JPH05501351A

JPH05501351A - プロホルモンタンパク質に対する開裂部位阻止抗体及びその使用

Info

Publication number: JPH05501351A
Application number: JP2511902A
Authority: JP
Inventors: クリーグラー，マイケル; ペレツ，カール
Original assignee: カイロン　コーポレイション
Priority date: 1989-08-16
Filing date: 1990-08-13
Publication date: 1993-03-18
Also published as: WO1991002756A1; US5686259A; ATE189682T1; AU6276590A; EP0487610A1; DE69033457T2; AU641178B2; US5702705A; US5677182A; CA2023250A1; EP0487610B1; DE69033457D1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は免疫学／生化学の分野にあり、そしてプロホルモンに結合しよってタンパク質加水分解酵素で開裂される特異的部位を阻止することによってプロホルモン前駆体から成熟タンパク質ホルモンが生成することを妨害する抗体、好ましくはモノクローナル抗体の開発を示すものである。該抗体は、成熟ホルモン濃度の上昇を伴う疾患、とりわけ敗血症やＡＩＤＳを処置するための診断、予防及び治療用途を有するものである。

腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は細胞溶解性及び細胞増殖抑制性の抗腫瘍活性を有することが知られているサイトカインである。Ｃａｒｓｗｅｌ　１．　ｅｔ炎症性カスケードにおける媒介物質であり、敗血症において重要な役割を演じていることが最近示された。Ｂｅｕｔｌｅｒ、ｅｔ　ａｌ、（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２９　：８６９は、ネズミのモデルにおいて、エンドトキシンの致死効果がポリクローナルウサギ抗ネズミＴＮＦ抗体によって低減されうろことを報告している。米国では、単一の院内菌血症が約１９４．０００人の患者に発生し、そのうち約７５．０００人が死亡した。Ｍａｋ　ｉ　。

Ｄ、Ｇ、、１９８１．Ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌ　Ｉｎｆｅｃｔ、、（Ｄｉｋｓｏｎ、Ｒ，Ｅ、、Ｅｄ、）、１８３頁、ＹｒｋｅＭｅｄｉｃａｌ　Ｂｏｏｋｓ、ＵＳＡ。これらのほとんどの死因は６種類の主要なグラム陰性バチルスによるものであり、そしてそれらは緑膿菌、大腸菌、プロテウス属、クレブシェラ属、エンテロバクタ−属及びセラチア嘱である。菌血庁：こ対する現在の処置は抗生物質の通用であるか、不幸にもその効能は限られている。

菌皿痛の正確な病理については完全：：は解明されていないか、バクテリアエンドトキシン、リボボリサ・・ｌカライド（ＬＰｓＩか主要な原因物質であることが知られている。ＬＰＳは少なくとも三つの重要な抗原領域、すなわち脂質Ａ、コアポリサッカライド、及び〇−−異的ポリサッカライドから成る。１麦者はまた、Ｏ−特異的鎖または単に〇−抗原とも称される。〇−特特異的領領域ポリサッカライド繰り返し単位からなる長鎖ポリサッカライドである。ポリサッカライド単位の数はバクテリア種の違いによって異なり、１〜６ないし７Ｉ［のモノサッカライド単位にわたり変化しつる。〇−特異的鎖はグラム陰性バクテリアの違いによって変化するが、脂質Ａ及びコアポリサッカライドは同一ではなくても類似している。

ＬＰＳが敗血症において重要な役割を演じているので、その活性を打ち消すための様々な方法が追求されている。現在では、ＬＰＳに対する抗体が標準的な抗生物質治療に対する重要な臨床的手助けにまもなくなるであろうことを暗示する研究がかなり行われている。

ＬＰＳは結果的に患者の死亡を引き起こす生化学的事象のカスケードを開始する。ＬＰＳ導入後の第二事象は、マクロファージ細胞のＬＰＳ刺激の結果として腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が産生されることであると広く考えられている。こうして、ＴＮＦの中和抗体、または敗血症効果を阻害しつる池の分子を生産するためにかなりの努力が払われている。ＴＮＦの抗体は貴重な臨床用途を有するようである。Ｔｒａｃｅｙ、ｅｔ　ａｌ、、１９８７．Ｎａｔｕｒｅ、　１１旦：　６６２゜ＴＮＦは膜結合形及び可溶性分泌形の両方で存在することが示されている。

