９８５）　；　ｌｏｎｇ、　Ｌ　Ｗ等、　 Ｊ、　１ｍｍｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　８２：３０３−３１３（１９８５ ）　；これらの文献は本明細書の一部を構成する）。この技術は、ファージ溶解 によってその産物か放出されるこの溶原性ファーン中に発現したクローンの迅速 なスクリーニングを可能にする。この系で一般的に直面する諸問題の１つは、詳 細なエンドヌクレアーゼ制限マツピング（地図化）、プローブの調製およびＤＮ Ａ配列決定用のプラスミドベクター中にＤＮＡ断片をサブクローニングする必要 性である。加えて、ファージ保存液からのＤＮＡＭ製は面倒であり、効率良く研 究し得る潜在的に陽性なりローンの数を制限する。最後に、クローニングした遺 伝子からの粗タンパク質抽出物の調製はファージベクター宿主においては問題が 多い。

これらの問題を克服するために、本発明は、ビルレンスおよび／または免疫性に 関与するタンパク質を発現させるために、クローン化細菌染色体Ｄ　Ｎ　Ａのス クリーニング用に開発したプラスミドベクターを提供する。したがって本発明は さらに、Ｂ群連鎖球菌に対して天然に産出した抗体に結合するタンパク質の発現 について迅速にスクリーニングできるクローニングベクターの開発とその使用に 関する。このベクターを、一般に使用されているプラスミドクローニングベクタ ーｐＵｃ１２（冨ｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、等、Ｇｅｎｅ　１９：２６９−２７６（ １９８２）　；Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ、　Ｊ等、Ｇｅｎｅ　２６：１０１−１０６ （１９８３）　：　Ｖｉｅｒａ、　Ｊ等、Ｇｅｎｅ　１９：２５９−２６８（１ ９８２）　；これらの文献は本明細書の一部を構成する）を改変することによっ て調製した。本発明は、以下に記述するベクターおよびその機能的等飾物に関す る。

この系を使用すれば、プラスミドクローンの操作、制限エンドヌクレアーゼによ るマツピングおよびそのＤＮＡ挿入物の配列決定、プローブの調製、および遺伝 子産物の研究が、サブクローニングのＺ・要無く、容易にできる。ｐＵｃ１２は ２．７３キロ塩基（ｋｂ）の高コピー数プラスミドであり、Ｃｏ１Ｅ１複製起源 、アンビアリン耐性および１ａｃＺ遺伝子中のポリリンカーを有している（Ａｕ ｓｕｂｅｌ、　Ｆ、　Ｍ、等、　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　；　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌ、　Ａ■ ５ｎ、　／Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、　ＮＹ（１９８７）　；こ の文献は本明細書の一部を構成する）。

ｐｕｃ　１２のポリリンカー中に幾つかの改変が加えられた（Ａｒｕｆｔｏ、　 Ａ、等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　８４：８５７ ３−８５７７（１９８７）　；この文献は本明細書の一部を構成する）。ｐｕｃ 　１２改変の全体計画は、同一であるが非付着性の複数のＢｓ　ｔＸ１クローニ ング部位か存在するようにポリリンカーを改変すること、直鎖状宿主プラスミド の容易な分離を可能にする゛スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）”断片を加えるこ と、並びに、３つの翻訳読み枠のすへてについてｌａｃプロモーターからの発現 を提供すること、であった。

外来ＤＮＡを高効率で挿入するための部位を提供するため、およびプラスミドの 自己連結の可能性を最小限にするために、反転した非付着性Ｂｓ　ｔＸ１末端（ 複数）をポリリンカーに加えた。図１に示すように、ｐＵｃ　１２をまずＢａｍ ＨＩで切断しく操作１）、そのプラスミドを、部分的に相補的な２つの合成オリ コヌクレオチドアダプター　１５マー（ＧＡＴＣＣＡＴＴＧＴＧＣＴＧＧ）およ び１１７−（ＧＴＡＡＣＡＣＧＡＣＣ）と混合した（操作２）。上記のアダプタ ーをｐＵｃ　ｉ　２中に連結するとき２つの新しいＢｓ　ｔＸ１部位か生成する が、元来のＢａｍ８１部位も復元する（操作３）。

次にこのプラスミドをポリヌクレオチドキナーゼで処理し、連結することによっ て閉環状プラスミドを形成する（操作４）。このプラスミドをＢｓ　ｔＸｌで処 理した時に得られる末端は同一であり、かつ非付着性（どちらもＧＴＧＴ突出部 を有している）である（操作５）。

自己連結し得る部分的に切断されたプラスミドによって汚染されることなく、ク ローニングのための直鎖状プラスミドが精製できるようにするために、ポリリン カー中に第２の改変を加えた。平滑末端の３６５塩基対（ｂｐ）のＦｎｕＤ２断 片をプラスミドｐＣＤＭから得た。Ｂ　ｓ　ｔ　Ｘ　１部位を含んでいないこの カセ、、トまたは“スタ、７フアー”断片を、部分的に相補的な２つの合成オリ コメクレオチド：１２マー（ＡＣＡＣＧＡＧＡＴＴＴＣ）および８マー（ＣＴＣ ＴＡＡＡＧ）に平滑末端連結した（操作６）。アダプターを伴う得られた断片は ４ｂｐの突出部（ＡＣＡＣ）を有しており、これは操作５に示した改変ｐｕｃ　 １２プラスミドの末端と相補的である。この改変ｐＵｃ］、２プラスミドを、ア ダプターを伴ったｐＣＤＭ挿入物に連結した。得られた構築物（ｐＵＸ　１２と 命名した）を図２に示す。プラスミドｐＪＭｓ１またはｐＪＭＳ２３から、導入 した連鎖球菌ＤＮＡ配列を削除することによって、ｐＵＸ１２プラスミドを再生 することができる。別法として、プラスミドｐｕｃ　１２を用いて、組換え法（ または相同性（ホモロガス）組換え）によってｐＵＸ１２作成することもてきる 。

ＰＵＸ　１２は発現ベクターとして使用されるべきであるので、そのポリリンカ ーがｌａｃプロモーターに関する３つの潜在的な読み枠のすべてを含むように、 さらに改変することが好ましい。これらの変化は、クローニングした遺伝子断片 についての正しい読み枠を１／６の頻度で可能にする。例えばクローニングした 断片は、２種類の配向のうぢの１つの配向で、また３種類の読み枠のうちの１つ の読み枠でベクター中に挿入され得る。＋１読み枠型を構築するために、ｐＵＸ １２プラスミドをそのポリリンカー中のユニーク（唯一の）部位で切断する制限 酵素ＥｃｏＲＩで切断した。ＴＡ　ＤＮＡポリメラーゼの５°　−３′　ポリメ ラーゼ活性を用いて、−末鎖５°付着末端を補充した。これによりＥｃｏＲ＋部 位の欠失がもたらされ、新しいＸｍｎ１部位か生成した（図３Ａ）。ＥｃｏＲｉ 部位の欠失を立証し、ポリリンカー中に新しいＸｍｎ１部位が存在することを確 認することによって、この構築を確認した。さらに、標準的配列決定プライマー （Ａｕｓｕｂｅｌ、　Ｆ、　Ｍ、等、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍ ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌ、Ａｓ５ｎ、／Ｗ ｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹ（１９８７））を用いて、この＋１ 改変ｐＵＸ１２プラスミドの二本鎖ＤＮＡ配列決定を実行した。このＤＮＡ配列 決定によって、ポリリンカーに４塩基対が付与されたことが示され、ｐＵＸｌ２ の＋１読み枠型への改変が確認された。このプラスミドをｐＵＸｌ　２＋１と呼 ぶ。

−１読み枠型を構築するために、ｐＵＸ１２ベクターを、そのポリリンカー中の ユニーク部位で切断する制限酵素５ａｃＩで切断した。Ｔ４ポリメラーゼの３’ 　−５’　エキソヌクレアーゼ活性を用％ｚて、その−末鎖３′付着末端を削除 して平滑末端にし、得られた平滑末端を連結した。得られた配列は、Ｓａｃ　１ 部位が排除されているはずであり、また新しいＦｎｕＤ２部位が生成しているは ずである（図３Ｂ）。しかしながらｐＵＸｌ、ｌ−１プラスミドの制限マツピン グによると、Ｓａｃ　１部位か存在せず、ＦｎｕＤ２部位も存在しないことが示 された。さらに、このポリリンカー上のＳｍａｌ／Ｘｍａ１部位かもはや存在し なかった。幾つかの潜在的なｐｕｘ　１２−１構築物をミニブレノブぐ微量調製 ）二本鎖ＤＮＡから配列決定した。配列決定した６種の改変プラスミドのうち、 １つには１０ヌクレオチドが存在せず、それゆえに−１読み枠型が生成したこと がわかった（図３Ｇ）。このことは、Ｔ４　りＮＡポリメラーゼか追加のエキソ ヌクレアーゼ活性を有しており、ポリリンカーの二本鎖部分をさらに削除するこ とを示唆している。それにもかかわらず、得られたプラスミドは−１読み枠を有 していた。このプラスミドをｐＵＸｌ２−１と命名した。

（以下余白） Ｂ群連鎖球菌の抗原性タンパク質のクローニングにおけるｐ　ｔ、Ｊ　Ｘ−１２ ベクターの使用を、以下の実施例に詳述する。要約すると、Ｂ群連鎖球菌由来の ＤＮＡまたはそのようなりＮＡに相補性のＤＮＡをｐＵＸｌ２、ｐｔＪｘｌ　２ ＋　１またはｐｕｘｉ２−ｔベクターに導入し、これを用いて大腸菌を形質転換 する。クロー一ングし、たＤＮＡを大腸菌中で発現させ、その細胞溶解液を試験 することによって、それがＢ群連鎖球菌に対する抗血清に結合し得るタンパク質 を含むか否かを決定する。

ｐＵＸ、１２の有用性を増大させ得る潜在的に興味深いｐＵＸｌ２の改変が幾つ かある。例えば、ｌａｃプロモーターを別のプロモーターに置換することができ るし、低コピー数ベクターを作成するために複製起源を改変することもでき、ま たその薬剤耐性マーカー（標識）を変更してもよい。

本発明は、Ｂ群連鎖球菌特有のタンパク質に結合したＢ群連鎖球菌特有の多糖（ 例えば莢膜多糖）からなるワクチンに関する。このような複合ワクチンの“多糖 ”および“タンパク質”は、Ｂ群連鎖球菌に特有の分子と同一であってもよいし 、あるいはそのような分子の機能性誘導体であってもよい。機能性誘導体の例に は、天然タンパク質の断片および／または天然タンパク質の変種（例えばアミノ 酸配列に変化を有するが、天然分子か示すものと本質的に同じ免疫原性、ピルレ ンスまたは抗原性を保持しているタンパク質）か含まれる。本発明の目的のため には、哺乳類（動物またはヒト）中に導入されたときに、Ｂ群連鎖球菌と反応し 得る抗体を引き出すあらゆる多糖が使用できる。本発明の好ましい多糖の例には 、Ｂ群連鎖球菌の多糖またはその等価物が含まれる。本発明の目的のためには、 哺乳類（動物またはヒト）中に導入されたときに、Ｂ群連鎖球菌によって発現さ れるタンパク質と反応し得る抗体を引き出すか、もしくはＢ群連鎖球菌の多糖に 対する抗体を引き出すために多糖の免疫原性を増大させる、あらゆるタンパク質 か使用できる。本発明の好ましいタンパク質の例には、Ｂ群連鎖球菌のＣタンパ ク質またはその等価物が含まれる。

