JPH05501198A - バイオセンサーおよびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 バイオセンサーおよびその製造方法 コースオキシダーゼ（ＧＯＤ）によって選択的に定量するだめのバイオセンサー 、ルタチオン、さらには空気中の酸素でも、測定値、とくに測定される電流に多 か物による妨害に対する感受性も高められる。

置換ポリピロールからの多孔性の、電気的に絶縁された間層が配置される構成を とることで十分である。この場合、もちろん、妨害種の酸化還元過程、たとえば アスコルビン酸まだはグルタチオンによる酸化還元過程は、オキシダーゼをその 上に固定化した層が、添加あるいは測定条件下に、有意な酸化還元活性をもはや 示さないことにより持続的に阻止される。高い感受性を達成するため過酸化水素 の電極への望ましい拡散を考慮すると、オキシダーゼの固定化のためには可能な 限り薄い担体間層が追求されるべきである。この場合、この間層を薄い層の多孔 性、透過選択性の膜として形成させることで、満足できる結果を得ることができ る。

本発明の方法によって置換されたポリピロールの重合は、電気化学的に有意に低 下した伝導度を考慮づると比較的難しく、櫃めて薄いフィルム厚の場合だけ、通 常、このように置換されたポリピロールをホモポリマーとして適用できる。比較 的大量の酵素ならびにその補酵素の望ましい固定化を考慮して一定のフィルム厚 を得ようとする場合には、通常、非置換ビロールと置換ビロールがらのコポリマ ーの沈殿によってフィルム層を構成させることが必要になる。このようなコポリ マー層はついで、酵素の固定化に関して有利である。このようなコポリマー層が なお高い伝導度と、場合によってはまだ測定可能な酸化還元活性を示すことがあ るという危険を避けるため、この場合、ホモポリマーがらの比較的薄い層であっ たとしても、酸化還元活性あるいは伝導度の低下に必要な少なくとも１種の置換 体を沈殿させることが適当である。

したがっこ、本発明のバイオセンサーは、電柵上に置換ビロールがらのホモポリ マーおよびコポリマーの少なくとも２層が搭載されるまうに構成するのが有利で ある。

ポリピロール上へのオキシダーゼの固定化、とくに酵素および補酵素ならびに担 体層の間に共有結合を形成させるためには、カルボキシル基およびニトロ基のよ うな置換基が原理的に知られている。電気伝導度を高く維持し、酸化還元活性を 促進りるこれまで課題とされた立場においては、このような置換の範囲は通常、 確実な固定化のために必要な範囲に限定された。ポリピロールの伝導度および酸 化還元活性を低下させるだめにも、原理的にはカルボキシル基およびニトロ基が 適しているが、この場合には、このようなカルボキシル基およびニトロ基の範囲 が酵素の固定化のだめに必要と考えられる範囲を越えても、オキシダーゼによっ て分解される物質の定量の選択性の有意な向上が少なくとも第一に保証されなけ ればならない。本発明によれば、酸化還元活性と伝導度の低下のために、また同 時に酵素の担体への固定化の便宜のために、好ましくはカルボキシ置換ポリピロ ールが調達される。本発明によって製造される改良Ｎ−アルキルポリピロールを 含有する薄いフィルム層で常法により測定された血流中のグルコース濃度の直線 関係には０〜９　ｍＭの範囲で直線性が認められるので、好ましくは、高い濃度 の測定には固定化酵素が透過選択性の膜で被覆されるように構成することによっ て、感度口線を移動させることが可能である。補助的な透過選択性膜が感受性に 負荷をかけ、それによって直線範囲が高濃度方向に移動する。

本発明によるこのようなバイオセンサーの製造方法は、実際上、Ｎ−および／ま たは３−置換モノマーを、電極が配置されだ担体上に電気化学的に沈殿させるこ とを特徴とするものである。電気化学的な沈殿によれば、一定の、制御可能な層 厚を形成させることができる。この場合もちろん、すでに述べたように、モノマ ーの低い伝導度自体が採用できる層厚を決定することになる。電気化学的な沈殿 のほかに、好ましい方法としては、バイオセンサーを気相がらの沈殿によって度 において、電極が配置された担体上に沈殿させる。伝導度が著しく低い場合には 、本発明の目的に応じて、気相からの沈殿層を厚くすることもできるが、あまり よく制御された層厚は製造できない。このように気相から行われる沈殿は実際上 技術的な問題ががなり多く、沈殿させるビロールの沈殿過程における蒸気圧は酸 化剤の蒸気圧と一致させなければならない。しかしながら、この方法は、伝導性 のない支持体に密着したポリマー層を沈殿させることを可能にする。このような 、気相からの沈殿によって被覆された電極は、ついで気相中酸素プラズマによっ て彫刻ないしはエツチングを行うことができる。

