JPH05500604A - 細胞溶解を伴わずに細胞を死滅させる方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞溶解を伴わずに細胞を死滅させる方法発明の分野 本発明は酵母、細菌もしくは菌類の発酵型の増殖において細胞を死滅させる方法 に関するものである。

発明の背景 微生物の培養もしくは発酵における様々な工程においては、培養物の増殖終了時 もしくは発酵工程終了時に増殖活動を停止させて所望の生成物を培養物もしくは 発酵混合物から回収できるように、混合物中の活性細胞を死滅させることを可能 にすることが度々必要となる。これは、特に、組換え体ＤＮＡを含有している生 体を製造宿主として増殖させ、いかなる生存可能な組換え生体も環境中へ逃がさ ないようにする必要のある場合に当てはまる。

また、細胞内で生成された所望の任意の生成物を回収するため、細胞を死滅させ た時点で細胞を溶解させることも度々望まれる。細胞を死滅させかつ溶解させる ための従来の方法の１つは熱を用いることによる。ウニブナ−等（Ｗｅｇｎｅｒ 、　ｅｔ　ａｌ、）の米国特許第４．６０１．９８６号は細胞を死滅させ、微生 物培養物の増殖を停止させるための熱の使用の１例である。ある種の微生物に有 用なもう１つの方法は浸透圧を変化させることによって細胞を溶解させるもので ある。この方法の１例はオーパート等（Ａｕｂｅｒｔ、　ｅｔ　ａｌ、）の米国 特許第４．２９９．８５８号に記載されている。細胞を溶解させるために用いら れる従来の方法のもう１つは細胞壁もしくは細胞膜を破壊する酵素の導入による ものである。この方法の例はスギャｖ　（Ｓｕｇｉｙａｍａ）の米国特許第３， ８１６，２８０号、コバヤシ等の（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ、　ｅｔ　ａｌ、）の米 国特許第３．１１９０．１９８号およびキタムラ等（Ｋｉｔａｍｕｒａ、　ｅｔ 　ａｔ、）の米国特許第３，９１７，５１０号に開示されている。これらの特許 の開示を参照のためにここで引用する。

しかしながら、他の場合には、細胞を溶解することなく微生物活性を停止させる ために単に細胞を死滅させることが望ましい。これは特に細胞が所望の生成物を 製造しかつ分泌する系に当てはまる。このような系においては、細胞を溶解させ ると細胞の破片や物質が余分に放出され、この結果、所望の分泌生成物の回収お よび精製がより困難かつより高価なものとなるため、細胞を溶解することなく細 胞を死滅させることが極めて望ましいものとなる。したがって、このような系に おいて細胞を溶解することなく死滅させることができれば、分泌生成物の回収お よび精製における工程の効率化が認められる。

多くの系において宿主微生物、例えば菌類は死滅させるのが困難である。加熱法 のような従来の方法はあまりにも過酷であるために細胞が死滅する前に所望の分 泌生成物を破壊もしくは改変してしまうことがある。このような系においでは細 胞を死滅させることなく生成物を回収しなければならないか、これには冗長かつ 高価な抑制のための手順および装置が要求される。

大規模な商業的発酵方法においては、細胞溶解を伴うことなく、したがって抑制 の必要をなくし、得られる発酵混合物を処理して生成された所望の生成物を回収 することのできるように細胞を死滅させて細胞の増殖を停止するためのより高効 早かつ高速な方法が望まれる。加熱法および他の細胞を死滅させるだめの公知の 方法は商業的に使用するには速度およびエネルギー効率か低すぎるものであり、 し。

ばしば細胞の不必要な溶解を招くものである。さらに、細胞を死滅させるための 従来の方法の多くは微生物による酵素の製造のための培養および発酵工程には適 合（、ないものである。従来の方法は所望の酵素が分離されて回収される前に該 酵素を変質もしくは改変することがしばしばあるものであり、あるいは、それら の方法は、所望の酵素生成物の分離、回収および精製をより困難にし、かつ非効 率的なものにし、したかって、より高価にするような、例えば他の酵素のような 物質を導入するものである。

したがって、本発明は、細胞を死滅さセで抽出および生成物回収処理を行うため の微生物の発酵物もしくは培養物を調製するためのより迅速かつより効率的な方 法を得ることを目的とするものである。また、本発明は、微生物による酵素の製 造およびこのような微生物により製造された酵素の回収および精製に適合した、 所望の細胞を死滅させるための方法を提供することを「Ｊ的とするものである。

