JPH11502104A

JPH11502104A - ゴナドトロピン放出ホルモン受容体活性の抑制および調節

Info

Publication number: JPH11502104A
Application number: JP8524961A
Authority: JP
Inventors: シー．シールフォン，スチュアート
Original assignee: マウントシナイスクールオブメディシンオブザシティーユニバーシティーオブニューヨーク
Priority date: 1995-02-17
Filing date: 1996-01-26
Publication date: 1999-02-23
Also published as: EP0815116A4; US5985583A; WO1996025423A1; CA2213315A1; EP0815116A1

Abstract

(57)【要約】本発明はＧｎＲＨ−Ｒ遺伝子およびタンパク質に関する。本明細書に開示するＤＮＡ配列は、ＧｎＲＨ−Ｒの産生のために設計された発現系に、および／またはＧｎＲＨ−Ｒを発現し、そして好ましくはＧｎＲＨ誘導シグナル伝達に応答する細胞系に、遺伝子操作され得る。そのような細胞系は、ＧｎＲＨアゴニストおよびアンタゴニストをスクリーニングし、同定するために有利に用いることができる。本発明の別の側面によれば、ＧｎＲＨＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列、ＧｎＲＨ発現産物、およびそのような産物に対する抗体を、ＧｎＲＨ−Ｒの異常な発現（例えば、過剰発現、過少発現、または機能不全な変異型受容体の発現）に関連する生殖疾患の診断および療法に用いることができる。ＧｎＲＨ−Ｒトランスジーンを有するトランスジェニック動物は、ＧｎＲＨ類似体のin vivo評価のための動物モデルとして用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】ゴナドトロピン放出ホルモン受容体活性の抑制および調節１．序論本発明はゴナドトロピン放出ホルモン受容体（ＧｎＲＨ−Ｒ）のクローニング、およびＧｎＲＨ−Ｒを発現する遺伝子工学的に作製された宿主細胞に関する。そのような工学的に作製された細胞は、ＧｎＲＨ−Ｒの活性化、調節および脱共役に関与する薬物およびＧｎＲＨ類似体を評価し、スクリーニングするのに用いることができる。２．発明の背景ＧｎＲＨ−Ｒは神経系および内分泌系の統合における重要なメディエーターである。正常な生殖は、特異的な高親和性下垂体受容体に結合してゴナドトロピンである黄体形成ホルモン（ＬＨ）および濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の分泌を開始させる、生理的濃度のＧｎＲＨの拍動性(pulsatile)放出に依存している。生理的濃度のＧｎＲＨは調和を保ちながら正常な生殖を統合するが、高レベルのアゴニストは反対の応答、すなわちゴナドトロピン分泌の抑制を引き起こす。視床下部−下垂体−性腺軸を活性化および抑制するＧｎＲＨ類似体の能力は、不妊から前立腺癌にいたる種々の疾患の治療において広く臨床的有用性を見いだされてきた。性腺刺激物質ＧｎＲＨ−Ｒの応答性および能力は、アゴニスト、濃度および暴露パターンによって影響される（Clayton，1989，J．Endocrinol 120:11-19）。 in vivoおよびin vitro両方の研究が、低濃度の拍動性のＧｎＲＨは受容体の活動を刺激し、そして高濃度のアゴニストは受容体のダウンレギュレーションおよび脱感作を誘導することを立証した。ＧｎＲＨのその受容体への結合は、ホスホリパーゼＣを刺激し、イノシトール-1,4,5-トリホスフェートおよびジアシルグリセロールを生成する(Huckle およびConn，1988，Endocrine Reviews 9: 387-3 95）。次に、これらの第２メッセンジャーは細胞内貯蔵物からカルシウムを放出し、プロテインキナーゼＣを活性化する。受容体のアップレギュレーションは、プロテインキナーゼＣとカルシウムの両方を必要とするように思われる(Huckle およびConn，1988，Endocrine Reviews 9: 387-395; Huckleら，1988，Journal of Biological Chemistry 263: 3296-3302; Youngら，1985，Journal of Endocr inology 107: 49-56)。どのエフェクターがダウンレギュレーションの基礎をなしているのかは不明である。ＧｎＲＨ−Ｒの調節および脱感作の基礎となる作用機構の理解においては受容体結合の研究により大きな進歩があったが、ＧｎＲＨ−Ｒ遺伝子の転写物および生合成の直接測定はこれまで不可能であった。ＧｎＲＨ−ＲｃＤＮＡのクローニングは、ＧｎＲＨ−Ｒの活性化、調節および脱共役の評価を進展させるであろう。この受容体の一次配列の決定は、改善された類似体の方向づけられた設計を容易にするであろう。しかし、強い興味にもかかわらず、今日までＧｎＲＨ−Ｒ遺伝子は如何なる種においてもクローニングして発現させられていない。３．発明の概略本発明はＧｎＲＨ−Ｒ遺伝子およびタンパク質に関する。本明細書に開示するＤＮＡ配列は、ＧｎＲＨ−Ｒの産生のために設計された発現系に、および／またはＧｎＲＨ−Ｒを発現し、そして好ましくはＧｎＲＨ誘導シグナル伝達に応答する細胞系に、遺伝子操作され得る。そのような細胞系は、ＧｎＲＨアゴニストおよびアンタゴニストをスクリーニングし同定するために有利に用いることができる。本発明の別の側面によれば、ＧｎＲＨＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列、ＧｎＲＨ発現産物、およびそのような産物に対する抗体を、ＧｎＲＨ−Ｒの異常な発現（例えば、過剰発現、過少発現、または機能不全な変異型受容体の発現）に関連する生殖疾患の診断および療法に用いることができる。ＧｎＲＨ−Ｒトランスジーンを有するトランスジェニック動物は、ＧｎＲＨ−Ｒ類似体のin vivo評価のための動物モデルとして用いることができる。本明細書に記載するＧｎＲＨ−Ｒ配列の解明は、生殖内分泌学における大きな進歩を反映しており、そして、ＧｎＲＨ−Ｒのシグナル伝達および調節の複雑な性質を明らかにする。大抵のホルモンシグナルと異なり、ＧｎＲＨは極めて重要な情報を伝える脈拍の振動数および振幅を有する拍動性の様式で放出される(Wei ssら，1990，Mol．Endocrinol．4:557-564; Hasenlederら，1991，Endocrinolog y 128: 509-517)。ＧｎＲＨ−Ｒ結合能それ自体が、暴露期間および濃度に依存してアゴニストによってアップまたはダウンレギュレーションされる(LoumayeおよびCatt，1982，Science 215: 983-985)。前立腺肥大、前立腺癌、子宮内膜症および性的早熟を含む種々のヒト疾患のコントロールを助けるＧｎＲＨアゴニストの臨床的有用性は、下垂体脱感作の誘導に依存している。ＧｎＲＨ−Ｒのクローニングは、視床下部、下垂体および性腺の各ホルモンの複雑な相互作用のより大きい理解をもたらすであろう。４．図の説明図１。アンチセンスオリゴヌクレオチドによるセロトニン（５ＨＴ）受容体およびＧｎＲＨ−Ｒ発現のハイブリッド阻害。100 nM ５ＨＴまたは200 nM ＧｎＲＨを横線の位置で浴に導入した。Ａ：ラット脳ＲＮＡ（５ＨＴ応答用）、αＴ３ −１ＲＮＡ（ＧｎＲＨ応答用）およびアンチセンス５ＨＴ_IC受容体オリゴヌクレオチドの混合物を前もって注射しておいた卵母細胞における５ＨＴおよびＧｎＲＨへの応答。16個の細胞が同じ応答を示した。Ｂ：ラット脳ＲＮＡ、αＴ３− １ＲＮＡおよびアンチセンスＷＺ７オリゴヌクレオチドの混合物を前もって注射しておいた卵母細胞におけるＧｎＲＨおよび５ＨＴへの応答。24個の細胞が同じ応答を示した。図２。卵母細胞中に発現されたクローンＷＺ２５の特徴付け。ＧｎＲＨアンタゴニストの不在下（左）および存在下（右）にＷＺ２５転写物を注射した卵母細胞のＧｎＲＨへの電気生理学的応答。図示した３つのトレーシング(tracing)は異なる細胞に由来する。実線および点線は、それぞれＧｎＲＨおよびＧｎＲＨアンタゴニストの投与を示す。注射をしなかった卵母細胞はＧｎＲＨに全く応答しなかった(n=12)。Ｂ：ＷＺ２５由来の転写物を注射した卵母細胞の膜におけるＧｎＲＨ−ＡおよびＧｎＲＨによる¹²⁵Ｉ−ＧｎＲＨ−Ａの置換。注射をしなかった卵母細胞由来の膜と組み合わせたαＴ３−１細胞膜を用いた匹敵する置換曲線も示した（●）。誤差線はＳＥＭを示す。図３。クローンＷＺ２５のヌクレオチド配列（配列番号１）および推定されるアミノ酸配列（配列番号２）。番号付けは981 塩基対オープンリーディングフレームの最初のメチオニンから始まる。推定されるアミノ酸配列をヌクレオチド配列の下に示す。推定上の膜貫通領域 I〜VII に下線を付してある。アミノ酸配列の下に付した記号は、潜在的Ｎグリコシル化部位（▲）、およびプロテインキナーゼＡ（◆）、カゼインキナーゼ２（●）およびプロテインキナーゼＣ（＊）のリン酸化部位を示す(Hubbard およびIvatt，1981，Ann．Rev．Biochem．50:555- 583; KempおよびPearson，1990，Trends Biochem．Sci．15:342-346; Pearson およびKemp，1991，Meth．Enzymol．200: 62-81; Kennelly およびKrebs，1991 ，J．Biol．Chem．266:15555-15558)。図４。ＧｎＲＨ−Ｒの疎水性プロット、ならびにＧｎＲＨ（マウスゴナドトロピン放出ホルモン受容体）、ＩＬＲ（ヒトインターロイキン−８受容体）(Murph y およびTiffany，1991，Science 253: 1280-1283)、ＳＰＲ（ラットサブスタンスＰ受容体）（HersheyおよびKrause，1990，Science 247: 958-962）、β１Ｒ（ヒトβ１−アドレナリン性受容体）(Frielleら，1987，Proc．Natl．Acad．Sc i．USA 84:7920-7924)、およびＲＨＯ（ヒトロドプシン）(NathansおよびHognes s，1984，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81: 4851-4855)のアミノ酸配列のアライメント。Ｉ〜VII は推定上の領域を示す。枠で囲んだ部分は同一のアミノ酸残基を示す。図５。ＧｎＲＨ−ＲｍＲＮＡの分布。Ａのオートラジオグラム：２μg のマウス全下垂体、ＧＴ−１、ＧＨ３およびＡｔＴ２０ＲＮＡ、および65 ngのα Ｔ３−１全ＲＮＡを用いた溶液ハイブリダイゼーションアッセイ。Ｂ：３μg のポリ（Ａ）⁺αＴ３−１ＲＮＡを用いたノーザンブロット分析。Ｃ〜Ｆ：ラット下垂体前葉 in situハイブリダイゼーション。Ｃ：アンチセンスプローブＸ線フィルムオートラジオグラフィー。Ｄ：センスプローブ対照(検量線= 450 μm) 。Ｅ、Ｆ：エマルジョンに浸漬した下垂体前葉切片の暗視野(検量線= 50μm)、明視野(検量線= 100 μm)光学顕微鏡写真。分子量マーカーはHind IIIで消化したλ ＤＮＡであった。図６。アフリカツメガエル卵母細胞におけるヒトＧｎＲＨ−ＲｃＤＮＡの発現。図７。pSV2A-ヒトＧｎＲＨ−Ｒ構築物を用いてトランスフェクトしたＣＯＳ− １細胞から調製した膜に結合している〔¹²⁵Ｉ〕ＧｎＲＨアゴニストの置換。図８。pSV2A-ヒトＧｎＲＨ−Ｒを用いてトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞におけるイノシトールホスフェート産生に及ぼすＧｎＲＨおよびＧｎＲＨアンタゴニストの効果。図９。ヒトＧｎＲＨ−Ｒのヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列。図10。ヒトＧｎＲＨ−ＲｃＤＮＡを用いたノーザンブロット分析。レーン１（Ｔ）：ヒト精巣ポリ（Ａ）ＲＮＡ；レーン２（Ｐ）：ヒト下垂体ポリ（Ａ）ＲＮＡ；レーン３（Ａ）：ヒトβ−アクチンｃＤＮＡ；レーン４（Ｒ）：ヒトＧｎＲＨ−ＲｃＤＮＡ．図11。ヒトＧｎＲＨ−Ｒの構造図。５．発明の詳細な説明本発明はマウスおよびヒトのＧｎＲＨ−Ｒのクローニングおよび発現に関する。生殖系において中心的な役割を果たすＧｎＲＨ−Ｒは、Ｇタンパク質結合受容体に特徴的な７つの膜貫通ドメインによって特徴付けられるが、典型的な細胞内Ｃ末端を欠いている。ＧｎＲＨ−Ｒのこの変わった構造および調節ドメインは、この受容体に媒介されるシグナル伝達および調節の独特な側面に関与している。本発明により生産されるＧｎＲＨ−Ｒは、受容体の活性化、調節および脱共役に関与する薬物およびＧｎＲＨ類似体を評価しスクリーニングするのに用いることができる。または、ＧｎＲＨ−ＲＤＮＡ、オリゴヌクレオチドおよび／またはアンチセンス配列、またはＧｎＲＨ−Ｒ、そのペプチド断片、またはそれらに対する抗体を生殖疾患の診断および／または治療に用いることができる。説明を明確にするため、以下の分節では例としてマウスおよびヒトのＧｎＲＨ −Ｒを取り上げて本発明を説明する。しかし、原則を同様に適用して他の種のＧｎＲＨ−Ｒをクローニングし発現させること、およびこの独特なＧｎＲＨ−Ｒファミリーに属する他の受容体（すなわち、細胞内Ｃ末端を欠き、かつＧｎＲＨまたはその類似体に結合するＧタンパク質型受容体）をクローニングし発現させることが可能である。５．１．ＧｎＲＨ−Ｒコード配列マウスＧｎＲＨ−Ｒのヌクレオチドコード配列（配列番号１）および推定されるアミノ酸配列（配列番号２）を図３に示す。ヒトＧｎＲＨ−Ｒのヌクレオチドコード配列および推定されるアミノ酸配列を図９に示す。本発明は以下のものを含む遺伝子を包含する。すなわち、（ａ）本明細書に開示するＤＮＡ配列（図３および９に示す）の少なくとも１つ；（ｂ）本明細書に開示するＤＮＡ配列（図２および９に示す）によってコードされるアミノ酸配列をコードする任意のＤＮＡ配列；（ｃ）高ストリンジェント条件下で〔例えば、 0.5 M NaHPO₄、7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、１mM ETDA 中で65℃でフィルター結合ＤＮＡとハイブリダズさせ、そして 0.1xSSC/0.1% SDS を用いて68℃で洗浄する（Ausubel F.M.ら(編)，1989，Current Protocols in Molecular Biolo gy，Vol．I，Green Publishing Associates Inc．およびJohn Wiley & Sons，In c.，New York，p．2.10.3）〕本明細書に開示するコード配列（図２および９に示す）の相補体にハイブリダイズし、かつ上記（ａ）の遺伝子によってコードされる遺伝子産物に機能的に等価な遺伝子産物をコードする、任意のＤＮＡ配列；および／または（ｄ）中程度のストリンジェント条件等の比較的低いストリンジェント条件下で〔例えば、0.2xSSC/0.1% SDS を用いて42℃で洗浄する（Ausubel ら，1989，前出）〕本明細書に開示するコード配列（図２および９に示す）の相補体にハイブリダイズし、なおかつ上記（ａ）の遺伝子によってコードされる遺伝子産物に機能的に等価な遺伝子産物をコードする、任意のＤＮＡ配列である。本発明はまた、上のパラグラフの（ａ）から（ｄ）に記載のＤＮＡ配列にハイブリダイズし、それゆえそれらの相補体である核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子をも含む。