本明細書の記述においては、ある細菌に天然に伴う分子に構造または配列が本質 的に類似している場合、その多糖またはタンパク質がその細菌に゛特有゛である 、という。この用語は、その生物に特異な分子、並びに、他の生物に存在するが 、ヒトまたは動物宿主におけるその細菌のビルレンスまたは抗原性に関与する分 子、を共に包含することを意図している。

本発明のワクチンは、受動免疫化または能動免疫化のいずれかによってＢ群連鎖 球菌に対する耐性を付与し得る。受動免疫化の一態様として、本ワクチンを宿主 （すなわちヒトまたは動物）ボランティア（志願者）に与え、引き出された抗血 清を回収し、これをＢ群連鎖球菌がもたらす感染を有すると推測されるレシピエ ンド（受血者）に直接与える。

抗体または抗体断片を毒素ラベル（標識）で標識し得ることは、この型の受動免 疫化を行う際に、もう１つのＢ群連鎖球菌感染治療法を提供する。この態様とし て、Ｂ群連鎖球菌抗原を認識し得る抗体または抗体断片を患者に投与する前に、 これらを毒素分子で標識する。このように毒素で誘導体化した分子がＢ群連鎖球 菌細胞に結合した場合、この毒素部分はその細胞の死をもたらすであろう。

第２の慇様どして、本発明のワクチンを（妊娠または分娩中またはそれ以前の） 女性（雌）に、その女性と、（胎盤を通しての抗体の受動的取り込みによって） その胎児または新生児の両者を防御するように作用する抗血清の産生を引き起こ すのに充分な時間と量の条件下で与える。

したがって本発明は、Ｂ群連鎖球閑による感染、または本複合ワクチンの多糖お よび／またはタンパク質に対する抗血清によって認識され結合され得る抗原を有 する生物による感染、を防くが、または緩和する方法に関し、これらを提供する ものである。本明細書の記述においては、個体への投与が、ある疾患の症状また は状態の全体的または部分的な緩和（即ち抑制）をもたらすが、あるいはその疾 患に対する全体的または部分的な個体の免疫をもたらす場合に、ワクチンかその 疾患を防く、または緩和するという。

本ワクチン（またはそれが引き出す抗血清）の投与は゛予防的パにち、あるいは “治療的パにも使用し得る。予防的に与える場合、Ｂ群連鎖球菌感染のあらゆる 症状に先んじて本化合物を与える。本化合物の予防的投与は、これに続くあらゆ る感染を防くが、もしくは緩和するように作用する。治療的に与える場合、実際 の感染の症状か検出された時に本化合物を与える。本化合物の治療的投写は実際 の感染を緩和するよう作用する。

したかって、本発明の抗炎症薬を（予期される感染を防くが、もしくは緩和する ために）感染の発症に先立って与えてもよいし７、あるいは実際の感染の開始後 に与えてもよい。

レシピエンド（受容者）患者がある組成物の投与に耐え得る場合、その組成物か “医薬的に許容される”、という。そのような薬剤の投与１が生理学的に有意で ある場合、その薬剤が”治療的に膏効な量°′で投与された、という。ある薬剤 の存在がレシピエンド患者の生理学に検出し得る変化をもたらす場合、その薬剤 が生理学的に有意である、という。

当業者には理解されるであろうが、本発明のワクチンをある個体に５える場合、 それは、塩類、緩衝１夜類、アジュバント類、またはその組成物の有効性を改良 するために望ましい他の物質を含有し得る組成物の形態であり得る。アジュバン トは、特異的免疫応答を特異的に増大するために使用し得る物質である。通常は 、免疫系に与える前にアジュバントと組成物を混合するか、もしくはこれらを別 個に、しかし免疫化する動物の同じ部位に与える。アジュバントはその組成に基 づいて、おおざっばにいくつかの群に分類できる。これらの群には、油アンユバ ント（例えば、フロイント完全および不完全アジュバント）、鉱塩類（例えば、 Ａ　Ｉ　Ｋ　（Ｓｏ、）　、、ＡＩＫ（ＳＯ，）２、Ａ　Ｉ　ＮＨ，（ＳＯ４） 、ソリ力、カオリン、および炭素）、ポリヌクレオチド類（例えば、ポリＩＣお よびポリＡＵ酸）、およびある種の天然物質（例えば、結核菌のワックスＤ１コ リ不ハクテリウ４°″ル″ム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍ ）または百日咳菌、およびプルセラ属の一員に存在する物質）が含まれる。これ らの物質のうちアジュバントとして特に有用な物質は、例えばクイルＡ　（Ｑｕ ｉｌ　Ａ；５ｕｐｅｒｆｏｓ　Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）などのサポニン類であ る。ワクチン組成物中で使用するのに適した物質の例は、Ｒｅｍｅｎｇｔｏｎ’ ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　（Ｏｓｏｌ、＾、　ｌ ｌａ、　Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌ　ｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、　Ｅａｓｔｏｎ、　ＰＡ、 　戟@３２４ −１３４１頁（１９８０））に記載されており、この文献は本明細書の一部を構 成する。

本発明の治療用組成物は、注射、迅速な注入、鼻咽頭吸収（鼻咽頭内）、経皮吸 収によって非経口的に、あるいは経口的に投与することかできる。あるいは、本 組成物を筋肉内あるいは静脈内に投与してもよい。非経口投与用組成物には、滅 菌した水性または非水性溶液剤、懸濁剤、および乳剤が含まれる。非水性溶媒の 例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油なとの植物 油、およびオレイン酸エチルなど注射可能な有機エステルである。

皮膚透過性を増大させ、抗原吸収を促進するために、担体または密封包帯を使用 することができる。経口投与用の液体剤形は一般的に、その液体剤形を含有する リポソーム溶液剤を含み得る。懸濁化リポソームの適切な形態には、当該技術分 野で通常に使用される精製水などの不活性希釈剤を含有するエリキシル剤、乳剤 、懸濁剤、溶液剤、およびシロップ剤が含まれる。不活性希釈剤に加えて、この ような組成物に、アジュバント、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、または甘味料 、香料、あるいは芳香剤を含有させてもよい。

多重投与法を用いる場合、免疫化のタイミングには多くの異なる技術か存在する 。免疫化された動物か発現する免疫グロブリン種（レバートＩＪ−）の多様性と レベルを増大させるために、本発明の組成物を複数回使用することかできる。典 型的には、多重免疫化を行う場合、１〜２カ月置きに行う。

本発明によれば、治療用組成物の“有効量”とは、望ましい生物学的効果を達成 するのに充分な量のことである。一般的には、本組成物の有効量を提供するのに 必要な投与量は、動物またはヒトの年令、法帖、性別、および疾廖の程度、また 他にも存在する場合には、当業者によって調節され得る他の変数、などの因子に 応じて変化するであろう。

本発明の抗原性調製物は、有効量の単一投与または複数投与によって投与され得 る。本発明の組成物の有効量は０．０１〜１０００μｓ／ｍｌ／投与、より好ま しくは０．１〜５ｏ０μｇ／ｍｌ／投与、最も好ましくは１０〜３００μｇ／ｍ ｌ／投与の範囲で変化し得る。

以上で本発明の一般的記述を終えたので、以下の実施例を参照することによって 本発明をより容易に理解できるであろう。例示のために以下の実施例を提供する か、指定しない限り、以下の実施例は本発明の制限を意図するものではない。

Ｔ）ＵＸ１２ベクターのクローニング効率を試験するため、並びに改変した読み 枠が正しく転写されるか否かを決定するために、いくつかの実験を計画した。こ れらの実験の結果を以下に簡単に要約する： １、ＤＮＡ断片をｐＵＸ、１２中にクローニングするために、３種類の構築物、 即ちｐＵＸｌ２（元来の゛′ゼロ”読み枠構築物）、ｐＵＸｌ、２＋１およびｐ ＬｌＸ１２−１を等モル１度で混合した。次にこれらのプラスミドをＢｓｔＸｌ で切断しすることにより、ポリリンカー内のスタッファ−断片を切断した。低融 点アガロースまたは酢酸カリウム勾配（Ａｒｕｆｆｏ、　Ａ、等、　Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４：８５７３−．８５７７（ １９８７）、　Ａｕ５ｕｂｅｌ、Ｆ、Ｍ等、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉ ｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌ八ｓｓへ、 ／Ｖｉｌｅｙ　Ｉｎｔｃｒｓｃｉｅｎｃｅ、罫（１，９８７））を用いて、スタ ッファ−断片をプラスミドから分離した。クローニングされるべきＤＮＡを、平 滑末端を与える制限酵素（平滑末端を与える制限酵素はどれでも使用できる）で 切断した。必要ならば、シグナル鎖末端＜ｓｉｇｎａｌ　５ｔｒａｎｄｅｄ　ｅ ｎｄｓ）を伴っている二本鎖ＤＮＡを、平滑末端が生成するように改変すること かできる。これらのＤＮＡ断片の平滑末端を２種類の合成オリゴヌクレオチドア ダプターと混合した。これらはスタッファ−断片を調製する際に使用した１２マ ーおよび８７−と同一である。改変Ｉ７たＤ　Ｎ　Ａ断片を、取り込まれなかっ た合成オリゴヌクレオチドから、酢酸カリウム勾配上で分離した。

次にこれらの断片を直鎖状ｐＵＸ＋、２族プラスミド中に連結し、これらを大腸 菌の形質転換に使用した。

ｐＵＸ１２ベクターか、アダプターを伴う挿入物のクローニングにとって最適な 条件下では低頻度で自己連結することを立証するために、第２の薬剤耐性マーカ ーをｐＵＸｌ２中にクローニングした。

図１に示すように、ｐＵＸｌ、２はβ−ラクタマーゼ遺伝子を有しており、アン ピシリンに対する耐性（ａｍｐＲ）を保持している。第２のマーカーのクローニ ングの論理的根拠は、両薬剤耐性マーカーを含有するクローンと、典型的なりロ ーニング条件下で自己連結したためにアンビンリン耐性のみが発現するｐＵＸ１ ２プラスミドとの比を比較することにある。プラスミドｐＢＲ３２２由来のテト ラサイクリン耐性遺伝子（ｔｅｔ”）をｐＵＸｌ２のポリリンカー内に上述のア ダプターと共にクローニングした。一連の試験的連結を行うことによって、断片 末端に対するオリゴヌクレオチドアダプターの至適濃度、並びに、連結および形 質転換のための直鎖状ｐ　Ｕ　Ｘ１２プラスミドに対する改変挿入物の比を確立 した。ｔｅｔＲ遺伝子遺伝子カマ−カー使用することにより、アンピシリン含有 プレート上で選択した形質転換体の９９％以上がｔｅｔ’マーカーをも保持する ようなりローニングパラメーターを決定することができた。

したがってこの系における自己連結の頻度は極めて低く、ｐＵＸ１２中のライブ ラリーをスクリーニングする前に、ポリリンカー中の挿入物の存在についてスク リーニングする必要はない。