Ｄｅｃｋｅｒ、ｅｔ　ａｌ、、１９８７．Ｊ、ｏｆ−工ｍｍｕｎｏユニ、よ１旦：９５７；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、ｅｔ　ａｌ、、１９８８　Ｃｅ上１，５３：４５゜ヒトＴＮＦ’がクローニングされ、１７ｋＤポリペプチドと異常に長い７６アミノ酸の推定シグナルリーダー配列とから成ることが示されている。この１７ｋＤ分子が１敗血症の原因となる生化学的カスケードを開始させること：；含まれる重要な物質である。Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、ｅｊ　ａｌ、、１９８８．　Ｃｅ上上、　ｌ１：４５によって、ＴＮＦは膜結合２ＳｋＤ形と１７ｋＤ種に相当する可溶性形との両方で存在しうることが提唱された。この２６ｋＤ形は成熟１７ｋＤ分子の前駆体またはプロホルモンである。このＴＮＦの１７ｋＤ形が敗血症を引き起こす際に中心的役割を演じる。上述のＫｒｉｅｇｌｅｒ、ｅｔ　ａｌ、は、ＴＮＦの二つの形が異なる生物学的効果をもちつると提唱しているが、それらが何であるかについては言及されていない。

ＴＮＦは、敗血症において重要な役割を演じる池に、潜伏ウィルスを保有するヒト細胞におけるヒト免疫不全ウィルスの発現を開始することに関係していることが最近示された。ＦＯｌｋｓ、　旦ニー」」ユ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１．Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、ｖｏｌ、８６．ｐ、２３６５　（１９８９１，こうして、ＴＮＦの２６ｋＤ前駆体から１７ｋＤまたはそれ以下の分子量形のＴＮＦの生成を妨害あるいは抑制することが、潜伏ウィルスを保有するＡＩＤＳ患者をそのウィルスの発現を妨害することによって治す効果的な方法であろう。

ＴＮＦは病気の発生に係わっているので、その作用に対するインヒビターが熱心にめられている。上述の抗ＴＮＦ抗体の池に、ＴＮＦ阻害活性を有する池の１１によって記述されている。それは熱病患者の尿中に存在するが、不幸にも、臨床的に有用であるところまでには精製及び特性付けられていない。

ＴＮＦの免疫病原特性は、患者血清中の生物学的活性な１７ｋＤＴＮＦの正確なモニターを望ましいものとする。現在は、マウス欅維芽細胞を使用するかまたは１７ｋＤ種に直接の抗体を用いるがする面倒なｉｎ　ｖｉｔｒｏ細胞毒性検定によってｘ７ｋＤＴＮＦを測定している。１７ｋＤ分子は２６ｋＤＴＮＦから派生するので、患者の病気経過により有益で且つ予言的であるのは２６ｋＤＴＮＦと１７ｋＤ形との比率であろう。現在のところ、２６ｋＤ分子について信頼性ある検定法かない。

本発明の第一の目的は、ホルモ〕・を生じる開裂部位にプロテアーゼが接近するのを直接的または間接的に立体的に妨害するプロホルモン上の領域に結合することによって、プロホルモン前駆体からホルモンが生成する速度を低減または妨害するポリクローナル及びモノクローナルの両方の抗体について記述することである。

本発明の第二の目的は、タンパク質加水分解を受けて低分子量形ＴＮＦを生じる２６ｋＤ分子上のエピトープに結合しよってその部位でのタンパク質加水分解を阻止することによって、２６ｋＤプロホルモン前駆体から低分子量形ＴＮＦが生成する速度を直接的に低減または妨害するポリクローナルまたはモノクローナルの抗体について記述することである。

本発明の第三の目的は、２６ｋＤプロホルモン上の開裂部位から離れているエピトープに結合しよってその部位におけるタンパク質加水分解を立体障害により阻止することによって、２６ｋＤプロホルモン前駆体から低分子量形ＴＮＦが生成する速度を間接的に低減または妨害するポリクローナルまたはモノクローナル抗体について記述することである。

