JPH05501062A - Ｈｉｖ―１のウイルス性コンプレックス抗原に結合する組換え蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＨＩＶ−１のウィルス性コンプレックス抗原に結合する組換え蛋白質 人の種々のモノクローナル抗体（ｍＡ、Ｋ）は、例えば疾病によって成る抗原に 対して免疫反応を示すような人のＢリンパ球を取り出し、このＢリンパ球を成る 適当な細胞系、中でも骨髄種細胞系との融合によって不死化（ｉｍｍｏｒｔａｌ ｉｓｉｅｒｅｎ）させるようにして作ることができる。このようにして得られた ハイブリッド細胞系、ハイブリドーマはｍＡＫの生産担体の役目をする。これら は試験管内で細胞培養物の形で使用し、そして必要な規模で培養することができ る（１）。

その際清算される物質は一部に完全ｍＡＫであり、このものは互いにジスルフィ ド架橋といくつかの非共有結合によって結合されている２つのＨ鎖及び２つのＬ 鎖によって特徴づけられ、そしてそれらは−緒になって、その特異的に結合する 抗体を形成する〔２）。

このような抗体の構造は例えば補体の活性化のような、いわゆるエフェクター機 能をもたらす成る定常的領域と、それぞれの抗体の特異的結合を引き起こす成る 可変領域とに分けることができる。

種々の抗体は生物化学的方法によって酵素反応的に分解することができる。例え ばパパイン又はペプシンによって上記定常的領域の一部を分解することができる 。このようにして作られたＦａｂ’又は（Ｆａｂ’１２フラグメントはもとの抗 体と類似的な態様で、その対象とする抗体を結合することができる（２）。完全 な定常領域の、いわゆるＦｖフラグメントをもたらすような蛋白質の酵素分解的 な分解も報告されている。しかしながらこれは上に述べたような種々の抗体のパ パイン分解やペプシン分解に比してはるかに低い再現性でしか実現することがで きない（３，４）。けれども遺伝子工学の種々の方法によって、Ｆｖフラグメン トは再現可能な態様で作り出すことができる。それに必要な前提条件、並びに用 いられるいくつかの方法を以下に記述する。

種々のルーチン作業的方法を用いてｍＡＫを生産するハイブリドーマ細胞系のｃ ＤＮＡバンクが作られる。ｍＡＫ生産性の種々のハイブリドーマから傘ＲＮＡが 分離される。このＲＮＡはリポソーム性ＲＮＡの他にその細胞の全転写体を包含 する。不完全に加工された核の転写体のみならず、いわゆるメツセンジャーＲＮ Ａである成熟した細胞質転写体も存在する。これらは３゛末端のところのポリ− アデノシン尾部によって特徴づけられる。このポリーＡ領域はオリゴ−ｄＴセル ローズを用いる親和性クロマトグラフィーにより上記成熟したｍＮＲＡを分離す るために用いることができる。「逆転写酵素」によってそのｍＲＮＡをいわゆる ｃＤＮＡに逆転写することができる。適当なベクターの使用によって、その得ら れた核ｃＤＮＡの混合物をクローニングすることができ、これによっていわゆる ｃＤＮＡバンクがもたらされる（５）。種々の免疫グロブリン特異性ハイプツト 化ゾンデが所望の配列の含まれた各クローンの特定と分離とを許容する。これら クローンのＤＮＡの配列形成及び公知の免疫クロプリン遺伝子（ドイツ国ハイデ ルベルクのＥＭＢ　Ｌ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄａｔａ　 Ｌｉｂｒａｒｙ　）との配列の比較によって各クローンの類別の確実性を得るこ とができる。このようにして、例えばｍＡＫのＬ鎖又はＨ鎖の各配列を備えてい るクローンを分離することができる。

このようにして得られた免疫グロブリン−ｃＤＨＡの配列分析によってＨ鎖又は Ｌ鎖の個々のドメインを公知の免疫グロブリン配列と比較することによって特定 することができ、可変領域及び定常領域を特定することができ、そして例えば可 変領域内においてその特異的抗原結合をもたらす、いわゆる「過可変的」又は「 相補性決定領域」を特定することができる（６）。

このようにしてクローニングされた抗体遺伝子は種々の系において発現させるこ とができる。まず第一に、適当な発現ベクターを用いれば、例えば骨髄腫細胞の ような種々の動物細胞の培養を使用することができる（７）。完全抗体のための 発現担体として酵母を用いること（８）やバクテリア細胞を用いること（９）は 疑問であり、と言うのはそのような細胞は明らかに、抗体がそれであるようなそ れらにとって非常に大きな分子を正しく合成することができないからである。

この方向における成功は低級真核生物や原核生物において種々の抗体のサブフラ グメントを発現させることを試みたときに初めてもたらされた。以下においては 大腸菌におけるＦｖフラグメント又はＦａｂフラグメントの発現を許容する４つ の異なった方法を記述する。

５ｋｅｒｒａ　及びＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ　［１９８８年（１０）　］はマウス の抗ホスホリルコリン抗原（ＭｃＰＣ６０３）のいくつかの可変領域の遺伝子を 、そのバクテリアの細胞周辺腔中にその生産物を放出する役目をするそれぞれ１ つのバクテリア性リーダー配列が後続しているＬａｃ−プロモーター／オペレー ター領域に引き続いて挿入した。

この場合には膜外蛋白質Ａ　（ｏｐｍＡ）のリーダー及びアルカリ性ホスファタ ーゼ（ｐｈｏＡ）のリーダーを対象としている。このプラスミドを大腸菌中にト ランスフェクションした後でそのバクテリアの細胞周辺腔内での作用性の、すな わち抗原結合性の蛋白質の発現が確認された。

Ｂｅｔｔ、ｅｒ　等［１，９８８年（１１）　］は人の癌腫細胞の表面にしばし ば見出されるようなガングリオシド−抗原を認識するキメラ性マウス７人の抗体 のＦａｂフラグメントを作り出した。ここで用いたプラスミドの構築はそれぞれ 、それぞれの鎖に対してコードする配列の前のねずみチフス蘭ａｒａ、Ｂプロモ ーター並びにｐｅｌ、Ｂリーダー配列からなっている。その形質転換されたバク テリアの培養上澄液から抗原結合性のい（つかのＦａｂフラグメントが得られた 。

興味あることに、５ｋｅｒｒａ　及びＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ　［１９８８年（１ ０）　ｌもＢｅｔｔｅｒ等［１９８８年（ＬＩ〕］　もいわゆるジシストロン的 な構造、すなわちただ一つのメ・ラセンジャーＲＮＡ分子の上にそれら両方の個 別に発現する鎖についての情報が存在しているような構造を利用している。それ ら報告者は、Ｈ鎖（ＶＨ）の可変領域とＬ鎖（ＶＬ）のそれとの正しい重なり合 いのための前提条件をなすところの、その生じたポリペプチド鎖の空間的接近が それによって保証されると報告している。

まさにこの問題、すなわちＦｖ−ペプチドのヘテロダイマー（天然には共有結合 的には結合していない）の形成はＨｕｓｔｏｎ等（１９８８年（１２）　］及び Ｂｊｒｄ等［１９８８年（１３）　ｌによって異なった方法で解決することが試 みられ、すなわち天然には現れないような１個のアミノ酸リンか一配列を介して の共有結合的なそれら鎖の連結によって解決することが試みられた。このリンカ −配列はこれが一定の数及び配列のアミノ酸よりなっていて、成る抗体の天然の コンホーメーションにおいてはその結合されるべき各領域の間に存在する間隔を 、そのコンホーメーション中に不必要なストレスを持ち込むことなく架橋するこ とができるということによって特徴づけられる。

１（ｉｓｔｏｎ　等［１９８８年（１２）　］はマウスの抗ジゴキシン抗体の各 可変領域をＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳの１５個のアミノ酸の配列のリンカ −を介して連結した。その選ばれた配置は■８−リンカー　ＶＬであった。この いわゆる１重鎮ＦｖフラグメントはＭＬＥリーダー配列と結合させてその合成的 ｔｒｐ−プロモーター／オペレーターの制御のもとに不溶性の封入体の形で発現 された。これを６Ｍのグアニジン／ＨＣＩの中に溶解してそのリーダーをアミノ 酸Ａｓｐ　とＰｒ。

との間で酸加水分解し、そしていくつかのクロマトグラフィ一段β皆の後で１本 鎖の抗原結合性活性Ｆｖフラグメントが得られた。

原理的に類似の方法がＢｉｒｄ等［１，９８８年（１３）　］により、特異的に フルオレッセインを結合するマウスの抗原結合性蛋白質の構築のために選ばれた 。けれどもこれらのグループはＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲ３ＬＤの配列の １８個のアミノ酸のリンカ−を使用した。このリンカ−は人の「カルボニックア ンヒドラーゼ」の配列の１部であり、そしてプルツクヘブンの蛋白質構造データ ノ（ンクから、そのＦｖフラグメントの互いに連結されるべき各アミノ酸の位置 に空間的に厳密に合致するループ構造として選ばれた。個別領域の配置はここで はＨｕｓｔｏｎ等［１９８８年（１２）　］　におけるそれと異なり、すなわち ■、−リンカーー■Ｈであった。

上に記述した大腸菌中の抗原フラグメン１−を生産するための遺伝子の構築はい ずれもマウスの配列に、そして１つの場合にマウス７人のキメラに関する。人の 配列を用いての対応すね研究はまだ公表されていない。

Ｆａｂ’、　（Ｆａｂ’ｌｚ及びＦｖのフラグメントは種々の完全抗体に比して 種々の異なった利点をもたらす。完全抗体に比してこのものが小さいことに基づ き、これは試験管内においても実際の生体における実用の場合にもより容易にカ リ迅速に拡散することができる。このような理由から、このものは一般に容易に 取り扱うことができ、そして定常領域の種々の機能（例えばエフェクター機能、 細胞受容体への結合、他の分子への結合等）が必要でないか、或いは不利益さえ ももたらすようなほとんどの場合に各種完全抗体と等価であり、そして場合によ ってはむしろ好ましい。例えば種々の完全抗体を用いる場合に腫瘍のイメージン グにおいてその抗体の定常領域により媒介されてその抗体の細胞受容体への非特 異的な結合によって条件づけられているバックグラウンド信号によりしばしば種 々の問題が生ずる。Ｆａｂフラグメントを用いた場合にこのような問題を低減で きると言うことが知られている。従ってＦｖフラグメント又は１重鎖Ｆｖフラグ メントを用いることがこのような関係において更に改善をもたらすであろうこと が予想できる（１３．１２）。

今日まで、小型の充分に記述されている種々の抗原、例えばフルオレッセインや ジゴキシン等に結合するようなマウス起源の種々の抗体を用いて作業が行われて きた。全遺伝子構築は抗原として低分子量物質（分子量１　、０００　以下）が 結合されるように構成されている。天然においてはるかにしばしば現れる抗原物 質はペプチド類、ペプチドグリカン類、蛋白質類及び多糖類であり、そしてそれ 自信高分子である。

