JPH07183A

JPH07183A - コリネバクテリウムの生産するサイクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼの製造法及び該酵素の利用

Info

Publication number: JPH07183A
Application number: JP5097077A
Authority: JP
Inventors: Hiroji Tsuji; 廣二辻
Original assignee: Amano Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Amano Enzyme Inc
Priority date: 1993-03-30
Filing date: 1993-03-30
Publication date: 1995-01-06

Abstract

(57)【要約】【目的】比較的低温下で作用してＣＤを生産し、且つ
又、受容体得異性の広い性質を併せ持つところのCGTase
の工業的製造法を提供する。【構成】コリネバクテリウムに属するCGTase生産能を有
する微生物を培養し、培養物中にCGTaseを生産せしめ、
これを採取するCGTaseの製造法並びに該酵素を用いるＣ
Ｄの製造法及び該酵素を用いる糖転移生成物の製造法で
ある。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、サイクロデキストリン
・グルカノトランスフェラーゼ（EC 2.4.1.19、以下CGT
aseという）の製造方法並びに該酵素を用いるサイクロ
デキストリン（以下ＣＤという）の製造法及び該酵素を
用いる糖転移生成物の製造法に関する。

【０００２】更に詳しくは、コリネバクテリウム（Cory
nebacterium）属に属するCGTase生産能を有する菌株を
培養し、培養物中にCGTaseを産生せしめ、これを採取す
るCGTaseの製造法並びに該CGTaseを澱粉等の溶液に作用
せしめて、主としてβ−ＣＤを生成せしめるＣＤの製造
法及び該CGTaseを糖供与体溶液に受容体存在下作用せし
めて糖転移生成物を生成せしめる糖転移生成物の製造法
に関する。

【０００３】ＣＤは、６〜８個のグルコース分子がα−
1,4−グルコシド結合で環状に結合した非還元性のマル
トオリゴ糖であり、その分子空洞内に種々の物質を取り
込んで包接化合物を形成し、取り込まれた物質の物理、
化学的性質を変化させることができ、そのため、酸化し
易い化合物や光分解し易い化合物の安定化、揮発性化合
物の不揮発化、難溶性化合物の可溶化、臭気性物質の無
臭化が可能であり、医薬品、化粧品、農薬及び食品への
広い分野で利用されている。

【０００４】CGTaseは、澱粉単独に作用させると分子内
転移反応によりＣＤを合成するが、適当な受容体存在下
で糖供与体に作用させると分子間糖転移反応を触媒し、
受容体への糖転移生成物を合成する。

【０００５】最近、CGTaseの分子間糖転移反応を利用し
てカップリングシュガーの製造、ヘスペリジン誘導体及
びルチンの溶解度の改善、ステビオシドの味覚の改善及
びＬ−アスコルビン酸の安定化などの種々の有用物質の
合成や有用配糖体の性質改善等が行われるようになり、
受容体特異性の幅の広いCGTaseが要望されている。

【０００６】

【従来の技術】これまで、CGTaseの生産菌としては、主
として、バチルス属のものが知られている。

【０００７】例えば、バチルス・メガテリウム（Bacill
us megaterium）のCGTase（特開昭48-40996）、バチル
ス・マセランス（Bacillus macerance）のCGTase（特開
昭56-43212）、バチルス・サーキュランス（Bacillus c
irculans）のCGTase（特開昭48-40996）、バチルス・ス
テアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilu
s）のCGTase（特開昭60-120984）等があげられる。

【０００８】しかしながら、CGTaseの分子間糖転移作用
の面から着目すると、バチルス・メガテリウム（Bacill
us megaterium）、バチルス・マセランス（Bacillus ma
cerance）及びバチルス・サーキュランス（Bacillus ci
rculans）の何れのCGTaseも受容体特異性が狭く、各種
糖転移生成物の合成や性質、物性の改変等に利用するに
は不十分であった。

【０００９】そして又、バチルス・ステアロサーモフィ
ラス（Bacillus stearothermophilus）のCGTaseは、Ｌ
−ラムノースを受容体としたとき、糖転移効率が低く、
糖転移生成物量が少ない。

【００１０】しかも、この酵素は耐熱性酵素であり、高
温度での反応性に比較して、４０〜５０℃の比較的低温
度での反応性が低いために、物質の合成や改変に利用す
るには、必ずしも適してはいなかった（例えば、Ｌ−ア
スコルビン酸への糖転移にこの酵素を使用しようとして
も、Ｌ−アスコルビン酸が高温において不安定なため使
用することが困難である等）。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、比較
的低温下で作用してＣＤを生産すると同時に受容体特異
性の広い性質を併せ持つところのCGTase生産能を有する
微生物を見い出し、該微生物を培養し、培養物中にCGTa
seを産生せしめ、これを採取するCGTaseの製造法を提供
することにある。

