JPH05501059A

JPH05501059A - γ―ＣＧターゼ

Info

Publication number: JPH05501059A
Application number: JP3506310A
Authority: JP
Inventors: シュミット，ゲルハルト
Original assignee: Consortium fuer elektochemische Industrie GmbH
Current assignee: Consortium fuer elektochemische Industrie GmbH
Priority date: 1990-03-27
Filing date: 1991-03-22
Publication date: 1993-03-04
Anticipated expiration: 2009-04-27
Also published as: DE59105733D1; TW234146B; FI924294A0; FI924294L; CA2078992A1; WO1991014770A3; FI924294A7; KR930700646A; EP0521948A1; DE4009822A1; EP0521948B1; HUT63190A; ES2073743T3; KR960013463B1; US5409824A; ATE123808T1; JPH0630575B2; WO1991014770A2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 γ−ＣＧターゼ本発明はまず第一にγ−シクロデキストリンを産生するシクロデキストリングリコジルトランスフェラーゼに関する。

酵素シクロデキストリングリコジルトランスフェラーゼ（省略形：ＣＧターゼ）Ｅ、Ｃ，２，４，ｌ　１９はシクロデキストリンのデンプンからの形成を触媒する。シクロデキストリン（ＣＤ）を構成するグルコース単位の数に応じてα−ＣＤ（グルコース単位６）、β−ＣＤ（グルコース単位７）及びγ−ＣＤ（グルコース単位８）に分けられる。

従来２つの型のＣＧターゼが知られている：ａ〕例えばバチルス・マケランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍａｃｅｒａｎｓ；英国特許第２１６９９０２号）、クレブシェラ・プノイモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；ヨーロッパ特許公開第２２０７１４号）及びバチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ　ｌｕｓ　；英国特許第２１６９９０２号）のＣＧターゼのような第１にα−シクロデキストリンを形成するＣＧターゼ、α−ＣＧターゼとも表される。

ｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ；米国特許第４４７７５６８号）、バチルス・マガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍａｇａｔｅｒｉｕｍ；米国特許第３８１２０１１号）、バチルス・オウベンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｏｈｂｅｎｓｉｓ；日本国特許第７４１２４２８５号）、ミク０）ｙ７クス　ｓｐ、（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ５＋）、；ヨーロッパ特許公開第０１７２４２号）及び好アルカリ性バチルス・　ｓｐ、（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、；Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１９８８．１３４．９７〜１０５　；Ａｐｐ　１．Ｍｉｃｒ。

ｂｉｏｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１９８７．２６．１４９〜１５３）のＣＧターゼのような第一にβ−シクロデキストリンを形成するＣＧターゼ又はβ−ＣＧターゼ。

γ−ＣＧターゼに関しては文献中に２つの示唆が記載されている。

ａ）バチルス・Ｓｐ、のシクロデキストリングリコジルトランスフェラーゼはＥｔＯＨの添加の際に主にβ−及びγ−シクロデキストリン（１０，４対１８゜７％）からの混合物を製造する（日本国特許第６３１３３９９８号）。この酵素はその動力学的特性に関して明らかにされていないので、特別な型に分類することができない。

ｂ）２つの論文［Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

ンプンカガク、１９８６．３３．１３７］にバチルス・スプチリスＮｏ、３１３のγ−ＣＧターゼが記載されている。このγ−ＣＧターゼはγ−シクロデキストリン及び直鎖状オリゴサツカリドの形成を特徴とする。

ＣＧターゼはデンプンから環式産生物を生成するだけなので、この″ＣＧターゼではα−アミラーゼ（デンプンから直鎖状オリゴサツカリドを生成）及びＣＧターゼの転移形が該当する。この“γ−ＣＧターゼは低い収率を達成できるだけなのでγ−シクロデキストリンの製造には好適ではない（ヨーロッパ特許公開第３２７０９９号、第２頁、４０〜４３行参照）。