そのようなハイブリダイゼーション条件は、上に記述するように、高ストリンジェント条件であるか、またはそれより低いストリンジェント条件であってよい。核酸分子がデオキシオリゴヌクレオチド（「オリゴ」）である場合、高ストリンジェント条件とは、例えば、6xSSC/0.05% ピロリン酸ナトリウムを用いて37℃(14塩基オリゴの場合)、48℃(17塩基オリゴの場合)、55℃(20塩基オリゴの場合)および60℃(23 塩基オリゴの場合)で洗浄することをいう。これらの核酸分子は、例えば、標的遺伝子の調節に有用な標的遺伝子アンチセンス分子として、および／または標的、フィンガープリントおよび／または経路遺伝子核酸配列の増幅反応におけるアンチセンスプライマーとして、働きうる。さらに、そのような配列は標的遺伝子の調節に有用なリボザイムおよび／または三重らせん配列の一部として用いることができる。さらに、そのような分子は、ＧｎＲＨ−Ｒ関連疾患の存在、またはそれにかかりやすい素質を検出する診断方法の構成要素として用いることができる。本発明はさらに（ａ）上記コード配列および／またはそれらの相補体（すなわちアンチセンス配列）の任意のものを含むＤＮＡベクター；（ｂ）コード領域の発現を引き出す調節エレメントと機能しうる形で連結された上記コード配列の任意のものを含むＤＮＡ発現ベクター；および（ｃ）宿主細胞中でコード領域の発現を引き出す調節エレメントと機能しうる形で連結された上記コード配列の任意のものを含む遺伝子工学的に作製された宿主細胞を包含する。本明細書に用いる調節エレメントという用語は、以下のものを含むがそれらだけに限定されない。すなわち、誘導性および非誘導プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよび発現を引き出し、調節する当業者に公知の他のエレメントである。本発明は本明細書に開示するＤＮＡ配列の任意のものの断片を包含する。最長オープンリーディングフレームは、分子量が約37,000の327アミノ酸タンパク質をコードする。３個の共通なＮ結合グリコシル化部位が存在し、２個はＮ末端に、そして１個は第１の細胞外ループに存在する（図３）。推定されるタンパク質の疎水性分析は、他のＧタンパク質受容体と20〜30% の配列類似性を有し、そしてインターロイキン−８受容体に最も高い相同性を有する、７つの高度に疎水性のアミノ酸ドメインを明らかにしている（図４）。ＧｎＲＨ−ＲはＧタンパク質受容体スーパーファミリーのほとんど最小のメンバーであるが、ＧｎＲＨ−Ｒの第１の細胞質ループはＧタンパク質受容体のどれよりも長く、そして他のＧタンパク質受容体とは異なり、ＧｎＲＨ−Ｒは極性の細胞質Ｃ末端を欠いている。ＧｎＲＨ−Ｒには高度に保存された残基、例えば多くの受容体を安定化させる最初の２つの細胞外ループのそれぞれにあるシステイン残基等が存在する一方、ＧｎＲＨ−Ｒの幾つかの特徴は他と異なっている。例えば、多くのＧタンパク質受容体の機能にとって必須であることが見いだされた高度に保存された膜貫通ドメインIIのアスパラギン酸／グルタミン酸は、アスパラギンに置換されている。他のＧタンパク質受容体からの別の逸脱は、膜貫通ドメインIII の近隣に位置する保存されたチロシンがセリンに代わっていることである。これは、他のＧタンパク質受容体のシグナル伝達にとって重要なドメインにおいて、ＧｎＲＨ−Ｒに独特の潜在的なリン酸化部位を作り出している。他の潜在的な調節リン酸化部位もまた存在する（図３参照）。本発明はまた、ヒトを含む他の種から単離されたＧｎＲＨ−Ｒ遺伝子に関する。³²Pで標識したマウスＧｎＲＨ受容体の挿入配列を用いて、ランダムヘキサマープライミングによりλgt10ヒト下垂体ｃＤＮＡライブラリーを釣り上げることにより、ヒトＧｎＲＨ受容体をクローニングした。単離したクローンが機能性ヒトＧｎＲＨ−Ｒをコードすることを確認するため、合成ＲＮＡ転写物を卵母細胞に注射した。ＲＮＡを注射した卵母細胞はすべて、ＧｎＲＨに暴露すると大きな減極性電流を発生し、クローニングされたＤＮＡ断片が機能性受容体をコードしていることを示した。ヒトＧｎＲＨ−Ｒのヌクレオチドコード配列（配列番号３）および推定されるアミノ酸配列（配列番号４）を図９に示す。ヒトクローンの配列決定は、984 bp オープンリーディングフレームを含む2160 bpの挿入配列を同定した。上記オープンリーディングフレームは、マウス受容体の推定される配列に90% 同一な328 アミノ酸タンパク質をコードする。疎水性分析は、Ｇタンパク質結合受容体に特徴的な７つの疎水性ドメインを同定した。マウス受容体の推定される構造に関して見いだされたように、ヒトＧｎＲＨ−Ｒは本質的にいかなるＣ末端細胞内ドメインをも欠いている。２個の潜在的Ｎ結合グリコシル化部位が存在し、それらは最初の細胞外ドメインのそれぞれに１個づつ存在する。数個の細胞質セリンおよびトレオニン残基が細胞内ドメインに見いだされ、これらは調節リン酸化部位として働くのかもしれない（図11）。放射性標識したヒトＧｎＲＨ−Ｒをプローブとして用いたノーザンブロット分析は、ヒト下垂体ポリ（Ａ）ＲＮＡ中に約4.7 kbの転写物を同定した（図10）。ヒト精巣から精製したポリ（Ａ）ＲＮＡ中には、またはヒトβアクチンｃＤＮＡ対照を用いた場合には、いかなるシグナルも検出されなかった。上記ＲＮＡの５’末端および３’末端非翻訳ドメインの範囲を決定するため、一次ライブラリースクリーニング由来のファージ単離物のＰＣＲ分析を実施した。ＧｎＲＨ−ＲｃＤＮＡ挿入配列の５’末端に近い配列に相当するアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマー、または上記挿入配列の３’末端付近に相当するセンスプライマーを、近隣のＧＴＩクローニング部位に対して設計されたプライマーと組み合わせて用いて、未精製クローンをマップした。同定された最長ＰＣＲ産物は、-1.3 kb の付加的５’末端配列および-0.3 kbの付加的３’末端配列を有していた。これらのデータは、ＧｎＲＨ−ＲｍＲＮＡが少なくとも 1.3 kbの５’末端非翻訳配列および 1.5 kb の３’末端非翻訳配列を有することを示唆する。ノーザンブロットデータに基づくならば、これは付加的非翻訳配列( 〈1kb)が単離されたクローンのいずれにも含まれていないことを示唆する。本発明はまた、ＧｎＲＨ−Ｒ活性が存在する他の種より単離したＧｎＲＨ−Ｒ遺伝子に関する。ＧｎＲＨ−Ｒファミリーのメンバーは、本明細書では、ＧｎＲＨに結合する受容体と定義される。このような受容体は、ヌクレオチドレベルで約80%の相同性を、そして膜貫通ドメインの外の領域に位置する実質的な配列におけるアミノ酸レベルでは90%もの相同性を示しうる。ＧｎＲＨ−Ｒファミリーの他の受容体のクローニングは、多数の異なる方法で実施することができる。例えば、マウスおよびヒト配列を用いて、ＰＣＲプローブとして使用可能な縮重または完全縮重オリゴヌクレオチドプローブを設計することがでる。もしくは、ＧｎＲＨ−Ｒを発現する適切な細胞由来のｃＤＮＡライブラリー、またはゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。図３および11にそれぞれ示すマウスおよびヒト配列のＮ末端および細胞質ループ（細胞内および細胞外の両方）を有利に用いて、このようなオリゴヌクレオチドプローブを設計することができる。なぜなら、これらの領域はＧｎＲＨ−Ｒファミリー内で比較的保存されているに相違ないからである。または、バクテリオファージｃＤＮＡライブラリーを、低減したストリンジェンシー条件のもとで、ヒトまたはマウスＧｎＲＨ−Ｒクローンの放射性標識化断片を用いてスクリーニングし、ＧｎＲＨ−Ｒ関連タンパク質を単離することができる。使用できるクローニング戦略の総論としては、例えば、Maniatisら、1989 ,Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Press，N.Y. ；およびAusubel ら、1989，Current Protocols in Molecular Biology，Green Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.を参照されたい。本発明によれば、ＧｎＲＨ−Ｒ、その断片、融合タンパク質または機能的等価物をコードするヌクレオチド配列を、適切な宿主細胞においてＧｎＲＨ−Ｒもしくはその機能的に活性なペプチド、融合タンパク質または機能的等価物の発現を引き出す組換えＤＮＡ分子の作製に使用することができる。または、ＧｎＲＨ− Ｒ配列の部分とハイブリダイズするヌクレオチド配列を、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、サザンおよびノーザンブロット分析、等に使用することもできる。遺伝子暗号の縮重により、実質的にＧｎＲＨ−Ｒアミノ酸配列、例えば図３に示すマウス配列（配列番号２）または図９に示すヒト配列（配列番号４）、またはその機能的等価物をコードする他のＤＮＡ配列を、本発明の実施においてＧｎＲＨ−Ｒのクローニングおよび発現に使用することができる。このようなＤＮＡ配列には、ストリンジェントな条件下でマウスまたはヒトＧｎＲＨ−Ｒ配列とハイブリダイズ可能なＤＮＡ配列、または遺伝子の縮重がないならばストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡ配列が含まれる。ストリンジェントな条件は種々の方法で調節することができる。たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施する場合は、プライマーの鋳型へのアニーリングが起こる温度、または反応緩衝液中のMgCl₂の濃度を調節することができる。放射性標識化ＤＮＡ断片またはオリゴヌクレオチドを用いてフィルターを精査する場合は、ストリンジェンシーは洗浄液のイオン強度を変えることにより、またはフィルター洗浄を実施する温度を注意深くコントロールすることにより調節することができる。本発明にしたがって使用することができる変更されたＤＮＡ配列は、同一の、または機能的に等価な遺伝子産物をコードする配列をもたらす、様々なヌクレオチド残基の欠失、付加または置換を含む。遺伝子産物それ自体が、表に現れない、したがって機能的に等価なＧｎＲＨ−Ｒを産生するサイレント変化をもたらす、ＧｎＲＨ−Ｒ配列内のアミノ酸残基の欠失、付加または置換を含有してもよい。このようなアミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性の類似性に基づいてなされる。例えば、負に荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ；正に荷電したアミノ酸にはリシンおよびアルギニンが含まれ；類似した親水性値をもつ非荷電の極性ヘッド基(head group)を有するアミノ酸には以下のものが含まれる：すなわち、ロイシン、イソロイシン、バリン；グリシン、アラニン；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；フェニルアラニン、チロシンである。本明細書では、機能的に等価なＧｎＲＨ−Ｒとは、ＧｎＲＨに結合するが、その天然の対応物であるＧｎＲＨ−Ｒと必ずしも同一の結合親和性を有するわけではない受容体、をいう。本発明のＤＮＡ配列は、遺伝子産物のプロセシングと発現を改変する変更を含むがそれらだけに限定されない種々の目的に合わせて、ＧｎＲＨ−Ｒコード配列を変更するために遺伝子工学的に作製することができる。例えば、当分野で周知の技法（例えば、部位特異的突然変異誘発法）を使用して突然変異を導入し、新しい制限部位を挿入する、グリコシル化パターン、リン酸化等を変える、などが可能である。例えば、酵母等の特定の発現系において、宿主細胞が遺伝子産物を過度にグリコシル化することがある。そのような発現系を使用するときは、ＧｎＲＨ−Ｒコード配列を変更してＮ−結合グリコシル化部位を除去することが好ましい。例えば、マウス配列においては、図３に示すグリコシル化部位の１個以上を変更することによりこれが達成できる。本発明の別な態様においては、ＧｎＲＨ−Ｒ配列または改変されたＧｎＲＨ−Ｒ配列を異種配列に連結して、融合タンパク質をコードさせることができる。融合タンパク質は、ＧｎＲＨ−Ｒを異種部分から切り離せるように、ＧｎＲＨ−Ｒ配列と異種タンパク質配列との間に位置する開裂部位を含むように遺伝子工学的に作製することも可能である。本発明のまた別な態様においては、当分野で周知の化学的方法を用いて、ＧｎＲＨ−Ｒのコード配列を全部または部分的に合成することが可能であろう。例えば、Caruthers ら、1980，Nuc．Acids Res．Symp．Ser．7:215-233; Creaおよび Horn，180，Nuc．Acids Res．9(10):2331; Matteucci および Caruthers，1980, Tetrahedron Letters 21:719; ならびに Chow および Kempe，1981，Nuc．Acids Res．9(12):2807-2817 参照。または、ＧｎＲＨ−Ｒアミノ酸配列を全部または部分的に合成する化学的方法を用いて、タンパク質自体を作製することも可能であろう。例えば、ペプチドは固相法により合成し、樹脂から切り離し、分取高速液体クロマトグラフィーにより精製することができる（例えば、Creighton，198 3，Proteins Structures And Molecular Principles，W.H．Freeman and Co.，N ．Y.，pp．50-60参照）。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析または配列決定により確認できる（例えば、エドマン分解法; Creighton，1983，Proteins Stru ctures and Molecular Principles，W.H．Freeman and Co.，N.Y.，pp．34-49参照）。５．２．ＧｎＲＨ−Ｒの発現生物学的に活性なＧｎＲＨ−Ｒを発現するため、ＧｎＲＨ−Ｒまたは上記第５ .１節に記述したその機能的等価物をコードするヌクレオチド配列を適切な発現ベクター、すなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含むベクターに挿入する。ＧｎＲＨ−Ｒ遺伝子産物、および組換えＧｎＲＨ −Ｒ発現ベクターによってトランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞または細胞系は、種々の目的に使用できる。これらの目的には、以下のものが含まれるがそれだけに限定されない。すなわち、ＧｎＲＨの結合を競合的に阻害しＧｎＲＨの活性を「中和する」抗体を含む、この受容体に結合する抗体（つまりモノクローナルおよびポリクローナル抗体）の作製；ＧｎＲＨ−Ｒを介して作用するＧｎＲＨ類似体または薬物のスクリーニングおよび選択；等である。５．２．１．発現系当業者に周知の方法を用いて、ＧｎＲＨ−Ｒコード配列および適切な転写／翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、in vitro組換えＤＮＡ技法、合成技法およびin vivo組換え／遺伝子組換えが含まれる。例えば、Maniatisら，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manu al,Cold Springs Harbor Laboratory，N.Y.