【００１２】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
本目的のCGTase生産能を有する微生物を広く自然界に求
め、鋭意探索を試みた結果、土壌から得られた１菌株
が、本目的のCGTaseを生産することを見い出した。

【００１３】そして、本菌株がコリネバクテリウムに属
する新種であること及びコリネバクテリウム属において
これまでCGTaseを生産する報告は、無いことを知ると共
に、本菌株を培養し、培養物中にCGTaseを産生せしめ、
これを採取することにより本発明を完成した。

【００１４】本発明において使用され、新たに土壌から
発見、分離された本菌株の菌学的性質は下記の通りであ
る。

【００１５】（１）形態細胞の形および大きさ：多型状桿菌、1.0 × 1.5μ 運動性の有無：無し胞子の有無：無しグラム染色性：陽性抗酸性：陰性

【００１６】（２）各培地における生育状態肉汁寒天平板培養：発育は、良好で初期は淡黄の全縁半
透明のコロニーとなる。表面はわずかに鱗片状を示す。
数日後、平坦、不透明且つ黄〜オレンジ色の厚いコロニ
ーとなる。中央部及び周辺部は、円錐状又は隆起状にな
るため特にその部分は強いオレンジ色を示す。肉汁寒天斜面培養：直状で軟らかく平坦で光沢がある。
周縁は全縁で生育は良好。可溶性色素は産生しないが、
菌苔は黄〜淡橙。弱アルカリ性肉汁寒天で橙色および生
育が著しく高まる。肉汁液体培養：生育はやや弱いが、一様に混濁後膜状の
沈殿を生ずる。リトマスミルク培養：還元・消化

【００１７】（３）生理学的性質ＯＦテスト：発酵、酸化共になし酸素に対する態度：好気性ゼラチンの加水分解：陽性カゼインの加水分解：陽性（弱）澱粉の加水分解：陽性チロシンの加水分解：陰性エスクリン加水分解：陰性ツイーン８０加水分解：陰性アルギニンの加水分解：陰性馬尿酸加水分解：陰性カタラーゼ：陽性オキシダーゼ：陰性レシチナーゼ：陰性ＤＮＡアーゼ：陽性ウレアーゼ：陰性硫化水素の生成：陰性インドールの生成：陰性３ケト乳糖生成：陰性（黄色）ＶＰテスト：陰性硝酸塩の還元：陰性クエン酸の利用：陰性メチレンブルー還元：陰性生育pHの範囲：7.0〜9.4 生育温度の範囲：16〜42℃（最適は38℃）食塩に対する生育性：0.5〜7.0％で陽性、10％で陰性マッコンキー生育：陰性サブロウ寒天生育：陰性糖類からの酸生成の有無：グルコース＋Ｌ−アラビノース − キシロース − マンニット − ラクトース − トレハロース＋ガラクトース＋マンノース − マルトース＋メリビオース＋ソルビット − シュークロース＋サリシン＋（弱い）

【００１８】以上の菌学的性質について、Bergey's Man
ual of Determinative Bacteriology第８版（1974）及
びBergey's Manual of Systematic Bacteriology第２巻
（1986）を参照し、その性状を比較したところ、本菌
は、アルカリ性培地で強オレンジ色を産出する多型性細
菌であり、胞子は、染色では認められない比較的耐熱の
細菌であることから、コリネバクテリウム（Corynebact
erium）に属することが分かった。

【００１９】さらに、本菌は、上記の菌学的諸性質か
ら、Bergey's Manualに記載されないコリネバクテリウ
ム属の新種であることが分かり、それ故、本菌株をコリ
ネバクテリウム・エスピー（Corynebacterium sp.）No.
9616と命名した。

【００２０】本菌株は工業技術院生命工学工業技術研究
所にFERM P-13520として寄託されている。

【００２１】尚、これまでコリネバクテリウム（Coryne
bacterium）に属する菌株において、CGTase生産能を有
する旨の報告はなく、本菌株が初めてである。

【００２２】本菌株を利用して、CGTaseを製造するため
には、当該微生物が良好に生育し、酵素を順調に生産す
るために必要な炭素源、窒素源、無機塩等の栄養源を含
有する合成培地又は天然培地中でこれを培養する。