本発明によれば、前にあげた類の蛋白質は細胞系３Ｄ６［英国Ｐａｒ切ｎ　Ｄｏ ｗｎのＰＨＬＳ　；受は入れ番号Ｎｏ、　８７１１０３０１　（１，１４，１５ ，１６）］より出発する抗体の抗原結合性領域を含んでいる。これによって初め て所望の結合特性を示し、かつ例えば酵母やバクテリアのような単細胞微生物中 でも発現することのできるような人起源の蛋白質が得られる。

加えて、本発明によれば人の成る種抗体から導かれた１本鎖構造の形成が記述さ れる。この１本鎖構造は小型で充分に定義されている種々の抗原とは逆に、成る ビールス性の高分子量コンプレックス抗原に結合する。この１本鎖フラグメント を構築するための対応するそれぞれの方法が、公表されている種々の抗体類と異 なる、中でも人の種々の抗体類においても有効であること、すなわち抗原形成性 の分子をもたらすであろうということは予想できなかったことである。

同様に、経験的に小さな抗原におけるよりもより多数のアミノ酸がその抗原−抗 体結合にたずされっているような、例えばウィルスの表面上の種々の抗原のよう なコンプレックス抗原が同様な態様で対応する結合性抗体の可変領域範囲内の遺 伝子操作を許容すると言うことはまだ分かっていない。

特異的にＨｒ　Ｖ−１−ｇｐ４１と反応するＩｇＧＩ／にの型の大モノクローナ ル抗体を生産しかつＨＩ　Ｖ−１−ｇｐ１２０　と弱い交差反応を示す細胞系３ Ｄ６　［３Ｄ６；　（１、ｔ　１４．１５．１６）１より出発して全ＲＮＡが分 離された。この場合にグアニジンーイ１　ソシアネート抽出及び５．７　Ｍ　Ｃ ｓＣ１の支持剤の上での超遠心分離が用いられた（５）。

この全ＲＮＡからオリゴ−ｄＴ−セルローズの上の吸着によってポリーＡ＋フラ クション、すなわちそのｍＲＮＡが分離された（スウェーデンのＰｈａｒｍａｃ ｉａ社のｍＲＮＡ精製キット）。

このｍＲＮＡはｃＤＮＡの合成のための基質として用いられた。（スウエーデ［ ンのＰｈａｒｍａｃｉ　ａ　社のｃＤＮＡ合成キット）。

このｃＤＮＡバンクのクローニングはプラスミドベクターＰＵＣ１９の中で行わ れた。それら組換えプラスミドは大腸菌ＨＢ　１０１株の中で形質転換させ、そ してＬＢ培地（５）の上で培養した。

各陽性クローンをい（つかの特異的オリゴヌクレオチドゾンデを用いてのハイブ リダイゼーションにより同定した。それらゾンデのための各配列は人ＩｇＧ１− Ｈ鎖又は−に−Ｌ鎖の定常領域からなるＥＭＢＬ　ＤＮＡ配列データバンクから 取り出した。

陽性ハイブリッド化信号によって同定された各クローンは更に制限分析によって 特徴付け、そして最も長い挿入片を有するプラスミド類を備えているクローン類 を同定した。

これらクローンの配列分析によって抗体のＨ鎖又はＬ鎖について完全にコード表 示を持つ。

Ｄ　ＮＯ：２）の挿入部の配列においてリーダーペプチドの領域と可変領域との Ａ−Ｄも参照〕　： １）特定の各制限酵素についての認識配列を挿入変異させた。これらの制限部位 を用いて抗体３Ｄ６のＨ鎖及びＬ鎖の各可変領域をそれぞれのプラスミドから切 り出した。

２）後での発現に必要な開始コドン及び終結コドンを挿入変異させた。

抗体３Ｄ６の各可変領域を成るリンカ−と連結することができるように、そのリ ンカ−の両方のＤＮＡ鎖を形成する２種類の合成的オリゴヌクレオチドを作った 。これら両オリゴヌクレオチドは次のように選ばれ、すなわちこれらが互いにハ イブリダイゼーションされたときに成る２重鎖ＤＮＡが生じ、そしてその両端に はそこから延び出している１本鎖ＤＮＡ領域が存在してこれが各対応する制限酵 素によって上述の挿入変異させた制限部位のところで切断したときに生ずる延び 出した端部と厳密に等しいものであるように選ばれる。これにより、この制限酵 素によって分離された領域の上記リンカ−の合成的オリゴヌクレオチドとの連結 反応が許容される。

−リーダー１可変領域　→ −ＫＧＶＱＣＩＥ’ＶＱＬＶ→ １４１　ＡＡＡ　ＧＧＴ　ＧｃＴＣＡＧ　ＴＧＴＧＡＡ　（汀Ｇ　ＣＡＧ　ＣＴ Ｇ　ＧＴＧ　１７０　野生型ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＴｒＣＣＣＣＡＴＧ　ＧＡＡ　Ｇ ＴＧ　ＣＡＧ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　変異したものＥｃｏＲＩ　Ｎｅａｒ 開始 Δ：　抗体３Ｄ６（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）のＨ鎖の可変領域とリーダー領域 との間の移行部における突然変異 突然変異した塩基を＊で示しである。野生型ＤＮＡ中のコードされたアミノ酸が あげられでいるが、それに加えて突然変異により生じた制限部位ＥｃｏＲＩ　及 びＮｃｏＩ並びに開始コドンＡＴＧ　があげられている。

−可変領域１定常領域　− →ＶＴＶＳＳＩＡＳＴＫＧ− ５１９ＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＴ　ＴＣＡ　ＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧ　ＧＧＣ ５４８野生型ＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＴ　ＴＣＡ　ＧＧＡ　Ｔ（：ＣＡＣＣＡＡ Ｇ　ＧＧＣ変異したちのあげられている。

→　リーダー１可変領域　→ −ＰＧＡＫＣＩＤ　Ｉ　ＱＨＴ　− ７９ＣＣＡ　ＧＧＴ　ＧＣＣＡＡＡ　ＴＣＴ　ＧＡＧ　ＡＴＣＣＡＧ　ＡＴＧ　 ＡＣＣ１０８Ｃ，ＣＡ　ＧＧ′Ｔ　ＧＣＣＡＡＡ　ＧＴＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧ　 ＡＴＧ　Ａ（：Ｃ−可変領域１定常領域　− −ＶＤ　Ｉ　ＫＲＩＴＶＡＡＰ− ３９７ＧＴＧ　ＧＡＴ　ＡＴＣＡＡＡ　ＣＧＡ　ＡＣＴ　ＧＴＧ　ＧＣＴ　ＧＣ Ａ　ＣＣＡ　４２６σＴＧ　ＧＡＴ　ＡＴＣＡＡＡ　ＣＧＡ　丁ＡＡ　ＧＣＴ　 ＴＣＴ　ＧＣＡ　ＣＣＡＨｉｎｄＩ工Ｉ 終結 旦：　抗体３Ｄ６　（ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：２）のＬ鎖の定常領域と可変領域と の間の移行部における突然変異 突然変異した塩基を＊で示しである。野生型ＤＮＡ中のコードされたアミノ酸が あげられているが、それに加えて突然変異により生じた制限部位ＨｉｎｄＩＩＩ 並びに終結コドンＴＭ　があげられている。

対応的に前処理した３つのフラグメント（■８、リンカ−１■Ｌ）の相互間の連 結反応によって各可変領域とリンカ−との間の移行部に、この部分に天然に生ず るヌクレオチドとは異なるヌクレオチドの包含された上記挿入変異させた制限部 位を有する遺伝子が得られた（下記Ｅ及びＦ参照）。

もとのアミノ酸配列を再び作り出すために上述の移行部のところに成る新し〈実 施した突然変異通程によってその所望のＤＮＡ配列が作られた（下記Ｅ及びＦ参 照）。

−Ｖ、ｌ　リンカ−→ １　傘　傘＊ ３８０　ＧＴＧ　ＡＣＣＧＴＣＴＣＴ　ＴＣＧ　ＧＧＡ　ＴＣＣＧＧＴ　ＧＧＣ ＴＣＧ　ＧＧＣ４１２ＧＴＧ　Ａｃｅ　ＧＴＣＴＣＴ　ＴＣＧ　ＧＧＴ　ＧＧＣ ＧＧＴ　ＧＧ（：　ＴＣＧ　ＧＧＣ→Ｖ　Ｔ　Ｖ　Ｓ　Ｓ　Ｇ　Ｇ　Ｇ　Ｇ　Ｓ 　Ｇ一旦：　■□領領域ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）の部分における天然アミノ酸 配列の再形成のための逆突然変異の前後におけるＶ、／リンカ一連結部のＤＮＡ 配列突然変異した塩基は＊で示しである。最終的アミノ酸配列があげられている 。

斡１ ４２２　ＴＣＧ　ＧＧＴ　ＧＧＣＧＧＣＧＧＡ　ＧＴＣＧＡＧ　ＡＴＣＣＡＧ　 ＡＴＧ　４５１ＴＣＧ　ＧＧＴ　ＧＧＣＧＧＣＧＧＡ　ＴＣＴ　ＧＡＣＡＴＣＣ ＡＧ　ＡＴＧ−３Ｇ　Ｇ　Ｇ　Ｇ　Ｓ　Ｄ　Ｉ　Ｑ　Ｍ→旦：　■、領領域ＳＥ Ｑ　ＩＤ　ＮＯ：３）の部分における天然アミノ酸配列の再形成のための逆突然 変異の前後におけるリンカ−／ＶＬ連結部のＤＮＡ配列突然変異した塩基は＊で 示しである。最終的アミノ酸配列があげられている。

これらの方法によって、■４−リンカー　Ｖｔ、の構造を有する遺伝子を構築し た。この構築体は５ｃ３Ｄ６　（１本鎖３Ｄ６）と表示され、そしてこれはクロ ーニングベクターｐＵｃ１９　の中に挿入された（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）。

得られたベクターを凶≦ｃ３Ｄ６で表わす。

この５ｃ３Ｄ６　遺伝子はプラスミド凶≦ｃ３Ｄ６からいくっがの制限酵素によ って切り出され、そしてバクテリアの発現ベクターｐ）（Ｋ２２３−３　（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ社）の中にこれを挿入したが、このベクターはイソプロピル−β −チオ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）によって誘導されたｔａｃ−プロモーターを 含んでいた。得られたベクターは址監但匹と表示するが、これを大腸菌株ＪＭ１ ０５　の中に形質転換させた。

バクテリアの培養 それら形質転換されたバクテリアを実験室培養器中で２．０　のＯＤ、。。値ま でＬＢ培地（５）中で培養した。次いで発現の誘発をイソプロピルチオガラクト シド（ＩＰＴＧ）の添加によって行った。各バクテリアをＩＰＴＧの存在のもと に３時間更に培養し１次いで遠心分離によって回収して一８０’Ｃにおいて貯蔵 した。