およびAusubelら、1989，Current Pr oto cols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates and Wiley Inters cience，N.Y．に記述されている技法を参照されたい。種々の宿主−発現ベクター系がＧｎＲＨ−Ｒコード配列を発現するのに使用できる。これらは以下のものを含むがそれだけに限定されない。すなわち、ＧｎＲＨ−Ｒコード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換した細菌等の微生物；ＧｎＲＨ−Ｒコード配列を含む組換え酵母発現ベクターを用いて形質転換した酵母；ＧｎＲＨ−Ｒコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ；タバコモザイクウイルスＴＭＶ）に感染させた、またはＧｎＲＨ−Ｒコード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）を用いて形質転換した植物細胞系；または、安定に増幅された（例：ＣＨＯ／ｄｈｆｒ）またはＤＭ染色体中で不安定に増幅された（例：マウス細胞系）ＧｎＲＨ−ＲＤＮＡの多重コピーを含むように遺伝子操作した細胞系を含む、組換えウイルス発現ベクター（例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルス）に感染させた動物細胞系である。これらの系の発現エレメントは、その強度と特異性において異なる。使用する宿主／ベクター系により、構成プロモーターおよび誘導プロモーターを含む多数の適切な転写および翻訳エレメントの任意のものを発現ベクターに使用できる。例えば、細菌系でクローニングを行うときは、バクテリオファージλのpL、plac 、ptrp、ptac（ptrp-lacハイブリッドプロモーター）等の誘導プロモーターが使用できる；昆虫細胞系でクローニングを行うときは、バキュロウイルスのポリヒドリンプロモーター等が使用できる；植物細胞系でクローニングを行うときは、植物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、熱ショックプロモーター；RUBI SCO の小サブユニットのプロモーター；クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロモーター）または植物ウイルス由来のプロモーター（例えば、ＣａＭＶの３５ＳＲＮＡプロモーター；ＴＭＶのコートタンパク質プロモーター）が使用できる；哺乳動物細胞系でクローニングを行うときは、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）、または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター）が使用できる；ＧｎＲＨ−ＲＤＮＡの多重コピーを含む細胞系を作製するときは、ＳＶ４０、ＢＰＶ、およびＥＢＶをベースとするベクターを適切な選択マーカーと共に使用できる。細菌系においては、発現されるＧｎＲＨ−Ｒの意図された用途によって、多数の発現ベクターが有利に選択できる。例えば、抗体の作製のために大量のＧｎＲＨ−Ｒを生産しなければならないときは、容易に精製できる融合タンパク質産物の高レベル発現を引き出すベクターが望ましいだろう。このようなベクターには以下のものが含まれるが、それらだけに限定されない。すなわち、大腸菌発現ベクターpUR278（Rutherら、1983，EMBO J．2:1791）（ここでＧｎＲＨ−Ｒコード配列は、ハイブリッド AS-lac Z タンパク質が産生されるように lac Zコード領域のフレームに合わせてベクターに連結することができる）；pIN ベクター(Ino uye およびInouye，1985，Nucleic Acids Res．13:3101-3109; Van Heekeおよび Schuster，1989，J．Biol．Chem．264:5503-5509); 等である。pGEXベクターもまた、外来ポリペプチドをグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)を有する融合タンパク質として発現するのに使用できる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性で、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させ、次いで遊離グルタチオンの存在下で溶出させることにより、溶解した細胞から容易に精製できる。これらpGEXベクターは、クローニングされた興味のあるポリペプチドをＧＳＴ部分から引き離せるように、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ開裂部位を含むように設計されている。酵母においては、構成または誘導プロモーターを含む多くのベクターが使用できる。総説については、Current Protocols in Molecular Biology，Vol.2，198 8，Ausubelら（編）、Greene Publish．Assoc．& Wiley Interscience,第13章； Grantら、1987，Expression and Secretion Vectors for Yeast，in Methods in Enzymology，Wuおよび Grossman（編），1987，Acad．Press，N.Y.，Vol.153,p p．516-544; Glover，1986，DNA Cloning，Vol．II，IRL Press，Wash.，D.C.第３章；およびBitter，1987，Heterologous Gene Expression in Yeast，Methods in Enzymology，BergerおよびKimmel（編）、Acad．Press，N.Y.，Vol.152，p p．673-684;および The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces，1982 ，Strathernら（編）、Cold Spring Harbor Press，Vols．ＩおよびIIを参照されたい。植物発現ベクターを使用する場合には、多数のプロモーターのうち任意のものによってＧｎＲＨ−Ｒコード配列の発現を推進させることができる。例えば、ＣａＭＶの35S ＲＮＡおよび19S ＲＮＡプロモーター（Brissonら、1984，Nature 310:511-514）、またはＴＭＶの外被タンパク質プロモーター(Takamatsuら、198 7，EMBO J．6:307-311)等のウイルスプロモーターが使用できる。または、RUBIS CO の小サブユニット(Coruzziら、1984，EMBO J．3:1671-1680; Broglieら、198 4，Science 224:838-843)等の植物プロモーター；もしくは、大豆 hspl7.5-Eまたは hsp17.3-B（Gurleyら、1986，Mol．Cell．Biol．6:559-565）等の熱ショックプロモーターが使用できる。これらの構築物は、Tiプラスミド、Riプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、等を用いて植物細胞に導入することができる。これらの技法の総論については、例えば、Weissbach およびWeissback，1988，Methods f or Plant Molecular Biology，Academic Press，NY，第VIII節，pp．421-463;ならびに、GriersonおよびCorey，1988，Plant Molecular Biology，2d Ed.，Blac kie，London 第7-9章を参照されたい。ＧｎＲＨ−Ｒを発現するのに使用できる別の発現系は、昆虫系である。このような系の１つにおいては、オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa calif ornica ）核多角体病ウイルス(AcNPV)が外来遺伝子を発現するベクターとして使用される。このウイルスは、スポドプテラ・フルジペルダ（Spodoptera frugipe rda )細胞中で増殖する。ＧｎＲＨ−Ｒコード配列は、このウイルスの非必須領域（例えばポリヒドリン遺伝子）にクローニングし、AcNPV プロモーター（例えばポリヒドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。ＧｎＲＨ−Ｒコード配列の挿入がうまくゆくと、ポリヒドリン遺伝子の不活性化と閉鎖されていない (non-occluded)組換えウイルス（すなわち、ポリヒドリン遺伝子によってコードされるタンパク質のコートを欠くウイルス）の産生をもたらすであろう。次に、これらの組換えウイルスを用いて、挿入遺伝子を発現させるスポドプテラ・フルジペルダ細胞を感染させる（例えば、Smithら、1983，J．Viol．46:584; Smith ，米国特許第4,215,051参照）。哺乳動物細胞においては、ウイルスベースの多数の発現系が使用できる。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合は、ＧｎＲＨ−Ｒコード配列をアデノウイルスの転写/ 翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび３部分リーダー配列に連結することができる。次に、このキメラ遺伝子をin vitroまたは in vivo 組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１またはＥ３領域）への挿入は、感染した宿主中で生存可能であり、かつＧｎＲＨ−Ｒを発現することができる組換えウイルスをもたらす(LoganおよびShenk，1984，Proc．Natl．Acad．Sci．(USA)，81:36 55-3659)。または、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーターを使用することもできる。（例えば、Mackettら、1982，Proc．Natl．Acad．Sci．（USA）79:7415 -7419; Mackettら、1984，J．Virol．49:857-864; Panicaliら、1982，Proc．Na tl．Acad．Sci．79:4927-4931参照）。挿入されたＧｎＲＨ−Ｒコード配列の効率的な翻訳のためには、特異的開始シグナルもまた必要とされる場合がある。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が含まれる。それ自身の開始コドンおよび隣接配列を含む完全なＧｎＲＨ−Ｒ遺伝子を適切な発現ベクターに挿入する場合は、付加的翻訳制御シグナルはなんら必要とされない。しかし、ＧｎＲＨ−Ｒコード配列の一部のみを挿入する場合は、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルを供給しなければならない。さらに、その開始コドンは、挿入配列全体の翻訳を確実にするために、ＧｎＲＨ−Ｒコード配列のリーディングフレームと一致していなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の多様な起源のものでありうる。発現効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーター、等を包含させることにより増強できる（Bitterら、 1987，Methods in Enzymol．153:516-544 参照）。さらに、挿入配列の発現を調節する、または所望の特異的様式で遺伝子産物を修飾しプロセシングする宿主細胞株を選択することができる。このようなタンパク質産物の修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、開裂）は、そのタンパク質の機能にとって重要でありうる。異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳後プロセシングおよび修飾のための、特徴的で特異的な作用機構をもつ。適切な細胞系または宿主系を選択して、発現された外来タンパク質の適正な修飾およびプロセシングを確実にすることができる。この目的のため、一次転写物の適切なプロセシング、すなわち遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構をもつ真核宿主細胞が使用できる。このような哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８等が含まれるが、これらだけに限定されない。組換えタンパク質の長期間にわたる高収率産生のためには、安定した発現が望ましい。例えば、ＧｎＲＨ−Ｒを安定的に発現する細胞系を遺伝子操作することが可能である。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するよりも、むしろ適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、等）によって制御されるＧｎＲＨ−ＲＤＮＡおよび選択マーカーを用いて宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入に続いて、遺伝子操作した細胞を１〜２日間富化培地中で増殖させ、そして次に選択培地に替えてもよい。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドをその染色体中に安定に組み込み、そしてフォーカスを形成するまで増殖することを可能とする。次にこのフォーカスをクローニングし、細胞系へと拡大させることができる。この方法は、ＧｎＲＨ−Ｒを細胞表面に発現し、かつＧｎＲＨが仲介するシグナル伝達に応答する細胞系を遺伝子操作に有利に使用することができる。このように遺伝子操作された細胞系は、ＧｎＲＨ類似体をスクリーニングするのに特に有用である。多数の選択系を使用することができる。これらの選択系には以下のものが含まれるが、それらだけに限定されない。すなわち、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子(Wiglerら、1977，Cell 11:223)、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(SzybalskaおよびSzybalski，1962，P roc．Natl．Acad．Sci．USA 48:2026)、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(Lowyら、1980，Cell 22:817)を、それぞれｔｋ^-、ｈｇｐｒｔ^- またはａｐｒｔ^-細胞に採用することができる。また、代謝拮抗物質耐性を、メトトレキセートへの耐性を付与するｄｈｆｒ遺伝子（Wiglerら、1980，Natl． Acad．Sci．