本発明の第四の目的は、流体試料、例えば血液中の１７ｋＤ及び２６ｋＤＴＮＦの両方を測定する免疫検定法について記述することである。好ましい実施態様では、該抗体が中和し、こうして試料中の生物学的活性なＴＮＦの瀾定決を提供する。

本発明のこれら及び池の目的については、以下の本発明の記述を考慮するとよｌ）完全に理解される。

本発明は、プロホルモ；前駆体からホルモンか生成することを低減または妨害するブロホルモニ抗体、好ましくは高親和性ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を生産することに広く関する。本発明はまた、寄生疾患の処置に並び１：免疫検定：：おいて該抗体を利用すること；＝も関する。いくつかの特許／′持許出噸及びｆ４学文献を以Ｆ：；参照する。本発明はこれらの参照文献に示された材料及び方法にたよるので、参照としてすべての参照文献をそれらの全体として取り込むつもりである。

本発明をより正確に規定するため、本明細書では、該技術分野における使用に一般に一致する以下の定義に従って特定の語句を用いる。

「プロホルモン」及び「成熟ホルモン」という語句は以下の意味である。プロホルモンは、産生の際に除去されるクンバク質のペプチドセグメントを有する、好ましくは免疫学的起源のタンパク質を包含することを意図する。該ペプチドが除去されると「成熟」形のホルモンが生じる。本発明の好ましい実施態様は、以下に詳細に記述するよう：二、１７ｋＤ成熟形におもに開裂される２６ｋＤＴＮＦプロホルモンである。しかしながら、池の開裂生成物もまたプロホルモンから生成し、そしてこれらも「成熟」ホルモンを意味する範囲内にあると意図される。

最後に、ＴＮＦ以外のプロホルモンがこれらの定義の範囲内に入り、そして本発明の一部分としてみなされることに着目することが重要である。プロホルモンの例としてＣ３Ｆｓや［１−１が挙げられる。

「モノクローナル抗体」とは、単一抗体産生細胞の有糸分裂由来の純系個体群くまたはクローン）によって産生された抗体組成物を意味する。モノクローナル抗体組成物は、それが純系個体群の細胞２：よって産生されない抗体を実質的に含まない場合には、「池の抗体を実質的に含まない」。「実質的に含まない」という語句は、汚染抗体が組成物中：二約５重量％以下であることを意味する。

「開裂部位阻止抗体」とは、ＴＮＦブロホルモニ：こ結合し、そして該プロホルモンか低分子量フラグメント２；開裂されるのを妨害または抑制する抗体を意味する。結合は開裂部位においてでもそこから離れていてでもよい。

「抗体産生細胞系」は、多世代：：わたり１ｎｖｉｔｒ　で安定成長可能な単一抗体産生細胞の有糸分裂由来の純系個体群またはクローンである。

本明細書で用いる「腫瘍壊死因子」またはｒＴＮＦ、は、周知の哺乳類のサイトカインの組み換え形または天然形の両方を意味する。ＴＮＦは文献において、「カケクチン（Ｃａｃｈｓｃｔｉｎ）　ＪやｒＴＮＦ−ａ」を含む池の名称で呼ばれている。

「組み換えＴＮＦＪまたはｒｒＴＮＦ」は、天然形ＴＮＦ（またはその部分）と同じまたは実質的に同じアミノ酸配列をもち、そしてｉｎ　ｖｉｔｒｏ及び１ｎｖ１ｖＯの両方においてＴＮＦの生物学的活性を維持する組み換えＤＮＡを発現することによって産生された、ミューティン＋１ｕｔａｉｎ）を含むタンパク質を意味する。ヒトＴＮＦを含む天然及び組み換えの両方の哺乳類ＴＮＦの産生及び単離については、該技術分野において公知である。例えば、Ｃａｒｓｗｅｌｌ、ｅｔ　ａｌ、　（１９７５）　Ｐｒ０Ｃ１Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡヱｉ：３６６６−３６７０；Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ、ｅｔ　ａｌ、（１９８３）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　１旦：　５３９７−５４０１；Ｗａｎｇ、ｅｔ　ａｌ、（１９８５＋　５ｃｉｅｎｃｅ　２２８：１４９−１５４；Ｂｅｕｔｌｅｒ、ｅｔ　ａｌ、＋１９８５）　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１炙１＝９８４；Ｂｅｕｔｌｅｒ、ｅｔ、ａｌ、（１９８５＋　５ｃｉｅｎｃｅ　２ＪＡｉ：８６９；Ｂｅ１ｔｌｅｒ、ｅｔ　ａｌ、（１９８５１Ｎａｔｕｒｅ　３１６−：５５２；Ｐｅｎｎ１ｃｉａ、ｅｔ　ａｌ、＋１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　４上２ニア２４；Ａｇｇａｒｗａｌ、ｅｔ　ａｌ、（１９８５）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、λ旦旦：　２３４５を参照されたい。