次にその蛋白質を抽出し、精製した。

抽出及び精製 それぞれの実験バッチに対して１０　ｇのバイオマス（温潤重量）を用いた。そ れら細胞はりゾチームを用いて成る浸透圧的な衝撃との組み合わせにおいて溶解 し、次いで一２０℃において凍結させた。この凍結させた大腸菌ペーストを多数 の小さな破片に砕き、そしてＳＴＥ緩衝液（１０ｆｆ１Ｍトリス、１００　ｍＭ 　ＮａＣ１，１ｍＭＥＤＴＡ、　ｐＨ８，０）を用いてｌＯ％濃度懸濁液を作る 。この懸濁液に、各種ヌクレアーゼ、リゾチーム及びインヒビターの含まれた溶 解用液を加える（表１参照）。

この大腸菌懸濁液を４２℃において１５分間インキュベートする。トリトン−Ｘ −１００の添加（最終濃度０，５％）及びあらためて行った４５℃における５分 間のインキュベーションによって各細胞を溶解する。

封入体の回収 沈降物をＳＴＥ緩衝液中に懸濁させて４℃において８時間撹拌する。その封入体 は遠心分離によって濃縮する。このために遠心分離用管の中にグリセリン支持剤 〔燐酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）中の５０％グリセリン〕を予め入れておき、その上 層に同量の懸濁液を入れて遠心分離する（Ｂｅｃｋｍａｎｎ　社の遠心分離器Ｊ ２−２１．　：ロータＪＡ−２０，４℃、６００　ｒｐｍ　、　３０　分）。

封入体の溶解 濃縮した封入体をＰＢＳ中の６ＭＧｕＨＣ１（グアニジン塩酸塩〕の中でｐ）１ ８．３において撹拌のもとに４℃において溶解させる（１２　時間）。次いでそ の蛋白質含有量を測光的にめる。

レフオルディング 上記ＧｕＨＣ１中に溶解した蛋白質を各種異種蛋白質の存在のもとに再生する。

まず最初蛋白質の決定を行う。その溶解した封入体を再生用緩衝液（ＰＢＳ中Ｇ 址ＣＩ　ＩＭ、還元型グルタチオン３０−１酸化型グルタチオン３−１ＥＤＴＡ 　１００μＭ；１）Ｈ８，３）を用いて最終濃度が蛋白質８０　ｍｇ／ｌ　とな るように稀釈する。

その溶解した封入体の稀釈はビユレットを用いてその再生用衝液中の蛋白質溶液 をゆっくりと滴加することによって実験室規模で行う。最も良好には３７℃にお いて操作する。

レフオルディングは逆相ＨＰＬＣを用いて行った。このためにｐＨ値を５．５に 調節した各試料を取り、それ以上のレフオルディングを停止させるためにその試 料を遠心分＠　（Ｍｌｌｌｉｐｏｒｅの卓上遠心分離機、室温、４７００　ｒｐ ＋ｎ）　Ｌ、滅菌濾過（空孔幅０．２２μｍ、蛋白質結合性が低い）し、必要の 場合に濃縮（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅの車上遠心分離機、２０℃、４７（１０ｒｐｍ ）　ｔ、てそれぞれ２５０μｍを逆相クロマトグラフィーによってＨＰＬＣ分析 した（ドイツＭａｃｈｅｒｅｙ　ｕｎｄ　Ｆｏｇｅ１社のＮｕｃｌｅｏｓｉ１３ ００．５％ｍ、４Ｘ１２５ｍｍ　−−０，１％ＴＦＡ／アセトニトリル１０−６ ０％の直線勾配がそのカラムに４０以内にわたり印加された）。

再生された５ｃ３Ｄ６　を限外濾過する。、１００００ダルトンでカットオフす るポリスルホン膜を用いる。その膜濾過された蛋白質溶液をアニオン交換材の上 に担持させ、次いで１（１０ｍｕ　ＮａＣ１によってカラムから溶離させる。

５ｃ３Ｄ６は５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５（スウェーデンのＰｈａｒｍａｃｉａ 　社）によるゲル濾過によって脱塩し、そしてＮａｋａｎｅ等（１７）の方法に 従いアルカリ性ホスファターゼと抱合させる。

精製された５ｃ３０６　蛋白質は５ＤＳ−ＰＡＧＥによって制御された（図７） 。

５ｃ３Ｄ６蛋白質の機能性の検出のためにＨＩＶ−１−試験紙（米国ＢｉｏＲａ ｄ社）を用いてウェスタン法試験を行った。陽性のコントロールとして動物細胞 から分離した天然抗体を用いて類似の試験を行った。陰性のコントロールとして は大腸菌からの全蛋白質の調製物を用いた。この試験の結果は陽性であって、図 ８に示す通りである。

親和性クロマトグラフィーによる５Ｃ３Ｄ６　蛋白質の精製対応的に精製した５ ｃ３０６　蛋白質を用いて標準条件のもとてフロイント氏の完全アジュバントに より家兎血清を作った。　ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ　ク ロマトグラフィー（スウェーデンのＰｈａｒｍａｃｉａ　社）を用いてこの家兎 血清から工（フラクションを得た。その抗体の特異性をＥＬＩＳＡを用いて確認 した。ペプチドシンセサイザを用いて１５個のアミノ酸の長さのリンカ−ペプチ ド（配列：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）を作り、そして引き続いてカルボ ジイミド縮合物を用いて牛血清アルブミン（ＢＳＡ）と６＝１のモル比で抱合さ せた。この抱合体を用いて各マイクロタイタープレートを被覆した。この血清プ ローブを上記の被覆されたマイクロタイタープレートの中でインキュベートし、 そして結合された抗体をペルオキシダーゼで標識された山羊の抗家兎ＩｇＧ　に よって検出した。このようにして作り、試験した抗−５ｃ３Ｄ６　ＩｇＧ　を、 ＢｒＣＮにより活性化した５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ　（スウェーデンのＰｈａ ｒｍａｃｉａ　社）に結合させた。結合されなかった物質は洗浄除去した。上述 のように再生して５ｅｐｈａＪεｘ　Ｇ−２５（スウェーデンのＰｈａｒｍａｃ ｉａ社）で脱塩された予め精製した５ｃ３Ｄ６　蛋白質の抽出物を、その抗＝ｓ ｃ３Ｄ６カラムに吸着担持させた。結合されなかった物質は洗浄除去し、そして 特異的に結合された５ｃ３Ｄ６　蛋白質を０，１Ｍ　グリシンＨＣＩ　緩衝液に よってｐＨ２６５において溶離させた。次にこの溶離液を１１）リス緩衝液で中 和し、そして５ｃ３８６蛋白質を既述のように５ＤＳ−電気泳動を用いて特徴決 定し、そしてウェスタン法でその作用性について試験した。

５ｃ３Ｄ６蛋白質の免疫親和性クロマトグラフィー的精製のためのもう一つの方 法は次のように行われる； ＢＳＡに結合させた上述のリンカ−ペプチドを用いて家兎血清をフロイントの完 全アジュバントにより作った。そのＩｇＧ　フラクションをＣＭ　−５ｅｐｈａ ｒｏｓｅＦａｓｔ　Ｆｌｏｗクロマトグラフィー（スウェーデンのＰｈａｒｍａ ｃｉａ　社）によって得、そしてＢ　Ｓ　Ａ　−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ　カ ラム（スウェーデンのＰｈａｒｍａｃｉａ　社）を用いて更に精製して抗ＢＳＡ 抗体を除去した。そのようにして得られた抗リンカ−ＩｇＧをＢｒＣＮで活性化 した５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ　（スウェーデンのＰｈａｒｍａｃｉａ　社）に 結合させた。上述のように再生して５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５（スウェーデン のＰｈａｒｍａｃｉａ社）で脱塩された５ｃ３Ｄ６　蛋白質の予め精製した抽出 物を、上記抗リンカーカラムに吸着担持させた。結合されなかった物質は洗浄除 去し、そして特異的に結合した５ｃ３０６　蛋白質を０．１Ｍ　グリシンＨＣＩ 　緩衝液によってｐＨ２，５において溶離させた。次にこの溶離液を１＆ｌリス 緩衝液で中和し、そして５ｃ３Ｄ６蛋白質を既述のように５ＤＳ−電気泳動を用 いて特徴決定し、そしてウェスタン法でその作用性について試験した。

ＨＩＶ−１ｇｐ　１６０の免疫親和性クロマトグラフィー的精製５ｃ３Ｄ６〜免 疫親和性カラムを調製するために精製された５ｃ３Ｄ６　蛋白質を１　ｍ１ＨＨ Ｓカラム（スウェーデンのＰｈａｒｍａｃｉａ　社）の上に結合させた（Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ社の処方に従い）。

ｐｇ　１６０　（抗体３Ｄ６並びに５ｃ３Ｄ６　蛋白質によって特異的に結合さ れるＨＩＶ−１の被覆蛋白質の）の予備精製をＢａｒｒｅｔｔ　等（１８）に従 って行った。

組換えｇｐ１６０　を含んでいるその予備精製された物質を限外濾過／ダイヤ濾 過によって濃縮し、そして５ｃ３Ｄ６−免疫親和性クロマトグラフィーのために コンディショニングした。このコンディショニングされた物質を５ｃ３Ｄ６−免 疫親和性カラムの上に吸着担持させた。平衡化緩衝液としては０１％のＴｗｅｅ ｎ　２０を含むｐＨ７，４の１００−のトリス緩衝液を用いた。その組換え抗原 は３Ｍ　のロダニドを用いて溶離させた。個々の段階の取率は表２にまとめであ る。

倒−２ 大腸菌から分離したアルカリ性ホスファターゼの遺伝子（ＥｃｐｈｏＡ）と　５ ｃ３Ｄ６遺伝子とを融合させた５ｃ３０６　の別のクローニングを次のように行 った。

５ｃ３Ｄ６遺伝子をプラスミドｐＵｃｓｃ３Ｄ６から制限酵素によって切り出し 、そしてベクターｐＥｃｐｈｏＡ＆ｔ３　（１９）の中に挿入した。得られたベ クターは臥ム弧匹で表示される。上記ベクターｐＥｃｐｈｏＡＭｕｔ３　は大腸 菌から分離したアルカリ性ホスファターゼ（２０）の遺伝子を含むが、この遺伝 子中にオリゴヌクレオチドへ指向された突然変異生成によってそのコードされた 領域の３゛末端にそのＥｃｐｈｏＡ遺伝子の他の種々の遺伝子との融合を許容す る制限部位を挿入変異させた。このようにして融合遺伝子の発現により融合蛋白 質、すなわちそれぞれのコードする領域が互いにアミノ酸を介してペプチド結合 により連結されている蛋白質を作ることができる。

ＥｃｐｈｏＡ−ｓｃ３Ｄ６　融合遺伝子をｐＡＰｓｃ３Ｄ６から種々の制限酵素 により切り出し、そしてバクテリアの発現ベクターｐＫＫ２２３−３　（スウェ ーデンのｐｈａｒｍａｃｉａ　社）の中に挿入した。得られたプラスミドはｐＫ ＫＡＰｓｃ３Ｄ６で表示される。

このプラスミドｐＫＫＰＡｓｃ３Ｄ６を大腸菌株ＪＭ１０５　の中に形質転換さ せ、そしてその形質転換されたバクテリアをＬＢ培地（５）の中で培養した。Ｉ ＰＴＧで誘導した後にそれらバクテリアの細胞周辺腔からの活性のＥｃＰｈｏＡ −ｓｃ３Ｄ６融合蛋白質を次のように生成した。