USA 77:3567; O'Hareら、1981，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78:15 27）；マイコフェノール酸への耐性を付与するｇｐｔ遺伝子（MulliganおよびBe rg，1981，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．78:2072）；アミノグリコシドＧ− ４１８への耐性を付与するｎｅｏ遺伝子（Colberre-Garapinら、1981，J．Mol． Biol．150:1）；およびハイグロマイシンへの耐性を付与するｈｙｇｒｏ遺伝子( Santerreら、1984，Gene 30:147)の選択の基礎として使用できる。最近、さらなる選択遺伝子が報告された。それらは、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようにするｔｒｐＢ；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用できるようにするｈｉｓＤ（Hartman およびMulligan，1988，Proc．Na tl．Acad．Sci．U.S.A．85:8047)；およびオルニチンデカルボキシラーゼインヒビターである２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン（ＤＦＭＯ）への耐性を付与するＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）[McConlogue L.，1987， In: Current Communications in Molecular Biology，Cold Spring Harbor labo ratory（編）]である。本明細書に記載の特定の実施態様において、SV40初期プロモーターを含む発現ベクターpSV2A 中にヒトＧｎＲＨ−ＲのｃＤＮＡをサブクローニングした。pSV2 A-ヒトＧｎＲＨ−Ｒ構築物を用いて、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション法(Keown，W.A.ら，1990，in Methods of Enzymology，Vl．185(Goeddel,D. V.編),pp．527-537，Academic Press，New York)によりＣＯＳ−１細胞を一過性にトランスフェクトした。トランスフェクトされたＣＯＳ−１細胞由来の膜を用いた実験は、異種発現された受容体はＧｎＲＨと結合可能であることを示した。また、リガンド結合がイノシトールリン酸代謝と結びついていることが見いだされ、これはさらにトランスフェクトされたＣＯＳ−１細胞が機能性ヒトＧｎＲＨ −Ｒを発現したことを示していた。５．２．２．ＧｎＲＨ−Ｒを発現するトランスフェクタント(transfectant) または形質転換体の同定コード配列を含み、そして生物的に活性な遺伝子産物を発現する宿主細胞を少なくとも４種類の一般的アプローチにより同定することができる。すなわち、（ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション；（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の有無；（ｃ）宿主細胞におけるＧｎＲＨ−ＲｍＲＮＡ転写物の発現によって測定される転写レベルの評価；および（ｄ）イムノアッセイまたは生物活性によって測定される遺伝子産物の検出である。第１のアプローチでは、ＧｎＲＨ−Ｒコード配列、その一部または誘導体にそれぞれ相同なヌクレオチド配列を含むプローブを用いて、発現ベクターに挿入されたＧｎＲＨ−Ｒコード配列の存在をＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションによって検出することができる。第２のアプローチでは、特定の「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、メトトレキセートへの耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスにおける閉鎖体(occlusion body)の形成、等）の有無に基づいて組換え発現ベクター／宿主系を同定し、選択することができる。例えば、ＧｎＲＨ −Ｒコード配列がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入されている場合は、マーカー遺伝子機能の不在によってＧｎＲＨ−Ｒコード配列を含む組換え体を同定することができる。または、ＧｎＲＨ−Ｒコード配列の発現を制御するために用いられたものと同一の、または異なるプロモーターの制御下に、マーカー遺伝子をＧｎＲＨ−Ｒ配列とタンデムに配置することができる。誘導または選択に応答してのマーカーの発現は、ＧｎＲＨ−Ｒコード配列の発現を示す。第３のアプローチでは、ＧｎＲＨ−Ｒコード領域の転写活性をハイブリダイゼーションアッセイによって評価することができる。例えば、ＲＮＡを単離し、そしてＧｎＲＨ−Ｒコード配列またはその特定部分に相同なプローブを用いてノーザンブロットにより分析することができる。または、宿主細胞の全核酸を抽出し、そのようなプローブへのハイブリダイゼーションをアッセイすることができる。第４のアプローチでは、ＧｎＲＨ−Ｒタンパク質産物の発現を、例えばウエスタンブロット、イムノアッセイ（ラジオイムノ沈降法、酵素結合イムノアッセイ、等）によって免疫学的に評価することができる。しかし、発現系が成功したことについての最終的試験は、生物的に活性なＧｎＲＨ−Ｒ遺伝子産物の検出を必要とする。受容体活性を検出するためには多数のアッセイが使用できる。これらのアッセイにはＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ類似体結合アッセイ；および試験基質とした遺伝子操作した細胞系を用いるＧｎＲＨ生物学的アッセイが含まれるが、それらだけに限定されない。本明細書に記述する特定の実施態様において、ヒトＧｎＲＨ−ＲｃＤＮＡを含む組換え発現ベクターを用いてトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞から細胞膜を調製した。¹²⁵Ｉ標識ＧｎＲＨ類似体を用いて、ヒトＧｎＲＨ−Ｒの発現を検出した。さらに、第7.1.5 節に記述するようにＧｎＲＨ刺激イノシトールリン酸（ＩＰ）産生レベルを測定することにより、生物的に活性なＧｎＲＨ−Ｒの発現を検出することができた。５．２．３．ＧｎＲＨ−Ｒの回収生物的に活性なＧｎＲＨ−Ｒを高レベルで産生するクローンが一旦同定されたならば、そのクローンを増やし、大量の受容体を産生するのに用いることができる。産生された受容体は、以下のものを含むがそれらだけに限定されない、当分野で周知の技法を用いて精製することができる。すなわち、イムノアフィニティー精製；高速液体クロマトグラフィー、ビーズに結合したＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ類似体等の固定化リガンドを用いるアフィニティークロマトグラフィーを含むクロマトグラフ法；抗体を用いるイムノアフィニティー精製；等である。ＧｎＲＨ−Ｒコード配列が開裂可能な融合タンパク質をコードするように遺伝子操作されている場合、アフィニティー精製技法を用いて容易に精製を行なうことができる。例えば、コラゲナーゼ開裂認識共通配列をＧｎＲＨ−Ｒのカルボキシ末端とプロテインＡの間で遺伝子操作することが可能である。生じる融合タンパク質は、プロテインＡ部分に結合するＩｇＧカラムを用いて容易に精製することができる。コラゲナーゼを用いて処理することにより、融合していないＧｎＲＨ−Ｒを容易にカラムから放出させることができる。別の例は、外来のポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を有する融合タンパク質として発現するpGEXベクターの使用であろう。融合タンパク質は、クローニングした遺伝子とＧＳＴ部分の間にトロンビンまたは第Ｘａ因子開裂部位を持つように遺伝子操作することができる。この融合タンパク質は、グルタチオンアガロースビーズに吸着させ、次にグルタチオンの存在下で溶出することにより、細胞抽出物から容易に精製することができる。本発明のこの側面において、任意の開裂部位または酵素開裂基質を、ＧｎＲＨ−Ｒ配列と精製に用いうる結合パートナーを有する第２ペプチドまたはタンパク質（例えば、それに対してイムノアフィニティーカラムを調製することができる任意の抗原）の間で遺伝子操作することができる。５．３．ＧｎＲＨ−Ｒを規定する抗体の創成遺伝子組換えで産生されたＧｎＲＨ−Ｒのエピトープに対する抗体を作製するために、当分野で公知の種々の方法を用いることができる。中和性抗体、すなわち受容体のＧｎＲＨ結合部位で競合する抗体は、診断および治療剤にとって特に好ましい。ウイルスの血清マーカーを規定する抗体は、診断用途に好ましいであろう。そのような抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片およびＦａｂ発現ライブラリーにより作製された断片を含むが、これらだけに限定されない。抗体の産生のため、ウサギ、マウス、ラット等を含むがこれらだけに限定されない種々の宿主動物を、ＧｎＲＨ−Ｒを用いた注射により免疫感作することができる。宿主の種によって、免疫応答を増大させるため、種々のアジュバントを用いることができる。これらのアジュバントには以下のものが含まれるが、それらだけに限定されない。すなわち、フロイントアジュバント（完全および不完全）、水酸化アルミニウム等のミネラルゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール等の界面活性剤、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット− ゲラン(Calmette-Guerin)杆菌）およびコリネバクテリウム・パルバム（Coryneb acterium parvum）等の潜在的に有用なヒトアジュバントである。ＧｎＲＨ−Ｒに対するモノクローナル抗体は、培養中での連続的継代細胞系による抗体分子の産生を提供する任意の技法を用いて調製することができる。これらの技法は以下のものを含むがそれらだけに限定されない。すなわち、KohlerおよびMilsteinによって最初に記述されたハイブリドーマ技法（Nature，1975，25 6:495-497)、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法(Kosborら，1983，Immunology Toda y，4:72; Coteら，1983，Proc．Natl．Acad．Sci.，80:2026-2030)およびＥＢＶ −ハイブリドーマ技法(Coleら，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Ther apy，Alan R．Liss，Inc.，pp．77-96)である。さらに、適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子由来の遺伝子を適切な生物活性を有するヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングすることにより「キメラ」抗体(Morrison ら，1984 ，Proc．Natl．Acad．Sci.，81:6851-6855; Neuberger ら，1984，Nature，312: 604-608; Takeda ら，1985，Nature，314:452-454)を産生するために開発された技法を用いることができる。または、一本鎖抗体（米国特許第4,946,778 号）を産生するために記述された技法を、ＧｎＲＨ−Ｒ特異的一本鎖抗体の産生のために適合させることもできる。ＧｎＲＨ−Ｒの特異的結合部位を有する抗体断片は公知の技法によりつくり出すことができる。例えば、そのような断片は抗体分子のペプシン消化により生成されるF(ab')₂断片、およびF(ab')₂断片のジスルフィド架橋を還元することにより生成されるFab 断片を含むが、これらだけに限定されない。またはFab 発現ライブラリーを構築して(Huseら，1989，Science，246:1275-1281)、ＧｎＲＨ−Ｒに対する所望の特異性を有するモノクローナルFab 断片の迅速で容易な同定を可能とすることができる。５．４．ＧｎＲＨ−Ｒ、ＤＮＡおよび遺伝子操作した細胞系の用途上記のＧｎＲＨ−ＲＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＧｎＲＨ− Ｒ発現産物、抗体、および工学的に作製された細胞系は、生殖疾患の診断および治療のため、ならびにドラッグデザインおよび薬物の発見において、多数の用途を有する。例えば、ＧｎＲＨ−ＲＤＮＡ配列はＧｎＲＨ−Ｒ発現の異常を診断するために生検のハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、in situ ハイブリダイゼーションアッセイを含むサザンまたはノーザン分析）に用いることができる。治療剤への応用としては、ＧｎＲＨ−ＲＤＮＡ配列に基づいて設計したアンチセンス分子またはリボザイム分子を利用して、ＧｎＲＨ−Ｒ遺伝子産物の輸送および発現をブロックすることができる。これについては、翻訳開始部位（例えば、ＧｎＲＨ−Ｒヌクレオチド配列の-10から+10の間の領域）由来のオリゴヌクレオチドが好ましい。または、ＧｎＲＨ−ＲＤＮＡを遺伝子治療アプローチに用いて、ＧｎＲＨ−Ｒおよびその機能を再構成するため、正常な組換え遺伝子を患者の欠陥細胞に導入する、つまり内因性突然変異を正すことが可能であろう。本発明の別な実施態様においては、生検組織における受容体発現パターンを決定するため、またはin vivo診断イメージングのためにＧｎＲＨ−Ｒに特異的な抗体を用いることができる。このような使用においては、「中和」抗体が好ましい。例えば、イメージング化合物と結合させた抗体を患者に投与して、ＧｎＲＨ −Ｒの位置および分布をin vivoで「マップ」することができる。本発明の別な実施態様においては、ＧｎＲＨ−Ｒ自体、またはそのＧｎＲＨ結合部位を含む断片をin vivoで投与することができるであろう。遊離のＧｎＲＨ −Ｒまたはそのペプチド断片は、ＧｎＲＨと競合的に結合し、そしてＧｎＲＨと天然の受容体との相互作用をin vivoで抑制できるであろう。本発明の別な実施態様においては、ＧｎＲＨ−Ｒに特異的な抗体応答の刺激を避妊の手段として用いることができる。例えば、ＧｎＲＨ−ＲまたはＧｎＲＨ− Ｒ融合タンパク質を用いた注射により種々の宿主動物を免疫感作して、それら動物の免疫系を刺激し、循環性抗ＧｎＲＨ−Ｒ抗体の産生をもたらすことができる。ＧｎＲＨ−Ｒおよび／またはＧｎＲＨ−Ｒを発現する細胞系は、ＧｎＲＨ−Ｒ活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する抗体、ペプチド、有機分子または他のリガンドをスクリーニングするのに用いることができる。例えば、ＧｎＲＨの活性を中和することができる抗ＧｎＲＨ−Ｒ抗体は、ＧｎＲＨ−Ｒ機能を抑制するために使用できる。さらに、ＧｎＲＨ活性が低下している生殖疾患に用いるため、ＧｎＲＨ活性を模倣する抗ＧｎＲＨ−Ｒ抗体を選択することができる。あるいは、遺伝子組換えで発現させた可溶性タンパク質またはタンパク質を発現する細胞系を用いたペプチドライブラリーまたは有機化合物のスクリーニングは、ＧｎＲＨの生物活性を抑制することによって機能する治療剤分子の同定に有用でありうる。