電気化学的方法において、目的に適った最小の層厚あるいは有用な微孔構造を確 実に達成するためには、沈殿を多層に行わせることが可能で、この場合、交互に モノおよびコポリマーを沈殿させることができる。どくにコポリマーの場合は、 非置換ビロールまだはメチルピロールのモノマーがらのコポリマーとすることが できる。このコポリマーでは電気化学的方法における厚い層の沈殿が容易になる 。

置換ビロールの製造のだめには、式ＲＸ（式中、Ｒは−ＣＨ２ＣＯＯＨ，−（Ｃ Ｈ２１，、Ｃｏｏｌ。

−（Ｃ１＋２１４ＣＨ（ＮＨ２１ｃＯＯＨ，−ＣＨ（ＣＩ（、，０Ｈ）ＣＯＯＨ ，−ＣＨ（ＣＨ２ＳＨＩＣＯＯＨ。

を依味し、ＸはＦ、　Ｃ１，Ｂｒ、ｌまだはトシルがら選ばれる離脱基を意味す る）で表される化合物を、相間移動触媒および、／まだはクラウンエーテルと４ 、強塩基だどえばＮａＯＨまたばＫＯＩ（の存在下に反応させることによって行 うのが有利である。

この場合、相間移動触媒としては、好ましくは、式α（Ｒ）４フｎｘ（式中、ｎ は１または２を意味し、置換ＭＲは同種もしくは互いに異種であコて、炭素原子 １〜２０個を有する直鎖状もしくは分岐状のアルキル基を意味し、ＸはＥ。

ルキルアンモニウム塩を添加することにより、所望のように置換されだビロール がとくに高収皐で、また以後の反応を妨言するような副生成物も含まずに得られ る。さらに、出発原料を相間移動触媒まだはクラウンエーテルで処理することに より、ビロール分子に、酸に不安定な置換基を結合させることも可能になる。

各クラウンエーテルが取り込むので適当であるにすぎない。

置換ビロールの他の製造方法においては、置換もしくは非置換のγ−アミノカル ボン酸、アミノ酸または５個までのモノマー単体をもつペプチドを、酸性溶液中 、ジメトキシテトラヒドロフランと処理することによってｄうのが有利である。

この場合、置換および非置換のアミノカル、７ｔ）酸としでは、好ましくはβ− アミ２ノプロピオン酸、γ−アミノ酪酸、γ−アミノ吉草酸、ε−アミノカプロ ン酸、ω−アミノウンデカン酸、アミノ安息香酸、Ｆ、ＣＩ、　Ｓｒおよび／も しくはメチル置換基で置換されたアミノカルボン酸、たとえば、３−アミノ−３ −メチルプロパン酸、２−フルオロアミノ酢酸、２−ブロモアミノ酢酸、γ−ア ミノー２−クロロ酪酸、γ−アミノー２−フルオロ酪酸、γ−アミノー２−ブロ モ酪酸、γ−アミノー２，２−ジメチル酪酸、γ−アミノー２−クロロー２−メ チル酪酸、１−アミノ−１，３−プロピルジカルボン酸、γ−アミノー３−メチ ル酪酸が、酸化還元活性を低下させる置換基として適してい−こ、まだアミノ酸 としてはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラ ニン、プロリン、リジン、セリン、システィンおよびアルギニン、ならびにこれ らのアミノ酸の誘導体が酸化還元活性を低下させる置換基として適している。酸 化還元活性および伝導度を低下させる置換基としては上述のように、５個までの モノマー単位を有するペプチドも有利に使用できて、本発明の方法の好ましい実 施態様に述べるように、同種または異種のアミノ酸の縮合によって得ることがで きる。この種のペプチドとしては、とくにアラニルアラニン、グリシルグリシン 、アラニルグリシン、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ、　Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙおよ びＧＩＹ−Ｇｌｙ−Ａｌａ、ならびにこれらのペプチドの誘導体を挙げることが できる。