２、ｐＵＸ１２のポリリンカー中の翻訳読み枠の位置を確認するために、配列ど 産物かわかっており、それ自身のプロモーターか欠如している構造遺伝子をクロ ーニングした。この目的のために、プラスミド上に保持されたｔｏｘ構造遺伝子 の変異体（Ｃｏｓｔ、ａ、　Ｊ、　Ｊ、等、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１４８（ １）：１２４−１３０（１９８１）、　ＭｉｃｈｅＬ、Ｊ、Ｌ等、　Ｊ、　Ｖｉ ｒｏｌ、　４２：５１０−５１８（１，９８２）　；これらの文献は本明細書の 一部を構成する）を選択した。このプラスミドｐＡＢｃ４０２を制限エンドヌク レアーゼＡｐＡＩおよびＨｉｎｄｌｌｌで同時に処理した（Ｂｉｓｈａｉ、　Ｌ 　Ｒ，等、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６９：１５５４−１５６３（１９８ ７）、　Ｂ１５ｈａｉ、１ｆ、Ｒ，等、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６９ ：５１４０−５１５１（１，９８７）　；これらの文献は本明細書の一部を構成 する）。ＡｐａＩ部位は構造遺伝子内のＮ末端付近にあり、Ｈｉｎｄ１１１部位 はｔｏｘ遺伝子のＣ末端のすく外側に存在する。低融点アガロースを用いて、こ の１．２に、ｂの制限断片をｐＡＢｃ４０２ヘクターの残りの４．ｌｋｂから分 離した。

クローニングのための平滑末端を作成するために、このｔｏｘ断片をＴ４　ＤＮ Ａポリメラーゼで処理した。このポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によっ てＡｐａＩの３′末端が削除され、ポリメラーゼ活性によってＨｉｎｄｌ１１部 位の突出部か補充された（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、等、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　 Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ ｂｏｒ、　ＮＹ（１９８２））　ｏ平滑末端を有するこの精製断片を３種類の読 み枠すべてを含むｐＵＸ１２の混合物中に連結した。個々の形質転換体を任意に 選択し、制限マツピングでスクリーニングすることによって、その挿入物の配向 と読み枠を決定した。さらに、ポリリンカー／アダプター／挿入物領域のヌクレ オチド配列を決定した。６種類の潜在的な配向と読み枠の組み合わせのすべてが 同定された。最後に、これらのクローンからの抽出物を、ジフテリア毒素に対す る抗血清でプローブするウェスタンプロットを用いてスクリーニングした（Ｂｌ ａｋｅ、　Ｍ、　Ｓ、等、　Ａｎａｌｙｔ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１３６：１７５ −１７９（１９８４）、　Ｍｕｒｐｈｙ、Ｊ、Ｒ，等、　Ｃｕｒｒ、　Ｔｏｐｉ ｃｓ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ、１１８：２３５−２５１（ １９８５））。

反応性毒素に関与するタンパク質は、正しい配向および読み枠にある構造遺伝子 を含むクローンからのみ検出された。このプラスミドをｐＵＤＴＡＨ−１と命名 した。そのポリリンカーのＤＮＡ配列およびｔｏｘ構造遺伝子の始まりを表１に 示す。記載した配列は、ｐＵＤＴＡＨ−１中のｔｏｘ’　構造遺伝子の始まりの ＤＮＡ配列である。ＡＴＧは転写物（ｌａｃＺ”）の開始シグナルであり、ＧＡ ＴはｐＵＸ１２の改変ポリリンカーの始まりであり、ＧＣＣはｔ。

Ｘ”遺伝子の正しい翻訳読み枠の始まりである。

ポリリンカー　オリゴヌクレオ　ジフテリア（ＡＴＧ４ａｃＺ翻訳開始コドンン 　チドアダプター　ｔｏｘ’　遺伝子Ｂ群連鎖球菌からの染色体ＤＮＡの精製を 達成するために、Ｂ群連鎖球菌のＡ９０９株（Ｌａｎｃｅｒ　１ｅｌｄ、　Ｒ， Ｃ等、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１４２　：１６５−１７９（１９７５）） から、ルーベンス等（Ｒｕｂｅｎｓ、　Ｃ，Ｅ、等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１ ．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８４ニア２０ｇ−７２１２（１９８７））に よって改良されたノール（Ｈｕｌｌ）等の方法（ｔ＋ｕ１１．　Ｒ，Ａ等、　Ｉ ｎｆｅｃｔ、　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ、　３３：９３３−９３８（１９８１）　： 上記の両文献は本明細書の一部を構成する〉によって染色体ＤＮＡを単離した。

。要約すると、ムタノリシン（ｍｕｔａｎｏｌｙｓｉｎ）を用いて、Ｂ群連鎖球 菌Ａ９０９株（Ｉａ／ｃ）をプロトプラストに変換した。得られた表面抽出物が 、無傷の該細菌に対して生じた防御的抗血清と免疫反応する数多くのタンパク質 を含有することがわかった。不溶性タンパク質画分を、従来のカラムクロマトグ ラフィーを用いて部分精製した。単一の１４牛ロタルトン（ｋｄ）種が高度に濃 縮された分画を含む２つの分画を使用してウサギを免疫化した。これらの部分精 製Ｂ群連鎖球菌タンパク質に対して生じた抗血清は、マウスビルレンス検定にお いて、Ｃタンパク質を保持するＢ群連鎖球閑の異種のくヘテロロガス）莢膜型に 対して受動的防御を付与し得ることがわかった。

Ｂ群連鎖球菌ＤＮＡを、浮揚性密度塩化セ／ウム（ＣｓＣ１）勾配中で遠心分離 することによって精製し、その染色体ＤＮＡをＴＡＥ緩衝’ｄｉ　（ｐ　Ｈ８， Ｏ）　（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、等、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、 　Ａ　１．ａｂｏｒａｔ。

ｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１（ａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ 、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ（１９W ２））に対して徹底的に透析した。Ｂ群連鎖球菌のへ９０９株は１型莢膜を有し ており、Ｃタンパク質を発現し、過去においてＣタンパク質の研究に使用されて いる（Ｖａｌｔｏｎｅｓ、　Ｍ、　Ｖ等、　Ｍｉｃｒｏｈ、　Ｐａｔｈ、　１　 ：１９＋、−２０４（１９８６））。また、スクリーニング用の防御的抗血清の 調製に使用したのもＢ群連鎖球菌のこの株である。

Ｂ群連鎖球菌染色体ＤＮＡの収量は平均して、Ｂ群連鎖球菌の終夜培養物者５０ ０　ｍ、　ｌあたり３〜５ｍｇである。精製したこのＤＮＡを、一般に使用され る２４種類の制限エンドヌクレアーゼで個別に消化し、得られた断片を１．　０ ％アガロースケルにかけた。クローニングベクターで通常使用されるポリリンカ ー上にユニーク部位を有するものを含めて、広範囲の酵素を選択した。ゲルの臭 化エチジウム（ＥｔＢｒ）染色は、すへての制限酵素かＢ群連鎖球菌Ｄ　Ｎ　Ａ の非連続な断片サイズ分布を与えることを明らかにした。このことは、Ｂ群連鎖 球菌ＤＮＡが試験した制限酵素のいずれに対しても修飾されないことを示唆して いる。

このＤ　Ｎ　Ａのブロック連結に対するβ■害剤か存在するか否かを決定するた めに、上述の制限エンドヌクレアーゼ消化物をエタノール沈殿し、連結緩衝液中 に入れ、Ｄ　Ｎ　Ａ　１．）ガーセと共に１４°Ｃて終夜インキュベー！−した 。これらの試料を再度１０％アガロースゲルにかけ、ＥｔＢｒで染色した。得ら れた制限様式（パターン）はより高分子量の分布を示した。したがってＢ群連鎖 球菌ＤＮＡの連結の阻害はなかった。

Ｂ群連鎖球菌染色体ＤＮＡのライブラリーのｐｕｘｌ　２中でのｍ１製、および それによる大腸菌の形質転換を以下のように行った。Ｂ群連鎖球菌染色体ＤＮＡ をクローニング用に切断するために、広範囲にわたる制限断片サイズの分布を与 える４種類の制限酵素を選択した。ｐＵＸ　１２ヘクターとアダプターは平滑末 端断片をクローニングする場合に最も有効である。選択した酵素は４塩基対部位 を認５識し、平滑末端を残す。Ｂ群連鎖球閑ＤＮＡを、Ａｌｕｌ、ＦｕｎＤ２、 Ｈａ　ｅ　ＩＩＩおよびＲｓ　ａ、　ｌで個別に部分消化した。

得られた断片を混合し、フェノール／クロロホルムで精製し、エタノール沈殿し 、連結緩衝液中に再懸濁した（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ等、￥ｏｌｅｃｕｌａｒ 　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　 Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ ｂｏｒ、ＮＹ（１９８２））　。Ｂ群連鎖球菌ＤＮＡ断片　１μｇを、１２マー のオリゴヌクレオチドアダプター３μｇおよび８７−のオリゴヌクレオチドアダ プター　２７．＋　ｇと混合した。Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ３μｌ　（６００単位 ：　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を加え、その反応液を終夜１４ °Ｃに維持した。遊離のリンカ−をＢ群連鎖球菌ＤＮＡ断片から酢酸カリウム速 度勾配上で分離した（Ａｒｕｆｆｏ、　Ａ。

等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４：８５７ ３−８５７７（１９８７））。

３種類の翻訳読み枠すべてを含むｐＵＸｉ、２プラスミドをＢｓｔＸｌで消化し 、そのスタッファ−断片を低融点アガロースゲルを用いて除去した。アダプター を付加したＢ群連鎖球菌断片　］、　Ｏｎ　ｇを、連結緩衝液　１００μｍ中の 直鎖状ｐＵＸ１．２ベクター　１１００ｎと混合し、これにＯ１％Ｔ４　ＤＮＡ リガーセを加えることによって、Ｂ群連鎖球菌ライブラリーを調製した。この連 結反応液を終夜１４°Ｃに維持した後、これを用いて、アンピノリンを含有する プレート上の大腸菌ＭＣ１０６１株を形質転換した（Ａｕｓｕｂｅｌ、　Ｆ。

Ｍ等、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ ｇｙ（１９８７））　。

得られた形質転換体のうぢ１６種を単離し、Ｌ　Ｂ中で終夜成育し、ミニブレツ ブによってプラスミドＤＮＡを単離した。このプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩで 消化し、１０％アガロースゲルにかけた。

スクリーニングしたすべてのプラスミドがｐＵＸｉ　２ベクター中に挿入物を含 んでおり、挿入物の平均サイズは１．４に、ｂであった。

現在までのところ、２００以上のクローンから得られたプラスミドＤＮＡをスク リーニングし、ポリリンカー中に挿入物を欠くと思われたクローンは１つだけで あった。

ライブラリーのスクリーニングに使用する防御的抗血清の特徴づけ既に議論した ように、Ｃタンパク質は種々の技術によって部分精製されており、種々の技術に よって防御的抗血清が部分精製されており、焼入かの研究者によって防御的抗血 清が調製されている（Ｂｅｖａｎｇｅｔ、　Ｉ７１等、　Ａｃｔａ　Ｐａｔｈ、 　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ、　５ｃａｎｄ、　５ｅｃｔ、　Ｂ、　９３：１１３−１１ ９（１X８５）。