本明細書で用いられるように、約２６，０００の分子量を有するＴ　Ｎ　Ｆはプロホルモン形のｒＮＦを意味する。プロホルモンのアミン末端ペプチドの長さがそれが由来する種］こ依存して変化し、一方分子のプロペプチドセグメントが高度：：保存されていることは知られている。本当に、マウスにおいては、プロホルモンの推定リーダー配列を構成する７９Ｉ１１のアミノ酸の約８６％が、ヒトＴＮＦのプロ配列を含んて成る７６＠の既知アミノ酸と同一である。このように、以下で約２６．０００の分子量を有するＴＮＦを指す場合には、特定の種から由来したものではなく、該技術分野において周知のようにヒトの配列と比較して若干異なるリーダー配列を有しうる分子を意味していることは当業者シ：は理解される。

ここで敗血痛とは、バクテリアの感染の結果生じる、バクテリアエンドトキシン、リポポリサッカライド（ＬＰ’３１による疾患を意味するものと定義される。

それは少なくとも６種類の主要なグラム陰性バチルスにより誘発されつるものであり、そしてそれは緑膿菌、大腸菌、プロテウス属、クレブシェラ属、エンテロバクタ−属、及びセラチア属である。ＴＮＦは該疾患の早い段階に寄与する一つの因子であり、より詳細には、該分子の１７ｋＤ形または該技術分野で周知のより小さいミューティンがおもな活性種である。

「コンハターセ′」またはｒＴＮＦコンハターゼ」という語句は、２６ｋＤＴＮＦを一つ以上の低分子量種へタンパク質加水分解的に開裂する原因である、体内に通常存在する酵素を包含することを意味する。コンバターゼは実質的に膜組込み形であるが、重要な活性はサイトツルに位置している。

ＴＮＦコンバターゼに適用された「膜組込み形」という語句は、３０，０００ｘｇベレット画分においてコンハクーゼ活性のほとんどが存在することによって示されるように、実質的に不溶性であるコンハターゼ形を意味する。

「組み換え抗体」とは、Ｈｌｌ及びＬｗＡの各アミノ酸配列の一部が、特定の種に由来するあるいは特定のクラス：二属する抗体における対応する配９りと相同性であり、一方該鎖の残るセグメントが他における対応する配シ１１と相同性である、そのような抗体を意味する。最も通常：こは１組み換え抗体においては、Ｌｌｌ及びＨｌｌの両Ｈの可変領域か哺乳類の一つの種に由来する抗体の可変領域を反映し、一方一定領域は池：：由来する抗体の配列と相同性である。

結合阻害検定：：おいて二種の抗体か互いに池Ｈの抗体を２１３率よく阻止する場合、この二種の抗体は「交差阻止」である、または「共有エピトープ」を有する。こうして、抗体Ａ及びＢが交差阻止である場合：こは、抗原を抗体Ｂと予ｔａイシキユベーションした場合抗体Ａはその抗原とは結合せず、そして抗原を抗体Ａと予備インキュベーションした場合抗体Ｂはその抗原とは結合しない。

本明細書で用いられる、抗体のそのエピトープへの「結合親和性」または「Ｋａ」という語句は、式Ｋａ　＝８／３　（ｒ　ｔ−Ｔｔ、　）　（式中、Ｉｔは５０％トレーサーにおけるインヒビター取り込みの全モｌ内１度であり、Ｔｔはトレーサーの全モル濃度である）による標準的方法に従い計算された結合親和性を意味する。＼（ｕｌｌｅｒ、（１９８０１Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　３４：３４５−３５２を参照されたい。