【００２３】炭素源としては、澱粉又はその組成画分、
焙焼デキストリン、加工澱粉、澱粉誘導体、物理処理澱
粉及びα−澱粉等の炭水化物が使用できる。具体例とし
ては、可溶性澱粉、トウモロコシ澱粉、馬鈴薯澱粉、甘
藷澱粉、デキストリン、アミロペクチン、アミロース等
があげられる。

【００２４】窒素源としては、ポリペプトン、カゼイ
ン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー或
いは大豆又は大豆粕などの抽出物等の有機窒素源物質、
硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機塩窒素
化合物、グルタミン酸等のアミノ酸類が挙げられる。

【００２５】そして無機塩類としては、リン酸１カリウ
ム、リン酸２カリウム等のリン酸塩、硫酸マグネシウム
等のマグネシウム塩、塩化カルシウム等のカルシウム
塩、炭酸ナトリウム等のナトリウム塩等が用いられる。

【００２６】培養は、振盪培養若しくは、通気攪拌培養
等の好気的条件下に於いて培地pH７〜11の範囲、好まし
くはｐＨ８〜10の範囲に調整し、温度10〜40℃の範囲、
好ましくは、25〜37℃で実施するのが望ましいが、この
条件以外であっても微生物が生育し、目的とする酵素を
生成する条件であれば特に制限されない。

【００２７】このようにして培養を行うと、通常は培養
を開始して２〜７日間で培養液中にCGTaseが生産され
る。

【００２８】次いで、培養液から菌体を除去し、培養ろ
液を得、限外ろ過膜で脱塩、濃縮した後、硫安塩析又は
有機溶媒沈降等により酵素を回収する。

【００２９】こうして得られた粗製のCGTaseは、そのま
までもＣＤ生成反応に使用できるが、必要に応じて、更
にＤＥＡＥ−セファデックス（商品名、ファルマシア社
製）による吸着溶出、セファデックス（商品名、ファル
マシア社製）による分画等により精製して使用する。

【００３０】得られた酵素CGTaseの酵素化学的性質を以
下に述べる。

【００３１】作用及び基質特異性：１％可溶性澱粉液
〔5 mM CaCl₂ を含む10 mM 酢酸緩衝液（pH6.0）〕20 m
lに本酵素（乾燥澱粉１ｇ当たり２単位）を加えて、40
℃で反応を行い、経時的に対原料澱粉当たりのＣＤ生成
量を測定した。その結果を図１に示す。

【００３２】図中の白四角はβ−ＣＤの生成量を示すも
のであり、白三角は、α−ＣＤの生成量を示すものであ
り、白丸はγ−ＣＤの生成量を示すものである。

【００３３】図１より明かなように本酵素は澱粉に作用
し、主としてβ−ＣＤを生成し、α−ＣＤ及びγ−ＣＤ
をも生成する。

【００３４】受容体特異性：１mM CaCl₂を含む10mMリ
ン酸緩衝液（pH7.0）に10％のα-ＣＤ及び10％の各種受
容体をそれぞれ含むものを基質とし、本酵素５単位を加
え、４０℃で20時間反応させ、得られた糖転移生成物を
ＴＬＣにて分析した。

【００３５】同時にバチルス・マセランス（Bacillus m
acerans IFO 3490）由来のCGTase、バチルス・サーキュ
ランス（Bacillus circulans IFO 3329）由来のCGTase
及びバチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus ste
arothermophilus）由来のCGTase（林原社製品）のそれ
ぞれについても、添加する酵素活性を同一とし、受容体
特異性を調べ、本酵素と比較し、その結果を表１に示し
た（但し,この場合の緩衝液には、10 mM 酢酸緩衝液（p
H5.5）を使用した。）。

【００３６】尚、表中の記号のうち＋は、糖転移生成物
を生成する場合を（糖転移生成物量は、＋の数に比例し
て多くなる。）、（＋）は、僅かに糖転移生成物を生成
する場合を、−は、糖転移生成物を生成しない場合をそ
れぞれ表示した。

【００３７】

【表１】

【００３８】表１から明かなように、本酵素は、受容体
のＤ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロー
ス、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース及びＬ−ラム
ノースに対して糖転移生成物を生成するのみならず、Ｄ
−マンノース、Ｄ−リボース、Ｄ−フコース及びＬ−フ
コースに対しても糖転移生成物を生成するので、バチル
ス・マセランス及びバチルス・サーキュランス由来のCG
Taseに比較してより受容体特異性の幅が広いことは明ら
かであり、そしてまた、Ｌ−ラムノースに対する糖転移
生成物は、バチルス・ステアロサーモフィラス由来のCG
Taseより多く生成していることも分かる。