それ故、本発明の課題は主にγ−ＣＤを産生ずる酵素を製造することである。

この課題は、細菌をγ−ＣＧターゼの分泌に関してスクリーニングし、これらの細菌の特性を明らかにし、かつ該細菌のγ−ＣＧターゼを精製し、かつ生化学的に特性を明らかにすることにより解決された。

本発明によるγ−シクロデキストリングリコジルトランスフェラーゼは第一にγ −シクロデキストリンを産生ずるγ−シクロデキストリングリコジルトランスフェラーゼであり、基質デンプンにより第一にγ−シクロデキストリン及び逐次生成物としてほとんど全面的に環式オリゴサツカリドを形成するものが優れている。

細菌をγ−ＣＧターゼの産生に関してスクリーニングするに当たり有利にはデンプンを分解する、特に有利には好アルカリ性デンプン分解細菌を使用する。

γ−ＣＧターゼを産生する細菌の特性を明らかにするに当たっては細菌の形状、幅、長さ及び運動性を測定する。更に、ダラム反応における着色性、カタラーゼを形成するその能力並びにＧＣ−含量を測定する。

付加的に、異なる温度、異なるｐＨ及び異なるＮａＣ１濃度でのその生長挙動を測定する。

γ−ＣＧターゼの精製後に酵素の生化学的特性を明らかにする０例えば酵素の分子量、至適ｐＨ，ｐＨ安定性、至適温度及び温度安定性を測定する。

γ−ＣＧターゼの収率を高めるために、それをコードする遺伝子を遺伝子工学的に修飾し、かつ分泌型突然変異体中で発現させる。そのために遺伝子を初めにクローン化し、かつ配列決定する。その遺伝子をＥ。

コリ中でクローン化すると優れている。その後、同定した遺伝子をプロモータ、有利に調節可能なブロモ−することのできるｔａｃ−プロモータの制御下に配置する。これによってγ−ＣＧターゼの調節可能な過剰発現が可能である。最適な分泌のためにはシグナルペプチドの使用が有意である。固有のシグナルペプチドの使用はγ−ＣＧターゼ分泌にとっては好適である。

γ−ＣＧターゼをコードする遺伝子及びリーダ配列と共に調節性要素、例えばｔａｃ−プロモータも含有するベクターをγ−ＣＧターゼの製造のために微生物。

有利にＥ、コリ、特に有利にＥ、コリの分泌型突然変異体中に導入する。好適な分泌型突然変異体はコーロッパ特許公開第３３８４１０号に開示された方法により製造することができる。プロモータの誘導により、ラクトース又はＩＰＴＧに関連するｔａｃ−プロモータの場合、培地中でγ−ＣＧターゼの過剰生産及び分泌を達成することができる。分泌型突然変異体の上澄から本発明による蛋白質を公知方法で精製することが本明細書に記載の酵素により初めて第一にγ−シクロデキストリンを産生するγ−ＣＧターゼを製造することができる。

本酵素は記載の遺伝子工学的方法により、それが天然に由来する微生物から可能である場合に多量に取得することができる０本＃素により、米国特許第４８２２８７４号に記載の方法によりγ−シクロデキストリンの製造時間を著しく短縮することができる。

γ−シクロデキストリンはとりわけ疎水性物質の水溶液中での溶解度を高め、不安定物質を安定化しく例えばＵＶ−保護、酸化保護）、かつ揮発性物質を結合する。γ−シクロデキストリンは処方化剤としても使用することができる。

とりわけγ−シクロデキストリンは次の分野で使用される：製剤工業食品工業化粧品植物保護化学工業。

実施例において本発明によるγ−ＣＧターゼの単離、その遺伝子工学的修飾並びにこのγ−ＣＧターゼを好アルカリ性細菌バチルス２９０−３　（ＤＳＭ　５８５０）から過剰発現することにつ（Ｘで記載する。