発明の概要 広範な態様によれば、本発明は、酵母、細菌もしくは菌類の増殖物、培養物もし くは発酵物中の細胞を死滅させるための方法であって、（ａ）前記酵母、細菌も しくは菌類を含有する増殖、培養もしくは発酵混合物のｐＨをｙ−？ｆ）選択さ れた有機酸のｐＫ、以下に調節１２、（ｂ）前記混合物中の細胞をほぼ完全に死 滅させるに充分な量の前記多め選択された有機酸もしくはその塩を添加すること からなる。

好ましい態様によれば、本発明は酵母、細菌もしくは巾類の増殖物、培養物もし くは発酵物中の細胞を死滅させるための方法であって、（ａ＞前記酵母、細菌も しくは菌類を含有する増殖、培養もしくは発酵混合物のｐＨを４．７５以下に調 節し、次いで、（１））前記混合物中の細胞をほぼ完全に死滅させるに充分な量 の酢酸を前記混合物に感加することからなる。

もう１つの態様によれば、本発明は、酵母、細菌も１．＜は菌類の細胞からなる 水性組成物と、前記組成物のｐＨを予め選択された有機酸のｐＫ、以下まで下げ るに充分な量の鉱酸と、前記細胞をほぼ完全に死滅させるに充分な量存在する前 記有機酸もしくはその塩とからなる組成物である。

発明の説明 本発明の開発においては、発酵混合物中のｐＨ変化だけでは完全もしくは充分な 細胞の死滅を達成することはできないことが見出だされた。例えば、キモシンの 製造のためのアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　Ｎｉｇｅｒ） の発酵物においては、硫酸を用いてｐＨを約２まで低下させても所望の細胞死滅 度は達成できない。したがって、従来は、キモシン生成物を回収するための混合 物を調製するために充分に細胞を死滅させて発酵工程を停止するには発酵混合物 を加熱することが必要であった。

本発明の好ましい態様においては、最初に発酵混合物のｐＨを硫酸のような鉱酸 の添加によって約４，７５以下に調節した後、酢酸を添加するようにすれば、酢 酸が発酵工程において細胞を死滅させるのに特に有用であることが見出だされた 。驚くべきことに、この方法を使用した場合、発酵混合物中の細胞のほぼ完全な 死滅を達成するのに必要な酢酸の量は比較的小さいことが見出だされた。一般に 、この方法においては、わずか約１〜２重量％の酢酸を用いれば細胞の完全な死 滅が得られるであろう。ある種の培養もＩ７くは発酵混合物においては、混合物 の総重量に対して約１０重量％以上というような、より多量の酢酸の使用が必要 になることもあるが、他の工程においては０．２５重置火というような少量な酢 酸を用いるたけて充分な細胞死滅度を得ることかできることもある。しかしなが ら、一般には、混合物のｐＨ調節後に添加される酢酸の量は約０．５重量％〜約 １０重量％の間、好ましくは約０，７５重量％〜５重Ｎ２６の間、より好ましく は約１重量％〜３重量％の間となることが見出だされた。

より一般的には、本発明の方法は、最初に鉱酸を用いて培養もしくは発酵混合物 のｐＨを細胞の死滅のために用いられる選択された有機酸のｐＫ、とほぼ同一か それ以下のｐＨに調節し、ｐＨが適値になった後に前記有機酸を所望の細胞の死 滅を得るに充分な全添加すれば、上記の工程に従って所望のいかなる有機酸を用 いても使用できるものである。例えば、細胞の死滅を達成するために蟻酸を用い る場合、混合物のｐＨを鉱酸で約３．７５以下に調節した後、細胞の死滅を達成 するために蟻酸を添加する。プロピオン酸を使用することが選択される場合は、 ｐＨを約４．８７以下に調節した後、混合物にプロピオン酸を添加する。有機酸 は炭素原子数１〜約５であって妥当性および適合性のある酸であればいずれのも のであってもよい。選択される有機酸は培養もしくは発酵混合物中に生成する所 望の生成物と適合しかつ該生成物を破壊せず、該生成物を混合物から回収するた めに用いられる分離、回収および精製方法に干渉しないものにするべきである。

また、有機酸を添加する前に混合物のｐＨを調節することは必要ではないことも 見出だされた。有機酸を混合物に添加してから鉱酸を添加してｐＨを本発明の実 施に好ましい値に調節することも可能である。後述のように、これは有機酸の塩 を用いる場合にも当てはまる。塩を添加した後にｐＨを調節してもよい。広範な 態様において、本発明の実施では、使用される選択された有機酸のｐＫ、値以下 のｐＨを有する混合物中に前記有機酸もしくはその塩を使用することだけが重要 である。