バクテリアを遠心分離によって回収し、そして３０樹　のＮａＣ１を加えたｐＨ ７，５の１０ｍＭ１−リス緩衝液を用いて洗浄する。その洗浄されたバクテリア を再びｐＨ７，５の３３−　のトリス緩衝液中に懸濁させ、そして同体積の４０ ％濃度の蔗糖溶液（３３ｍＭｌ−リス緩衝液中の）を加え、そしてＥＤＴＡを０ ．１ｍＭの最終濃度になるように加える。室温において１０分間インキュベート した後、バクテリアを遠心分離し、そして０．５　ｍＭ　ＭｇＣ１ａ溶液の中に 取り入れる。０℃においてｌＯ分間インキュベーションした後にＰＭＳＦとＥＧ ＴＡとからなるプロテアーゼ阻害性混合液を加え、そしてバクテリアを遠心分離 する。上澄液をｐＨ７，５のＩＭトリス治液を用いて２５　ｍＭ　の最終トリス 濃度にする。この操作によって大腸菌細胞の細胞周辺腔が開放される。

１２０００　Ｇで遠心分離することによってその蛋白質溶液は清澄化され、そし て次に限外濾過によってａ縮される。

ＥｃｐｈｏＡ−ｓｃ３Ｄ６　蛋白質は疎水性相互作用クロマトグラフィーによっ て平に精製されるａ　Ｐｈｅｎｙｌｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ　 （スウェーデンのＰｈａｒｍａｃｉａ　社）をｐＨ７５の２５ｍＭトリス緩衝液 中の６０％飽和した硫酸アンモニウム溶液で平衡化させた。上記蛋白質溶液をこ の平衡化緩衝液に替えてそのカラムに供給した。

５ｃ３Ｄ６は６０％濃度硫酸アンモニウムからＯ％濃度硫酸アンモニウム濃度ま での直線的勾配で溶離する。ＥｃｐｈｏＡ−ｓｃ３Ｄ６　蛋白質を含んでいる各 フラクションはゲル濾過によって脱塩される。

このＥｅｐｈｏＡ−ｓｃ３Ｄ６蛋白質の作用性を検出するためにＨＩ　Ｖ〜ｌ− 試験紙（米国ＢｉｏＲａｄ　社）を用いてのウェスタン法試験を行った。コント ロールのために動物細胞から分離された天然抗体を用いて同様な試験を行った。

陰性コントロールとしては大腸菌からの全蛋白質の調製物を用いた。この試験の 結果は陽性であったが、これは図８に示す通りである。

ＥＬＩＳＡによるＨ　Ｉ　Ｖ−１抗原の直接検出ｇ＋）１２０−特異性のモノク ローナル抗体（英国Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏｗｎ　のクローン２５Ｃ２、受付番号Ｎ ｏ、　８９１２０６０１．　ＰＨＬＳ）をマイクロタイタープレート（等級工、 デンマークのＮｕｎｃ社）の上に被覆した。エイズウィルスＨＩ　Ｖ−１を含ん だ培養上澄液（］６）をこの被覆したマイクロタイタープレートの上に載せた。

基準として組換えｇｐ１６０　（１８）を用いた。

結合用なかった物質を充分に洗浄除去した後にそのＥｃＰｈｏＡ−ｓｃ３Ｄ６の 蛋白質を担持させてインキュベートした。結合しなかった物質をもう一度洗い流 し、そしてｐ−ニトロフェニルホスフェートを用いてその結合したＥｃＰｈｏＡ −ｓｃ３Ｄ６蛋白質を測光的に６０２　ｎｒｎの波長で検出した。図９にその標 準曲線とＨＩＶ−１ｉ性の培養上澄液の種々のサンプルを示す。

拮抗性抗）（ＩＶ−Ｉ　ＥＬＩＳＡ 各マイクロタイタープレート（等級工、デンマークのＮｕｎｃ社）を１０　ｍｇ ／ｍｌの組換えｇｐ１６０　（１８）の溶液で被覆した。次にそれらのプレート をＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０　＋　１％ＢＳＡで洗浄した。

５４ｇ；／ｍｌ　のＥｃＰｈｏＡ−ｓｃ３Ｄ６融合蛋白質の溶液を１：１の比率 でＨＩ　Ｖ−１陽性血清又はＨＩ　Ｖ−１陰性血清と混合し、そして上記の被覆 されたプレートの上に担持させた。コントロールとして稀釈緩衝液と混合したＥ ｃＰｈｏＡ−ｓｃ３Ｄ６融合蛋白質を担持させ、そして３７℃において６０分間 インキュベートした。次に結合しなかった物質を洗浄除去した。

ｐ−ニトロフェニルホスフェートの添加によって結合されたＥｃＰｈｏＡ−ｓｃ ３Ｄ６融合蛋白質の部分を検出した。生じた着色を６（１２ｎｍの波長において 測光的に定量した。それら匍清の阻害を血清の含まれていないＥｃＰｈｏＡ−ｓ ｃ３Ｄ６の吸光度に対する％でめた。図１０に示すように、全てのＨＩ　Ｖ−１ 陽性の血清はｇｐ１６０　へのＥｃＰｈｏＡ−ｓｃ３Ｄ６融合蛋白質の結合を阻 害する。全てのＨＩ　Ｖ−１陰性の血清はＨＩ　Ｖ−１陽性の血清よりも僅かな 阻害を示した。

皿一旦 マウスの骨髄腫細胞を宿主細胞として用いた５Ｃ３０６蛋白質の他の発現形態を 次のように実施した： ５ｃ３Ｄ６遺伝子の３゛部分をプラスミドｐＵｃ、５ｃ３Ｄ６　（ＳＥＱ　ＩＤ 　ＮＯ：３）から部分的なＥｃｏＲＶ　消化並びに完全なＨｉｎｄＩＩＩ　消化 によって分離した（フラグメントの長さ４０１　ｂｐ　）。プラスミドｐＵ（１ ：３０６＋（Ｃ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）からＨｇＩ２の遺伝子の３°部をＥ ｃｏＲＶ　及びＨｉｎｄＩＩＩ　を用いての切断によって除去した。残存したベ クターの中にアガロース−ゲル電気泳動によって分離しかつ精製した４０ｉ　ｂ ｐの５ｃ３Ｄ６−遺伝子のフラグメントを挿入した。そのように組換えられた遺 伝子は従って抗体３Ｄ６のＨ鎖のリーダーペプチドに対する配列よりなり、これ に続いて５ｃ３Ｄ６−遺伝子の配列が後続する。このプラスミドはｐＬｓｃ３Ｄ ＩＩ＋で表示される。この構造は種々の動物細胞中で５ｃ３Ｄ６　蛋白質を放出 させることを許容する。そのコードされた蛋白質はｐＬｓｃ３Ｄ６　から酵素Ｎ ｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによって分離され、その各延び出した末端はＫｌｅｎ ｏｗ氏ポリメラーゼで充満され、そして種々の動物細胞に適した発現ベクターｐ ＲｃＲ５Ｖ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）のＳｍａＩ部位中にクローニング された。この発現ベクターのＳｍａ工部位はＲ３ＶのＬＴＲｌすなわち強力なウ ィルスプロモーターと、もとは牛の成長ホルモンから出発した転写−集結配列と の間に存在する。この制限部位中に挿入することによって成る一つの分子的環境 の中に任意の構造を導入することができ、これがそれら遺伝子の動物細胞中での 発現を許容する。更にベクターｐＲｃＲ３Ｖはもう一つの選択的遺伝子「ネオマ イシン抵抗性」を有し、これは形質転換が成功した動物細胞をその培養物中から 選択することを許容する。

このようにして構築されたプラスミドは匹堕双匡盛西で表示される。このものは Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３　（２１）の系のマウス骨髄腫細胞の中にトラン スフェクトされた。形質転換された細胞を抗生物質ネオマイシンを用いて選択す ることによって２つのクローニング円及びスクリーニング円の中で５ｃ３Ｄ６− 遺伝子を発現する合計５個のクローンが選び出された。個々のクローンの発現水 準は抗原特異性のＥＬＩＳＡを用いて試験したが、これは０．５　ないしｌ　Ｌ Ｌｇ／ｍｌ　の範囲にある。

５ｃ３Ｄ６蛋白質を含有しているそれらチランスフエクトされたマウス骨髄腫細 胞の培養上澄液を５００Ｇ　での遠心分離によってパケット遠心分離機中で清澄 化させた。その清澄化された培養上澄液を限外濾過（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社の、 カットオフ１００００ダルトンのＭｉｎｉｔａｎ、　ＰＴＧＣ）によって約１０ 倍に濃縮し、そしてｐＨ７，２の５０　ｍＭ　ト’）ス緩衝液で５倍の容積でダ イヤ濾過した。

ダイヤ濾過した蛋白質溶液をＱ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ　（ スウェーデンのＰｈａｒｍａｃｉａ社）によって更に精製した（平衡化緩衝液： ｐＨ７，２の５０ｍＭｈリス緩衝液）。この５ｃ３Ｄ６　蛋白質の溶離は１５０ 　ｍＭ　ＮａＣ１を用いて行った。精製された蛋白質は抗原特異性ＥＬＩＳＡを 用いて試験した。個々の精製段階の収率は表３に示しである。

例−豆 プラスミド己岨双堕岨西をチャイニーズハムスター０ｖａｒｙ（ＣＨＯ）の細胞 中にトランスフェクトした。例３に２述したと同様にしてそれら形質転換された 細胞を選びだし、スクリーニングし、そしてその５ｃ３Ｄ６　蛋白質を細胞培養 上澄液から精製した。抗原特異性ＥＬＩＳＡを用いての発現水準の試験は１ない し５ａｇ／ｍｌ　抗体の値を与えた。

倒−ｊ。

５ｃ３Ｄ６遺伝子をプラスミドｐＵＣｓｃａＤ６から制限酵素により切り出し、 そして酵母−発現ベクターｐＧ１　（米国Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ　のＣ１ｏｎｔｅ ｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ　社）に挿入した。この構築において ５ｃ３Ｄ５　遺伝子はガラクトースで誘導されたＣＡＬｌ−プロモーターの支配 のもとに置かれる。その構築体を鎧匹抛り！但弦ｃｅｒｅｖｉｓｊａｅ　の５Ｈ Ｙ−２（ｔｒｐｌ−）　株の中にトランスフェクトし、そしてトリプトファンを 含まない培地の中でトリプトファン−栄養素要求の相補性について選択した。陽 性の形質転換体を分離し、そして５ｃ３Ｄ６　蛋白質の生産に用いた。