Ｂｒ−、ビロール、３−メチルビリジンまたはニコチンアミドのような置換基を 付加することができる。３−メチルビリジンまだはニコチンアミドで置換された ビロールは、酸化還元活性の著しい低下を示し、有用であることが明らかにされ ている。とくに好ましい方法においては、以下の置換ビロールをホモポリマーど して担体上に被覆することができる。

２−（１−ピロロ）−アセチルグリシン１−ドデシルビロール １−（４−カルボキシベンジル）−ビロール１−（４−ニトロフェニル）−ビロ ール１−（４−カルボキシフェニル）−ビロール３−カルボキシ−４−メチルビ ロール １−ベンゾールスルホニリビロール ４−（３−ピロロ）−４−ヒドロキシ酪酸４−（３−ピロロ）−４−ケト酪酸 ３−［（ヒドロキシ４−ニトロフェニル）メチルビロール範囲で実施できるが、 それにより易伝導性のモノマーの場合も、比較的速やかな、センサーの場合とは 異なる別の測定原理を使用し、とくにレドックスメディエータ−のような妨害混 在物を全く測定しない。

本発明の方法のとくに好ましい構成を、以下の実施例および図面によってさらに 詳細に説明する。

厚さ１００〜３００　ｕｍのガラス薄片を洗浄し、電柵の担体材料として使用し た。高沈殿させた。金属層は続いて３ｕｍのケイ素ニトリドで絶縁し、エツチン グを行い、構築した。

り洗浄し、アセトンですすぎ、壓のない環境で乾燥した。ついで電極をアセトニ 電極にこのようなサイクリックポルタンメトリーを５回反復した。

サイクルを３０回反復した。沈殿工程の終了後、電極上に薄い、褐色のポリマー 層が認められた。

同様にして、以下の化合物のポリマー層をＰｔ−表面上に保持させることができ た。

１−（Ω−カルボキシメチル）−ビロール１−（Ω−カルボキシエチル）−ビロ ール１−（Ω−カルボキシプロピル）−ビロール１−（Ω−カルボキシペンチル ）−ビロール１−（Ω−カルボキシデシル）−ビロール１−（１，３−ジカルボ キシプロビル）−ビロール１−［（１−カルボキシ３−メチル）ブチル］−ビロ ール２−（１−ピロロ）−アセチルグリシン１−ドデシルビロール １−（４−カルボキシベンジル）−ビロール１−（４−ニトロフェニル）−ビロ ール１−（４−カルボキシフェニル）−ビロール３−カルボキシ−４−メチルビ ロール ４−（３−ピロロ）−４−ヒドロキシ酪酸４−（３−ピロロ）−４−ケト酪酸 ３−［（ヒドロキシ４−ニトロフェニル）メチルビロールは１０〜３０に変動さ ぜた。

されたポリマー層は、置換ビロールおよび非置換ビロールからのコポリマーから なり、このコポリマー中のビロールと置換ビロールの割合は約１０．１であった 。

同様にして、メチルビロールとＣ）で述べた置換ビロールからのコポリマーも保 持させることができだ。

次に直ちにリン酸緩衝液（ＤＨ＝７．０：　０、Ｉ　Ｍ）中５　ｍｇ／ｍｌのグ ルコースオキシダーゼを含む溶液に入れ、２時間反応させた。このようにして得 られた電極を緩衝液および水で洗浄し、４℃で保存した。

同様にして、以下の酵素、すなわちガラクトースオキシダーゼ、アミノ酸オキシ ダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、コレステリンオキシダーゼおよびアスコルベ ートオキシダーゼ、ならびに抱合酵素系を、ポリピロール被覆電極にカップリン グさせることができた。

酪酸のカルボキシル基に酵素がカップリングしだ、得られたビロール−Ｎ−酪酸 −ビロールコポリマーを、図１に模式的に示す。

るだめに、バイオセンサー上に被覆層を配置するここができる。

パーフルオロ化およびスルホン化したポリマーの溶液１ｍｌに、トリエチルアミ ン２０ｕｌおよび酢酸２０Ｉ＋ｌを加えて緩衝化した。バイオセンサーをこの溶 液に浸すか、またはこの溶液をバイオセンサーの表面上に噴霧して、バイオセン サーを被覆した。次に、バイオセンサーを室温で乾燥し、ついで４℃で保存した 。