以下の理論に限定されるものでも必ずしも該理論に基づくものでもないか、本発 明は以下の機構によって予期せぬほど効率的かつ完全に細胞の死滅を達成するも のと考えられる。使用すべき有機酸のｐＫ、以下に混合物もしくは培地のｐＨを 低下させることにより、該酸はプロトン化もしくは非荷電化され、酸としては細 胞に「不可視コなものとなる。次いで、細胞は通常の方法Ｃ中性酸化合物を栄養 素として吸収もしくは移入する。なぜなら、細胞はこの化合物を酸とは認識しな いからである。いったん細胞内に入ると酸は再びイオン化され、次いで、細胞内 のｐｎを変え、この結果、細胞は死滅する。この機構の理論に従えば、酸のプロ トン化された形を細胞が栄養素として摂取する傾向のある有機酸を選択すること が明らかに望ましい。好ましい酸は酢酸である。なぜなら、これは広範囲の細胞 に対し。

て有効であり、入手できる酸のうちで最も安価であるからである。使用される細 胞培養物および工程の経済性により、他の有効な酸も使用可能である。

有機酸の濃度は重要ではないが、有機酸の添加時に細胞混合物が希釈され過ぎな いように充分高い濃度とするべきである。酢酸を用いる場合は氷酢酸か好ましい 形態である。

また、当業者には有機酸の塩類も使用可能なことが認められるであろう。例えば 、酢酸の代わりに、酢酸ナトリウムを用い、その場で酢酸が形成されるようにし てもよい。

酸塩もしくは少なくともその一部はを機構のｐＫ、以下の値に鉱酸によってｐＨ を低下させた溶液中においてプロトン化される。また、当業者には明らかなよう に、塩は有機酸と異なってｐＨに影響を与えないため、溶液のｐＨ調節は酸塩を 用いた場合、その酸自体を用いた場合とは異なったものとなる。溶液および細胞 死滅後に該溶液から回収されるべき溶液成分と適合するものであれば、いかなる 有機酸塩を用いることもできる。前述のように、混合物のｐＨは有機酸もしくは その塩が混合物に添加される前後のいずれにおいて酸のｐＫ、値以下に調節して もよい。しかしながら、本発明の好ましい態様においては、最初に鉱酸によって ｐＨを所望の値に調節した後、有機酸を添加する。

本発明の方法により混合物のｐＫ、を調節するために用いることのできる鉱酸に は硫酸、塩酸、および細胞混合物のｐＨを混合物中の細胞を死滅させるために用 いられる有機酸のｐＫ、と同等もしくはそれ以下の値まで低下させることのでき る他の鉱酸が含まれる。ｐＨ調節用の鉱酸とｊ。

では、発酵もしくは培養混合物もしくは培地から所望の生成物を分離もしくは抽 出するために用いられる方法および装置に適合するものを選択することが好まし い。使用される鉱酸の濃度は、混合物の過度な希釈を伴うことなく細胞混合物の ｐＨを所望の値に調節できるように、充分高くするべきである。

以上、本発明の一般的な特徴を述べたが、次いで、以下の実施例に記載される特 定の態様により本発明を説明する。

実　施　例 以下の実施例において、試料は一般に６％もしくは１０％の大豆粥／グルコース で培養されて４〜５日後に採取されたアスペルギルス・ニガーのアワモリ変種（ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｗａｒ、　ａｖａａｏｒｉ）の発酵物か ら得た。本発明によって得られる細胞の死滅を試験する目的においては特定の細 胞生成技術は重要ではない。以下の比較結果は、細胞死滅化を行った後に残存す る生存細胞の量を測定するために標準的な連続希釈試験を用いた様々な態様を示 すものである。細胞死滅化処理の後、試料はｐＨ５，５とし、連続的に０６８５ ％ＮａＣ１で希釈し、ＣＭＡブレートの上に広げてプレートし、３７℃で７２時 間インキュベートした後、ＣＦＵ／＋ｅｌを測定した。

実施例Ｉ この実施例はアスペルギルス・ニガーのアワモリ変種のほぼ完全な細胞死滅を達 成する本発明の方法の有効性を示すものである。

アスペルギルス・ニガーのアワそり変種の発酵混合物の試料２種を硫酸でｐＨ２ ，０に調節した。この酸をよく混合した後、一方の試料に４体積％の氷酢酸を添 加した。両方の試料を冷室中に一晩保存した後、細胞死滅試験を行った。