生産性株の培養並びに生成物の分離、後処理及び精製の条件は標準仕様に従って 行われた（２２）。

伝一旦 ５ｃ３Ｄ６遺伝子をブラスミヂｐＵｃｓｃ３［］６から制限酵素によって切り出 し、そしてベクターｐＡｃ３７３の中に挿入した（２３）。この組換えプラスミ ドをバキュロウィルスＡｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ　核多角体 病ウィルス（ＡｃＭＮＰＶ）のＤＮＡと一緒にＳ　ａｄｏ　ｔｅｒａ　ｆｒｕ　 ｉ　ｅｒｄａ　に由来する細胞系Ｓｆ９　の中にトランスフェクトした。このＳ ｆ９　細胞の培養は米国Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　の カタログに記述されているような標準方法に従って行った。トランスフェクショ ンの３ないし５日後にその組換えウィルスのプラークを顕微鏡で同定して分離し た。その分離された組換えウィルスが野生型ウィルスによって汚染されていない ことを確実にするために更に３つのプラーク精製過程を引き続いて行った。組換 えウィルスによるＳｆ９　細胞の感染は３ないし５日後にその感染された細胞の 溶解をもたらし、そしてその細胞溶解物の上澄液中での５ｃ３Ｄ６　蛋白質の生 産をもたらした。

この５ｃ３０６　蛋白質をこの上澄液から例３に記述したと同様な態様で精製し 、分析した。このようにしてこの組換え蛋白質の作用性を確認することができた 。

医−ヱ 蛋白質アビジンのためにコードする配列（２４）を合成遺伝子として合成オリゴ ヌクレオチドによって作り、すなわちその遺伝子の５゛末端に追加的に大腸菌ア ルカリ性ホスファターゼに対するリーダーペプチドの配列が、またその３゛末端 には他の種々の遺伝子を挿入するためのポリリンカー領域が存在するようにして 作った。このポリリンカー領域に挿入した各遺伝子は適当な条件のもとて融合の 相手としてのアビジンとの融合蛋白質として発現される。その５′末端に存在す るリーダーによってこの融合蛋白質は活性型として大腸菌の細胞周辺腔の中に放 出される。この構築体をバクテリアの発現ベクターｐＥＴ３ａ　（２５）の適当 な制限部位中に挿入したが、このベクターはクローニングされた遺伝子の発現の ためにバクテリオファージ■−φ１０　プロモーター並びにφ−ターミネーター を包含している。得られたベクターはｐＦｒ−３ａ−Ａｖ　で表示される。

バクテリオファージ「−φ１０　プロモーターはバクテリオファージＴ７ＲＮＡ ポリメラーゼの不存在においては大腸菌細胞中で転写させることができないとい う性質を有する。しかしながら例えば濃密に成長した大腸菌培養物をＴ７ボリメ ラーゼについての遺伝子情報を有しているファージベクターで感染させた場合に は、それにより生産される「ポリメラーゼは、例えば種々のベクターの中で上記 のもののようにクローニングされて存在している種々の遺伝子の発現をもたらす 。この性質は大腸菌中でのアビジン及びアビジン融合蛋白質の発現にとって非常 に重要であり、と言うのはアビジンは成長しつつある大腸菌培養物にとって毒性 があるからである。

５ｃ３Ｄ６遺伝子をベクターｐＵｃｓｃ３０６から制限酵素によって切り出して ベクター＋１１ＥＴ−３ａ−Ａｖのポリリンカー領域中に挿入した。得られたベ クターはｐＦｒ−３ａ−Ａｖ−ｓｃ３Ｄ６で表示される。適当な大腸菌宿主細胞 （例えばＨＭＳ１７４　）をこのベクターで形質転換させて培養した。培養物が ０．６　のＯＤ、。。に達したならば直ちにバクテリオファージＴ７　Ｇｅｎ１ 　を有しているバクテリオファージＣＥ６　（Ｌａｒｎｂｄａ社のｃＩｔｓ８５ ７ＳＩＭｎ７）を感染させた。それにより生じた「ポリメラーゼは大腸菌の細胞 周辺腔の中でアビジン−５ｃ３Ｄ６　融合蛋白質の発現をもたらした。発現が最 大に達した（培養条件によってファージの感染の３ないし１２時間後）ならば直 ちに、その組換え蛋白質を例２に記述した態様で遊離させて限外濾過により濃縮 した。

濃縮した蛋白質溶液を５ｅｐｈａｒｙｌ　Ｓ　２００　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社 ）の上で更に精製し、そして限外濾過によってもう一度濃縮する。この溶液をビ オチンのカラムに加える。対応する融合蛋白質アビジン−５ｃ３Ｄ６　は特異的 に結合してとどまる。不純物を洗浄除去する。そのようにして作られた親和性カ ラムを組換えｇｐ１６０　の精製のために例１と同様にして使用し、すなわちＢ ａｒｒｅｔｔ　等（１８）に従い予備精製した蛋白質溶液をこの親和性カラムに 加えて結合しなかった物質を洗浄除去した後、その組換えｇｐ１６０　を３Ｍ　 のロダニドで溶離させた。その際得られた収率は表２に示した結果と類似のもの である。

ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１ 配列の種類：対応する蛋白質を含むヌクレオチド配列の長さ：　１５４８塩基対 鎖の形状　：１本鎖 トポロジー二円形 分子の種類二人ｃＤＮＡの挿入を有するプラスミドＤＮＡ起源 生物　二人 直接的実験の由来： 細胞系名称、３Ｄ６ 特徴： １から　３６　ｂｐまでニブラスミドｐｃＵ１９　ポリリンカー３７　ＩＩ　１ ５２７　ＩＩ　：抗体３Ｄ６の挿入ＨＲ３７ノア　９８＃：５’未翻訳領域 ９９　１１５２６　ｐ　：コーディング領域９９　Ｉｔ　１５５　ｎ　：信号ペ プチド１５６　ｊｌ　１５２６　ｊｌ　：成熟ペプチド１５６　〃５３３　／／ 　：可変領域 １５６　１Ｊ　２４５　１）　：フレームワーク１２４６　Ｊ）　２６０　１１ 　：相補性決定領域２６１　〃３０２　ｔｔ　；フレームワーク２３０３　１） 　３５３　ｔｔ　；相補性法定領域３５４　）ｌ　４４９　Ｊ／　：フレームワ ーク３４５０　ＩＩ　５００　ｎ　：相補性決定領域５０１　ＩＩ　５３３　／ Ｊ　：フレームワーク４５３４　ｊｌ　１５２６　〃：定常領域１５２７　／／ 　１５４７　ｎ　ニブラスミドｐｃＵ１９　ポリリンカー特性：　抗体３Ｄ６の Ｈ鎖のｃＤＮＡクローンがプラスミドｐＵｃ１９　の中番されいてる。

浄書（内容；二変更なし） １に挿入 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） ＭＧ　ＡＡＡ　ＧＴｒ　ＧＡＧ　ＣＣＣＡＡＡ　ＴＣＴ　ＴＧＴωＣＡＡＡ　Ａ ＣＴ　ＣＡＣＡＣＡ　ＴＧＣＣＣＡ　８６３浄書（内容に変更なし） ＧＡＧ　ＡＡＡ　ＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡ　ＧＣＣＭＡ　ＧＧＧ　ＣＡＧ　Ｃ ＣＣαａＣ，＋いＧ２　ＣＡＧ　１２２３ＧｌｕＬｙｓＴｈｒ工１ｅＳｅｒＩ、 ｙｓＡｌａＬｙｓＧｌ、ｙＧｉｎＰｒｏＡｒｇＧｌ、ｕＰｒｏＧｉｎＧＴＧ　Ｔ ＡＣＡＣＣＣｒＧ　ＣＣＣＣＣＡ　ＴＣＣＣＧＧ　ＱＡＴ　ＱＡＧ　ｆｉ　ＡＣ ＣＡＡＧ　ＡＡＣＣＡＧ　１２６８Ｖａｌ　Ｔｙｔ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　 Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｒ９　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　 Ｇ１ｎＧＴＣＡＧＣＣｒＴＧ　ＡＣＣＴＧＣＣ’１℃ＧＴＣＡＡＡα；ＣＴｒＣ ＴＡＴ　ＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＤ１３Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｃ ｙｓ　Ｌｅｕ　ＶａｌＬｙｓ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｓ ｐ　ｌ１ｅα：ＣＧｒＧ　ＧＡＧ　ＴＧＧ　ＧＡＧ　ＡＧＣＡＡＴ　ＧＧＧ　Ｃ ＡＧ　ＣＣＧ　ＧＡＧ　ＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧ　１３５８八１ａＶａｌＧｌ ｕＴｒｐＧ１．ｕＳｅｒＡｓｎＧユｙＧｉｎＰｒｏＧｌｌｉＡｓｎＡｓｎＴｙｒ ＬｙｓＡＣＣＡＣＧ　ＣＣＴ　ＣＣＣＧＴＧ　ｆ？ｒＧ　ＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧ ＧＣＴＣＣＴＴＣＴＩＣＣＴＣＴＡＣ１４０：ＩＴｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒ ｏ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｐｈ ｅ　Ｌｅｕ　ＴｙｒＡＧＣＡＡＧ　ＣＴＣＡＣＣＧＴＧ　ＧＡＣＡＡＧ　ＡＧＣ ＡＧＧ　ｕ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＧＧＧ　ＡＡＣＧＴＣ１４４８Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　 Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ｇｉｎ　 Ｇｌｎ　Ｇ１．ｙ　Ａｓｎ　Ｖａ１ＴＴＣＴＣＡ　ＴＧＣＴＣＣＧｒＧ　ＡＴＧ 　ＣＡＴ　ＧＡＧα？？’　ＣＴＧ　ＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＡ　１４９ ３Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　ＭＥＴ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ａｌａ 　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　Ｔｙｒ　ＴｈｒＣＡＧ　ＡＡＧ　ＡＧＣＣ ＴＣＴＣＣＣＴＧ　ＴＣＴ　ＣＣＧα；Ｔ　ＡＡＡ　’ＩＮＩＪ　１５２６Ｇｉ ｎ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　ｌ１ａｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｕｙ　Ｌ ｙｓ　５ｔｏｐＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧ　ＣＡＴＧＣＭＧＣＴ　Ｔ　１５４７ＳＥ Ｑ　ＩＤ　ＮＯ：２ 配列の種類：対応する蛋白質を含むヌクレオチド配列の長さ＝９４５塩基対 鎖の形状　；１本鎖 トポロジー；円形 分子の種類二人ｃＤＮＡの挿入を有するプラスミドＤＮＡ起源 生物　：人 直接的実験の由来： 細胞系名称＝３Ｄ６ 特徴＝　１から　２１　ｂｐまでニブラスミドｐｃ１１１９　ポリリンカー２２ 　１）　７３２　／Ｊ　：抗体３Ｄ６の挿入り鎖２２））　２７　〃：５’未翻 訳領域 ２８／／　７３２　．１１：コーディング領域２８／／　９３　＃：信号ペプチ ド ９４　ＩＩ　７３２　＃　：成熟ペプチド９４　ＪＬ　４０８　ｊ）　：可変領 域９４　／／　１６２　ｎ　：フレームワーク１１６３＃　１９５　１７：相補 性決定領域１１９６　／Ｊ　２４０　／７　：フレームワーク２２４］、ｌ）　 ２６１　＃　：相補性決定領域２２６２　〃３５７　／／　：フレームワーク３ ３５８　／／　３７８　ｎ　、相補性決定領域３３７９　／／　４０８　ｔｔ　 ：フレームワーク４４０９　／／　７３２　ｎ　：定常領域７３３　ＩＩ　９０ ５　／／　：３’未翻訳領域９０６　〃９４５　／／　ニブラスミドｐ（：０１ ９　ポリリンカー特性：　抗体３Ｄ６のＬ鎖のｃＤＮＡクローンがプラスミドｐ Ｕｃ１９　の中に挿入されいてる。