本発明の１実施態様において、ＧｎＲＨ−Ｒの全コード領域またはそのリガンド結合ドメインを発現する工学的に作製された細胞系は、ＧｎＲＨアンタゴニストおよびアゴニストをスクリーニングし、同定するために使用できる。合成化合物、天然物、および潜在的に生物的に活性な物質の他の供給源を多数の方法でスクリーニングすることができる。ＧｎＲＨまたはその類似体のＧｎＲＨ−Ｒへの結合を抑制する試験化合物の能力は、第7.1.4 節に記述するような標準的受容体結合技法を用いて測定することができる。発現細胞におけるシグナル伝達応答に及ぼすＧｎＲＨ結合の効果を阻止または模倣する作用物質の能力を測定することが可能である。例えば、第２メッセンジャー生成の調節または細胞代謝の変化、等の応答（すなわち、細胞内カルシウム貯蔵物の放出またはプロテインキナーゼＣの活性化）をモニターすることができる。本明細書に記述する特定の実施態様においては、ＧｎＲＨ刺激イノシトールリン酸（ＩＰ）産生をＧｎＲＨ−Ｒ媒介シグナル伝達のインジケーターとして利用した。ＧｎＲＨ媒介シグナル伝達の測定のためのアッセイは、これらの目的のために開発された任意の常用技法を用いて実施することができる。ＧｎＲＨ−ＧｎＲＨ−Ｒ系を介してシグナル伝達を調節する試験化合物の能力もまた動物モデル系を用いてin vivoで測定することができる。たとえば、トランスジーンとしてＧｎＲＨ−ＲＤＮＡを含むトランスジェニック動物を遺伝子操作して、そのようなアゴニストまたはアンタゴニストの効果をin vivoで試験することができる。発現細胞におけるシグナル伝達応答に及ぼすＧｎＲＨ結合の効果を阻止する作用物質の能力を測定することが可能である。例えば、ホルモンの産生、生殖機能の抑制または活性化、またはホルモン応答性腫瘍の大きさの退縮、等の応答をモニターすることができる。５．４．１．GnRH-Rタンパク質または遺伝子操作された細胞系を用いるペプチドライブラリーのスクリーニング固相支持体に結合したアミノ酸のすべてのありうる組み合わせからなるランダムペプチドライブラリーを使用して、GnRH-Rのリガンド結合部位に結合しうるペプチドを同定することができる。ペプチドライブラリーのスクリーニングは、受容体との相互作用によってGnRH-Rの生物活性を阻害するかまたは活性化するように作用をする薬剤の発見について治療的価値を有しうる。 GnRH-Rに結合しうる分子の同定は、ペプチドライブラリーを組換え可溶性GnRH -Rタンパク質を用いてスクリーニングすることにより達成できる。GnRH-Rの発現および精製方法は上記５．２．１．節に記載されており、そして組換え完全長Gn RH-Rまたは興味ある機能性ドメインに応じGnRH-Rの断片を発現させるのに使用できる。例えば、GnRH-Rの細胞内および細胞外リガンド結合ドメインは別々に発現させてペプチドライブラリーのスクリーニングに使用することができる。 GnRH-Rと相互作用し複合体を形成するペプチド／固相支持体を同定および単離するために、GnRH-R分子を標識または「タグ付け」することができる。GnRH-Rタンパク質はアルカリホスファターゼ若しくはセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素へ、またはフルオレセインイソチオシアナート（FITC）、フィコエリトリン（PE）またはローダミンを包含しうる蛍光標識等の他の試薬へのコンジュゲーションにより標識できる。任意の既知の標識のGnRH-Rへのコンジュゲーションは当該技術分野でよく知られた技術を用いて実施できる。あるいはまた、GnRH-R発現ベクターを、商業的に入手しうる抗体が存在するエピトープを含有するキメラGnRH-Rタンパク質を発現するように遺伝子操作することもできる。エピトープ特異的抗体は、酵素、蛍光色素または着色若しくは磁気ビーズを用いる標識化を含む当該技術分野でよく知られた方法を用いてタグ付けすることができる。 GnRH-Rに結合しうるペプチドを同定するには、この「タグ付けされた」GnRH-R コンジュゲートをランダムペプチドライブラリーと22℃で30分から１時間インキュベートして、GnRH-Rとライブラリー内のペプチド種との間に複合体を形成させる。次にこのライブラリーを洗浄してすべての未結合GnRH-Rタンパク質を除去する。GnRH-Rがアルカリホスファターゼまたはセイヨウワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしている場合には、ライブラリー全体をアルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼのいずれかの基質、例えば、それぞれ５−ブロモ−４− クロロ−３−インドイルホスフェート（BCIP）または3,3',4,4'-ジアミノベンジジン(DAB)を含有するペトリ皿に注ぐ。数分間インキュベートした後、ペプチド／固相−GnRH-R複合体の色が変わり、そして容易に同定されマイクロマニピュレーターを用いて解剖顕微鏡の下に物理的に単離されうる。もし蛍光タグ付きGnRH -R分子を用いる場合には、複合体は蛍光活性化ソーティングにより単離されうる。異種構造のエピトープを発現するキメラGnRH-Rタンパク質を使用する場合には、ペプチド／GnRH-R複合体の検出は標識されたエピトープ特異的抗体を用いることにより達成されうる。ひとたび単離されると、固相支持体に結合したペプチドの同定はペプチド配列決定により決定されうる。可溶性GnRH-R分子を用いることに加え、別の態様ではGnRH-Rを発現する無傷の細胞を用いてGnRH-Rに結合するペプチドを検出することが可能である。無傷の細胞の使用は、マルチサブユニットであるか、若しくは不安定である受容体と一緒に、または細胞膜の脂質ドメインが機能することを必要とする受容体と一緒に使用することが好ましい。GnRH-Rを発現する細胞系を作製する方法は、５．２．１．節および５．２．２．節に記載されている。この技術で使用される細胞は生きた細胞であるかまたは固定された細胞のいずれでもよい。細胞はランダムペプチドライブラリーとインキュベートされ、そしてライブラリー中のあるペプチドに結合して標的細胞と関連固相支持体／ペプチドとの間に「ロゼット」を形成するであろう。このロゼットは次に示差遠心分離により単離されるか、または解剖顕微鏡の下に物理的に除かれうる。全細胞アッセイの代替として、GnRH-R分子は、標識されるかまたは「タグ付け」されていてもよいリポソームに再構成でき、そして前記したようにしてペプチドライブラリーのスクリーニングに使用できる。５．４．２．GnRH-Rタンパク質または遺伝子操作された細胞系を用いる化合物のスクリーニング GnRH-Rを発現する細胞系を使用して、GnRH-R活性を変調するかまたはGnRH-R介在シグナル伝達を変調する分子をスクリーニングすることができる。かかる分子には小さい有機若しくは無機化合物、またはGnRH-R活性を変調するか若しくはGn RH-R／GnRH複合体の形成を促進若しくは抑制する他の分子が包含されうる。合成化合物、天然産物、および潜在的に生物学的に活性な物質の他の供給源を多数の方法でスクリーニングできる。試験分子がGnRH-GnRH-R 結合および／またはGnRH-Rシグナル伝達を妨害する能力は標準的な生化学的技術を使用して測定できる。触媒活性の活性化若しくは抑制、他のタンパク質の燐酸化若しくは脱燐酸化、第２メッセンジャー産生の活性化若しくは変調、細胞性イオンレベルの変化、シグナリング分子の会合、解離若しくは転座、または特異的な遺伝子の転写若しくは翻訳のような応答も監視できる。これらのアッセイはスクリーニングの過程でこれらの目的のために開発された慣用の技術を用いて実施できる。リガンドのその細胞性受容体への結合は、シグナル伝達経路を介して、種々の細胞過程に影響しうる。GnRH-R／GnRHシグナリング経路の制御の下にある細胞過程には、それらに限定されるわけではないが、非調節細胞増殖、分化の阻止または細胞死のような異常なまたは潜在的に有害な過程に加え、ホルモン産生のような正常な細胞機能、および細胞の増殖および／または分化が包含されうる。当該技術分野で知られた技術による記載された細胞過程のいかなる定性的または定量的観察および測定もが、スクリーニング経路におけるシグナル伝達のスコアリング手段として有利に使用されうる。 GnRH-Rと相互作用する化合物のスクリーニング、同定および評価のための種々の態様が以下に記載されており、これら化合物はGnRH受容体シグナリング経路の制御の下に種々の細胞過程に影響を及ぼしうる。本発明は下記のことを包含するGnRH-R活性を変調しうる化合物の同定方法を包含する、すなわち、 (a) 純粋なまたは半純粋形態の、膜調製物中の、または全生存細胞もしくは固定細胞中のGnRH-Rまたはその機能性誘導体に上記化合物を接触させ； (b) 工程(a)の混合物を、GnRHまたはGnRH類似体の存在下で上記化合物がシグナル伝達を促進または抑制するのに十分な期間でインキュベートし； (c) シグナル伝達を測定し； (d) 上記シグナル伝達活性を、上記化合物の不存在でインキュベートしたGnRH-R のシグナル伝達と比較して、それにより上記化合物がシグナル伝達を促進するかまたは抑制するか決定する。 GnRH-R、またはシグナル伝達を変調しうる化合物の同定に有用なその機能性誘導体は、それらが有意なシグナル伝達能を保持する限り、例えばアミノ酸欠失および／または挿入および／または置換をしてもよい。GnRH-Rの機能性誘導体は、天然に存在するかまたは組換えにより発現されたGnRH-Rから、タンパク質分解による開裂に続く当業者に知られた慣用の精製操作により調製できる。あるいはまた、機能性誘導体は組換えＤＮＡ技術により、機能性ドメインを包含するGnRH-R の一部分を好適な細胞中で発現させることにより生産できる。機能性誘導体はまた化学的に合成することもできる。GnRH-Rを発現する細胞は粗製または精製されてGnRH-Rの供給源として使用されうるし、またはこれらアッセイにおける試験用に膜調製物中で使用されうる。あるいはまた、全生存細胞または固定細胞を直接これらのアッセイに使用することもできる。 GnRH-Rシグナル伝達活性は標準的な生化学的技術によるかまたはそのシグナルにより制御される細胞過程を監視することにより測定できる。例えば、GnRH-R活性の変調を評価するために、GnRH-Rを含有する反応混合物に試験分子を添加した後にホスホリパーゼＣの活性化またはイノシトール−1,4,5 −トリホスフェート若しくはジアシルグリセロールの生成をアッセイすることができる。あるいはまた、プロテインキナーゼＣの活性化または細胞内貯蔵所からのカルシウムイオンの放出をアッセイすることもできる。本発明はさらに、GnRH-Rと相互作用するとGnRH-RへのGnRHの結合作用を模倣するシグナルを引き起こすかまたはその引き金を引く化合物をスクリーニングする方法を提供する。シグナル伝達は、シグナリング経路の制御の下にある細胞過程がリガンド結合により惹起される場合と同様の様式で影響される場合に模倣される。かかる化合物はGnRH-Rを活性化する天然に存在するかまたは合成的に生産された分子であってもよい。また、本発明は化学的または生物学的調製物中のGnRH-Rに結合可能な分子を同定する方法であって、 (a) GnRH-Rまたはその機能性断片を固相マトリックスに固定し； (b) 上記化学的または生物学的調製物を、上記化合物を結合させるのに十分な期間、工程(a)で作製した固相マトリックスに接触させ； (c) 固相マトリックスからすべての未結合物質を洗い落とし； (d) 固相に結合された上記化合物の存在を検出し；それにより上記化合物を同定する、ことを含んでなる該方法をも包含する。前記方法はさらに下記工程をも包含しうる、すなわち、 (e) 結合した化合物を固相マトリックスから溶出させ、それにより該化合物を単離する。「GnRH-Rに結合可能な化合物」なる用語は、GnRH-Rと相互作用する天然に存在するかまたは合成的に生産された任意の分子を指す。かかる化合物には、GnRH-R シグナル伝達を直接的または間接的に変調できるとともに細胞内部でGnRH-Rの細胞内ドメインと天然に会合している分子が包含されうる。かかる化合物の例としては、(i)GnRH-Rの天然の基質；(ii)シグナリング複合体の一部分である天然に存在する分子；および／または他の細胞型により生産された天然に存在するシグナリング分子がある。５．５．増殖性疾患の治療におけるGnRH-R類似体の使用本発明の態様においては、アゴニストまたはアンタゴニスト活性のいずれかによりGnRH-R変調に関与する薬物は癌のような増殖性疾患の治療に有用でありうる。例えば、GnRH-Rの活性を変調する薬物は、細胞表面上にGnRH-Rを発現するGnRH 応答性癌細胞の増殖を調節するのに使用できる。 GnRH-R活性が介在するホルモンレベルの調節はまたホルモン応答性腫瘍の治療にも有用でありうる。本発明の別の態様においては、アゴニストまたはアンタゴニストGnRH-R活性のいずれかを示す薬物はホルモン応答性腫瘍の異常増殖を間接的に変調するのに使用できる。エストロゲンおよびテストステロンのようなホルモンの生産はGnRH-R活性の変調によって調節されうる。例えば、GnRH-R活性の変調剤は、血清テストステロンレベルを低下させるという所望される効果を得るために男性前立腺癌患者に投与されうる。加えて、GnRH-R変調剤はエストロゲン活性のレベルを低下させるために女性の乳癌患者に投与されうる。５．６．薬理学的調製物 GnRH-R受容体シグナル伝達を変調する特定のペプチド、タンパク質、有機化合物または抗体は、それ自体でまたは適当な担体若しくは賦形剤と混合し医薬組成物として患者に投与できる。治療されるべき特有の状態に応じて、これらの薬剤は製剤化されそして全身的ににまたは局所的に投与されうる。製剤化および投与の技術は「Remington's Ph armaceutical Sciences」，Mack Publishing Co.，Easton，PA,最新版、に見出されうる。好適な経路には、例えば、経口、直腸、経粘膜、または経腸投与；筋肉内、皮下、骨髄内注射、ならびに髄腔内、直接心室内、静脈内、腹腔内、鼻内、または眼内注射を含む非経口送達が包含され、固形腫瘍の場合にはその固形腫瘍に直接注射されうる。注射用には、本発明の薬剤は水溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル液、または生理食塩水緩衝液のような生理学的に適合する緩衝液中で製剤化されうる。経粘膜投与には、透過すべき障壁に対して適切な浸透剤が製剤中に使用される。かかる浸透剤は当該技術分野で一般的に知られている。本発明化合物は当該技術分野でよく知られた製剤学上受容されうる担体を用いて経口投与に適する剤形に容易に製剤化できる。かかる担体は、治療すべき患者に経口摂取させるために本発明化合物を錠剤、丸剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁液、等として製剤化することを可能にする。本発明で使用するのに好適な医薬組成物には、その意図する目的が達成できるような有効量で活性成分を含有する組成物が包含される。有効量の判定は特に本明細書中に提示される詳細な開示に照らして充分に当業者の能力の範囲内にある。活性成分に加え、これらの医薬組成物は活性化合物の医薬上使用できる製剤への加工を容易にする賦形剤および補助剤を包含する適当な製剤学上受容されうる担体を含有しうる。経口投与用に処方された製剤は錠剤、糖衣錠、カプセル剤または液剤の形態であってもよい。