第１図：好アルカリ性菌株バチルス２９０−３のγ−ＣＧターゼのβ−及びγ− シクロデキスト１ノン産生の転写解読枠第３図：γ−ＣＧターゼの過剰発現番；使用したｔａＣ−プロモータープラスミドｐＪＦ１１８ｕ第４図−合成オリゴヌクレオチドＭ８及びＭ９第５図：発現プラスミドｐ　ＣＭ７５０第６図：合成オリゴヌクレオチドＭＩＯ１Ｍｌ　１Ｍ１２及びＭ１３第７図ニブラスミドルｃＭ７２０例１：γ−ＣＧターゼ産生好アルカ１）性細菌のスフ１ノ〜０．２ｇを秤量し、かつ滅菌生理食塩溶液１ｍｌを包含する滅菌容器中に＠濁させた。粗大成分の沈積後にその都度０．１ｍｌをデンプン寒天プレート（培地１１０ｇ／Ｉ可溶性デンプン、５ｇ／ｌペプトン；５　ｇ　／　ｌ　＠母エキス；Ｉｇ／ＩＫＨ，Ｐ○ 、；０．２ｇ／］Ｍｇ５Ｏ４ｘ７Ｈ，Ｏ；　１０ｇ／ＩＮａｚＣＯ，；　１５ｇ／ｌ寒天；ｐＨ１０，４）上に塗布した。寒天プレートの恒温保持を３０℃で２〜３日間行った。デンプン分解細菌のコロニーは低分子のデンプン分子の劣化により生成した混濁した牽輪を示した。コロニーを単離し、かつ２回デンプン寒天プレート上で精製した。

更に培養を前記の組成の液体培地２ｍｌ中で実施した。

３０℃で４８時間恒温保持した後で細胞を遠心分離し、かつ上澄をγ−ＣＧターゼ活性に関して試験した。上澄２００μｍを２０ｍＭトリス／ＨＣＩ　ｐＨ９，Ｏ；５ｍＭＣａＣｌ２中の１０％デンプン溶液２００μｍと共に１〜５時間４０ ℃で恒温保持した。酵素反応をメタノール６００μｌの添加により停止し、かつ上澄を遠心後にＨＰＬＣにより分析した。多数の単離体から、動力学的に優先的にγ−シクロデキストリンを形成するＣＧターゼを培地中に析出する菌株のバチルス２９０−３を単離した（第１図）。

例２：菌株バチルス２９０−３の分類学上の特性の明示分垣学約分票は、従来正確には特性を明らかにすることのできなかったバチルス・フィルムス／レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｉｒｍｕｓ／１ｅｎｔｕｓ）− 複合体に分類することのできるダラム陽性の、胞子形成性細菌に該当することを明らかにした（表１参照）。

表１・単離体２９０−３の分類学的特性性　質　バチルス　２９０−３桿　菌　十輻　μｍ　０．７〜０，９長　さμｍ　２．５〜４．０運動性　十内生芽胞　十ダラム反応　十カタラーゼ　＋最大温度プラス生長℃　４０マイナス生長℃　４５生長ｐＨ５，７の培地中　− ｐＨ７，０の培地中　− ＮａＣＩ　５％　÷ ７％　＋ｍｏｌ　％　Ｇ＋Ｃ３６，６特表平５−５０１０５９　（４）例３．γ−ＣＧターゼの精製菌株バチルス２９０−３を培地ｌ（例１参照）中で培養した。４８時間の生長時間後に細胞を遠心により分離し、かつ培養上澄に（ＮＨ，）、ＳＯ，を飽和度６６％が達成されるまで添加した。混合物を１時間４℃で貯蔵し、かつ更に沈殿物を遠心（１００００ｘｇ　：２０分間ンにより分離した。沈殿物を開始容量の１／１００で緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス／ＨＣｌｐＨ８゜５．５ｍＭＣａＣ１，，０，０５％ｙ−ＣＤ）中に再懸濁し、かつ同じ緩衝液に対して透析した。遠心（１０分間；　１０１００００ｘ後に酵素溶液を親和性カラム（γ−シクロデキストリンがセファロース６Ｂにプチルジグルシジルエーテルを介して結合）上に施した。