【００３９】尚、Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース及び
Ｌ−ラムノースを受容体とし、本酵素、バチルス・マセ
ランス由来のCGTase及びバチルス・ステアロサーモフィ
ラス由来のCGTaseを用いたときのそれぞれの糖転移生成
物を、ＴＬＣにて分析したクロマトグラムを図２に示
す。

【００４０】図中、Ｂはブランク（受容体のみの場合）
であり、Ｘは本酵素の場合であり、Ｍはバチルス・マセ
ランス由来のCGTaseの場合であり、Ｓはバチルス・ステ
アロサーモフィラス由来のCGTaseの場合をそれぞれ示
し、またＲはグルコース及びマルトオリゴ糖を示す。

【００４１】至適ｐＨ：本酵素を1.5％可溶性澱粉溶
液に40℃にてpH３〜13のpH条件下で、30分間作用させ、
それぞれの活性を測定し、その結果を図３に示す。

【００４２】尚、図中の白丸はマッキルバイン（McIlva
ine）緩衝液の、白三角はアトキンス・パンチン（Atkin
s & Pantin）緩衝液のｐＨ曲線を示すものであり、図３
から明かなように本酵素の至適ｐＨは、５〜６付近であ
る。

【００４３】至適温度：本酵素を1.5％可溶性澱粉溶
液に各種温度にてpH６の条件下で30分間作用させ、それ
ぞれの活性を測定し、その結果を図４に示す。

【００４４】図４から明かなように本酵素の至適温度
は、60℃付近である。

【００４５】安定pH：本酵素液をpH４〜10のpH条件下
で、40℃で30分間保持し、その残存活性を測定し、その
結果を図５に示す。

【００４６】尚、図中の白丸はマッキルバイン（McIlva
ine）緩衝液の、白三角はアトキンス・パンチン（Atki
ns & Pantin）緩衝液の安定ｐＨ曲線を示すものであ
り、図５から明かなように安定pH範囲は、ｐＨ5.5〜9.5
である。

【００４７】温度安定性：本酵素液を各種温度下で、
pH6.0〔0.1M マッキルバイン（McIlvain）緩衝液〕にて
30分間放置後、それぞれの残存活性を測定し、その結果
を図６に示す。

【００４８】図６の実線から明かなように本酵素は、50
℃で90％の残存活性を示した。尚、本酵素は、カルシウ
ム塩の添加により安定化され、10mMのカルシウム塩によ
り50℃の処理においても、100％の残存活性を示した
（図６中の破線で示す。）。

【００４９】活性測定法：基質〔1.5％可溶性澱粉、
0.1Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）〕0.5mlに酵素液0.05mlを
添加し、40℃にて30分間反応し、その後、0.1Ｎ塩酸５m
lを加え反応を停止し、その0.5mlを採り、0.05％ヨウ素
−0.05％ヨウ化カリウム溶液５mlを加え、発色させ、66
0nmでの吸光度の減少を測定した。

【００５０】この測定条件にて、１分間に660nmの吸光
度を１％減少させる酵素量を１単位とした。

【００５１】本発明方法によりＣＤを製造するには、例
えば、先ず１〜30％の澱粉（澱粉又はその組成画分、加
工澱粉等を含む）を含有する水溶液に本酵素液（精製品
又は粗製品）を0.5〜20単位（乾燥澱粉１ｇ当たり）加
えてpH４〜10、温度20〜70℃にて、１〜50時間酵素反応
を行う。

【００５２】そして又、本発明方法により糖転移生成物
を製造するには、例えば、先ず１〜30％の糖供与体（澱
粉又はその組成画分、加工澱粉、ＣＤ等を含む）を含有
する水溶液に１〜30％の各種糖類受容体存在下、本酵素
液（精製品又は粗製品）を0.5〜20単位（乾燥澱粉１ｇ
当たり）加えてpH４〜10、温度20〜70℃にて、１〜50時
間酵素反応を行う。

【００５３】以下に、実施例にて本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれらによって限定されるものではな
い。