浄書（内容に変更なし） ＧＴＧＡＡＴＴＣＧＡ　ＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＣＡＣＡＧＣ２７ＴＣＣＡＣＣ ＣＴＣＴＣＴ　ＧＣＡ　ＴＣＴ　ＧＴＡ　ＧＧＡ　ＧＡＣＡＧＡ　ＧＴＣ入ＣＣ ＡＴＣＡＣＴ　ＴＣＣ１６２５ｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ’　Ｓｓｒ　八ｌａ　５ｅ ｒ　Ｖａｔ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　ＩＬａ　Ｔｈｒ　Ｃｙ ｓＣＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＣＴＡＴＴ八ＧＴＡＣＧＴＣＧτ丁ＧＧＣＣＴＣ ＧＴＡ？ＣＡＧＣＡＧ２０７Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｓｉｒ　Ｇｉｎ　Ｓｅｅ　工ｌａ 　Ｓｅｒ　ＡＩ′ｇ　Ｔｒｐ　Ｌａｕ　入１ａ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｇ１ ｎ２８　３３　３Ｂ 人ＡＡＣＣＸＣＯＧ八入ＡＧＴＣＣＣＴＡ）、ＧＣτＣｍ八ＴＣτへＴ入入ＧＧ Ｃ＾ＴＣＴＡＧＴ２５２ＬｙＩＩＰｅａ　Ｏｌｙ　Ｌｙ＋＋　ＶａＬ　Ｐｒｏ　 Ｌｙｉ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　工Ｌｅ　Ｔｙｅ　Ｌｙ＋＋　Ａｌａ　Ｓｓ＋’　５ｓ ｒＴＴＡ　ＣＡＡ　八ＣＴ　ＧＧＯＣＴＣＣＣＡ　ＴＣＡ　入ＣＯ７丁ＣＡＧＣ ＧＣＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＴＣＴ　ＧＧＧ　２９７Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｓ＠ｒＧａｙ 　ＶａＬ　Ｐｆａ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｐｈ＠Ｓａｒ　Ｇｌｙ　ｇ＠ｒ　ＧＬｙ　 Ｓｅｒ　Ｇｌｙ５８　６３　６Ｂ ｋｃｌ　Ｇ入ＡＴＴＣＡＣＴ　ＣＴＣＡＣＣＡＴＣ入Ｇｅ　ｋＧｃ　ＣＴＣｅ入 ａＣＣで　ＣＡＴ　Ｇ入？　ＴＴＴ　３４２Ｔｈｉ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　 Ｌａｕ　Ｔｈｒ　工１＠　Ｓ＠ｌ″　Ｓ＠Ｉ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　入り　 入ｓｐ　Ｐｈｅ７３　１Ｂ　ｌ１ｌ ＧＣｈ　入ＣＴ　丁入Ｔ　ＴＡＣＷＣＣＡＡ　ＣＡＧ　ＴＡＴ　ＡＸＴ　入Ｇτ 　丁＾τ　ＴＣＴ　ＴｒＣＧＧＣＣＣＴ　３Ｂフ入Ｌａ　Ｔｈｗ　ＩＳｙ　Ｔｙ ｔ　Ｃｙｓ　ＧＩＬｎ　Ｏｌｎ　Ｔｙｒ　）ｕ＋ｎ　５ｅｒ　Ｔｙｒ　ｓｅｒ　 Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｐ’ｒ。

ＧＯＧ　ＡＣＣＡＡＡ　ＧＷ　ＯＡＴ　ＡＴＣＡ入ＡｃＧ入　入ＣＴ　ＧＴＧ　 ＧＣＴ　ＣＣＡ　ＣＣＡ　ＴＣＴ　ＣＴＣ４３２Ｇｌｙ　丁ｈｒ　Ｌｙｉ　ＶＩ ＩＬ　ＡＭＰ　工Ｌ＠　Ｌｙｅ　入ｒｇ　Ｔｈｒ　Ｖａｔ　入１ａ　Ａｈａ　ｉ ’ｒｏ　Ｓａｒ：　Ｖａ１？７ＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧ　ＣＣ入丁Ｃ’ｒＧ八へ　 （ＪＧ　ＣＡＧ　ＴＴＣλ入Ａ丁Ｃ？ＧＧ＾　八ＣＴ　Ｇｅｅ　４７７Ｐ）＋８ 　Ｚｌｅ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　ＧＬｕ　ＧＬＱ　Ｌ＠ｕ 　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　ＧＬｙ　Ｔｈｒ　入１ａ１１８　１２３　１２ｆｌ ＴＣＴ　ＯＴＴ　ＣＴＣＴＧＣＣＴＱ　ＣＴＣＡＪＴ　八ＡＣｍＣτ入τ　ＣＣ Ｃ八Ｃ＾　ＣＡＧ　ＣＣＣＡＡＡ　５２２５ｅｒ　ＶａＬ　Ｍａｌ　Ｃｙｓ　Ｌ ＠ｕ　Ｌ＠ｕ　入ａｎ　入ａｎ　Ｐｈｓ　’Ｑｒ　Ｐｒｏ　入ｘｑ　Ｇｌｕ　Ａ ｌａ　ＬｙｓＧＴＡ　ＣＡＧ　ＴＧＧ　ＸＡＧ　ＧＴＧ　ＯＡＴ　ＲＡＣＧＣＣ ＣＴＣＣＡＡ　ＴＯｆｆ　ＧＯＴ　ＡＡＣＴＣＣＧＡＧ　５６７ＶａＬ　Ｇｉｎ 　丁ｒｐ　Ｌｙｓ　Ｖａｔ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ｓａｒ 　ＧＬｙ　入ａｎ　Ｓｅｒ　Ｇ１ｎ１４１１　１５３　１５Ｂ Ｇ入Ｇ　八ＧＴ　ＣＴＣＡＣＡ　ＧＡＧ　（ＪＧ　ＯＡＣＪ１５ＣＡＡＧ　ＣＡ Ｃ八ａＣ入ＣＣ丁ＡＣ八ＧＣＣＴＣ６１２０１ｕＳ＠ｔ！／ａｔτｈｒＧｌｕり Ｌｒ＋入５ｐｋｒＬＹ＠＾雪ＰＳｅｒ）’ｈｔフ７ｃＳｅｒＬｅｕ浄書（内容に 変更なし） ＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣ１’Ｇ　ＡＣＧ　ＣｒＧ　ＡＧＣＡＡＡ　ＧＣＡ　ＧＡＣ ＴＡＣＧＡＧ　ＡＡＡ　ＣＡＣＭＡ　６５７ＧｒＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡ　 Ｇｒ′ｃＡＣＣＣＡＴ　ＣＡＧα；ＣＣＴＧ　ＡＧＣＴＣＧ　ＣＣＣＧｒＣ７０ ２ＡＣＡ　ＭＧ　ＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧ　ＧＧＡ　ＧＡＧ　ＴＧＴ　ＴＡＧ 　７３２Ｔｈｒ　［、ｙｓ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ 　ＣＹｓＳｔｏｐＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３ 配列の種類：対応する蛋白質を含むヌクレオチド配列の長さ＝７７６塩基対 鎖の形状　：１本鎖 トポロジー二円形 分子の種類：人ｃＤＮＡの挿入を有するプラスミドＤＮＡ起源 生物　二人 直接的実験の由来： 細胞系名称＝３Ｄ６ 特徴＝　１から　１３　ｂｐまでニブラスミドｐｃ：Ｕ１９　ポリリンカー１４ 〃７６０　／ｌ：挿入５ｃ３Ｄ６ １４〃１６〃：開始コドン １４　＃　３９４　／７　：可変領域、Ｈ鎖１７　）Ｊ　１０６　）ｌ　：フレ ームワーク１、Ｈ鎖１０７　／７　１２１　／／　：相補性決定領域１、Ｈ鎖１ ２２　１１　１６３　１）　：フレームワーク２、Ｈ鎖＋６４　ＩＩ　２１４　 ＩＩ　：相補性決定領域２、Ｈ鎖２１５　〃３１０　／／　：フレームワーク３ 、Ｈ鎖３１１　〃３６１　〃：相補性決定領域３、Ｈ鎖３６２　／Ｊ　３９４　 ）ｌ　：フレームワーク４、Ｈ鎖３９５　ｔｔ　４４０　／７　ニリンカー４４ １／７　７６０　〃：可変領域、Ｌ鎖４４１　１）　５０８　ＩＩ　：フレーム ワーク１、Ｌ鎖５０９　））　５４２　１１　：相補性決定領域１、Ｌ鎖５４３ ＃　５８８　／’：フレームワーク２、Ｌ鎖５８９　／／　６０７　ｎ　：相補 性決定領域２、Ｌ鎖６０８〃７０３　／ｌ：フレームワーク３、Ｌ鎖７Ｑ４　／ ／　７２４　１Ｊ　：相補性決定領域３、Ｌ鎖７２５　／Ｊ　７５７　／／　： フレームワーク４、Ｌ鎖７５８　／／　７６０　〃：終結コドン７６１　１）　 ７７６　ｎ　ニブラスミドｐ（：Ｕ１９　ポリリンカー特性：　抗体３Ｄ６の操 作された１本領ＦｖフラグメントのクローンがプラスミドｐＵｃ１９　の中に挿 入されいてる。

浄書（内容に変更なしン Ｅｉｇｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ：　Ｋｌｏｎ　ｄｅｓ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｔｅｎ　 ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ　Ｐｖ−Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｄ■■ Ａｎｔｉｋ６ｒｐｅｒｓ　３Ｄ６１ｎｓｅｒｔｉｅｒｔ　ｉｎ　ｄａｓ　Ｐｌａ ｓｍｉｄ　ｐＯＱ９゜ＡＡＡＡＧＡＡＴＴＣＣＣＣ１３ ＡＴＧ　ＧＡＡ　ＧＴＧ　ＣＡＧ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＱＡＧ　ＴＣＴ　（５ＧＧ Ａ　ＧＧＣ’１％　ＧＴＡ　ＣＡＧ　ＣＣＴ　５８ｙｒＥＴ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　 Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｕｙ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　 Ｖａｌ　Ｇｌｎ　ｐｒ。