本明細書で用いられるように、「インキュベーション」という語句は、抗原／抗体複合体を生成させる条件（例えば適当なｐＨ５温度、時間、培地など）のもとて抗体と抗原とを接触させることを意味する。また本明細書で用いられるように、「分離」とは、組成物中の結合していない抗原または抗体がいずれも除去され且つ支持体上の抗原／抗体複合体がいずれもそのまま残るように、試験支持体または固定化抗体から組成物を分離する方法、通常は洗浄を意味する。適当なインキュベーション及び分離技法の選択は該技術分野の範囲内にある。

１、、　２６ｋＤ好ましい実施態様において、２６ｋＤＴＮＦで免疫した哺乳動物から抗ＴＮＦ抗体産生免疫細胞を単離し、不死化して抗体分泌ハイプリドーマ細胞系を生ゼしぬる。低分子量形ＴＮＦへ分子か開裂されるのを妨害または防止する抗２６ｋＤｒＮＦを分泌・する細胞系は、２６ｋＤ分子を開裂するコシハターゼの存在における所望の抗体について培養上清を検定することによって同定できる。こうして、本発明は二つの部分にわけることかでき、各部分（二ついて別７：二記述する。

Ａ、６ｋＤＴＮＦ　：２６ｋＤ分子の開裂部位を阻止する抗体は、２６ｋＤ分子を発現する細胞、組織などを免疫原として用いて産生することができる。例として、２６ｋＤＴＮＦを発現させる技術において知られている生物学的因子１例えばＫｒｉｅｇｌｅｒ。

ｅｔ　ａｌ、、１９８８　Ｃｅ１ｌ、５旦：４５に記載されている刺激化単核細胞、白血球、または白血球起源の細胞系が含まれる。細胞系を培養する方法と同種に、単核細胞を単離する手順は該技術分野においてよく知られている。

第二の、好ましい方法は、コンハターゼによって認識される、以降ＴＮＦペプチドと称するペプチドを合成し、これらを免疫原として使用することである。抗体をペプチドにする方法は該技術分野においてよく知られており、そして一般にペプチドを適当な担体分子、例えば血清アルブミンに結合させることが必要である。好ましいペプチドは、Ｇｉｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−５ｅｒ−３ｅｒ−５ｅｒ＋Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−５ｅｒ−３ｅｒ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｉｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−３ｅｒ−５ｅｒ−３ｅｒ　− Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ− Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ、Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ａｓｐ− Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ、及びＰｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇ、Ｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−５ｅｒ−８ｅｒ−９ｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏである。該ペプチドは該技術分野において公知の方法、例えば５ｃｉｅｎｃｅ、２３２：３４１−３４７　（１９８５）に記載されているＭ　ｅ　ｒｒ　ｌ　ｆ　１　ｅ　１　ｄ固相法によって調製することができる。該手順は市販の合成装置、例えばフロックされたアミノ基の開裂かフッ化水素で達成されるＢｉｏｓｅａｒｃｈ　９５ｔ）Ｏ自動ペプチド合成機を利用することができ、そしてペプチドは、１５−２０μｎａ　Ｖｙｄａｃ　Ｃ４ＰｒｅｐＰＡＫカラムを使用するＷａｔｅｒｓ　Ｄｅｌｔ、ａ　Ｐｒｅｐ　３０００調製用ＨＰＬＣによって精製される。

２６ｋＤＴＮＦを得ることができる第三の方法は、２６ｋＤ分子の±ｎ　ｖｉｔｒｏでの転写／翻訳である。２６ｋＤ分子はプラスミドＢｌｌに存在するＤＮＡ配列によってコードされている。このことはＣｅｔｕｓの同時係属特許出願の、１９８６年１１月１２日発行の欧州特許公報第２００７４８号並びに米国特許第４．６７７．０６３号及び同第４，６７７．０６４号に記載されている。該配列はＰｓｔＩ消化によりｐＢｌｌから取り出され、適当なベクターにクローニングされ、そして該技術分野において公知の材料及び方法を用いて転写／翻訳される。

例えば、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−ａＰｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｂ、Ｄ、Ｈａｍｅｓ　ａｎｄ　Ｓ、Ｈｉｇｇｉｎｓ）ＩＲＩ　ｐｒｅｓｓ、１９８４；Ｍｅｌｔｏｎ、Ｄ、Ａ、ｅｔａｌ、、（１９８４）Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１２，７０３５；及びＰｅｌｈａｍ　ａｎｄ　Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、６ヱ。