【００５４】

【実施例】

実施例１可溶性澱粉 1.0％、ポリペプトン 0.5％、酵母エキス
0.25％、硫酸アンモニウム 0.1％、K₂HPO₄ 0.05％、MgS
O₄・7H₂O 0.025％、CaCl₂ 0.01％からなる培地（pH7.0）
100 mlを500 ml容坂口フラスコに入れ、常法により殺菌
後コリネバクテリウム・エスピー（Corynebacterium s
p.）No.9616 FERM-P 13520を接種し、37℃で40時間振盪
培養した。

【００５５】培養後、培養菌体を遠心分離にて除去し、
酵素液２Ｌを得、この酵素液を5 mMリン酸緩衝液中（pH
7.0）にて透析後、限外ろ過膜（モジュールＳＩＰ，旭
化成社製）にかけ、濃縮液 30ml（CGTase活性は4.6単位
／mlであった。）を得た。

【００５６】実施例２５％及び10％濃度の可溶性澱粉溶液〔5 mM CaCl₂ を含
む10 mM 酢酸緩衝液（pH6.0）〕20 mlに実施例１により
得られたCGTaseの濃縮液を1.0単位（乾燥澱粉１ｇ当た
り）を加え、50℃にて47時間反応させて得られたα−Ｃ
Ｄ、β−ＣＤ及びγ−ＣＤの収率（基質に対する重量比
で示す）は、澱粉濃度５％の場合、それぞれ16.6％、3
4.2％及び7.6％であり、澱粉濃度10％の場合、それぞれ
13.8％、27,0％及び6.6％であった。

【００５７】実施例３１mM CaCl₂を含む10mMリン酸緩衝液（pH7.0）にα-ＣＤ
（10％量）及びＤ−グルコース、Ｄ−キシロース、Ｌ−
ラムノースの各種受容体（何れも10％量）をそれぞれ含
むものを基質とし、本酵素５単位を加え、４０℃で20時
間反応させ、各種の糖転移生成物をＴＬＣにて分離取得
した。

【００５８】

【発明の効果】本発明は、CGTase産生能を有するコリネ
バクテリウムに属する微生物を培養し、培養物中にCGTa
seを生産せしめ、これを採取するCGTaseの製造法及び本
酵素を用いるＣＤの製造法である。

【００５９】本願発明は、本酵素を収率よく製造する方
法であり、これによりＣＤが安価に製造されると共に、
本酵素は、受容体特異性が広く、各種の糖転移生成物を
製造することができるので、物質の合成や性質の改変
等、食品分野、医薬分野及び工業分野等の様々な分野に
利用することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本酵素を澱粉に作用させたときの反応時間と各
種サイクロデキストリンの生成量との関係を示す。

【図２】本酵素、バチルス・マセランス由来のCGTase及
びバチルス・サーキュランス由来のCGTaseの各種受容体
に対する糖転移生成物をＴＬＣにて分析したクロマトグ
ラムの模式図を示す。

【図３】本酵素の至適ｐＨ曲線を示す。

【図４】本酵素の至適温度曲線を示す。

【図５】本酵素の安定ｐＨ曲線を示す。

【図６】本酵素の温度安定曲線を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】コリネバクテリウム属に属するサイクロデ
キストリン・グルカノトランスフェラーゼ生産能を有す
る微生物を培養し、培養物中にサイクロデキストリン・
グルカノトランスフェラーゼを産生せしめ、これを採取
することを特徴とするサイクロデキストリン・グルカノ
トランスフェラーゼの製造法。
【請求項２】澱粉、デキストリン、アミロース、アミロ
ペクチン等の溶液にコリネバクテリウム属の産生するサ
イクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼを反
応させ、反応液中に主としてβ−サイクロデキストリン
を生成せしめ、これを採取することを特徴とするサイク
ロデキストリンの製造法。
【請求項３】糖供与体を含有する水溶液に、受容体存在
下、コリネバクテリウム属の産生するサイクロデキスト
リン・グルカノトランスフェラーゼを反応させ、反応液
中に糖転移生成物を生成せしめ、これを採取することを
特徴とする糖転移生成物の製造法。
【請求項４】糖供与体が、澱粉又はその組成画分、焙焼
デキストリン、加工澱粉、澱粉誘導体、物理処理澱粉及
びα−澱粉等の炭水化物、サイクロデキストリンのうち
の何れかである請求項３記載の糖転移生成物の製造法。
【請求項５】受容体が、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクト
ース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンノース、Ｄ−リボー
ス、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−フコー
ス、Ｌ−フコース及びＬ−ラムノースのうちの何れかで
ある請求項３記載の糖転移生成物の製造法。