本発明の医薬組成物は、例えば慣用の混合、溶解、顆粒形成、糖衣形成、研和、乳化、カプセル化、捕捉(entrapping)または凍結乾燥工程等のそれ自体知られた方法で製造できる。非経口投与のための医薬製剤には水溶性形態における活性化合物の水溶液が包含される。加えて、活性化合物の懸濁液を適当な油性の注射懸濁液として調製できる。好適な親油性溶媒若しくはビヒクルにはゴマ油のような脂肪油、またはオレイン酸エチル若しくはトリグリセライドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームが包含される。水性注射懸濁液はカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランのような懸濁液の粘度を高める物質を含有しうる。場合によっては、懸濁液は高濃度溶液の調製を可能にするために化合物の溶解度を増大させる好適な安定剤または薬剤を含有してもよい。経口使用用の医薬製剤は、活性化合物を固形賦形剤と混合し、得られる混合物を必要により粉砕し、所望の場合は好適な補助剤を添加後に顆粒の混合物を加工して錠剤または糖衣錠コアとすることにより得ることができる。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；例えばとうもろこし澱粉、小麦澱粉、米澱粉、馬鈴薯澱粉、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、／および／またはポリビニルピロリドン(PVP)のようなセルロース調製物である。所望の場合は、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、またはアルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウムのようなその塩などの崩壊剤を添加できる。糖衣錠コアには適当なコーティングが付与される。この目的には濃厚な糖溶液を使用でき、これは場合によりアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポル(carbopol)ゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適当な有機溶媒または溶媒混合物を含有しうる。同定のためまたは異なる活性化合物量の組み合わせを特徴づけるために錠剤または糖衣錠コーティングに染料または顔料を添加できる。経口使用できる医薬製剤にはゼラチン製のプッシュフィットカプセル、ならびにゼラチンと可塑剤（例えばグリセロールまたはソルビトール）とから作られる軟質シールカプセルが包含される。プッシュフィットカプセルは活性成分を、ラクトースのような充填剤、澱粉のような結合剤および／またはタルク若しくはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、および場合により安定剤と混合して含有できる。軟質カプセルにおいては、活性化合物を脂肪油、流動パラフィン、または液状ポリエチレングリコールのような適当な液体中に溶解または懸濁することができる。加えて、安定剤を添加できる。適合性の医薬担体中に製剤化された本発明の化合物を包含する組成物は調製され、適当な容器に入れられ、そして指示された状態の治療のためにラベルを付けることができる。ラベルに指示された適当な状態には生殖性疾患および癌のような増殖性疾患の治療が包含されうる。加えて、本発明の化合物は避妊法として使用できる。本発明の疎水性化合物にとって好ましい製剤上の担体は、ベンジルアルコール、無極性界面活性剤、水混和性有機ポリマー、および水相を包含する共溶媒系である。好ましい共溶媒系はＶＰＤ共溶媒系である。ＶＰＤは３％W/V のベンジルアルコール、８％W/V の無極性界面活性剤ポリソルベート80、および65W/V のポリエチレングリコール300 を無水エタノール中で容量となした溶液である。ＶＰＤ共溶媒系(VPD:5W)は水溶液中の5%デキストロースを用いて１：１希釈したＶＰＤからなる。この共溶媒系は疎水性化合物をよく溶解させ、そしてそれ自体全身投与に際して低い毒性しか生じない。当然、共溶媒系の割合はその溶解性および毒性特性を破壊することなくかなり変動させることができる。さらに、共溶媒成分の同一性も変動させることができる。例えば、他の低毒性無極性界面活性剤をポリソルベート80の代わりに使用でき、ポリエチレングリコールのフラクションサイズを変動させることができ、他の生物適合性ポリマー（例えばポリビニルピロリドン）がポリエチレングリコールに代わることができ、そして他の糖または多糖類がデキストロースに代わることができる。あるいはまた、疎水性医薬化合物のための他の送達系も使用することができる。リポソームおよび乳剤は疎水性薬物のための送達ビヒクルまたは担体の良く知られた例である。通常はより毒性が大きいという犠牲はあるが、DMSOのようなある種の有機溶媒も使用できる。医薬組成物はまた好適な固形またはゲル相担体または賦形剤をも包含しうる。かかる担体または賦形剤の例には炭酸カルシウム、燐酸カルシウム、種々の糖、澱粉、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリマー（例えばポリエチレングリコール）が包含されるがそれらに限定されるわけではない。本発明のGnRH-R変調化合物の多くは製剤学上適合するカウンターイオンとの塩として提供されうる。製剤上適合する塩は塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、等を包含するがそれらに限定されない多くの酸を用いて形成できる。塩は水性のまたは対応する遊離塩基形態である他のプロトン性溶媒中により溶解しうる傾向がある。本発明の方法において用いられる何れの化合物でも、治療上有効な投与量は、最初に、細胞培養アッセイから予想される。例えば、投与量は、動物モデルで処方して、細胞培養で決定されるようなＩＣ50（すなわち、GnRH-R活性の最大の半分の抑制を達成するテスト化合物の濃度）を含む循環濃度範囲を達成することが可能である。かかる情報を用いて、ヒトにおいて有用な投与量をさらに正確に決定することが可能である。治療上有効な投与量とは、患者の症状の改善または延命をもたらすような化合物の量を言う。かかる化合物の毒性および治療上の効能は、例えば、ＬＤ50（母集団の５０％に対する致死投与量）およびＥＤ50（母集団の５０％に治療上有効な投与量）を決定するために、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的操作により決定することが可能である。毒性と治療上の効果との投与比率は治療指数であり、それは、ＬＤ50／ＥＤ50の比率として表される。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトで使用するための投薬量の範囲を処方するのに用いることが可能である。かかる化合物の投薬量は、好ましくは、循環濃度の範囲内にあり、毒性がほとんどない、あるいは毒性が全くないＥＤ50を含む。投薬量は、採用される投薬形態および用いられる投与経路に応じて、この範囲内で変化させてもよい。正確な配合処方、投与経路および投薬量は、患者の状態をみながら、各医師により選択することが可能である。（例えば、Finglら、1975，”The Pharmacologic al Basis of Therapeutics”，Ch.1 p.1を参照）。投薬の量および間隔を、それぞれ調節して、GnRH-R受容体阻害効果を維持するのに十分な活性部分の血漿レベルを達成してもよい。全身投与のための通常の患者の投薬量は、１〜２０００mg／日の範囲であり、通常は１〜２５０mg／日であり、典型的には１０〜１５０mg／日である。患者の体重について言えば、通常の投薬量範囲は0.02〜２５mg/kg/日であり、通常は0.02〜３mg/kg/日であり、典型的には0.2〜1.5mg/kg/日である。患者の体表面積について言えば、通常の投薬量範囲は0.5〜１２００mg/m²/日であり、通常は0.5〜１５０mg/m²/日であり、典型的には５〜１００mg/m²/日である。投薬の量および間隔をそれぞれ調節して、GnRH-R受容体抑制効果を維持するのに十分な活性部分の血漿レベルを達成してもよい。通常の平均的な血漿レベルは、５０〜５０００μg/ml内でなければらなず、通常は５０〜１０００μg/mlであり、典型的には１００〜５００μg/mlである。あるいはまた、上記化合物は、全身的ではなく局所的に投与してもよく、例えば、該化合物をしばしばデポー製剤または持続型放出製剤として直接的に腫瘍に注入することにより投与されてもよい。さらに、薬剤を、標的薬剤運搬系(targeted drug delivery system)で投与してもよく、例えば、腫瘍特異的抗体で被覆されたリポソームとして投与される。このリポソームは、腫瘍によって標的にされ、選択的に摂取される。局所投与または選択的摂取の場合、薬剤の有効な局所濃度は、血漿濃度には関係しない。６．実施例：機能的マウスGnRH-Rのクローニング以下のサブセクションは、マウスGnRH-Rを表す相補的ＤＮＡのクローニングを説明し、ツメガエル(Xenopus)卵母細胞発現を用いてその同一性を確認する。センスＲＮＡ転写物の注入より、機能的な高親和性のGnRH-Rの発現が起こる。しかし、性腺細胞系ＲＮＡを用いたGnRH-Rの発現は、アンチセンス・オリゴヌクレオチドにより遮断される。ラット下垂体前葉におけるin situハイブリダイゼーションによって、特徴的なGnRH-Rの分布が明かになる。このヌクレオチド配列は、３２７個のアミノ酸の蛋白質をコードし、これは、Ｇ蛋白質が結合している受容体に特徴的な７個の推定の膜貫通ドメインを有するが、典型的な細胞内Ｃ末端が欠如している。このGnRH-Rの変わった構造および新規な潜在的調節ドメインは、そのシグナル形質導入および調節の独特な面を説明する。 6.1．材料および方法薬剤は、以下の供給元から得た。：GnRH-Rアンタゴニスト[D-Phe^2.6,Pro³]-Gn RH(Bechem，Torrance，CA)、ブセレリン(buserelin)（D-Ser(But)⁶,Pro⁹-N-エチルアミドGnRH）Hoerchst-Roussel Pharmaceuticals(Somerville，NJ)。他の全ての薬品は、Sigma Chemical Co．(St．Louis，MO)からであった。全ての動物の管理は、NIH Guide for the CareおよびUse of Laboratory Animalsに従った。 6.1.1.卵母細胞のマイクロインジェクションおよび記録成体雌性アフリカツメガエル(Xenopus laevis)(Nasco，Ft．Atkinson，WI)を１８〜２０℃および１５ｈ／９ｈの昼／夜サイクルに保持した。卵母細胞を注入のために調製し、応答を先述のようにして記録した(Sealfonら、1990，Mol．End ocrinol 4; 119-124)。細胞を0.5ml容の浴に入れ、標準的な二電極技術(Dascal ，1987，CRC Crit．Rev．Biochem．417: 47-61)を用いて電圧を−７０mVにクランプした(clamped)。ペプチド・リガンドは、潅流緩衝液に希釈し、上記浴に導入した。クランプ電流(clamp current)は、チャート記録計を用いて記録した。反転電位(reversal potentials)は、アゴニストを用いて、あるいは用いずに、I BM PC/AT装置で、TL-1インターフェースおよびpCLAMPソフトウエア[Axon Instru ments(Burlingame，CA)]を用いて、２秒間にわたる−７０〜＋１０mVの連続ランピング(continuous ramping)により決定した。 6.1.2.ＰＣＲクローニングおよびハイブリッド阻害スクリーニングＲＮＡの調製およびｃＤＮＡの合成は先述のようにして行った(Sealfonら、19 90，Mol．Endocrinol 4: 119-124; Snyderら、1991，Neurosci Lett 122: 37-40 )。ハイブリッド阻害スクリーニング(hybrid arrest screening)のためのサブクローンは、ＧＰＲスーパーファミリーの保存された膜貫通ドメインに対応する種々の縮重オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲを用いて単離した。このオリゴヌクレオチドは、WZ7を含むサブクローンの群を単離するのに用い、公表されたオリゴマーの配列から改変し(Zhouら、1990，Nature 347: 76-80)、これは膜貫通III [5'-GAGTCGACCTGTG(CT)G(CT)(GC)AT(CT)(AG)CNNT(GT)GAC(AC)G(CG)TAC-3']および膜貫通VI[5'-CAGAATTCAG(AT)AGGGCANCCAGCAGAN(CG)(AG)(CT)GAA-3']に対応する。ＰＣＲは、低いストリンジェント条件で行った。反応の一部は、高いストリンジェント条件で再増幅し、制限酵素で消化し、pBluescript II KS+(Stratagen e)にサブクローニングし、配列決定した。ハイブリッド阻害アッセイでは、5HTI C受容体の膜貫通IIに対応するアンチセンス・オリゴヌクレオチド(5'-ATCAGC AATGGCTAG-3')(Juliusら、1988，Science 241: 558-564)およびWZ7に対応するオリゴヌクレオチド(5'-AGCATGATGAGGAGG-3')を合成した。αT3-1（１mg/ml）とラット脳全ＲＮＡ（１mg/ml）との混合物を、アンチセンス・オリゴヌクレオチド（１００μg/ml）を用いて、１０分間にわたって、３７℃で、２００mMのNaClおよび５mMのTrisを含有する緩衝液（pH 7.4，３μl容）中でプレインキュベートした。ツメガエルの卵母細胞に５０nlの上記混合物を注入し、４８時間にわたってインキュベートした後で、記録した。 6.1.3.ライブラリー・スクリーニングおよび配列決定 UniZap(Stratagene)αT3-1 ｃＤＮＡライブラリーの１０⁶個のプラークを、ランダム・ヘキサマー・プライマーによって³²Ｐ標識化されているWZ7の挿入物を用いてスクリーニングした。４０個の陽性のプラークを同定し、２回目および３回目のスクリーニングで７個を精製した。WZ25を、ヘルパー・ファージ切り出しによってpBluescript II SK+にサブクローニングし、両ストランドを、ジデオキシ連鎖末端法によって、シーケナーゼＴ７ＤＮＡポリメラーゼ(USB)を用いて配列決定した。配列は、taqポリメラーゼ標識化およびApplied Biosystems自動シーケンサーを用いて両ストランドを再度配列決定することによって、さらに確認した。予想される細胞質Ｃ末端がWZ25内での突然変異により末端切断される可能性を除外するために、３´配列を２種のさらなる独立したクローン内で確認した。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、VAXコンピュータのWisconsin GCGパッケージおよびマイクロプロセッサのMacVector(IBI)を用いて分析した。 6.1.4.WZ25 ＲＮＡ転写物の特徴決定 pBluescript II SK+(Stratagene)中のWZ25を直鎖状にし、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ(Stratagene)を用いて、キャップ化されたＲＮＡ転写体を合成した。