Ｒｕ５ｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓ、　Ｇ、　Ｊ等、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１６０：１ ４７６−１４８４（１９８４）、　Ｙｉｌｋｉｎｓ。

ｎ、　Ｈ，Ｗ、等、　１ｎｆｅｃ、　ａｎｄ　１ｍｍｕｎ、　４：５９６−６０ ４（１９７１））。

防御的抗体を引き出すＢ群連鎖球閑の上清から分子４１１４０００のタンパク質 を単離しまたバルト不ン（Ｖａｌｔｏｎｅｎ）　、カスパーおよびレビー（ｉ、 ｅｖｙ）の実験を再現するために、一連の実験を実行した（■ａｌａｔｏｎｅｎ 、　Ｍ、　Ｖ等、　Ｍｉｃｒｏｂ、　Ｐａｔｈ、　ｌ：１９１ｌ９１−２０４（ １９：この文献は本明細書の一部を構成する）。この実験によって、Ｃタンパク 質の濃縮および精製に先立ってＢ群連鎖球菌培養物の上清にタンパク質加水分解 阻害剤を添加すると（ｖｏｎｇ、　Ｗ、　Ｗ、等、　Ｊ、　１ｍｍｕｎｏ１．　 Ｍｅｔｈｏｄｓ、　８２：３０３−３１３（１９８５乃、分子！１１４０００の タンパク質が上清中の主要タンパク質ではなくなってしまうことが明らかになっ た。このことは、このタンパク質が、Ｂ群連鎖球菌培養物の上清中のより高分子 量のＣタンパク質のタンパク質加水分解によってもたらされることを示し上述の ように、発現を検出するために最も一般的に使用されるベクターはλＧＴＩＩに 基づいている（Ｙｏｕｎｇ、　Ｒ，Ａ等＋　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａ ｄ、ｓｃｉ　ＵＳＡ　８０：１１９４−１１９８（１９８３））。本発明者らは 、細菌コロニーの抗体スクリーニングに関して過去に記述された２つの方法を組 み合わせることによって、ｐＵＸ１２プラスミドベクターからの発現の検出感度 を増大させることができた。上述のライブラリーから得た形質転換体を終夜プレ ートに置き、得られたコロニーをニトロセルロースフィルター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ）に移した。このフィルターを密閉容器中のクロロホルム（ＣＨＣＬ、）で飽和 した雰囲気下に置くことによって、これらのコロニーを溶解した。次に、ヘルツ マン（Ｈｅｉｒｍａｎ）等が記述したように（Ｈｅｌ　ｒｍａｎ、　Ｄ、　Ｍ、 等、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ＵＳＡ８０：３１−３５　（１９８３） ）　、このフィルターを溶解３緩衝液（ｌｙｓｉｓ３ｂｕｆｆｅｒ）中に入れ、 終夜インキュベートした。ノマイオラノドラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって調製されたエクスブレスーブロノトアノセイ キノト（Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｂｌｏｔ　Ａｓ５ａｙ　Ｋｉｔ）中の西洋ワサビペル オキシクーセ複合アフィニティー精製ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉ ｓｈ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ、Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｐｕ ｒｉｆｉｅｄ　Ｇｏａｔ　Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ）　（比１：３００ ０）および市販の大腸菌溶解液（比１：２００）を用いて、抗体スクリーニング を行った。上述のよう（こコロニーをクロロホルムで予備処理し、ＤＮａ　ｓ　 ｅおよびリゾチームと共に終夜インキュベートすることにより、必要な一次抗体 の比を１・５００から１・５０００に減少させることができた。

実施例６ 陽性クローンおよびそのタン、ｆり質産物の初期分析Ｂ群連鎖球菌染色体ＤＮＡ のｐＵＸ１２ベクター中のライブラリーを上述の防御的抗Ｃタンノくり質抗血清 でスクリーニング゛した。Ｂ群連鎖球菌ライブラリーは１．４ｋｂの平均断片サ イズを有していた。形質転換体を上述のようにスクリーニングした後、サブクロ ーニングし、抗血清を用いて３回置スクリーニングした。スクリーニングした２ ００００クローンのうち、防御的抗血清と反応するクローンか３５種類独立に単 離された。これらのクローンを８１〜Ｓ３５と命名し、それぞれのクローンに含 まれるプラスミドをｐＪＭＳ１〜ｐＪＭＳ３５と命名した。これらのクローンの サイズは０．　９〜１３．７ｋｂの範囲にあり、４．５ｋｂの平均サイズを有す る。

プラスミドＤＮＡをこれらのクローンからミニブレツブによつ°Ｃ単離し、その 挿入物を４種類の制限エンドヌクレアーゼで調査した。

それぞれの群内て同一の挿入物サイズおよび共通の制限エンドヌクレアーゼマツ ピング様式を共有することに基づいて、１４のクローンを３つの群に分類するこ とができる。以下に議論するクローンＳ１およびＳ２３は異なる群に属すること がわかった。

個々のクローンの制限様式をさらに比較することによって、共通の制限断片を共 有する２４クローンを同定することができた。クローンＳ１およびＳ２３は共通 の制限断片を全く有さないことかわかった。

クローンの抽出物を調製し、ウェスタンプロットにかけ、ライブラリーのスクリ ーニングに使用した抗血清でプローブした。６種類のタンパク質抗原のサイズ群 （Ａ、　−Ｆ　）を同定した。制限エンドヌクレアーゼマツピングおよびウェス タンプロットから得たデータを組み合わせることによって、３５クローンのうち の２４クローンを６種類の異なるタンパク質抗原様式に分類することかできた（ 表２）。

この初期分類は、単に関連する遺伝子の潜在的な数を粗く調査するために行った たけである。Ｓｌは３．５ｋｄのサイズであって、抗原タンパク質様式Ａに属す ることかわかった。Ｓ２３は１３７ｋｄのサイズであって、抗原タンパク質様式 りに属することがわかった。

（以下余白） 表２ タンパク質　クトンの＠　挿入物の分子Ｉ　ＤＮＡ挿入書の　抗原のサイズＢ　 ３　１．９　７６０００　５００００Ｃ７４，４１，７４０００１３００００Ｄ 　６　１３．７　＞５０００００　１１００００Ｅ　１　１．７　６７０００　 ５００００Ｆ　１　０，９　３６０００　１５０００クローンの抽出物のウェス タンプロットを、Ｃタンパク質を発現しないＢ群連鎖球菌株に対する抗血清でプ ローブした場合、１つのクローン群のみが陽性であった（タンパク質プロフィー ルＢ）。このことは陽性クローンの大半かＣタンパク質を保持する株に特有なタ ンパク質を発現するが、これらのタンパク質はＢ群連鎖球菌のすべての株に共通 ではないことを示している。

Ｂ群連鎖球菌が発現するＣタンパク質の実際の数は決定されていない。Ｃ，Ｄ、 ＣからのＣタンパク質分類化抗血清（ｔｙｐｉｎｇ　ａｎｔｉｓｅｒａ）を特徴 つけたブラディ（Ｂｒａｄｙ）等による最近の免疫学的研究は、４種類の別個の 抗原を同定した（Ｂｒａｄｙ、　！−，Ｊ、等、　Ｊ、　ｌｎｉ’ｅｃｔ、　Ｄ ｉｓ。

１５８（５）・９６５−９７２（１９８８））。Ｂ群連鎖球菌の推定上のＣタン パク質クローンを予備的に遺伝子的および免疫学的に特徴づけることによって、 ４ないし５遺伝子か、Ｃタンパク質を保持することがわかっているＢ群連鎖球閑 株上に存在するタンパク質をコードしていることが示唆される。クローニングし た遺伝子産物かＣタンパク質を表現しているか否かを決定するために、２群の実 験を実行した。

上述のように、Ｃタンパク質の研究は２つの表現型：ペプシンによる減成には感 受性であるか、トリプシンに対しては感受性でない一部のタンパク質（ＴＲまた はαと呼ばれている）、並びに、ペプシンおよびトリプシンによる減成のどちら に対しても感受性であるもう１つのタンパク笛部（ＴＳまたはβと呼ばれている ）、を定義していた（Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ｄ、　Ｌ等、　Ｊ、　ＣＩ　ｉｎ、　 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１９　：５０６−５１０（１９８４）。

Ｒｕ５ｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓ、　Ｇ、　Ｊ、等、　Ｊ、　ＥＸｐ、　Ｍｅｄ、　 １６０　：　１４７６−１４８４（１９８４））。

分類化抗血清、αおよびβ、を用いて、クローニングした遺伝子産物をウェスタ ンプロット上てスクリーニングした（　Ｂｅｖａｎｇｅｒ、　ｌ、。

等、　Ａｃｔａ　Ｐａｔｈ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ、　５ｃａｎｄ、　５ｅｃｔ、 　Ｂ、　８７　：５］−５４（１９７９）　；　Ｂｅｖａｎ■■秩B Ｌ９等、　Ａｃｔａ　Ｐａｔｈ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ、　５ｃａｎｄ、　５ｅｃ ｔ、　８．８９：２０５−２０９（１９８１）　：　Ｂｅｖ≠■ ｇｅｒ、　Ｌ、等、　Ａｃｔａ　Ｐａｔｈ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ、　５ｃａｎｄ 、　Ｓｅｅ、　Ｂ、　９１　：２３１−２３４（１９８３）@；　Ｂｅ ｖａｎｇｅｒ、　Ｌ、等、　Ａｃｔａ　Ｐａｔｈ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ、　５ｃ ａｎｄ、　５ｅｃｔ、　Ｂ、　９３：１１３−１１９（１９W５） ；　Ｂｅｖａｎｇｅｒ、　Ｌ、等、　Ａｃｔａ　Ｐａｔｈ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ 、　１ｍｍｍｕｎｏ１．５ｃａｎｄ、　Ｓｅｃ、　Ｂ、　９R：１ ２１−１２４（１９８５）　：これらの文献は本明細書の一部を構成する）。

α分類化血清はタンパク質プロフィールＤを同定し、β分類化抗血清はタンパク 質プロフィールＡを同定した。これらのタンパク質をペプシンおよびトリプシン 消化にかけた。タンパク質プロフィールＤはペプシンに対して感受性であるが、 トリプシンに対しては非感受性であり、タンパク質プロフィールＡはペプシンお よびトリプシンの両者に対して感受性である。これらの結果は過去の研究と一致 しており、少なくとも２つのＣタンパク質遺伝子がクローニングされたことを裏 付けている。

最も重要で特徴的なＣタンパク質の性質は、それらがＣタンパク質を発現するＢ 群連鎖球菌株に対する防御的抗体を引き出し得るということである。クローニン グした遺伝子産物に対する抗血清を調製するためには、幾つかの方法が使用でき る。例えば大腸菌クローンの溶解液が、導入したＢ群連鎖球菌タンパク質または 大腸菌タンパク質に対する抗体を引き出し得るタンパク質を含むか否かを決定す るために、その大腸菌クローンの溶解液をウサギに直接注射することできる。交 差反応性抗体の数を減らすために、得られた抗血清を試験する前に、得られた抗 血清を大腸菌の溶解液で予備吸収させることができる。このような溶解液は、交 差反応性抗体の数を減少させるために、発現についてクローンをスクリーニング するために使用するコロニープロットにおいても、またＢ群連鎖球菌の細胞抽出 物および部分精製したＢ群連鎖球菌タンパク質の両者を研究するために使用する ウェスタンプロットにおいても、使用することかできる。