連続希釈試験の結果は以下の通りである。

試料　酢酸　１０９１０８１．０’　１０６１０’　１０’　１，０３１．０２ １０Ａ　０　０　０　０　０　０　０　３　７２　ＴＮＴＣＢ４％（ｖｏｌ）　 ０　０　０　０　０　０　０　０　０（ＴＮＴＣは細胞増殖が多すぎて計数不能 であることを示す。）この実施例は、硫酸単独では完全な細胞死滅が達成されな かったのに対し、硫酸と酢酸とを糺み合わせた場合には完全な細胞死滅が達成さ れたことを示すものである。

実施例１１ この実施例においては、実施例Ｉと同様の発酵混合物の一部を１２℃まで冷却し て６０時間保持した。この混合物から３種類の試料を得た。１つは未処理であり 、もう１つはＨ２ＳＯ４で処理してｐＨ２，０とした。第３の試料はＨ２ＳＯ４ で処理してｐＨ２，０とし、氷酢酸を混合物試料の１重量％添加した後、混合物 を通気してほぼ１時間攪拌した。

３種類の試料はすべてＮａＯＨでｐＨ５，５に調節し、連続希釈し、広げてプレ ートシ、３７℃で５日間インキュベートした。試験結果は以下の通りであった。

スＵ　胆ヱ　肥　胆二　〇、１１　臆し未処理　３０　ＴＮＴＣＴＮＴＣＴＮＴ ＣＴＮＴＣ２ＳＯ４ のみ（ｐＨ２，０）ＯＯ０２１９ ２ＳＯ４ （ｐＨ２，０）７１％　０００　Ｄ　Ｏ酢酸 この実施例は酢酸／硫酸処理が細胞に少なくとも６１０ｇの減少をもたらすこと を示すものである。

実施例ＩＩ＋ この実施例においては、実施例Ｉと同様の発酵液を用いて細胞死滅に対するｐＨ 調節の効果を調べた。また、この実施例においては、有機酸の代わりに有機酸塩 を用いた。

以下においては、試料１〜５はそのまま使用し、試料６〜ＩＯにはｐｎ調節の前 に２％の酢酸塩を（１００ｍｌあたり４．５３ｇの酢酸ナトリウムとして）添加 した。ｐＨ調節前にお０て、試料１〜５のｐｕは約５，８、試料６〜ＬＯのｐＨ は約６゜０であった。次いで、調節を行わずに発酵液の対照試料として用いた試 料４を除くすべての試料のｐＨを以下に示すような値に調節した。下記のｐＨが 得られるようにＨ２ＳＯ４もしくはＮＨ４ＯＨで各試料のｐＨを調節した。

試料　調節後のｐＨ ４５，８６（無調節） すべての試料は４時間氷上に保存した後、ｐＨを５．５に調節し、抗生物質とと もにＣＭＡプレート上にプレートした。プレートはＳＰＣで７日間インキュベー トした。試験結果は以下の通りであった。

試料　１０５　烈’　１．０’　１０２０．１ｍ１　１ｍ１１　０　２　７　５ ５　ＴＮＴＣＴＮＴＣ２０５１２８ＴＮＴＣＴＮＴＣＴＮＴＣ３１４７ＴＮＴＣ ＴＮＴＣＴＮＴＣＴＮＴＣ４３６４ＴＮＴＣＴＮＴＣＴＮＴＣＴＮＴＣ５３６６ ＴＮＴＣＴＮＴＣＴＮＴＣＴＮＴＣ６００００２Ｇ２ ７　０　１　２　３７　ＴＮＴＣＴＮＴＣ８０１３５６ＴＮＴＣＴＮＴＣ ９３３５ＴＮＴＣＴＮＴＣＴＮＴＣＴＮＴＣｌｏ　３　３４　ＴＮＴＣＴＮＴＣ ＴＮＴＣＴＮＴにの実施例は、混合物のｐＨを使用される有機酸のｐ　Ｋ、もし くは、好ましくは、それ以下の値に調節することの重要性を示すものである。例 えば４％というような、より多量の酢酸塩を用いると、より完全な細胞の死滅か より低いｐＨで得られる。しかしながら、この実施例においてはｐｎの影響を明 らかにするためにより低い値の酢酸塩を用いた。