卵母細胞に1.25 ngの得られた転写体を注入し、４８時間にわたってインキュベートした後で、記録した。卵母細胞は、緩衝液またはGnRHアンタゴニスト（アンタゴニスト６：[Ac-D-Nal(2)¹，D,α-Me-pCl-Phe²，D-Trp³，D-Arg⁶，D-Ala¹⁰]GnRH；アンタゴニスト２７：[Ac-D-Nal(2)¹，D-α-Me-pCl-Phe²，D-Trp³，N-ε-lpr-Ly s⁵，D-Tyr⁶，D-Ala¹⁰]GnRH；(Cander Spuyら、1987，Vickery BH and Nestor JJ （eds）LHRH and its Analogs: Cotraceptive and therapeutic Applications． NTP Press，Lancaster，Englandを参照）)のいずれかを用いて、３分間にわたって予備処理した後で、GnRH投与を行った。受容体の発現を確認するために、卵母細胞は、アンタゴニストを３分間にわたって洗い出した後で、GnRHに再度さらした。 6.1.5.ラジオリガンド結合アッセイ膜を調製するために、５００個の卵母細胞にそれぞれ2.5 ngの合成WZ25ＲＮＡを注入した。４８時間後、卵母細胞の膜を記載(Kobilkaら、1987，J．Biol．Che m．262: 15796-15802)のようにして調製し、１０mMのHEPES、1mMのEDTAおよび0. 1%のウシ血清アルブミンを含有する結合緩衝液に再懸濁して、２０個の卵母細胞／mlの最終濃度を得た。¹²⁵I-[D-Ala⁶，NaMe-Leu⁷，Pro⁹-NHEt]GnRH(GnRH-A)を用いた受容体結合アッセイは、ラットおよびヒツジの下垂体膜について先述したもの(Millarら、1989，J．Bio．Chem．264: 21007-21013)に基づいた。１０^-6M のGnRHアナログの存在下での結合は、非特異的な結合であると考えた。平均のBo （最大結合）および非特異的結合の値は、それぞれ1429および662cpmであった。 GnRH-AおよびGnRHについての解離定数(Kd)は、Enzfitter(Elsevier-BIOSOFT)を用いて決定した。 6.1.6.溶液ハイブリダイゼーション、ノーザンブロット分析および in situ ハイブリダイゼーション３９９ヌクレオチドの³²Ｐ標識化したGnRH-Rおよび1１７ヌクレオチドの1B15 （シクロフィリン内部ストランド）アンチセンスｃＲＮＡプローブを合成し、記載の方法(Autelitanoら、1989，Mo Cell．Endo．67: 101-105)を用いてＲＮＡに溶液でハイブリダイズした。ポリ(A)⁺αT3-1 ＲＮＡを用いたノーザンブロット分析は、記載(Sambrookら、1989，Molecular Cloning: A Laborabory Manual ．Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)のようにして行った。³⁵Ｓ−ＵＴＰ標識したｃＲＮＡを用いたin situハイブリダイゼーションは、自由に浮遊している下垂体の切片の上で、公表された方法(Gall & Is ackson，1989，Science 245: 758-761)にしたがって行った。切片を載せ、Amers ham Beta-max フィルムに３日間にわたってさらすか、あるいは放射活性エマルジョンに浸漬し、１７日後に現像させた。 6.2.結果 6.2.1.機能的マウスGnRH-RのｃＤＮＡクローニングマウス性腺刺激細胞系であるαT3-1[5]からのＲＮＡは、ツメガエル卵母細胞における機能的GnRH-Rの発現を支配するものであるが(Sealfonら、1990，Mol．E ndocrinol 4: 119-124)、これを用いて、Ｇ蛋白質結合受容体(GPR: Probstら、1 992，DNAand Cell Bio 11:1-20 を参照)の保存されたモチーフに対応する縮重オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲのためのｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲ生成物をサブクローニングし、配列決定して、アンチセンス・オリゴマーをハイブリッド阻害アッセイのために合成した(Kawashi，1985，Nuc．Acids Res．13: 4991-5 004)。クローンWZ7に対応するオリゴヌクレオチドは、α-T3-1およびラット脳ＲＮＡと共に同時注入した場合、卵母細胞におけるGnRH-Rの発現を完全に消滅させたが、脳5HTI_IC受容体の発現には影響しなかった（図１）。第２のアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、WZ7の別のセグメントを示すが、これもまた、テストした全ての卵母細胞（ｎ＝１６）においてGnRH-R発現を完全に、かつ特異的に失わせた。クローンWZ7は、αT3-1バクテリオファージｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして用い、７個の陽性のプラークを精製した。 1.3kbの最大の挿入物(すなわち、WZ25)を有するクローンが機能的GnRH-Rをコードするか否かを試験するために、それをＲＮＡ合成および卵母細胞発現のためにサブクローニングした。全ての合成ＲＮＡ注入卵母細胞（ｎ＞５０）は、GnRH にさらした場合、GnRH-R発現の大きな減極性応答特性(depolarizing response c haracteristic)を示した（図２）。WZ25 ＲＮＡ転写体によって卵母細胞において誘発されるGnRHに対する応答の反転電位(V^r)およびカルシウム依存性は、α T3-1 ＲＮＡを用いて予め得られたものと同様であった(Sealfonら、1990，Mol ．Endocrinol 4: 119-124)。GnRHによってもたらされる電流のVrは、−２７±0. 79mV（ｎ＝７）であり、卵母細胞における塩素イオンのものと一致した(Barish ，1983，J．Physiol．342: 309-325)。GnRHによってもたらされる応答は、記録する１時間前に卵母細胞を５mMのEGTAで予備処理することによって完全に失われた（ｎ＝４）が、潅流液中おけるCa²⁺の不存在によってそれ程影響を受けなかった（ｎ＝７）。したがって、クローンWZ25から発現された受容体は、ホスファチジルイノシトール加水分解を起こす受容体（Dascal，1987，CRC Crit．Rev．Bio chem．417:47-61を参照）に特徴的な、卵母細胞のカルシウムに依存するクロライドの流れによって媒介される応答を示した。得られた応答の薬理学は、哺乳動物のGnRH-Rの発現と一致した。GnRHアゴニスト[D-Ser(t-Bu)⁶，Pro⁹-NHEt]GnRH （１００nM ブセレリン、ｎ＝６）は、ＲＮＡ注入卵母細胞において減極性の電流をもたらした。等モルの弱いGnRHアンタゴニスト[D-Phe^2.6，Pro³]GnRHの存在下では、GnRH単独に対する応答と比較して、GnRHへの応答が６０％低下した（それぞれ、1880±551 nA，ｎ＝５、および4756±1082 nA,ｎ＝４）。２種の潜在的なGnRHアンタゴニストは、GnRHによってもたらされる電流を完全になくした（図２Ａ）。このｃＤＮＡクローンによってコードされる受容体をさらに特徴決定するために、WZ25 ＲＮＡ転写体を注入した卵母細胞から精製した膜の上でのラジオリガンド結合アッセイを行った。GnRHアゴニスト[D-Ala⁶，NαMe-Leu⁷，Pro⁹-NHEt]G nRH(GnRH-A)は、合成ＲＮＡが注入された卵母細胞の膜と高い親和性で結合した（図２Ｂ）。¹²⁵I-GnRH-AをGnRH-Aで置換することにより、WZ25 ＲＮＡ注入卵母細胞膜およびαT3-1細胞膜において、それぞれ4.5および2.9nMという同様のKd であることが明らかになった。クローン化した受容体に結合したGnRH-AのGnRHによる置換は、以前にαT3-1膜について報告されているように(Hornら、1991，Mol ．Endocrinol．5: 347-355)、それ程有効ではない桁数であった。したがって、ハイブリッド阻害および発現のデータにより、クローンWZ25がマウスGnRH-Rを示すことが確認される。 6.2.2.マウスGnRH-Rのコード配列の特徴決定クローンWZ25のヌクレオチド（配列番号１）および対応する予想されるアミノ酸配列（配列番号２）を図３に示す。最長のオープン・リーディング・フレームは３２７個のアミノ酸の蛋白質（相対的分子質量、Mr＝37,683）をコードする。可溶化したラットGnRH-Rの結合サブユニットについては、さらに長い大きさのもの（Mr 50,000-60,000）が報告されており(Hazumら、1986，J．Bio．Chem．261: 13043-13048; Iwashitaら、1988，J.Mol．Endocrinol．1: 187-196)、これは受容体のグリコシル化による。３つのコンセンサスＮ連結グリコシル化部位が存在し、２つはＮ末端にあり、１つは推定される第１の細胞外ループにある。第１の ATGは翻訳開始部位を示すと考えられる。その理由は、それがKozakコンセンサス配列(Kozak，1987，Nuc．Acids Res．15: 8125-8148)と非常に類似しており、かつ、さらなる５’配列を有する第２のｃＤＮＡクローンが、このリーディング・フレーム内に−５４および−５７の位置で、２つの非センス・コドンを含むからである。したがって、あらゆる上流スタート部位での翻訳開始は、正しいオープン・リーディング・フレームに到達する前に終了するであろう。ポリアデニル化シグナルは全くなく、明らかなポリ(A)末端が、ライブラリー構築の際の３’非翻訳領域におけるオリゴ(dT)プライミングを最も表すと思われる。しょ糖勾配(S ealfonら，1990，Mol．Endocrinol 4: 119-124)およびノーザンブロット分析により決定したところ、単離された機能的GnRH-R ｃＤＮＡは1.3kbであるが、この配列を含むｍＲＮＡは約4.6kbである（図５Ｂ）。一次ライブラリー・スクリーニングにより同定される４０個の陽性のプラークのＰＣＲ分析から、GnRH-R ｍＲＮＡがさらなる５’非翻訳配列と３’非翻訳配列との双方を含有することが示唆される。導き出された蛋白質の疎水性分析から、インターロイキン−８受容体と高度の相同性を有する他のＧＰＲに類似する２０〜３０％の配列を有する高い疎水性のアミノ酸の７つのストレッチ(stretches)が証明される（図４）。GnRH-R中の幾つかの高度に保存された残基（例えば、多くの受容体を安定化する最初の２つの細胞外ループの各々に存在するシステイン等）が注目されるが、GnRH-Rの幾つかの特徴は珍しいものである。例えば、高度に保存された細胞貫通IIアスパルテート／グルタメートは、多くのＧＰＲの機能にとって重要であることがわかっているが、これはアスパラギンで置き換えられる。GnRH-Rは、ＧＰＲのスーパーファミリーの中でほとんど最短のものであり、あらゆる他のＧＰＲとは異なって、極性細胞質Ｃ末端が欠如している。推定される第１の細胞質ループは、他の如何なるＧＰＲよりも長い。ＧＰＲの中でも独特なことに、GnRH-Rは二量重合により活性化する(Connら，1982，Nature 296: 653-655; Gregory & Taylor，1982，Natu re 300: 269-271)。その珍しい構造は、この提案された活性化のメカニズムに役立つであろう。他のＧＰＲとののもう１つの相違(deviation)は、セリンの、細胞貫通IIIに隣接して位置する保存されたチロシンへの置換である。これにより、他のＧＰＲのシグナル形質導入にとって重要なドメインに潜在的なリン酸化部位がつくられ、これはGnRH-Rに独自ものである。Ｃ末端のリン酸化は、GnRH-Rでは見られないことであるが、これは、幾つかのＧＰＲの減感作に寄与する（Probstら，1992，DN A and Cell Biology 11: 1-20を参照）。GnRH-Rの新規なリン酸化部位が受容体の減感作に介在するか否かを決定することは興味深いことである。他の潜在的な調節リン酸化部位も存在する（図３）。種々の神経内分泌細胞系におけるGnRH-R ｍＲＮＡの存在は、溶液ハイブリダイゼーション／ヌクレアーゼ保護アッセイによって調べた（図５Ａ）。GnRH-RｍＲＮＡはαT3-1細胞およびマウス下垂体において検出されたが、神経由来のGnRH （GT-1）、コルチコトロピン(corticotroph)（AtT20）またはソマトラクトトロピン(somatolactotroph)（GH3）細胞系では該アッセイの検出限界で検出されなかった。GT-1およびAtT-20細胞系において検出可能なGnRH-R ｍＲＮＡが存在しないことは、溶液ハイブリダイゼーション／ヌクレアーゼ保護アッセイにおいて高濃度のＲＮＡを用いて確認されている（Dr．Andrea C．gore,非公開のデータ）。図５Ｃは、ラット下垂体前葉におけるGnRH-R ｍＲＮＡの分布を示す。標識は、腺全体に不均一に分布し、GnRH-Rオートラジオグラフィによってパターンが予め観察された(Badr & Pelletier，1988，Neuropeptides 11:7-11)。明視野(br ight-field)および暗視野(dark-field)顕微鏡法により、GnRH-R ｍＲＮＡを発現する細胞の密集化が明らかになった（図５Ｅ，Ｆ）。７．実施例：ヒトGnRH-Rのクローニングおよび特徴決定以下のサブセクションは、ヒトGnRH-Rを表す相補的ＤＮＡのクローニングを説明し、かつツメガエル卵母細胞発現を用いてその同一性を確認する。さらに、このヒトGnRH-Rは、COS-1細胞内で発現して、機能的に活性であることが示された。 7.1.材料および方法 7.1.1.ヒトGnRH-Rのクローニング GT10ヒト下垂体ｃＤＮＡライブラリー(Clontech)の120万個のプラークを、高いストリンジェント条件で、マウスGnRH-R挿入物(Tsutsumiら，1992，Mol．Endo crinol．6: 1163-1169）（ランダム・ヘキサマー・プライミングにより³²Ｐ標識されている）でプローブした(Sambrookら，1989，Molecular Cloning: A Labora tory Mnual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y .)。３２個の陽性のプラークを二連のフィルターで同定した。すなわち、１０個はさらに特徴決定するために選別し、６個は次のスクリーニングによってうまく精製した。最も大きな挿入物を有するクローンを、pBluescript II SK+（構築物 LC27-4）のEcoRI部位にサブクローンし、両ストランドを、Applied Biosystems 自動シーケンサー(Foster City，CA，USA)で、合成オリゴヌクレオチド・プライマーを用いて、繰り返し配列決定した。配列は、VAXコンピューターのWisconsin GCGパッケージを用いて分析した。 7.1.2.ツメガエル卵母細胞での発現構築物LC27-4を直鎖状にし、キャップ化ＲＮＡ転写体をＴ３ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した。