１％のγ−シクロデキストリンを有する緩衝液Ａで溶離した。

溶離した蛋白質物質を硫酸アンモニウム沈殿により濃縮し、かつ再度透析した。

蛋白質の純度は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により調節した。

例４：γ−ＣＧターゼの生化学的特性の明示γ−〇Ｇターゼの生化学的特性の明確化により次の結果がもたらされた：分子量　７５０００Ｄａ至適ｐＨ６，０〜８．０ｐＨ安定性　５．０〜１０．０至適温度　６０℃ 温度安定性　５０℃まで例５．γ−ＣＧターゼの遺伝子のクローン化及び配列決定クローン化：菌株バチルス２９０−３の染色体ＤＮＡを部分的に制限酵素５ａｕ３Ａで切断し、かつフラグメントの大きさをアガロースゲル電気泳動を介して分画した後でこのＤＮＡ砕片をｐｔＪｃ１８　（ＢａｍＨＩ切断）中にクローン化した。

この遺伝子バンクのクローン２ｘｌＯ’個をコロニーハイプリダイゼイション実験（Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔ　ａｌ、１９８２．Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）においてバチルス１−１のβ−ＣＧターゼのコード領域の放射性標識した１、６ｋｂの大きさのＤＮＡフラグメント（ＢＧＩＩＩ−Ｐｓｔｌ）［：Ｐｒｏｃ、４ｔｈ　Ｉｎｔ、Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ（Ｈｕｂｅｒ　Ｏ，，５ｚｅｊｔｌｉ　Ｊ、、ｅｄｓ）１９８８．７１−７６頁、Ｋｌｕｗｅｒ　Ａｃａｄｅｍｉｃｌを用いて分析した。その際に、クローンｐ１９及びｐ４３が同定され、それらのプラスミドはγ− ＣＧターゼの遺伝子を包含していた。

配列決定。

γ−ＣＧターゼ構造遺伝子のヌクレオチド配列を測定するに当たりＤＮＡ−フラグメントをプラスミドｐＵＣ１８又はｐＵｃ１９中にサブクローン化した。エキソヌクレアーゼＩＩＩを用いてこれらのプラスミドの押入断片中で、サンガー− ジデオキシ連鎖開裂法（“Ｓａｎｇｅｒ−Ｄｉｄｅｏｘｙ−Ｋｅｔｔｅｎａｂｂ　ｒｕｃｈｍｅｔｈｏｄｅ″）によるＤＮＡ−配列決定がオーバーラツプする配列に案内するように欠失を発生させた（ＤＮＡ、１９８５．土、１６５−１７０）。γ−ＣＧターゼをコードする転写解読枠は２０９７個のヌクレオチドを包含する（第２図）、それから誘導される蛋白質は分子量７８０００Ｄａを有する６９９アミノ酸から成る。シグナルペプチドの切断後に分子量７５０００Ｄａになる。

例６：Ｅ、コリ中でγ−ＣＧターゼの発現及び分泌γ−ＣＧターゼの過剰発現のために“ｔａｃ”−プロモータプラスミドｐＪＦ１１８ｕ（第３図）を使用した。このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｔｎｄｌＩＩで切断し、かつアガロースゲル電気泳動を介して小さなりＮＡフラグメントを“ポリリンカー”から分離した。

プラスミドｐ１９（例６参照）をＡｃｃｌ及びＨｉｎ、　ｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉで切断し、かつアガロースゲル電気泳動を介して２．４ｋｂの大きさのＤＮＡ−フラグメントを単離し、これはγ−ＣＧターゼの構造遺伝子をほぼ完全に持っている。

遺伝子の５′末端で（第２図の″ＡｃｃＩサイト”参照）シグナルペプチドをコードする短い領域が欠損している。この領域は２つの合成オリゴヌクレオチドＭ８及びＭ９（第４図）により換えらｐＪＦ１１８ｕのＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　１−フラグメントとｐ１９のオリゴヌクレオチドベアＭ８、Ｍ９及びＡｃｃＩ−Ｈ１ｎｄＩＩＩ７ラグメントとの連結により発現プラスミドｐｃＭ７５０（第５図）が生成した。