クローニングしたＢ群連鎖球菌タンパク質抗原に対する抗血清を生じさせるため に、タンパク質プロフィールＡ、ＢおよびＤの代表的クローンを超音波処理し、 ウサギに注射する（Ｌａｎｃｅｒ　１ｅｌｄ、　Ｒ，Ｃ。

等、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１４２：１６５−１７９（１９７５）、　Ｖ ａｌｔｏｎｅｎ、　Ｍ、　Ｖ、等、　Ｍｉｃｒｏｂ、　Ｐａ狽■B １：１９１−２０４（１９８６））。対照ウサギにはポリリンカー中に挿入物を 含まないｐＵＸ１２を保持する大腸菌を注射する。この抗血清を大腸菌溶解液で 予備吸着させ、まずウェスタンプロット中でライブラリー中のクローンの抽出物 に対してスクリーニングする。したがって、クローン間の交差反応性エピトープ が存在するか否かを決定することができ、これらの抗血清が予備的なスクリーニ ング中に同定したクローン化タンパク質に対して注がれることを確認することが できる。

別法として、予備吸着させた抗血清をマウス防御モデル中で試験することもでき る。この古典的モデルでは、ウサギの抗血清をマウスに腹腔内注射する（Ｌａｎ ｃｅｆｉｅｌｄ、　Ｒ，Ｃ，等、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１４２：１６５ −１７９（１９７５））。翌日、Ｃタンパク質を保持することがわかっている生 育可能なり群連鎖球菌のしＤｌｌｏを腹腔内に再度注射する。終了点は、４８時 間後のマウスの死亡である。

クローニングした遺伝子配列によって発現するタンパク質の免疫原性を試験する ために、ｐＪＭｓｌおよびｐＪＭＳ２３を含有する大腸菌細胞を成育し、これを 用いて細胞抽出物を調製した。次にこれらの抽出物を用いてウサギを免疫化した 。ＳｌおよびＳ２３抽出物による免疫化に応答して生じた抗血清を、マウス防御 モデルを用いて試験した。

マウス防御モデル実験を行った時、タンパク質プロフィールＡおよびＤを代表す るクローン（それぞれＳｌおよび５２３）から生じた抗血清が、それぞれ防御的 であることがわかった。タンパク質プロフィールＣを代表するクローンから得た 抗血清は防御的ではなく、対照抗血清も防御を示さなかった。またタンパク質プ ロフィールＣを発現するクローンに対して生じた抗血清は、Ｃタンパク質を保持 しないＢ群連鎖球菌株から抽出したタンパク質を結合した。したかつてこの群の クローンはＣタンパク質をコードしていない。要約すると、６群のクローンのう ち５群が、Ｃタンプくり質を発現するＢ群連鎖球菌株に特有の（ユニークな）タ ンプくり質をコードしていな〜）。

２つのクローン群の生化学的、免疫学的および機能的な初期分析によって、少な くとも２つのＣタンパク質遺伝子（Ｓｌおよび５２３）のクローニングが成功し ていることが立証された。これは、Ｂ群連鎖球菌からクローニングされた単一ポ リペプチド遺伝子産物が防御的免疫を引き出し得るという最初の証明である。Ｓ ｌに対する抗体が、Ａ９０９抽出物の５０　ｋ、　ｄおよび６０ｋｄのバンドを 結合し得ることがわかった。Ｓ２３に対する抗体が、Ｂ群連鎖球菌表面抽出物中 の分子量＞１８０ｋｄ〜４０ｋｄの範囲のバンドの定期的な繰り返し様式に結合 し得ることがわかった。Ａ、　９０９抽出物からを示す。このことは異なる分子 量のタンパク質中で単一のエピトープが認識されたことを示しており、規則的な 繰り返し構造を示唆している。Ｓ１抗血清によって認識されるタンプ（り質はペ プシンおよびトリプシン減成に対して感受性であり、一方、Ｓ２３抗血清によっ て認識されるタンパク質はペブ／ンに対しては感受性であるが、トリブ／ンに対 しては非感受性であった。この実験は、ＢＲ連鎖球菌から部分精製され、Ｂ群連 鎖球菌クローン化遺伝子から発現したこれらのタンパク質か、Ｂ群連鎖球菌のＣ タンパク質のαおよびβ抗原を表現していることを示している。

上述の３５の潜在的Ｃタンパク質クローンを遺伝子的および免疫学的に評価する ことによって、存在する遺伝子の数を決定することができる。さらにこれらのク ローンの単離は、Ｂ群連鎖球菌感染に対する防御的免疫を付与する遺伝子の同定 を可能にする。初期クローンを得るために使用した防御的抗血清は、Ｃタンパク 質以外のタンパク質をも検出したようである。このような他のタンパク質を連鎖 球菌Ｂ感染に対する治療において使用することも、本発明に包含される。本発明 の主たる目的は免疫性に関与するタンパク質の単離および同定であるので、これ らのクローンによって発現したタンパク質に対して調製した抗血清を、マウス防 御モデルで研究することができる。防御的なタンパク質を発現するこれらの遺伝 子は複合ワクチン用のタンパク質として好ましい。

上述のように、大腸ｍ／ｐＵＸ１２ヘクターライブラリー中のＢ群連鎖球菌染色 体ＤＮＡを、防御的抗血清で初期スクリーニングすることによって、３５クロー ンが独立に単離された。これらのクローン化断片の制限エンドヌクレーセマ・ノ ビング、並びに、これらのクローンから得たタンパク質抽出物のウェスタンプロ ットのデータを組み合わせることによって、３５クローンのうちの２４クローン を６種の異なるタンパク質抗原様式（表２）に仮分類することができた。この調 査は、単離された遺伝子の潜在的な数を決定することを可能にした。

このようなりローンをさらに特徴づけるために、コロニープロットを用いて、ど のクローンか共通のＤＮＡ配列を共有しているかを決定することが好ましい。こ のようなプロットのためには、それぞれのクローンの単一コロニーをＬＢブロス の入った微ｔｉ定皿のウェルに入れ、３７°Ｃて終夜生育させる。対照コロニー には宿主大腸菌株およびｐｕｘ　１２を含有する大腸菌株が含まれる。この終夜 培養物を、同一培養培地を含む寒天プレート上のニトロセルロースフィルター上 に移す。これらのプレートを３７°Ｃで８時間以上生育させ、新鮮に生育したコ ロニーを含有するニトロセルロースフィルターを調製し、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブ リッド形成についてスクリーニングする。プローブを、ｐＵＸ１２ライブラリー 中のＢ群連鎖球菌ＤＮＡ挿入物から調製する。ミニブレノブを用いてそれらのク ローンからプラスミドＤＮＡを得る。ｐＵＸ１２中のポリリンカーはＢａｍＨ１ およびＢｓ　ｔＸ１部位の両者を挿入物の両側に有している。したがって、Ｂａ ｍＨｌかＢｓｔＨｌのいずれかを用いて、プラスミドからＢ群連鎖球菌挿入物を 切り出す。幸運なことに、Ｂ群連鎖球菌の染色体ＤＮＡにはＢａｍ８１部位がほ とんど無く、挿入物の多（はＢａｍＨＢｔｉ化の結果、−断片としてベクターか ら取り出される。低融点アガロースを用いてこれらの挿入物からプラスミドベク ターを分離する。これらの挿入物をアガロースケルから切り出し、ランダムプラ イム標識化（ｒａｎｄｏｍ　ｐｒｉｍｅ　ｌａｂｅｌｌｉｎｇ）によって直接標 識する。次に、標識したこれらの挿入物を用いてコロニープロットをプローブす る。これにより、Ｄ　Ｎ　Ａ配列を共有するクローンを同定することができる。

このように上述のコロニープロットから得た情報に基づいて、３Ｓクローンを、 ＤＮＡ配列を共有する群に分類する。これらの群を複数の制限エンドヌクレアー ゼでマツピングすることにより、それぞれのクローンと他のクローンとのそのＤ 　Ｎ　Ａ領域内での関係を決定スる。宿主プラスミドｐＵＸ１２はポリリンカー 中にのみ存在すル多くのユニーク制限エンドヌクレアーゼ部位を有しているので 、プラスミドミリプレノブＤＮＡを用いて、挿入物を別個に精製する必要なく、 制限マツピングの多くを実行できる。コロニープロットのデータを詳細な制限マ ツピングと組み合わせることによって、含まれている遺伝子座の数を合理的に評 価することができる。クローン群のいくつかが興味ある遺伝子をどこにも表して いない場合、これらのクローンを用いて、より完全な他の遺伝子コピーを染色体 ライブラリーから単離する必要があるかも知れない。しかしながら、最初に単離 した３５クローンの平均サイズ分布が大きいことを考慮すると、いくつかは完全 な読み取り枠を表しているであろうと思われる。

遺伝子分析を続行する前に、クローニングした遺伝子産物に対する抗血清を調製 し、これをマウス防御モデルで使用することによって、Ｂ群連鎖球菌による感染 を防御するこれらの抗血清の能力を決定することが好ましい（Ｌａｎｃｅｒ　１ ｅｌｄ、　Ｒ，Ｃ，等、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１４２　：１６５−１７ ９（１９７５）、　Ｖａｌｔｏｎｅｎ、Ｍ、Ｖ等、　Ｍｉｃｒｏｂ、　Ｐａｔｈ 、　Ｉ：１９１−２０４（１９８６））。

防御的抗体を引き出し得るタンパク質を発現するクローンは、複合ワクチンに用 いるための好ましい候補である。防御的抗体を引き出し得ないクロー／をさらに 分析することによって、それらもワクチンのための候補で有るか否を決定しても よい。Ｃタンパク質は膜結合性であるので、あるクローンによって発現したタン パク質が防御的抗体を引き出し得ないことは、そのタンパク質が大腸菌および高 コピー数ベクター中で安定でないという事実を反映しているのかも知れない。こ の問題は、Ａ群およびＢ群連鎖球菌から他の膜タンパク質をクローニングする際 に起こった（Ｋｅｈｏｅ、　Ｍ、等、　Ｋｅｈｏｅ、　Ｍ、等。

Ｉｎｆｅｃｔ、ａｎｄ　１ｍｍｕｎ、４３：８０４−８１０（１９８４）、　Ｓ ｃｈｎｅｅｗｉｎｄ、Ｏ，等、　ｌｒ＋４ｅｃ、　ａｎｄｌｍｍｕｎ、　５６・ ２１７４−２１７９（１９８８））。予備研究で単離した３５クローンのうちの いくつかは、小コロニー形態学を示す。さらに、これらのクローンのいくつかは 不安定であり、Ｂ群連鎖球菌ＤＮＡ挿入物部分かｐｕｘ　１２ポリリンカーから 脱落することかわかった。これらのクローンを安定化するために使用できる技術 はい（つかあり、それらには、低コピー数ヘクター中か、もしくは減弱化への調 節が可能なプロモーターの後に入れるか、３７℃ではなく３０°Ｃでクローンを 生育させるか、膜タンパク質を蓄積するように適応させたベクター中にクローニ ングすること、が含まれる。さらに、ｐＵＸ１２のようなｐＢＲ３２２由来のプ ラスミドのコピー数を制限する大腸菌宿主、ｐｃｎＢ、中にこれらのプラスミド を導入することができる（ｌ、０ｐｉｌａｔｏ　Ｊ、等、ｂｌｏＩＧｅｎ、Ｇｅ ｎｅｔ、２０５：２８５−２９０　（１９８６）　；この文献は本明細書の一部 を構成する）。