ＧＧＣＡＧＧ　ＴＣＣＣ”ｒＧ　ＡＧＡ　ＣＴＣＴＣＣＴ１Ｐｒ　ＧＣＡ　ＧＣ ＣＴＣＴ　ＧＧＡ　ＴｒＣＡＣＣＴＩＴ　１０３Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｌｅ ｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｈ ｅ　Ｔｈｒ　ＰｈｅＭＴ　ＧＡＴ　ＴＡＴ　ＧＣＣＡＴＧ　ＣＡＣＴＧＧ　ＧＴ ＣＣＧＧ　ＣＡＡ　ＧＣＴ　ＣＣＡ　ＧＧＧ　ＭＧ　ＧＧＣ１４８ＡＳｎ　Ａｓ ｐ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　ＭＥＴ　Ｈｌｓ　Ｔｒｐνａｌ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ａｌａ 　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　ＧｌｙＣＴＧ　ＧＡＧ　ＴＧＧ　ＧＴＣＴＣＡα； Ｔ　ＡＴＡ　ＡＧＴ　ＴＧＧ　ＧＡＴ　ＡＧＴ　ＡＧｒ　ＡＧｒ　ＡＴＡ　ＧＧ Ｃ１９３Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　ＧｕｙＬｙｓ　Ｓｅｒ　Ｔ ｒｐ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　ＧｌｙＴＡＴ　ＧＣＧ　ＧＡ ＣＴＣｒ　ＧｒＧ　ＡＡＧα℃α端ＴｒＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡ　ＧＡＣＡ ＡＣ２３８Ｔｙｒ　Ａｌａ　ＡＩＩｐＳｅｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ 　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｓｎα工ＭＧ　ＡＡＣ ＴＣＣＣＴＧ　ＴＡＴＣＴＧ　ＣＡＡ　ＡＴＧ　ＡＡＣＡＧＴ　ｆｉ　ＡＧＡα ？Ｉ’ＧＡＧ　２８３Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　”ｆ’ｆｒ　 Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　ＭＥＴ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ　ＧｌｕＧ ＡＣＡＴＣＧＣＣＴＴＡ　ＴＡＴ　ＴＡＣＴＧＴ　ＧＴＡ　ＡＡＡ　ＧＧＣＡＧ Ａ　ＧＡＴ　ＴＡＣＴＡＴ　ＧＡＴ　３２８Ａｓｐ　ＲＷ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｔ ｙｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｔ ｙｒ　ＡｓｐＡＧｒ　ＧＧＴ　Ｃ７ＴＡＴ　ＴｒＣＡＣＧ　ＧＩＴ　ＧＣＴ　Ｔ Ｔｒ　ＣＡＴ　ＡＴＣ’ｆｆ　ＧＧＣＣＡＡαん　３７３Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌ ｙ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ工ｌｅ　Ｔｒｐ 　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙｌｌｏ　１１５　１２０ ＡＣＡ　ＡＴＧ　ＧｒＣＡＣＣＣ１’Ｇ　ＴＣＴ　ＴＯ’ｌ　ＧＧＴ　ＧＧＣＧ Ｇｒ　ＧＧＣＴＣＧ　ＧＧＣＧＧｒ　ＧＧＴ　４１８Ｔｈｒ　ＭＥＴ　Ｖａｌ　 Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　 Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｕｙα石παπα℃α℃α論ＴＣＴ　ＧＡＣＡＴＣＣＡＧ　 ＡＴＧ　ＡＣＣＣＡＧ　ＴＣＴ　ＣＣＴ　４６３Ｇｕｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌ ｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　ＩＩｓ　Ｇｉｎ　ＭＥＴ　Ｔｈｒ　Ｇｌ ｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒ。

浄１（内容に変更なし） ＴＣＣＡＣＣＣ１１’Ｇ　ＴＣＴ　ＧＣＡ　ＴＣＴ　ＧＴＡ　ＧＧＡ　ＧＡＣＡ ＧＡ　ＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴ　ＴＧＣ５０８Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｉａｕ　Ｓｅ ｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｘｌ ｅ　Ｔｈｒ　ＣｙｓＣＧＧ　ＧＣＣＡＧＴ　ＣＡＧ　ＡＧＴ　ＡＴＴ　ＡＧＴ　 ＡＧＧ　ＴＷ　ＴｒＧ　ＧＣＣＴＧＧ　ＴＡＴ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　５５３Ａｒｇ 　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ工ｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　 Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｇ１ｎＭＡ　ＣＣＡ　ＧＧＧ　ＡＡＡ　ＧＴ ＣＣＣＴ　ＡＡＧ　ＣＴＣ（”ｒＧ　ＡＴＣＴＡＴ　ＡＡＧ　ＧＣＡ　ＴＣＴ　 ＡＧＴ　５９８Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌ ｅｕ　Ｌｅｕ工１ｅ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　５ｅｒＴＴＡ　ＧＡＡ 　ＡＧＴ　ＧＧＧ　ＧＴＣＣＣＡ　ＴＣＡ　ＡＧＧ胃ＣＭ疋α℃Ｎπα込■πα 石　６４３Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ 　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇ］、ｙＡＣＡ　ＧＡＡ 　ＴＴＣＡＣＴ　ＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧ　ＣＡＧ　ＣＣＴ　Ｇ ＡＴ　ＧＡＴ　’ＩＴＴ　６８８Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔ ｈｒ工ｌｅ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｐｈ ｅＧＣＡ　Ａ（Ｐｒ　ＴＡＴ　ＴＡＣＴＧＣＣＡＡ　ＣＡＧ　ＴＡＴ　ＡＡＴ　 ＡＧｒ　ＴＡＴ　ＴＣＴ　ＴＴＣα℃α１７３３Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｔｙ ｒ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　’ｒｙｒ　Ｓｅｒ　Ｐ ｈｅ　ＧＩＹ　ｐｒ。

ＧＧＧ　ＡＣＣＡＡＡ　ＧＴＧ　ＧＡＴ　ＡＴＣＡＡＡ　ＣＧＡ　ＴＭ　７６０ Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　５ｔｏｐ −−ＧＣ’ＩＴＣｒＧＣＡＣＣＡＴＣｒＧ　７７６衣−上 細胞懸濁液中の溶解剤の最終濃度 親和性リガンドとして５ｃ３Ｄ６　を含む組換えｇｐ１６０　のクロマトグラフ ィー精製の個別段階における収率表３ 形質転換されたマウス骨髄腫細胞の培養上澄液からの５ｃ３Ｄ６蛋白質の精製に おける個別段階の収率 文献 １　、Ｇｒｕｎｏｗ、　Ｒ，、Ｓ、　Ｊａｈｎ、　Ｔ、　Ｐｏｒｓｔｍａｎｎ、 　Ｓ、Ｔ、　ＫｉｅｓｓＬｔｇ、　Ｈ，５ｔｅｉｎｋｅｌｌ■秩B Ｆ、　５ｔｅｉｎｄｌ、　Ｄ、　Ｍａｔ、ｔａｎｏｖｉｃｈ、　Ｌ、　Ｇｕｅｒ ｔｌｅｒ、　Ｅ、　Ｄｅｉｎｈａｒｄｔ、　Ｈ，Ｋａｔｉｎ■■■ 及びＲ，ｖａｎ　Ｂａｅｈｒ、　１９８８、「高効率、人Ｂ細胞を不死化するペ テロ骨髄腫ＣＢ−Ｆ７　Ｊ　：Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　１ ０６　：　２５７”２、Ｗａｔｓｏｎ、　、Ｊ、　Ｄ、、　Ｎ、Ｈ，Ｈｏｐｋｉ ｎｓ、　ＪＪ、　Ｒｏｂｅｒｔｓ、　Ｊ、Ａ、　５ｔｅｉｔｚ及びＡ、Ｍ。

Ｗｅｉｎｅｒ、　１９８７、ＴｈｅＢｅｒＩｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｊｎｇｓ　Ｐ ｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｉｎｃ、刊行”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　 Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ″、　Ｖｏｌ、　！及び？３、　１ｎｂａｒ、 　Ｄ、、　Ｊ、　Ｈｏｃｈｍａｎｎ及びり、　Ｇｉｖｏｌ、　１９７２、「Ｈ鎖 及びＬ鎖の可変部内の抗原結合位置の偏在ｊ″Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ″、　６９：２６５９−２６６２４、）Ｉｏｃｈｍａｎ ｎ、　Ｊ、、　Ｄ、　Ｉｎｂａｒ−及びり、　Ｇｉｖｏｌ、　１９７３、「Ｈ鎖 及びＬ鎖のいくつかの可変部よりなる活性抗体フラグメント（Ｆｖ　）　Ｊ　： 　”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ″、Ｒ：１３３０−１１３５ ５、Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、　Ｅ、Ｆ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ及びＪ、　Ｓａｍ ｂｒｏｏｋ、　１９８２、ニューヨーク、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ ｒの　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ発行：” Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕ ａ１″６、Ｋａｂａｔ、　Ｅ、Ａ、、　Ｔ、Ｔ、　Ｎｕ、　Ｍ、　Ｒｅｉｄ−Ｍ ｉｌｌｅｒ、　Ｈ，Ｍ、　Ｐｅｒｒｙ及びに、　Ｓ。

Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ、　１９８７、米国Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ、　ｏｆ　Ｈｅａ ］、ｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　５ｅｒｖｉｃｅｓ。

Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　５ｅｒｖｉｃｅの５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｐｒ ｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｔｅｒｅｓｔ” ７、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、　Ｍ、Ｓ、、　１９８３、「リンパ球様細胞中にトラ ンスフェクトされた免疫グロブリンＨ鎖遺伝子の発現と支配」；ＥＭ１３０　Ｊ 、　”、　２：ｌ３７３−　】３７８８、Ｗｏｏｄ、　Ｃ，Ｒ，、Ｍ、Ａ、　Ｂ ｏｓｓ、　Ｊ、Ｈ，Ｋｅｎｔｅｎ、　Ｊ、Ｅ、　Ｃａ１ｖｅｒｔ及びＮ、Ａ、　 Ｒｏｂｅｒｔｓ。

１９８５、「酵母における機能的抗体の試験管内での組み立て及び合成」　：Ｎ ａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）”、　３１４：４４６−４４９９、Ｂｏｓｓ、　 Ｍ、Ａ、、　Ｊ、Ａ、　Ｋｅｎｔ、ｅｎ、　Ｃ，Ｒ，Ｗｏｏｄ及びＪ、Ｓ、　Ｅ ｍｔａｇｅ、　１９８４、［大腸菌における免疫グロブリンＨ鎖及びＬ鎖からの 機能的抗体の組み立て」：”Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、”　１２：３７９ １　−　３８０６１０、　５ｋｅｒｒａ、　Ａ、及びＡ、　Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕ ｎ、　１９８８、「大腸菌における機能的免疫グロブリンＦｖフラグメントの組 み立てＪ　：　”５ｃｉｅｎｃｅ”、　２４０：１０３Ｂ　−１０４１１１、Ｂ ｅｔｔｅｒ、　Ｍ、、　Ｐ、　Ｃｈａｎｇ、　Ｒ，Ｒ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ　及び Ａ、Ｈ，Ｈｏｒｗｉｔｚ、　１９８８、「大腸菌の活性キメラ性抗体フラグメン トの分泌Ｊ　：　５ｃｉｅｎｃｅ’“、　２４０：１０４１−１２、　Ｈｕｓｔ ｏｎ、　Ｊ、Ｓ、、　Ｄ、　Ｌｅｖｉｎｓｏｎ、　Ｍ、　Ｍｕｄｇｅｔｔ−Ｈｕ ｎｔｅｒ、　Ｍ、Ｓ、　Ｔａｉ、　Ｊ、　mｏｖｏｔｎｙ。