分泌型突然変異体Ｅ、コリＷＣ：Ｍ　Ｉ　ＯＯをプラスミドｐ　ＣＭ７５　Ｑにより形質転換し、かつこの形質転換した菌株を完全培地（ｌｏｇ／ｌペプトン；　５　ｇ　／　１酵母エキス；５ｇ／ｌＮａＣｌ；Ｊｏｇ／Ｉラクトース；Ｏ，Ｉｇ／１ｃａｃ１．；　１００ｍｇ／ｌアンピシリン）中で３０℃で培養することにより菌株バチルス２９０−３による酵素収率に比べて５００倍高いγ−ＣＧターゼ収率が可能であった。

例７・γ−ＣＧターゼの修飾ホスホルアミダイト法によりオリゴヌクレオチドベアＭ１０、Ｍ　１１及びＭｌ２、Ｍｌ３を合成した（第６図）。このオリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列はバチルス１−１のβ−ＣＧターゼのＮ末端アミノ酸配列をコードし［Ｐｒｏｃ、４ｔｈ　Ｉｎｔ、Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ（Ｈｕｂｅｒ　Ｏ，，５ｚｅｊｔｌｙ　Ｊ、、ｅｄｓ）１９８８゜７１−７６頁、ＫｌｕｗｅｒＡｃａｄｅｍｉｃコ、特表千５−５０１０５９　（５）かつ５ｓｐＩ切断部位までのＤＮＡ領域を包含するγ−ＣＧターゼのＮ末端範囲に同じである（第２図参照）プラスミドｐｃＭ７５０を部分的に制限酵素ＡｃｃＩで切断した。Ｓｓｐ　Ｉで後切断し、かつアガロースゲル電気泳動を介して大きさ７．３ｋｂのＤ　Ｎ　Ａフラグメントを単離した。このＤＮＡフラグメントと二本鎖オリゴヌクレオチドＭＩ　Ｏ，Ｍｌ　ｌ及びＭｌ２、Ｍｌ３との連結によりキメラγ−ＣＧターゼをコードするプラスミドｐｃＭ７２０（第７図）が生成した。

例６に相応する分泌型突然変異体Ｅ、コリＷＣＭ１００の形質転換及び培養によりγ−ＣＧターゼの収率は例６の結果に比べて２倍高まった。

例８．γ−ＣＧターゼを使ってγ−シクロデキストリンの製造可溶性デンプンｌｏｇを緩衝液（１０ｍｍｏｌ／１トリス／ＨＣＩ　ｐＨ８，０及び５ｍＭＣａＣ１ｚ）１００ｍｌ中に取り、かつデンプンを５分間９５℃に加熱することにより溶解した。５０℃に冷却後γ−シクロデキストリンの選択的錯体ビルダーとしてシクロヘキサデセノンＩｇを添加した。更に、γ−ＣＧターゼ１００Ｕをピペット添加した。パッチを激しく撹拌し、かつ反応温度を５０℃に保持した。、８時間の反応時間後に使用したデンプンに対してγ−シクロデキストリン４８％の至適収率が達成された。

比較例。

実験を例５と同様に実施した。ただしγ−ＣＧターゼの代わりにバチルス・マケランスのα−ＣＧターゼ１００Ｕを使用した。３２時間後にγ−シクロデキストリンの最大収率４３％が達成された。