実施例ＩＶ この実施例は酵母細胞を死滅させるだめの本発明の使用を示すものである。この 実施例においてはサツカロマイセスやセレビシェ（ＳａｅｃｈａｒｏＬＯｙｃｅ ｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）として知られる酵母をディフコ社（Ｄｉｒｃｏ）か ら入手できる標準ｒ　Ｙ　Ｍ　Ｊ培地上て３７℃において２４時間、２５Ｏｒｐ ｍで増殖させた。前述の実施例３と同様、１０種類の試料を得、試料６〜１０は ２％酢酸塩（酢酸ナトリウムとして）で処理し、ｐＨを下記の値に調節した後、 プレートして４時間インキュベートした。

１０　６．７５ 試験結果： 試料　１．０−５１０−６１０−７１０−８−ＣＦＵ／ｍ１（Ｘ　１０７）Ｉ　 ＴＮＴＣ４２／４１　７／２　１／３　４．２２　ＴＮＴＣ５０／４５　４１５ 　０１０　４．７３　ＴＮＴＣ４９／４８　３１５　２／１　４．９４　ＴＮＴ Ｃ５０／６４　１２１５　１１０　５．７５　ＴＮＴＣ４３１５４５／９　１／ １　４．９６　ＴＮＴＣ４３／２４　４／７　０／Ｑ　３．４７　ＴＮＴＣ３２ ／３４　５／８　１／１　３．３８　７ＮＴＣ５１／４８　Ｂ／７　０１０　５ ．１９　ＴＮＴＣ５６１５８４１５１／２　５．７１０　ＴＮＴＣ５Ｂ／４５　 ３１５　１１０．　５．１上記から結論できるように、ｐＨ２，８においては約 ２０％、ｐＨ３，６においては約３０％の死滅が得られ、ｐ　Ｈ４，７，５゜７ もしくは６．７５においては有意な死滅は得られなかった。

この実施例は死滅化の有効性に対するｐＨの影響を測定するために行われたもの であるが、例えば４％というような、より多量の酢酸塩を用いると、より完全な 細胞の死滅がより低いｐＨて得られる。また、理解されるように、酵母の細胞死 滅および増殖を正確に定量化することは菌類よりも困難であるが、この実施例は 酵母に対する本発明の有用性を示すものである。

以上、本発明を説明し、本発明の特定の実施例を示したが、本発明の範囲は以下 の請求の範囲により確定される。

国際調査報告

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．酵母、細菌もしくは菌類の増殖物、培養物もしくは発酵物中の細胞を死滅さ せるための方法であって、（ａ）前記酵母、細菌もしくは菌類を含有する増殖、 培養もしくは発酵混合物のｐＨを予め選択された有機酸のｐＫ■以下に調節し、 （ｂ）前記混合物中の細胞をほぼ完全に死滅させるに充分な量の前記予め選択さ れた有機酸もしくはその塩を前記混合物中に添加することからなることを特徴と する方法。
2. ２．前記有機酸が蟻酸、酢酸、プロピオン酸、もしくはそれらの塩であることを 特徴とする請求項１記載の方法。
3. ３．前記ｐＨを前記混合物に鉱酸を添加することによって調節することを特徴と する請求項１記載の方法。
4. ４．前記ｐＨを前記混合物に鉱酸を添加することによって調節することを特徴と する請求項２記載の方法。
5. ５．前記有機酸が酢酸であり、前記混合物のｐＨを約４．７５以下に調節するこ とを特徴とする請求項２記載の方法。
6. ６．前記有機酸もしくは塩を添加する前に前記ｐＨを調節することを特徴とする 請求項１記載の方法。
7. ７．前記ｐＨを調節する前に前記有機酸もしくは塩を添加することを特徴とする 請求項１記載の方法。
8. ８．水性組成物であって、酵母、細菌もしくは菌類の細胞と、前記組成物のｐＨ を予め選択された有機酸のｐＫ■以下まで下げるに充分な量の鉱酸と、前記組成 物中に存在する前記細胞をほぼ完全に死滅させるに充分な量存在する前記有機酸 もしくはその塩とからなる組成物。
9. ９．前記有機酸が蟻酸、酢酸、プロピオン酸、もしくはそれらの塩であることを 特徴とする請求項１記載の組成物。
10. １０．前記ｐＨが混合物への鉱酸の添加によって調節されていることを特徴とす る請求項８記載の組成物。
11. １１．前記ｐＨが混合物への鉱酸の添加によって調節されていることを特徴とす る請求項９記載の組成物。
12. １２．前記有機酸が酢酸であり、混合物のｐＨが約４．７５以下に調節されてい ることを特徴とする請求項９記載の組成物。