また、あるクローンが防御的抗体を引き出すタン）４４質を発現し得ないことは 、発現したタンパク質が防御に重要なエピトープを欠いていることを示している のかも知れない。これは、全遺伝子がクローニングされていないか、もしくは大 腸菌中で発現し得なかった場合である。Ｂ群連鎖球菌中ではＣタンパク質の翻訳 後プロセッシングか行われ、大腸菌中にクローニングしたＣタンパク質遺伝子に ついては行われないのかどうかも問題であろう。完全な遺伝子のサブクローニン グ抽出および／またはそれが発現し得る代替宿主環境へのその転移の必要がある かも知れない。

また、あるクローンが防御的抗体を引き出すタンノ＜り質を発現し得ないことは 、大腸菌内で生産された抗原から引き出される抗体か、Ｂ群連鎖球菌上の天然Ｃ タンパク質によって動物から引き出されるものとは異なっていることを示してい るのかも知れない。さらに、ウサギの免疫化に使用した溶解細菌抽出物は、いく つかの大腸菌タンパク質抗原を含んでいる。したがって、動物モデルでの試験に 用いる抗血清は、生物全体からではな（、部分精製した遺伝子産物から得る必要 があるであろう。

防御的抗体を引き出し得るクコーン化Ｂ群連鎖球菌タンノ〈り質はいずれもＣタ ンパク質と呼ぶことができる。この実験群のために調製した抗血清は、これらの タンパク質の位置を特定するためにも使用されるであろう。

害施例８ Ｃタンパク質遺伝子のマツピング、特徴づけ、および配列決定Ｃタンパク質遺伝 子をさらに特徴づけるために、上述のＣタン／　Ｎｌｌり質遺伝子クローンの微 細構造遺伝子地図を調製し、そのＤＮＡ配列を決定することができる。このよう なマ・ノビングはゲノムのサザンブ口、トを使用して達成することが好ましい。

ＣタンＡｊ質遺伝子のＤＮＡ配列を決定することによって、そのリポソーム結合 部位、潜在的プロモーター、シグナル配列、および独特の反復配列を含む遺伝子 構造を決定することができる。これらのＤＮＡ配列を既知のＤＮＡ配列ライブラ リーと比較することによって、既に特徴つけられている他の遺伝子と相同性があ るか否かを調べることが好まし０゜さらに、Ｃタンパク質のタンパク質配列をそ れらの遺伝子のＤＮＡ配列から決定することができる。しばしば、タン／り質配 列の分析によって、そのタンパク質の構造、機能および細胞内位置について予測 することができる。

したかって、ゲノムのサザンブロノトを用いて、これらの遺伝子が連結している か否かを決定することが好ましい。この技術のためには、Ｂ群連鎖球菌染色体Ｄ ＮＡを、６塩基対以上を含む配列を同定するいくつかの異なる制限エンドヌクレ アーゼで個別に消化する。

この目的は、複数遺伝子を保持し得る染色体ＤＮＡのより大きな断片を得ること にある。次に個々のエントヌクレーセ消化物をアカロースゲルにかけ、ニトロセ ルロース上に移す。次にこのサザンブロノトを、上述のライブラリーから誘導し た標識挿入物でプローブする。

コロニープロットまたはエンドヌクレアーゼマツピングで関連すると思われなか った２つのクローンか、同様の染色体バンドに結合した場合、それは、それらが 同じ遺伝子の一部であるか、もしくはそれらが染色体上で近（に連結している２ つの遺伝子であることを示しているであろう。どちらも場合にも、次の研究のた めに、これらのより大きな遺伝子断片クローニングして取り出す方法がいくつか ある。１つの技術は、Ｂ群連鎖球菌のコスミドライブラリーを調製し、興味ある プローブの１つとの）＼イブリット形成についてスクリーニングすることである 。２以上の興味ある遺伝子を含むクローンが得られたら、既に記述したクローン について記述したように、エンドヌクレアーゼでマツピングし、防御的抗原の発 現について研究することができる。

上述のクローンの同定はそれらのＤＮＡ配列決定を可能にする。

クローンがｐＵＸｌ、２プラスミド上にある場合、逆転写酵素による二本鎖ＤＮ Ａ配列決定を用いて、ポリリンカーに対して調製したオリゴヌクレオチドプライ マーからの配列決定を行うことができる。

この技術はｐＵＸ、１２プラスミドの特徴づけにおいて既に使用しており、６０ ０塩基対以上の遺伝子の配列を決定するための複数の追加オリゴヌクレオチドブ ライマーを配列決定するための迅速な方法である。したがって、Ｍｌ　３−末鎖 ＤＮＡ配列決定系中にサブクローニングすることによって、Ｃタンパク質遺伝子 のＤＮＡ配列を決定することが好ましい（Ａｕｓｕｂｅｌ、、　Ｆ、　！Ａ等、 Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　！Ａｏｌａｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８７））。

Ｃタンパク質のＤＮＡ配列の解明は、その遺伝子の構造、機能および調節並びに そのタンパク質産物に関する本質的な情報を提供する。前述のように、多くの研 究者らによって単離されたＣタン／くり質のサイズの異種性およびそれらの見か け上の抗原性の多様性は、遺伝子族（ファミリー）あるいはＣタン／＜り質遺伝 子のタン７　ｆり質産物を修飾するための翻訳後の機構の可能性を示唆している （Ｆｅｒｒｉｅｒｉ、Ｐ等、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　２７：１０２３ −１０３２（１９８０））　、　Ａ群連鎖球菌のＭタンパク質がこの現象の一例 として既に議論されている（Ｓｃｏｔｔ、　ＪＲ等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２：１ｇ２２−１８２６（１９８５））　 。ノ胃ブリッド形成法ではＭタンパク質のＤ　Ｎ　Ａ配列はＢ群連鎖球菌染色体 ＤＮＡとの相同性を示さないが、これらのＤＮＡ配列の間には構造的相同性か存 在し得る（）ｌｏｔ　ｌｉｎｇｓｈｅａｄ、　Ｓ、　′に等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ 、　Ｃｈｅｍ、　２６１　：１６７７−１６８６（１，９８６）、　５ｃｏｔｔ 、　Ｊ、　Ｒ，等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　Ｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪＳ Ａ　８２　：　１８２Q−１８２６（１ ９８５）、　５ｃｏｔｔ、　Ｊ、　Ｒ等、　１ｎｆｅｃ、　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ 、　５２：６０９−６１２（１９８６戸。Ｃタンパク質のＤＮＡ配列を既知のＤ ＮＡ配列のライブラリーと比較することか好ましい。さらに、そのＤＮＡ配列か ら得られるアミノ酸配列も既知のアミノ酸配列のライブラリーと比較する。

実施例９ Ｃタンパク質遺伝子の優勢 Ｃタンパク質遺伝子の優勢（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）を決定するために、臨床的 に得た染色体ＤＮＡおよび研究室で得たＢ群連鎖球菌の種々の抗原型の単離物を 、ゲノムサザンブロ、トヒで、ＣタンパクＮ　遺伝子でプローブする。さらに、 Ｃタンパク質遺伝子の発現の調節に関する情報を得るために、Ｄ　Ｎ　Ａ　−Ｄ 　Ｎ　Ａハイブリッド形成によって示された遺伝子組成物を用いる沈降素技術に よって決定した表現型発現の比較を行った。Ｃタンパク質遺伝子のプローブを用 いて、他の型の連鎖球菌および他の細菌病原体から得た染色体ＤＮＡをスクリー ニングした。

ランセフイールドが使用した最初の分類化株のほとんどを含むＢ群連鎖球菌の単 離物のＣタンパク質遺伝子からプローブを調製し、標識した（Ｌａｎｃｅｆｉｅ ｌｄ、　Ｒ，Ｃ，等、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１４２：１６５−１７９（ １９７５））。

臨床的に得たＢ群連鎖球菌および研究室で得たＢ群連鎖球菌の２４の単離物のコ ロニープロットを、上述の微量滴定技術を用いてスクリーニングした。次に、種 々の株がＣタンパク質遺伝子にハイブリッド形成する能力を、Ｃタンパク質に対 して注がれる分類化抗血清に結合しているこれらの生物の表現型特徴と比較する 。この方法では、どの株がＣタンパク質のいずれか、またはすへてを保持してい るかを決定することができ、また、いくつかの株かこれらの遺伝子の非活性なあ るいは潜在的なコピーを保持しているか否かを決定することができる。

次に、Ｃタンパク質遺伝子のサイズ、構造および位置を決定するために、コロニ ープロット上でＣタンパク質遺伝子プローブとハイブリッドを形成する株を、ゲ ノムのサザンブロノトを用いてスクリーニングする。コロニープロット上で結合 を示したＢ群連鎖球菌株から単離した染色体ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで 消化し、アガロースケルにかけ、ニトロセルロース上にプロットする。これらの サザンブロノトをＣタンパク質遺伝子のプローブでプローブする。

この方法では、異なるＢ群連鎖球菌抗原型において、これらの遺伝子の位置およ びサイズに相違があるか否かを決定することかでき、また臨床的に単離した（即 ち潜在的に毒性の）単離物と研究室の株（および臨床的にコロニー化したが、感 染を伴わないもの）との比較が可能である。

Ｃタンパク質遺伝子プローブを用いて、他の連鎖体菌株および種々の病原性細菌 をスクリーニングすることも好ましい。連鎖体菌株は、ビルレンスを伴う他のタ ンパク質（ＭおよびＣタンパク質を含む）を共有することがわかっている（Ｆａ ｈｎｅｓｔｏｃｋ、　Ｓ、　Ｒｏ等、　Ｊ、　Ｂａｃｔ、　１６７（３）：８７ （１−８８０（１９８８）、１（ｅａｔｈ、Ｄ、Ｇ、等、　１ｎｆｅｃ、　ａｎ ｄ　Ｉｍｍｕｎ、　５５：１２３３−１２３８（１９８７）、　５ｃｏｔｔ、Ｊ 、Ｒ，等、１ｎｆｅｃ、ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ、５２：６０９−６１２（１９８６ ）、　Ｗａｌｋｅｒ、　Ｊ、八等、　Ｉｒ＋４ｅｃ、　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ、　 ５５：１１８４−１１８９（１９８７）　；これらの文献は本明細書の一部を構 成する）。まず、試験する株がＣタンパク質遺伝子プローブと相同な配列を有す るか否かを決定するために、コロニープロットを用いてこれらの株をスクリーニ ングする。次に、コロニープロット上での陽性を試験する細菌株の染色体ＤＮＡ で、ゲノムのサザンブロソトを調製する。次に、Ｃタンパク質において例えば膜 アンカーとして作用する領域、免疫グロブリンのＦＣ領域に結合する領域、ある いは他の細菌中で同様の機能を有する他の遺伝子との相同領域を共有する領域な との相同領域の位置を特定し定義するために、これらのプロットをＣタンパク質 遺伝子でプローブする。