シクｏテキｙ、、トリンａ度Ｃ（ＣＤ）［ｋｇ／ｒｒ＋３１ニ”ｉ＝ｉ：ｚ、　４９０　５１０　５コ０！２（ＦＯｒｔＳ、）６１０　６：１０　６５０６７０　６９０　フ１０７３０　７５０　フ７０Ｂ５０　８７０　８９０９１０　９コ０　９５０１０：１０　１０５０　１０７０ −二１ｔｉ鴛ｉ；２（ＦＯｒｔＳ、）１５１０　１５：１０　１５５０１５７０　１５９０　Ｘ６１０ −二Ｅ６２（Ｆｏｒｔｈ、）１８１０　１８：１０　１８５０１８フ０　１８９０　１９１０特表平５−５０１０５９　（８）要　約　書本発明はγ−シクロデキストリングリコジルトランスフェラーゼに関する。これは、細菌をγ−シクロデキストリングリコジルトランスフェラーゼに関してスクリーニングし、これらの細菌の特性を明らかにし、かつ細菌のγ−シクロデキストリングリコジルトランスフェラーゼを精製し、かつ生化学的特性を明らかにすることにより得られる。該＃素はデンプンがらγ−シクロデキストリンを製造するのに使用することがで手続補正書（自発）特□庁長官や　平成４年　９１２５″ １、事件の表示ＰＣＴ／ＥＰ　９１１００５６０２、発明の名称 γ　−ＣＧ　タ　−　ゼ３、補正をする者ング］５、補正により増加する請求項の数　０６、補正の対象明細書及び請求の範囲７、　補正の内容（１）請求の範囲を別紙のとおり補正する。

（２）明細書第１頁第５行の「に関する。」を［に関し、該トランスフェラーゼは基質デンプンにより第一にγ−シクロデキストリン及び逐次生成物としてほとんど全面的に環式オリゴサツカリドを形成する。」と補正する。

（３）同第３頁下から第５〜２行の［基質デンプン・・・・・・優れている。ｊを「該トランスフェラーゼは基質デンプンにより第一にγ−シクロデキストリン及び逐次生成物としてほとんど全面的に環式オリゴサツカリドを形成する。」と補正す（４）同第５頁第１４行の「できる。」を「でき、このＣＧターゼは基質デンプンにより第一にγ−シクロデキストリン及び逐次生成物としてほとんど全面的に環式オリゴサツカリドを形成する。」と補正する。

（５）同第６頁第８〜９行のｒ　（ＤＳＭ５８５０）Ｊをｒ　（ＤＳＭ５８５０．１９９０年３月１９日にドイツ微生物及び細胞培養物保存機関ＤＳＭに寄託）」と補正する。

請求の範囲 ■、　バチルス２９０−３　（ＤＳＭ５８５０）からのγ−シクロデキストリングリコジルトランに取得することのできることを特徴とする請求項Ｉ記載のγ− シクロデキストリングリコジルトランスフェラーゼのアミノ末端領域で修飾された誘導体。

３．５′末端範囲で、バチルスｌ−１からの　−〇Ｇターゼの同じアミノ酸をコードするＤＮＡ領域により置換されている請求項１記載のγ−シクロデキストリングリコジルトランスフェラーゼの遺伝子によりコードされていることを特徴と　るγ−シクロデキストリングリコシルトられるシクロデキストリングリコジルトランスフェラーゼをコードする発現プラスミド。

５、ａ）好アルカリ性のデンプン分解性細菌をγ−ＣＧターゼに関してスクリーニングし、ｂ）これらの細菌を分類学的に特性を明らかに支ユＣ）細菌の　−〇Ｇターゼを精製し、かつ生化学的特性を明らかにし、ｄ）γ−ＣＧターゼの遺伝子をクローン化し、かつ配列決定し、ｅ）この遺伝子を成熟蛋白質の５′範囲をコードする領域中で修飾し、ｆ）このように修飾した遺伝子を調節可能なプロモータの制御下に配置し、かつ遺伝子を細菌と共に増殖させかつ遺伝子生成物を分泌させることが出きるように細菌中に導入し、）酵素を培養上澄から、誘導及び発現後に取得することを特徴とするγ−シクロデキストリングリコジルトランスフェラーゼの取得法。

６、　−シクロデキストリングリコジルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を固有のシグナルペプチドの使用下に遺伝子工学的に修飾して、γ−シクロデキストリングリコジルトランスフェラーゼの調節可能な過剰発現を可能にし、かつこのようにして修飾した遺伝子を分泌型突然変　体で発現させることを特徴とするγ−シクロデキストリングリコシルト・ランスフェラーゼ有するγ−シクロデキストリングリコジルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ。