Ｍ、Ｎ、　Ｍａｒｇｏｌｉｅｓ、　Ｒ，Ｊ、　Ｒｉｄｇｅ、　Ｒ，Ｅ、　Ｂｒｕ ｃｃｏｌｅｒｉ、　Ｅ、　Ｈａｂｅｒ、　Ｒ，Ｃｒｅａ及びＨ，Ｏｐｐｅｒｍａ ｎｎ、　１９８８、「抗体結合部位の蛋白質工学、大腸菌における抗ジゴキシン １末鎖Ｆｖ類似体中の特異的活性の回復」：°“Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ”、　８５：５８７９−５８８３１３、Ｂｉｒｄ 、Ｒ，Ｅ２．に、Ｄ、Ｈａｒｄｍａｎ、ＪＪ、Ｊａｃｏｂｓｏｎ、Ｓ、Ｊｏｈｎ ｓｏｎ、Ｂ、Ｍ、Ｋａｕｆｍａｎ。

ｓ、！＋４．　Ｌｅａ、　Ｔ、　Ｌｅｅ、　Ｓ、Ｉ（、Ｐｏｐｅ、　Ｇ、Ｓ、　 Ｒｉｏｒｄａｎ　及びＭ、　Ｗｈｉｔ、ｌａｗ、　１９８８A 「１本鎖抗原を結合する蛋白質Ｊ　：　”５ｃｉｅｎｃｅ’、　２４２：４２３ −４２［１１４、Ｄｏｅｐｅｌ、　Ｓ、Ｈ，、Ｔ、　Ｐｏｒｓｔｍａｎｎ、　Ｒ ，Ｇｒｕｎｏｗ、　Ａ、　Ｊｕｎｇｂａｕｅｒ　及びＲ，ｖ。

Ｂａｅｈｒ、　１９８９、「迅速拮抗性抗）ＩＩＶ　ＥＩＪＳＡにおける大モノ クローナル抗体の適用」　：　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ”、υ、 ｆｉ：２２９−２３３１．５．　Ｄｏｅｐｅｌ、　Ｓ、Ｈ，、Ｔ、　Ｐｏｒｓｔ ｍａｎｎ、　Ｐ、　Ｈｅｎｋｌｅｉｎ　及びＲ，ｖｏｎ　１３ａｅｈｒ、　１９ ８X、 「異なったペプチドによる大エイズウィルス（ＨＩＶ−１）　の過膜蛋白質の免 疫主要領域の詳細マツピング及びその抗−）（ＩＶ　ＥＬＩＳＡ　における利用 」　：Ｊ、　Ｖｉａｌ、　Ｍｅｔｈ、”　２５：１６７−１７８１Ｂ、Ｊｕｎｇ ｂａｕｅｒ、　Ａ、、　Ｃ，Ｔａｕｅｒ、　Ｅ、　Ｗｅｎｉｓｃｈ、　Ｆ、　５ ｔｅｉｎｄｌ、　Ｍ、　ＰｕｒｔｓｃｈｅｒA　Ｌ Ｒｅｉｔｅｒ、　Ｆ、　Ｕｎｔｅｒｌｕｇｇａｕｅｒ、　Ａ、　Ｂｕｃｈａｃｈ ｅｒ、　Ｋ、　ＴＪｈｌ及びＩ（、Ｋａｔｉｎｇｅｒ。

１９８９．７人工イズウィルス）ｉＩＶ−１に対する人モノクローナル抗体のパ イロット規模生産Ｊ　：　”Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉａｐｈｙｓ、　Ｍｅ ｔｈ、”、　１９（２−３）：２２３−２４０１７、Ｎａｋ、ａｎｅ、　Ｐ、に 、及びＡ、　Ｋａｗａｏｉ、　１９７４、「抱合の新しい方法、ペルオキシダー ゼで標識した抗体」　：　Ｊ、　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、’ 　２２：１０８４−１０９１１８、Ｂａｒｒｅｔｔ、　Ｎ、、　Ａ、　Ｍｉｔｔ ｅｒｅｒ、　Ｗ、　Ｍｕｎｄｔ、　Ｊ、　Ｅｉｂｌ、　Ｒ，Ｃ，Ｇａ１ｌｏ、　 Ｂ、　Ｍ盾Tｓ 及びＥ、　Ｄｏｒｎｅｒ、　１９８９、「ワクシニア組換え体より導いたＨＩＶ −１ｇｐ１６０　の大規模製造及び精製並びにその免疫原性の分析」　：　Ａｉ ｄｓ　Ｒｅｓ、　ａｎｄ　）ＩｕｍａｎＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ″、　５［２ ）　：１５９−１７１１９、Ｋｏｈｌ、　Ｊ、、　Ｆ、　Ｒｕｅｃｋｅｒ、　Ｇ 、　Ｈｉｍｍｌａｒ、　Ｄ、　Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈ及びＨ，Ｋａｔｉｎｇｅ ｒB １９９０、「翻訳された融合体の構築のための大腸菌アルカリ性ホスファターゼ のための操作された遺伝子」　：　Ｎｕｃ１．　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、”、　１ ８［４１：１０６９２０、Ｓｈｕｔｔｌｅｗｏｒｔｈ、　Ｈ，、Ｊ、　Ｔａｙｌ ｏｒ　及びＮ、　Ｍｉｎｔｏｎ、　１９８６、「大腸菌ＪＭ８３からのアルカリ 性ホスファターゼのための遺伝子の配列」　：　Ｎｕｃ１．　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ 、”、　１４（２１１：８６８９２１、Ｋｅａｒｎｅｙ、　Ｊ、Ｆ、、　Ａ、　 Ｒａｄｂｒｕｃｈ、　Ｂ、　Ｌｉｅｓｅｇａｎｇ及びに、　Ｒａｊｅｗｓｋｙ、 　１９７９、「免疫グロブリン発現は失ってしまったけれども抗体分泌性ハイブ リッド細胞系の構築を許容する新規なマウス骨髄腫細胞系」　；”Ｊ、　Ｉｍｍ ｕｎｏｌハ１２３：１５４８−１５５０ ２２、Ｇｌｏｖｅｒ、　Ｄ、Ｍ、、　１９８７　、ワシントンＤＣ，オックスフ ォードのＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ刊行″ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　ｐｒａｃｔ ｉｃａｌ　ａｐｐｒｏｅｃｈ”　の第１．２及び３巻２３、Ｓｍ１ｔｈ、　Ｇ、 Ｅ６．　Ｍ、Ｄ、　Ｓｕｍｍｅｒｓ　及びＭ、Ｊ、　Ｆｒａｓｅｒ、　１９８３ 、「バキュロウィルス発現ベクターを感染させた昆虫細胞の中での人β−インタ ーフェロンの生産」　：　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、”、　３：２１５ ６−２１６５２４、　Ｇｏｐｅ、シ１．Ｌ、、Ｒ，Ａ、Ｋｅｉｎａｅｎｅｎ、Ｐ 、Ａ、Ｋｒ１ｓｔａ、Ｏ，シ１．　Ｃｏｎｎｅｅｌｙ、Ｗ、Ｇ、Ｂｅａｔ撃■ Ｔ、　Ｚａｒｕｃｋｉ−３ｃｈｉｚ、　Ｂ、Ｗ、　Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ　及びＭ、 Ｓ、　Ｋｕｌｏｍａａ、　１９８７、「にわとりアビジンｃＤＮＡの分子クロー ニングＪ　：　”Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、”、　１５（８１：２５、　 ５ｔｕｄｉｅｒ、　ＦＪ、及びＢ、Ａ、　Ｍｏｆｆａｔｔ、　１９８６、「クロ ーニングされた遺伝子の選択的な高水準の直接発現のためのバタテリオファージ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの使用Ｊ　：　”Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　１８ ９：１１３図３　ＨＩＶ−１抗原の直接検出標準曲線（ＥＬＩＳＡによる）９５ −０％の阻害率％ 要約書 は種々の原核生物的又は真核生物的系において行われる。その精製のためには生 物化学的なりロマトグラフィー的方法が用いられる。記述されている組換え蛋白 質はＨＩＶ−１抗原の検出、定量、及び精製のために使用することができる。

手続補正書動巧 平成４年１１月１８日

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．ＨＶＩ−１のウイルス性コンプレックス抗原に結合する組換え蛋白質におい て、細胞系３Ｄ６に由来する抗体の可変領域を含んでいることを特徴とする、上 記蛋白質。
2. ２．ＳＥＱＩＤＮＯ：１に従うＨ鎖の可変領域を含んでいることを特徴とする請 求の範囲１の組換え蛋白質。
3. ３．ＳＥＱＩＤＮＯ：２に従うＬ鎖の可変領域を含んでいることを特徴とする請 求の範囲１又は２の組換え蛋白質。
4. ４．ＳＥＱＩＤＮＯ：３に従い構成されており、その際Ｈ鎖の可変領域が或るリ ンカーを介してＬ鎖の可変領域と結合されていることを特徴とする、請求の範囲 １ないし３のいずれか１つの組換え蛋白質。
5. ５．ＤＮＡ挿入列ｓｃ３Ｄ６又はこの挿入列とハイブリッドされる配列、或いは 変性によってその発現された蛋白質から導かれる配列を或るプラスミドの中に導 入し、このプラスミドで或る宿主を形質転換させ、そしてその構築体を発現させ ることを特徴とする、請求の範囲１ないし４のいずれか１つの組換え蛋白質の製 造方法。
6. ６．融合蛋白質として、なかでもアルカリ性ホスファターゼとともに、又はアビ ジンとともに発現されることを特徴とする、請求の範囲５の組換え蛋白質の製造 方法。
7. ７．挿入列ｓｃ３Ｄ６がＳＥＱＩＤＮＯ：３にあげたヌクレオチド配列を有する ことを特徴とする、請求の範囲５の方法において用いるための挿入列。
8. ８．上記蛋白質又はリンカーに対する特異性抗体が両方の可変領域の間に挿入さ れることを特徴とする、請求の範囲１ないし４のいずれか１つの組換え蛋白質を 精製する方法。
9. ９．精製に用いる抗体が担体の上に固定されていることを特徴とする、請求の範 囲８の方法。
10. １０．分離及び／又は精製が親和性クロマトグラフィーによって行われ、その際 場合により対応的な予備精製の後でｓｃ３Ｄ６蛋白質又はアビジン−ｓｃ３Ｄ６ 蛋白質をリガンドとしてその親和性クロマトグラフィーのために用いることを特 徴とする、ＨＩＶ−１抗原の分離及び／又は精製方法。
11. １１．組み合わされた検出−及び信号蛋白質としてＥｃｐｈｏＡ−ｓｃ３Ｄ６蛋 白質を含む融合蛋白質が用いられることを特徴とする、ＨＩＶ−１抗原の直接検 出方法。
12. １２．組み合わされた検出−及び信号蛋白質としてＥｃｐｈｏＡ−ｓｃ３Ｄ６蛋 白質を含む融合蛋白質が用いられることを特徴とする、拮抗的イムノアッセイに おいてＨＩＶ−１陽性血清を検出する方法。