潜在的なビルレンスを伴う性質のいくつかがＣタンパク質にあると考えられてお り、これらには耐性オブロニン作用および食菌作用に続く細胞内での殺菌の阻害 が含まれる（Ｐａｙｎｅ、　Ｎ、　Ｒ，等、　Ｊ、　１ｎｆｅｃ、　Ｄｉｓ、１ ５１：６７２−６８１（１９８５）、　Ｐａｙｎｅ、Ｎ、Ｒ等、　Ｉｎｆｅｃ、 　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ、　５５：１２４３−１２５１（１９８７乃。ビルレンス に関するＣタンパク質の役割をより良く理解するために、Ｃタンパク質遺伝子が 個別に変異している同遺伝子型株を構築する。これらの株を新生ラットモデルで ビルレンスについて試験するであろう（Ｚｅｌｉｇｓ、　Ｂ、　Ｊ等、　１ｎｆ ｅｃ、　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ、　３７：２５５−２６３（１９８２乃。２つの方 法が、Ｂ群連鎖球菌のビルレンスに関するＣタンパク質の役割を評価するための 同遺伝子型株を作成するために使用できる。好ましくは、自己複合化（ｓｅｌｆ −ｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅ）　トランスポゾンｔｎ９１８を用いるトランスポゾ ン変異処理法が使用できる。別法として、部位特異的変異導入法も使用できる。

Ｂ群連鎖球菌における遺伝子操作には有効な方法がないので、Ｂ群連鎖球菌中の 遺伝子を改変し、ビルレンスを研究するための同遺伝子型株を作成するための新 しい遺伝子技術を開発する必要がある（Ｌｏｐｉ　１ａｔｏ。

Ｊ等、　Ｍｏｌ　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　２０５：２８５−２９０（１９８６ ）　；この文献は本明細書の一部を構成する）。

トランスポゾン挿入変異処理法は、ビルレンスを伴う抗原の発現が異なる同遺伝 子型株を構築するために一般に使用される技術であり、Ｂ群連鎖球菌でのその使 用は十分記述されている（Ｃａｐａｒｏｎ、　Ｍ。

Ｇｏ等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　８４ ：８６７７−８６８１（１９８７）、　Ｒｕｂｅｎｓ、　ＣCＥ。

等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４ニア２０８ −７２１２（１９８７）、　ｍａｎｇｅｒ、　Ａ、　Ｒ，、qｅ ｓ、　Ｙｅｔ、　Ｓｃｉ、　３８：２０２−２０８（１９８５）、　Ｗｅｉｓｅ ｒ、　Ｊ、　Ｎ、　、　Ｔｒａｎｓ　Ａｓ５ｏｃ、　Ａｍｅ秩A　Ｐｈｙ ｓ、　９８：３８４−３９１（１９８５）　：これらの文献は本明細書の一部を 構成する）。

ルーベンスらは、Ｂ群連鎖球菌莢膜の研究におけるＴｎ９１６の有用件を立証し ている（Ｒｕｂｅｎｓ、　Ｃ，Ｅ、　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、　ＩＪＳＡ　８４ニア２０８−７２１２（１９８７））。自己複合化 トランスポゾンＴＮ９１６は、既に記述されているように、大便連鎖球菌からＢ 群連鎖球菌中に作成できる（Ｗａｎｇｅｒ、　Ａ、　Ｒ，、Ｒｅｓ、　Ｙｅｔ、 　Ｓｃｉ、　３８：２０２−２０８（１９８５）　；この文献は本明細書の一部 を構成する）。抗生物質耐性マーカーの取得について株を選択し、上述のように 調製した特異的抗血清によって検出されるＣタンパク質発現の欠失について、コ ロニープロット上でスクリーニングする。Ｃタンパク質遺伝子内での挿入位置を 特定するために、Ｃタンパク質を発現しないと思われる単離物を、ケノムのサザ ンブロｌトを用いてさらにマツピングすることかできる。元来のＴｎ９１６株は ｔｅｔＲを保持していたが、エリスロマインン耐性マーカーが最近Ｔｎ９１６中 にクローン化された（Ｒｕｂｅｎｓ、　Ｃ，Ｅ等、Ｐｌａｓｍｉｄ　２０：１３ ７−１４２（１９８８））　。Ｔ　ｎ　９１６による変異処理に続いて、！異株 かこのトランスポゾンのＩコピーだけを保持しており、このトランスポゾンかＣ タンパク質遺伝子内に局在していることを示す必要がある。

これらの技術は、Ｃタンパク質遺伝子がＢ群連鎖球菌の生存に必須でない限り、 Ｂ群連鎖球菌中のＣタンパク質遺伝子を欠失させるために直接適用できる。しか し、検出可能なＣタンパク質が全く欠如しているＢ群連鎖球菌株か記述されてお り、また、細菌のビルレンス決定因子かインビトロでの生存に必須の遺伝子であ ることは珍しい。調査されるであろうＴｎ９１６の別の使用法は、Ｃタンパク質 遺伝子の潜在的な調節要素の同定である。

特異的に定義された変異が望ましい場合、あるいはＣタンパク質遺伝子がＢ群連 鎖球菌の生育に必須である場合は、例えば条件付の変異体（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ａｌ　ｍｕｔａｎｔ）を作成するために、部位特異的変異導入法を使用すること かできる。このように部位特異的変異導入法はＢ群連鎖球菌タンパク質の遺伝子 分析に使用できる。Ｂ群連鎖球菌におけるこの技術の開発を遅らせている問題は 、Ｂ群連鎖球菌を形質転換する際に直面する困難性である。電気穿孔法は、他の 方法では形質転換が困難な細菌中にＤＮＡを導入する際に役立つことか立証され ている（Ｓｈｉｇｅｋａｗａ、　Ｋ等、Ｂｉｏｔｅｃｈ　６：７４２−７５１（ １９８８）　：この文献は本明細書の一部を構成する）。電気穿孔法を用いてＢ 群連鎖球菌を形質転換するための条件を使用することによって、この障害を克服 できる。したがって、相補性を評価し、Ｃタンパク質を発現しないＢ群連鎖球菌 中にＣタンパク質遺伝子を導入するために、部位特異的変異導入を行うことかで きる。天然または変異Ｃタンパク質遺伝子をＢ群連鎖球菌株中に挿入するために はいくつかの方法のうちのいずれを使用してもよい。例えば、薬剤耐性マーカー をｐＵＸ１２中のＣタンパク質遺伝子クローン内に挿入することかできる。

Ｂ群連鎖球菌中で発現し得るか、通常には存在しない薬剤耐性マーカーか好まし い。この改変ｐＵＸ１．２タンパク質クローンを、電気穿孔法を用いてＢ群連鎖 球菌中に導入する（Ｓｈｉｇｅｋａｗａ、　Ｋ、等＋Ｂｌｏｔｅｃｈ　６：７４ ２−７５Ｂ１９８８）　：この文献は本明細書の一部を構成する）。ｐＵＸ１２ プラスミドはＢ群連鎖球菌内では復製できないので、その薬剤耐性表現型を獲得 した株は、宿主ＧＢ染色体上のＣタンパク質遺伝子とｐＵＸ１２プラスミド上に 保持されている変異Ｃタンパク質との相同性組換えによって、それを行うと思わ れる。これらの変異体を上述のようにスクリーニングする。受容株中に相同性配 列か無い場合には、既知の連鎖球菌遺伝子、即ちＢ群連鎖球閑由来の天然の薬剤 耐性マーカー遺伝子内に挿入されたＣタンパク質遺伝子でヘクターを構築するこ とかてきる。電気穿孔法に続いて、このようなプラスミド構築物は相同性組換え によって染色体中に組み込まれるであろう。

別法として、改変したＣタンパク質遺伝子を自己複合化トランスポゾンＴｎ９１ ６中に挿入し、大便連鎖球菌からの交配を通してこの改変トランスポゾンを導入 することによって、改変したＣタンパク質遺伝子をＢ群連鎖球菌中に導入するこ ともてきる。この技術を使用することによって、Ｔｎ９１６をエリスロマイシン 遺伝子で改変し、この遺伝子をＢ群連鎖球菌の染色体中に挿入することに成功た （　Ｒｕｂｅｎｓ、　Ｃ，Ｅ等、Ｐｌａｓｍｉｄ　２０：１３７−１４２（１９ ８８））　。Ｔ　ｎ　９１６による変異処理に続いて、その変異株が該トランス ポゾンを１つだけ保持しており、そのトランスポゾンがＣタンパク質遺伝子内に 局在していることを示す必要かある。

実施例１１ Ｂ群連鎖球菌のビルレンスにおけるＣタンパク質の役割の評価Ｃタンパク質を保 持するＢ群連鎖球菌株とＣタンパク質を保持しないＢ群連鎖球菌株を比較した過 去の研究には、同遺伝子型であることが分かっていなかった単離物が含まれてい た（Ｆｅｒｒｉｅｒｉ、　Ｐ等。

Ｒｅｖ、　Ｉｎｆ、　Ｄｉｓ、　１０（２）　：１００１００４−１（１７１（ １９８゜したがって、観測されたビルレンスの相違かＣタンパク質に関連するも のが、あるいは何が他のビルレンス決定因子に関連するものかを決定することが できなかった。無傷のＣタンパク質遺伝子またはＣタンパク質遺伝子欠失のいず れかを有する同遺伝子型株の構築は、ビルレンスにおけるＣタンパク質の役割の 特徴づけを可能にする。これらの株を、ビルレンスについては新生ラットモデル で、その免疫原性についてはマウス防御モデルで試験することが好ましい。第２ の重要なビルレンス試験は、変異株中でのアレル置換の反転によってビルレンス を回復する遺伝子の能力である。Ｃタンパク質遺伝子を保持しないが、もしくは 不活化したＣタンパク質遺伝子を保持するＢ群連鎖球菌株中に、Ｃタンパク質遺 伝子を挿入すれば、得られた構築物のビルレンスを上記の動物モデルで試験する ことによって、Ｃタンパク質の効果を決定することができる。

Ｃタンパク質遺伝子が個別に変異したＢ群連鎖球菌の同遺伝子型株を、トランス ポゾン変異処理法または部位特異的変異導入法のいずれかを用いて作成すること ができる。染色体上の挿入が１つだけであることを決定するために、このような 株をゲノムのサザンブロノトで特徴づけることが好ましい。上述の微細構造遺伝 子マツピング技術を用いて、これらの挿入位置を確定することができる。次にこ れらの同遺伝子型株を、新生ラットモデル中でビルレンスについて試験する（Ｚ ｅｌｉｇｓ、　Ｂ、　Ｊ等、　Ｉｎｆｅｃ、　ａｎｄ　１ｍｍｕｎ、　３７：２ ５５−２６３（１９８２））。