９、　第２図に記載されているアミノ酸１９８〜アミノ酸２１４及び／又はアミノ酸２３８〜アミノ酸２４７及び／又はアミノ酸２６７〜アミノ酸２７５及び／又はアミノ酸３３６〜アミノ酸３４３のアミノ酸範囲を含有するγ−シクロデキストリングリコジルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ。

１０、請求項１から３までのいずれか１項によるγ−ＣＧターゼを使用することを特徴とするγ−シクロデキストリンの製法。

月ユ菌株バチルス２９０−３　（ＤＳＭ５８５０）。

国際調査報告＋＋ｎｅｔｎｈ１嗜１１ｎｈ１＾ｐｐＨｃ＋＋１ｎｎＮｕＰ（’Ｉ’／Ｅｌ’９１１００５６０Ｉｎ＋ｆ＋ｎａ、ｕ＋ｎ、ｌ　Ａｐｐｌ＋＋、＋＋ｕ。Ｎｔ＋　Ｉ’Ｃ１１Ｅｌ’　９１１００５６０国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．ａ）細菌をγ−ＣＧターゼの分泌に関してスクリーニングし、ｂ）これらの細菌の特性を明らかにし、かつｃ）細菌のγ−ＣＧターゼを精製し、かつ生化学的特性を明らかにすることにより得られるγ−シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ。
２．ａ）細菌をγ−ＣＧターゼの分泌に関してスクリーニングし、ｂ）これらの細菌の特性を分類学的に明らかにし、ｃ）細菌のγ−ＣＧターゼを精製し、かつ生化学的特性を明らかにし、ｄ）γ−ＣＧターゼの遺伝子をクローン化し、かつ配列決定し、ｅ）遺伝子を修飾し、かつ該遺伝子を細菌と共に増殖させかつ遺伝子生成物を分泌させることができるように細菌中に導入し、ｆ）酵素を培養液上澄から、誘導及び発現後に取得することにより得られるγ−シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ。
３．γ−ＣＧターゼの分泌に関してスクリーニングする細菌はデンプン分解性の、有利に好アルカリ性のデンプン分解性細菌であることを特徴とする請求項１及び２により得られるγ−ＣＧターゼ。
４．修飾として調節可能なプロモータ、殊にラクトースを誘導することのできるｔａｃ−プロモータ５′をγ−ＣＧターゼ遺伝子の前に挿入することを特徴とする請求項１から３までのいずれか１項により得られるγ−ＣＧターゼ。
５．パチルス２９０−３からのγ−ＣＧターゼ。
６．パチルス２９０−３からのγ−ＣＧターゼの修飾誘導体。
７．γ−シクロデキストリングリコシルトランスフエラーゼ。
８．菌株パチルス２９０−３（ＤＳＭ５８５０）。
９．請求項１から４までのいずれか１項により得られるシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼをコードする発現プラスミド。
１０．ａ）細菌をγ−ＣＧターゼの分泌に関してスクリーニングし、ｂ）これらの細菌の特性を明らかにし、ｃ）細菌のγ−ＣＧターゼを精製し、かつ生化学的特性を明らかにし、ｄ）γ−ＣＧターゼの遺伝子をクローン化し、かつ配列決定し、ｅ）遺伝子を修飾し、かつ該遺伝子を細菌と共に増殖させかつ遺伝子生成物を分泌させることができるように細菌中に導入し、ｆ）酵素を培養液上澄から、誘導及び発現後に取得することを特徴とするシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼの取得法。
１１．γ−ＣＧターゼの分泌に関してスクリーニングする細菌はデンプン分解性の、有利に好アルカリ性のデンプン分解性細菌であることを特徴とする請求項１０による方法。
１２．修飾として調節可能なプロモータ、殊にラクトースを誘導することのできるｔａｃ−プロモータ５′をγ−ＣＧターゼ遺伝子の前に押入することを特徴とする請求項１０又は１１項による方法。
１３．請求項１から７までのいずれか１項によるγ−ＣＧターゼを使用することを特徴とするγ−シクロデキストリンの製法。
１４．シクロヘキサデセノンを錯体ビルダーとして使用することを特徴とするγ −シクロデキストリンの製法。