卵母細胞の調製および電気生理学は先述(Sralfonら，1990 ,Mol．Endocrinol．4: 119-124)のようにして行った。細胞に１〜１０ngの合成転写物を注入し、電気生理学を二電極電圧クランプにより４８時間後に記録した。全てのアゴニストおよびアンタゴニストを0.2μMの濃度でかけた。アンタゴニストは、GnRHにさらす前に浴に３分間導入した。以下のGnRHアナログを用いた。：GnRH-A：[D-Ala⁶，N-Me-Leu⁷，Pro⁹-NHEt]G nRH；アンタゴニスト５：[D-pGlu¹，D-Phe²，D-Trp^3.6]GnRH；アンタゴニスト６：[Ac-D-NaI(2)¹，D-α-Me-pCl-Phe²，D-Trp³，D-Arg⁶，D-Ala¹⁰]GnRH；アンタゴニスト１３：[Ac-D-NaI¹，D-α-4-ClPhe²，D-Pal³，D-Arg⁶，D-Ala¹⁰]GnRH；アンタゴニスト２７：[Ac-D-NaI(2)¹，D-α-Me-pCl]-Phe²，D-Trp³，N-ε-ipr-L ys⁵，D-Tyr⁶，D-Ala¹⁰]GnRH[Van der Spuyら，1987，”LHRH and its Analogs": Contraceptive and Therapeutic Applications（Vickery，B.H．およびNestor ，J.J．eds）NTP Press，Lancaster]。ブセレリン(buserelin)[D-Ser(But)⁶,Pro⁹ ]GnRH)は、Hoerchst-Roussel Pharmaceuticals(Somerville，NJ，USA)の寛大な贈与であった。 7.1.3.COS-1 細胞のトランスフェクションヒトGnRH-R ｃＤＮＡを、SV40初期プロモーターを含有する発現ベクターpSV2 Aにサブクローニングした。COS-1細胞は、pSV2A-ヒトGnRH-R構築体により、DEAE −デキストラン法(Keownら，1990，”Methods in Enzymology”VI．185（Goedde l，D.V.，ed.）pp．527-537，Academic Press，New York)を用いて瞬間的にトランスフェクトした。GnRH結合の検討では、３ｘ１０⁶細胞／１０cm皿を１５μgのＤＮＡでトランスフェクトした。イノシトールリン酸産生に関する検討では、1. 8ｘ１０⁵細胞／ウエル（１２ウエルのプレート）を1.5μgのＤＮＡでトランスフェクトした。細胞は、トランスフェクションの４８時間後にアッセイした。 7.1.4.受容体結合細胞の膜は、トランスフェクトした細胞から、ラット下垂体について記載したような単一の遠心分離工程(Millarら，1989，J．Biol．Chem．264: 21007-21013 )を用いて調製した。受容体結合アッセイは、先述(Tsutsumiら，1992，Mol．End ocrinol．6: 1163-1169)のようにして、¹²⁵I-GnRH-Aを用いて行った。１０^-7Mの GnRH-Aを用いて、非特異的な結合を推定した。 7.1.5.イノシトールリン酸産生の刺激 GnRHで刺激されるイノシトールリン酸（IP）産生は、記載(Davidsonら，1990, Endocrinology 126: 80-87)のようにして決定した。LiClの存在下での[³H]IPの蓄積は、リン酸イノシトールのターンオーバーの指標として用いた。簡単に言うと、トランスフェクトされた細胞は、一夜にわたって[³H]イノシトールで標識化し、LiClの存在下で1.0μMのGnRHで刺激した。反応は、過塩素酸およびフィチン酸の添加により停止した。KOHで中和した後、イノシトールリン酸をDowexイオン交換カラムで分離し、カウントした。 7.1.6.ノーザンブロットおよびＰＣＲ分析ＲＮＡは、６つのヒト下垂体（５つは男性、１つは女性のもの、年齢３０〜４５才）およびヒト精巣（年齢８０才）から、グアニジニウム・チオシアネートで抽出することにより調製し、続いて塩化セシウム中で遠心分離した(Sambrookら，1989，"Molecular Cloning"：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Lab oratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。Promega PolyA Tract mRNA単離装置を用いて調製した下垂体（1.6μg）および精巣（0.9μg）のポリ（Ａ）ＲＮＡを、１％アガロース、2.2Mホルムアルデヒド・ゲルで電気泳動し、２０ｘＳＳＣ中のニトロセルロース膜(HYbond-C extra，Amersham)に移し、減圧下で８０℃で固定した。構築体LC27-4からの挿入物を、7.2ｘ１０⁸cpm/μgの比活性までAmersha m Megaprime Labelling Kitを用いて標識化した。ブロットをプレハイブリダイズし（２時間）、２ｘPipes、50% ホルムアルデヒド、0.5%ＳＤＳ、100μg/mlのニシンの精子ＤＮＡ中で４２℃でハイブリダイズし（一夜）、続いて洗浄した（最終洗浄 0.2ｘＳＳＣ、0.1%ＳＤＳ、６０℃、１０分間）。ヒトＲＮＡにおける過剰の５’および３’非翻訳配列を明らかにする(delineate)ために、クローンを、一次ライブラリー・スクリーニングにおける二連のフィルタで同定し、精製されなかったものは、GT10クローニング部位および公知のヒトGnRH-R挿入物に向かう対になったプライマーを有するＰＣＲ鋳型として用いた。得られるＰＣＲ反応の生成物は、１％アガロースゲル上で、ＰＣＲ鋳型としてクローンLC27-4を用いて得られるものと比較した。 7.2.結果 7.2.1.ヒトGnRH-Rのクローニングおよび特徴決定クローンLC27-4の配列決定は、2160bpの挿入物であることが同定された（図９）。最大のオープン・リーディング・フレーム(1008bp)は、該クローンの５’末端に伸びる。翻訳開始部位は、Kozakコンセンサス配列(Kozak，1987，Nucleic A cids Res．15: 8125-8148)の存在により、一部分は第１のATGとされる。特徴決定されるクローンはその完全な５’範囲内のリーディング・フレームに残っているという理由から、さらなる上流開始部位の存在は除外できない。しかし、さらなる５’コード領域の存在はありそうにないと考えられる。その理由は、翻訳開始部位が大きな確実性をもって指定される(assigned)ことが可能な、マウス受容体との高い相同性のためである(Tsutsumiら，1992)。したがって、ヒト受容体ｃＤＮＡは、328 個のアミノ酸の蛋白質をコードする984bpのリーディング・フレームを、マウス受容体の予想される配列と９０％の同一性で含む。長い３´非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナルを全く含まない。ノーザンブロット分析を用いて、全長ヒトGnRH ＲＮＡの大きさを決定した。このプローブは、ヒト下垂体ポリ（Ａ）ＲＮＡにおける約4.7 kbの単一のバンドであることが明らかになった（図１０）。ヒト精巣から精製されたポリ（Ａ）ＲＮＡまたはヒトβ−アクチンｃＤＮＡコントロールを用いて精製したポリ（Ａ）ＲＮＡでは、シグナルは全く検出されなかった。ＲＮＡの５’および３’非翻訳ドメインの範囲を決定するために、一次ライブラリー・スクリーニングからのファージ単離物のＰＣＲ分析を行った。LC27-4挿入物の５’末端付近の配列を表すアンチセンス・オリゴヌクレオチド・プライマー、または同じ配列の３’末端付近のセンス・プライマーを、隣接するGT1クローニング部位に対して設計されたプライマーとの連結(conjunction)に用いて、精製されていないクローンのマッピングを行った。同定した最長のＰＣＲ生成物は、約1.3kbのさらなる５’配列および0.3kbのさらなる３’配列を有していた（図示せず）。これらのデータは、GnRH-R ｍＲＮＡが少なくとも1.3kbの５’非翻訳配列と1.5kbの３’非翻訳配列とを含むことを示唆する。ノーザンブロットのデータに基づくと、このことは、さらなる非翻訳配列（＜１kb）が単離されたクローンの何れにも含まれていないことを示唆する。疎水性分析(Kyte-Dolittle)により、Ｇ蛋白質結合受容体の特徴である７つの疎水性ドメインを同定した（図９参照）。マウス受容体の予想される構造からわかるように、ヒトGnRH-Rは、本質的に、あらゆるＣ末端細胞内ドメインが欠如している。２つの潜在的なＮ連結グリコシル化部位が存在し、最初の２つの細胞外ドメインの各々にある。幾つかの細胞質セリンおよびトレオニン残基が、細胞内ドメインに見いだされ、調節リン酸化部位としての役割を果たす。 7.2.2.ツメガエル卵母細胞の注入単離された最大のクローンであるLC27-4は、約2.2kbの挿入物を含有していた。このクローンが機能的ヒトGnRH-Rをコードするか否かを試験するために、合成ＲＮＡ転写体をツメガエル卵母細胞に注入した。全てのＲＮＡ注入卵母細胞は、２ｘ１０^-7M のGnRH（ｎ＝１７）または２ｘ１０ M のブセレリン（Ｎ＝６；図１）にさらした際に、大きな減極性電流を生じ、これは、組織または細胞系ＲＮＡを用いた卵母細胞における哺乳動物のGnRH-Rの発現に従って得られる応答(Sea lfonら，1990，Mol．Endocrinol．4: 119-124)とは区別できなかった。これらの応答は、等モル濃度の２種の潜在的なGnRH受容体アンタゴニストによって完全に遮断された（それぞれｎ＝５；図６）。 7.2.3.ヒトGnRH-RのCOS-1細胞における発現クローン化されたヒトGnRH-Rをさらに特徴決定するために、受容体をCOS-1細胞内で発現した。ヒトGnRH-R構築体でトランスフェクトされたCOS-1細胞からの膜を用いた結合のデータを図７に示す。GnRH-AのGnRH-A、GnRHおよびアンタゴニスト５による置き換えは、解離定数がそれぞれ0.97nM、2.8nMおよび8.4nMであり、ヒト下垂体膜を用いて予め得たもの(Wormaldら，1985，J．Clin．Endocrinol ．Metab．61: 1190-1198)と類似する値であった。 COS-1細胞内で発現された受容体は機能的であり、イノシトールリン酸代謝に関連することがわかった。最大の受容体の刺激で、リン酸イノシトール(phospho inositol)代謝において約８倍の増加が達成され、GnRHのＥＣ₅₀は約３nMであった。（１０^-8）MのGnRHにより誘発されるＰＩターンオーバーの刺激は、GnRHアンタゴニストにより濃度依存的に抑制された（図８）。GnRHで刺激される（１０^-8 M）イノシトールリン酸産生は、アンタゴニスト１３（ＩＣ₅₀が6.7ｘ１０^-9M ）およびアンタゴニスト５（ＩＣ₅₀が1.05ｘ１０^-7M）によって抑制され（図示せず）、Kdの値がそれぞれ2.1 ｘ１０^-10Mおよび3.6 ｘ１０^-9Mであった(Leslie ，F.M.，1987，Pharmacol．Rev．39: 197-247)。本発明は、例示した実施例によって範囲が限定されるものではなく、それらの実施例は、本発明の単一の形態を説明するものとして意図され、機能的に等価であるあらゆるクローン、ＤＮＡまたはアミノ酸配列は本発明の範疇内である。まさに、本発明の種々の改変は、上記の記載および添付の図面から、当業者であれば可能である。そのような改変は添付の請求の範囲の範疇内であると意図される。さらに、ヌクレオチドについて与えられる全ての塩基対の大きさはおよその値であり、説明の目的で用いられる、と理解すべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/53 33/577 Ｂ 33/577 Ａ６１Ｋ 31/70 // Ａ６１Ｋ 31/70 39/395 Ｐ 39/395 Ｃ０７Ｋ 14/72 Ｃ０７Ｋ 14/72 Ａ６１Ｋ 37/02

Claims

【特許請求の範囲】１．ＧｎＲＨ−Ｒのヌクレオチド配列の一部に相補的なアンチセンス配列をコードし、かつ細胞におけるＧｎＲＨ−Ｒ遺伝子の翻訳を阻害するオリゴヌクレオチド。２．ＧｎＲＨ−Ｒのアミノ末端領域をコードするヌクレオチド配列に相補的な、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。３．ＧｎＲＨ−Ｒのエピトープに免疫特異的に結合するモノクローナル抗体。４．ＧｎＲＨのＧｎＲＨ−Ｒへの結合を競合的に阻害する、請求項３に記載のモノクローナル抗体。５．ヒトＧｎＲＨ−Ｒに結合する、請求項３または４に記載のモノクローナル抗体。６．ＧｎＲＨ−Ｒを用いて宿主種を免疫感作することを含んでなる避妊法。７．ＧｎＲＨ−Ｒ融合タンパク質を用いて宿主種を免疫感作することを含んでなる避妊法。８．ＧｎＲＨ−Ｒシグナル伝達を変調することのできる化合物を同定する方法であって、（ａ）純粋または半純粋形態の、膜調製物中の、または全生存細胞もしくは固定細胞中のＧｎＲＨ−Ｒまたはその機能性誘導体に前記化合物を接触させ；（ｂ）工程（ａ）の混合物を、ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ類似体の存在下で、前記化合物がシグナル伝達を促進または抑制するのに十分な期間インキュベートし；（ｃ）シグナル伝達を測定し；（ｄ）上記シグナル伝達活性を前記化合物の不在下でインキュベートしたＧｎＲＨ−Ｒのシグナル伝達活性と比較し、それによって前記化合物がシグナル伝達を刺激するか又は抑制するかを決定する、ことを含んでなる該方法。９．化学的または生物学的調製物中の、ＧｎＲＨ−Ｒに結合可能な分子を同定する方法であって、（ａ）ＧｎＲＨ−Ｒまたはその機能性断片を固相マトリックスに固定し；（ｂ）前記化合物を結合させるのに十分な期間、上記化学的または生物学的調製物を工程（ａ）で作成した固相マトリックスに接触させ；（ｃ）固相マトリックスから未結合の物質をすべて洗い落とし；（ｄ）固相に結合した前記化合物の存在を検出する、ことを含んでなる該方法。 10．化学的または生物学的調製物中の、ＧｎＲＨ−Ｒに結合可能な分子を同定する方法であって、（ａ）ＧｎＲＨ−Ｒまたはその機能性断片を固相マトリックスに固定し；（ｂ）前記化合物を結合させるのに十分な期間、上記化学的または生物学的調製物を工程（ａ）で作成した固相マトリックスに接触させ；（ｃ）固相マトリックスから未結合の物質をすべて洗い流し；（ｄ）固相に結合した前記化合物の存在を検出し；（ｅ）固相マトリックスから結合した化合物を溶出させ、それにより該化合物を単離する、ことを含んでなる該方法。 11．ＧｎＲＨ−Ｒに結合可能なペプチドを同定する方法であって、（ａ）固相支持体に結合させた、アミノ酸の全ての可能な組合せからなるランダムペプチドライブラリーを、前記ペプチドを結合させるのに十分な期間ＧｎＲＨ−Ｒタンパク質またはその機能性断片に接触させ；（ｂ）未結合ペプチドをすべて洗い流し；（ｃ）ＧｎＲＨ−Ｒに結合した前記ペプチドの存在を検出する、ことを含んでなる該方法。 12．請求項８、９、10または11に記載の方法によって同定または単離された化合物を含んでなる、ＧｎＲＨ−Ｒの生物活性を抑制する医薬組成物。 13．請求項８、９、10または11に記載の方法によって同定または単離された化合物を含んでなる、ＧｎＲＨ−Ｒの生物活性を活性化する医薬組成物。 14．請求項８、９、10または11に記載の方法によって同定または単離された化合物を含んでなる、動物の腫瘍を治療するための医薬組成物。 15．請求項８、９、10または11に記載の方法によって同定または単離された化合物を含んでなる、避妊のための医薬組成物。