各負荷間には排気を行うと、品質の高いビロールコポリマーの層が電極上に保持 された。

同様にして、ホモポリマーのみでなく各種のコポリマーの層を電極上に沈殿させ ることができる。

ニウム水酸化物の１０％水溶液１０ｍ１にくわえる。この混合物に、激しく攪拌 しなに淡黄色に着色する。反応終了後、水相を分離し、有機相の溶媒ならびに未 反応出発原料を減圧下に留去する。

例４ ００５Ｍのジメトキシテトラヒドロフランと００５Ｍの４−メチルアミノ安息香 酸を３０ｍ１の酢酸と混合し、水浴上７０℃で攪拌する。反応中に、わずかに褐 色に着色する。反応終了後、反応混合物を冷却し、生成物を析出させるため、− 夜釣５℃に保持する。ついで、沈殿した結晶を濾過し、真空中で乾燥する。生成 物はほぼ定量的な収率で得ることができた。

添付の図面中、図２には、現在の技術水準における単層バイオセンサーと本発明 のバイオセンサーにおける測定値を比較する。縦軸には、それぞれ、電流の測定 値をｎＡで示す。両電極に固定化した酵素はグルコースオキシダーゼで、０１Ｍ リン酸暖衝液中、２５℃、電圧５００ｍＶで、溶液のグルコース含量を測定する 。両溶液は、それぞれ４ｍＭ／ｌのグルコース、１　ｍＭ／ｌのグルタチオン、 １０　ｍｇ／ｍｌのアスコルベートおよび１％の酵母培地を含有する。単層バイ オセンサー（１）では、グルコースについては１０　ｎＡの応答、アスコルベー トについては５０　ｎＡの応答、グルタチオンについては７．３ｎＡの応答、酵 母培地についてはｌ　３ｎＡの応答が測定された。これがら、溶液中のアスコル ベートによる妨害シグナルは、グルコースシグナルに比べて約５倍大きいことが わかる。置換ビロールで被覆した本発明のバイオセンサー（２）では、グルコー スについては２１０　ｎＡの応答、アスコルベートについてば１４　ｎＡの応答 、酵母培地については２．３ｎＡの応答、グルタチオンについでは１．７ｎＡの 応答が測定された。すなわち、本発明のバイオセンサー（２）では、グルコース について約１０倍高い応答が得られだのみでなく、グルコースのシグナル以外の 他の、測定を妨害する化合物のすべてのシグナルは著しく低下し、しだがって、 置換ビロールで被覆しだバイオセンサー（２）によれば、グルコース含量の極め て正確な測定が可能になる。