トランスポゾン変異処理法は、Ｃタンパク質の発現の調節に関与する遺伝子の同 定を可能にする。例えば野生型Ｃタンパク質遺伝子を保持している株であって、 トランスポゾン変異処理の後にＣタンパク質を発現しなくなったことがわかり、 しかもトランスポゾンがそのＣタンパク質構造遺伝子内に位置しない株は、Ｃタ ンパク質遺伝子の発現の調節に関与する配列中に変異を保持している。この方法 を用いて、Ｍタンパク質の調節に関与するＡ群連鎖球菌中のｍｒｙ遺伝子座の特 徴っけが成功した（Ｃａｐａｒｏｎ、　Ｍ、　Ｇ、等＋　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　 ｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　８４：８６７７−８６８１（１９８７） 、　Ｒｏｂｂｉｎｓ、　Ｊ、　Ｃ等、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１６９F ５６３３−５６４０（１９８７）　；これらの文献は本明細書の一部を構成する ）。

これらの方法は、Ｃタンパク質を過剰発現する株、あるいはビルレンスまたは免 疫性の異なるＣタンパク質を産出する株を作成するためにも使用できる。

実施例１２ Ｃタンパク質のＢ群連鎖球菌上での位置の特定および免疫グロブｌ）ンに対する それらの結合能の評価ランセフイールドおよび他の研究者らは、Ｃタンパク質に 対する抗体がＢ群連鎖球菌の外膜に結合することを明らかにしている（Ｌａｎｃ ｅｆｉｅｌｄ、　Ｒ，Ｃ等、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１４２：１６５−１ ７９（１９７５）、　Ｗａｇｎｅｒ、　Ｂ、等、Ｊ、Ｇｅｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ｌ、　１１８：９５−１０５（１９８０））　。このことはＣタンパク質が外膜 タンパク質であることを示唆している。また、Ｃタンパク質はＢ群連鎖球菌の培 養上清から単離でき、このことは、これらのタンパク質かＢ群連鎖球菌によって 分泌されるか、もしくは細胞表面から高速度で失われることを示している。Ｃタ ンパク質遺伝子から誘導されたＤＮＡおよびタンパク質配列は、Ｃタンパク質の 構造と機能を決定する際に役立つ。Ｃタンパク質に関して一般に記述されている 潜在的なビルレンス決定因子は、免疫グロブリンＩｇＡに結合する能力である（ Ｆｅｒｒｉｅｒｉ、　Ｐ、等、　Ｒｅｖ、　ｌｎｆ、　Ｄｉｓ、　１０（２）　 ：１０１００４−１０７１（１９８、Ｒｕ５ｓｅｌ−Ｊｏｎｅｓ、Ｇ、Ｊ等、　 Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６０　：　１４６７−１４７５（１９８４））。

免疫電子顕微鏡を使用して、特異的抗体によって検出される細胞表面決定因子の 位置を特定した。Ｂ群連鎖球菌のＣタンパク質クローンに対して生じた抗血清を 、Ｃタンパク質を保持するＢ群連鎖球菌株と共にインキ二ベートする。フェリチ ン結合ヤギ抗ウサギＩｇＧを用い、既に記述されているようにして細胞表面上の 抗原を検出する（Ｒｕｂｅｎｓ、　Ｃ，Ｅ、等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　８４ニア２Ｄ８−７２１２（１９８７j 、胃ａｇｎｅｒ　Ｂ、等、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１１８： ９５−１０５（１９８０））。

免疫グロブリンに対するＣタンパク質の結合能の簡便な決定は、ウェスタンプロ ットを用いて評価できる。Ｃタンパク質遺伝子を含有する大腸菌クローンおよび Ｃタンパク質を保持するＢ群連鎖球菌の両方の細胞抽出物をＳ　Ｄ　Ｓ−Ｐ　Ａ 、　Ｇ　Ｅにかけて、ニトロセルロース上にプロットすることかできる。対照に は、野生型ｐＵＸ１２プラスミドを保持する大腸菌、Ｃタンパク質遺伝子を保持 しないＢ群連鎖球菌株、およびＣタンパク質遺伝子が不活化されている同遺伝子 型Ｂ群連鎖球菌株の抽出物が含まれる。このウェスタンプロットを、標識した免 疫グロブリン、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、およびそれらの成分、例えばＦ ＣまたはＦ（ａｂ）＝断片で、個別にプローブすることかできる（Ｈｅａｔｈ、 　Ｄ、　Ｇ、等、　Ｉｎｆｅｃｔ、　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ、　５５：１２３３− １２３８（１９８７）、　Ｒｕ５ｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓ、Ｇ１等、　Ｊ、　Ｅｘ ｐ、　Ｍｅｄ、　１６０　：　１４６７−１４７５（１９８４））。これらの免 疫グロブリンを、ヨードゲン（ｉｏｄｏｇｅｎ）またはクロラミンＴを用いてヨ ウ素化することが好ましい。

免疫グロブリンおよびその成分に対するＣタンパク質の結合能を測定するための 、より特異的な方法には、Ｃタンパク質を精製し、それらを結合検定に直接用い ることが含まれる（Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ、　Ｓ、　Ｒ。

等、　Ｊ　Ｂａｃｔ、　１６７（３）　：８７０−８８０（１９８６）、　Ｈｅ ａｔｈ、　Ｄ、　Ｇ、等、　Ｉｎ４ｅｃｔ、　ａｎｄ　Ｉｍ高■ ｎ、５５：１２３３−１２３８（１９ｇ？））　、タンパク質配列を用いれば、 Ｃタンパク質を精製することができる。加えて、Ｃタンパク質遺伝子は大腸菌中 て発現し得るので、Ｃタンパク質を過剰生産する大腸菌株を構築することかでき 、それゆえに精製用のＣタンパク質を大量に得ることかできる。

上述の記述は特定の好ましい態様について言及しているか、本発明がこれらに限 定されないことは理解されるであろう。開示した態様に種々の改変を加え得るこ と、並びに、そのような改変が本発明の範囲に包含されると考えられていること に、当業者は気付くであろう。

Ｂ群連鎖球菌の上述の防御的Ｃタンパク質抗原を、複合ワクチン中てのその能力 について試験した。この能力を評価するために、ｐＪＭＳＩまたはｐＪＭＳ２３ を含有する大腸菌の細胞抽出物を上述のように調製し、これをウサキの免疫化に 使用した。得られた抗血清ヲ、マウスの致死率モデルにおいて、マウスをＢ群連 鎖球菌Ｈ３６Ｂ株による感染から防御するその能力について試験した。）（３６ Ｂ株はＢ群連鎖球菌のＣタンパク質を保持している。対照として、Ｃタンパク質 を保持しない連鎖球菌５１５株による感染に対してマウスを防御するこの抗血清 の能力を決定した。これらの実験の結果を表４に示す。

上述の記述は特定の好ましい態様について言及しているが、本発明がこれらに限 定されないことは理解されるであろう。開示した態様に種々の改変を加え得るこ と、並びに、そのような改変か本発明の範囲に包含されると考えられていること に、当業者は気付くであろう。

（以下余白） 図１ 図　３ 図　４ マウスの防御データの要約 国際調査報告 ζ＾Ｉ＃を止喝−ｏｎ畠１＾ρ叶忙１電唱◇１ＩＮ６Ｉ＋Ｉ”Ｔ／丁ＩＣＱＩＭ Ｍ７（＋Ｐｒ：Ｔ／ｌ’ｓ９ｎ＃＋５２５１

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. １．（ｂ）Ｂ群連鎖球菌のタンパク質；に結合した（ａ）莢膜多糖； からなる、該Ｂ群連鎖球菌による感染に対する宿主免疫を付与し得る複合ワクチ ンであって、該タンパク質が組換えＳ１タンパク質および組換えＳ２３タンパク 質からなる群から選択される複合ワクチン。
2. ２．該タンパク質がＣタンパク質である請求項１の複合ワクチン。
3. ３．Ｂ群連鎖球菌のタンパク質をコードする遺伝子配列からなる組換え分子であ って、該タンパク質が組換えＳ１タンパク質および組換えＳ２３タンパク質から なる群から選択される組換え分子。
4. ４．該タンパク質がＢ群連鎖球菌のＣタンパク質である請求項３の組換え分子。
5. ５．プラスミドｐＪＭＳ１である請求項４の組換え分子。
6. ６．プラスミドｐＪＭＳ２３である請求項４の組換え分子。
7. ７．該分子が細菌中で該タンパク質を発現し得る請求項３の組換え分子。
8. ８．該分子が細菌中で該Ｃタンパク質を発現し得る請求項３の組換え分子。
9. ９．該細菌が大腸菌細菌である請求項７の組換え分子。
10. １０．組換えＳ１タンパク質および組換えＳ２３タンパク質からなる群から選択 されるＢ群連鎖球菌のタンパク質。
11. １１．Ｂ群連鎖球菌がもたらす感染を防ぐか、もしくは緩和する方法であって、 そのような感染の危険にあると思われる個体に、該感染に対する宿主免疫を付与 し得る複合ワクチンの有効量を投与することからなり、該ワクチンが、 （ｂ）該Ｂ群連鎖球菌のタンパク質；に結合した、（ａ）該Ｂ群連鎖球菌特有の 莢膜多糖、からなり、該タンパク貧が組換えＳ１タンパク質および組換えＳ２３ タンパク質からなる群から選択される方法。
12. １２．該タンパク質がＣタンパク質である請求項１１の方法。
13. １３．該タンパク質がプラスミドｐＪＭＳ１によってコードされているタンパク 質である請求項１１の方法。
14. １４． 該タンパク質がプラスミ ドｐＪＭＳ２３によってコードさ れているタンパク質である請求項１１の方法。
15. １５． Ｂ群連鎖球菌がもたらす感染を防ぐか、もしくは緩和する方法であって、妊娠し ている女性（雌）に、該女性（雌）の胎児に該感染に対する免疫を付与し得る複 合ワクチンの有効量を投与することからなり、該ワクチンが、 （ｂ）該Ｂ群連鎖球菌のタンパク質；に結合した、（ａ）該Ｂ群連鎖球菌特有の 莢膜多糖、からなり、該タンパク質が組換えＳ１タンパク質および組換えＳ２３ タンパク質からなる群から選択される方法。
16. １６． 該タンパク質がＣタンパク質である請求項１５の方法。
17. １７． 該タンパク質がプラスミドｐＪＭＳ１によってコードされている請求項１５の方 法。
18. １８． 該タンパク質がプラスミ ドｐＪＭＳ２３によってコードさ れている請求項１５の方法。
19. １９．Ｂ群連鎖球歯がもたらす感染を防ぐか、もしくは緩和する方法であって、 そのような感染の危険にあると思われる固体に、該感染に対する宿主免疫を付与 し得る複合ワクチンに第２の個体をさらすことによって引き出された抗血清の有 効量を投与することからなり、該ワクチンが、 （ｂ）該Ｂ群連鎖球菌のタンパク質；に結合した、（ａ）該Ｂ群連鎖球菌の莢膜 多糖、 からなり、該タンパク質が組換えＳ１タンパク質および組換えＳ２３タンパク質 からなる群から選択される方法。
20. ２０． 該タンパク質がＣタンパク質である請求項１９の方法。
21. ２１． 該タンパク質がプラスミ ドｐＪＭＳ１によってコードされ ている請求項１９の方法。
22. ２２． 該タンパク質がプラスミ ドｐＪＭＳ２３によってコードさ れている請求項１９の方法。
23. ２３． 該抗血清が毒素で標識されている請求項１９の方法。