Ｆｉｇ、１ Ｆｉｇ、２ 補正書の翻訳文提出書　く特許法第１８４紳８）祖４年４月３０日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．酵素によつて変換可能な物質たとえばグルコースを、不活性担体上に配置し た電極およびポリピロール層上に固定化したオキシダーゼたとえばグルコースオ キシダーゼ（ＧＯＤ）によつて選択的に定量するバイオセンサーにおして、ポリ マー層はその少なくとも１層にＮ−または３−置換ポリピロールからの透過選択 性、多孔性層を含有し、置換基は酸化還元活性および必要に応じてポリピロール 層に対する伝導性が実質的に低下するように選択することき特徴とするバイオセ ンサー ２．Ｎ−および／または３−置換ポリピロールからの多孔性の電気的に完全に絶 縁された間層を配置する「請求項１」に記載のバイオセンサー３．電極上に置換 ポリピロールからのホモポリマーおよびコポリマーを少なくとも２層にして搭載 する「請求項１または２」に記載のバイオセンサー４．カルボキシ置換ポリピロ ールを搭載する「請求項１〜３」に記載のバイオセンサー ５．固定化酵素が透過選択性の膜で被覆されている「請求項１〜４」に記載のバ イオセンサー ６．少なくとも１種の重合すべきピロールを、酸化剤とくに臭素を補助的に用い て、１・１０−５〜０．１ミリバール、−４０〜＋２０℃の温度において、電極 が配置された担体上に沈殿させことを特徴とする「請求項１〜５」に記載のバイ オセンサーの製造方法 ７．Ｎ−および／または３−置換モノマーを電極が配置された担体上に電気化学 的に沈殿させるここを特徴とする「請求項１〜５」に記載のバイオセンサーの製 造方法 ８．置換ピロールの製造は、ピロールを、式Ｒ×（式中、Ｒは【配列があります 】 を意味し、Ｘは■Ｃｌ，Ｂｒ，ｌまたはトシルから選ばれる離脱基を意味する） で表される化合物と、相間移動触媒および／またはクラウンエーテルこともに、 強塩基たとえばＮａＯＨまたはＫＯＨの存在下に反応させることによって実施す る「請求項７」に記載の方法 ９．相間移動触媒としては、式［Ｎ（Ｒ）４］ｎＸ（式中、ｎは１または２き意 味し、置換基Ｒは同種もしくは互いに異種であって、炭素原子１〜２０信を有す る直鎖状または分岐状のアルキル基を意味し、×はＦ，Ｃｌ，Ｂｒ、ｌ，ＣｌＯ ４，ＢＦ４，ＰＦ６，ＳＯ４またはＳＯ３意味する）で表されるテトラアルキル アンモニウム塩を使用する「請求項８」に記載の方法１０．置換ビロールの製造 には、置換または非置換のγ−アミノカルボン酸、アミノ酸または５個までのモ ノマー単位を有するペプチドを、酸性溶液中ジメトキシテトラヒドロフランと反 応させる「請求項７」に記載の方法１１．置換または非置換のアミノカルボン酸 には、酸化還元活性を低下させる置換基こしてＢ−アミノプロピオン酸、γ−ア ミノ酪酸、γ−アミノ吉草酸、ε−アミノカプロン酸、ω−アミノウンデカン酸 、アミノ安息香酸、Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒおよび／もしくはメチル置換基で置換された アミノカルボン酸、とくに、３−アミノ−３−メチルプロパン酸、２−フルオ口 アミノ酢酸、２−フ口モアミノ酢酸、γ−アミノ−２−クロロ酪酸、γ−アミノ −２−フルオ口酪酸、γ−アミノ−２−ブロモ酪酸、γ−アミノ−２，２−ジメ チル酪酸、γ−アミノ−２−クロロ−２−メチル酪酸、１−アミノ−１，３−プ ロピルジカルボン酸、γ−アミノ−３−メチル酪酸を使用する「請求項１０」に 記載の方法 １２．アミノ酸には、酸化還元活性を低下させる置換基こしてクリシン、アラニ ン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フエニルアラニン、プロリン、リジン、 セリン、システインおよびアルギニン、ならびにこれらのアミノ酸の誘導体を使 用する「請求項１０」に記載の方法 １３．同種または異種のアミノ酸の縮合によって得られる５個までのモノマー単 位を有するペプチドには、酸化還元活性を低下させる置換基こしてとくにアラニ ルアラニン、グリシルグリシン、アラニルクリシン、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ， Ｇｌｙ−Ａｌａ−ＧｌｙおよびＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ、ならびにこれらのペプ チドの誘導体を使用する「請求項１０」に記載の方法 １４必要に応じて、酸化還元活性を低下させるための置換基こして、ＳＯ３Ｈ− ，Ｂｒ−，ピロール、３−メチルビリジンまたはニコチンアミドで置換された２ −ブテンによって置換されたピロールを使用する「請求項１０」に記載の方法１ ５．以下の置換ピロール ２−（１−ピロロ）−アセチルクリシン１−ドテシルビロ−ル １−（４カルボキシベンジル）−ピロール１−（４−ニトロフェニル）−ピロー ル１−（４−中カルボキシフェニル）−ピロール３−カ月ボキシ−４−メチルピ ロール １−ｏ−トシルピロール １−ｐ−トシルピロール １−ベンソールスルホニリピロール ４−（３−ピロロ）−４−ヒドロキシ酪酸４−（３−ピロロ）−４−ケト酪酸 ３−［（ヒドロキシ４−ニトロフェニル）メチル］ピロール３−［（ケト４−ニ トロフエニル）メチル］ピロールをホモポリマー層として担体上に沈殿させる「 請求項６または７」に記載の方法１６．少なくとも２つの連続した層として電気 化学的沈殿を生じさせ、この場合、少なくこも−方の層の形成は置換ピロールの ホモポリマーの沈殿によつて行われる「請求項７〜１５」に記載の方法 １７．電気化学的沈殿はサイクリツクボルタンメトリーを使用して行う「請求項 ７〜１６」に記載の方法 １８．サイクリックボルタンメトリーは５０〜２００ｍＶ−１の電圧変化、好ま しくは約１００ｍＶｓ−１で操作する「請求項７〜１７」に記載の方法１９．サ イクリックボルタンメトリーは−５００ｍＶ〜＋１８００ｍＶの電圧範囲で行わ れる「請求項７〜１８」に記載の方法発明の詳細な説明