ｐ、２４７を参照されたい。転写生成物の２６ｋＤＴＮＦは免疫原として使用できる。しかしながら、１■　ｖｉｔｒｏの転写／翻訳では少量の生成物しか得られないので、そのように帰られた材料は１旦　ヱ１１Ｌ旦免疫法におもに用いられる。

別の方法は、２６ｋＤ分子をコードするＤ　Ｎ　Ａ配列で細胞を形質転換し、そして免疫原としての該分子またはそれから単離された２６ｋＤＴＮＦを発現する形質転換細胞を用いることである。この方法は、ｐＢｌ　１のＤＮＡ配列を適当なベクター例えばプラスミドｐＦＶＸＭに挿入することによって好ましくは達成される、該ｐＦＶＸＭはＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに寄託されており、その受託番号は第６７．１０３号である。ｐＦＶＸＭは、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、ｅｔ　ａ土、、１９８４．Ｃｅ１ｌ、３Ｆ３：４８３に記載されているプラスミドｐＥＶＸ由来のレトロウィルスベクや−である。ｐＥＶＸはＭｏ１ｏｎｅｙネズミ白血病ウイルス由来のスプライスドナ一部位３゛〜５′末端長反復体を有する。このスプライスドナー配列が、レトロウィルス構造の正しくスプライシングされた翻訳鋳型の収率を減少させることが以前から示されている。こうして、ｐＥＶＸを加工してスプライスドナ一部位を除去し、そしてＭｏ１ｏｎｅｙネズミ白血病ウイルスのスプライスドナー配列を欠如しているＨａｒｖｅｙネズミ肉腫ウィルスゲノムの類似のＳｍａ　Ｉフラグメントで置換した。得られたベクターｐＦＶＸＭはＭｏ１ｏｎｅｙネズミ白血病ウイルスのスプライスドナー配列を欠如しており、ウィルスパッケージング配列を担持している。ｐＦＶＸＭは、２６ｋＤＴＮＦ種をコードするＤＮＡ配列を挿入できる便利なＰｓｔ　Ｉ部位をもっている。

こうして、ｐＦＶＸＭまたは他の適当なベクターは、ＴＮＦを発現する感染細胞の選択を容易にする選択マーカーとともに、適当な細胞種へトランスフェクションされる。マーカーは第二のベクター例えばｐＥＶＸ−ｎｅｏによって導入することができる。ｐＥＶＸ−ｎｅｏはＫｒｉｅｇｌｅｒ、ｅｔ　Ｂ１．．１９８４、　Ｑ旦１１，３８：　４８３に記載されている。トランスフェクションは該技術分野において公知の方法によって、あるいはＷｉｇｌｅｒ、ｅｔ　ａよ、、１９７８、Ω旦よよ、１４ニア２５のリン酸カルシウム法の変法を使用することによって行うことができる。ＴＮＦ発現細胞は、Ｇｉｂｃｏより入手したＧ４１８を適当な濃度で供給した培地で選択される。ＴＮＦ活性を発現するＧ４１８耐性コロニーを同定する効率的方法は、Ｌ９２９細胞を用いる溶解検定を行うことである。この検定法は米国特許第４，６７７．０６４号明細書に詳細に記載されている。

８、　６ｋＤＮ　：２６ｋＤＴＮＦの抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもどちらでもよい。抗体は、非ヒト抗体でも十分な性能をもつが、ヒトのまたはヒト化したものが好ましい。

モノクローナル抗体は、上述のＴＮＦＮジペプチド群プチド複合体または２６ｋＤＴＮＦ、及びＫｏｈｌｅｒ、Ｇ、ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｃ，，１９７５、Ｎ３」−ＬＬ」−、ｚ１旦：４９５に記載されている手順または該技術分野において公知のその変法を用いて産生させることができる。２６ｋＤＴＮＦを免疫原として使用した場合に、免疫応答が２６ｋＤＴＮＦに特異的に結合しているエピトープのみならず、成熟形または１７ｋＤ種にも達することに注意することが重　・要である。以下に記載するスクリーニング検定を用いて、免疫原として２６ｋＤＴＮＦを使用して産生させた抗体の特異性が識別できる。しかしながら、２６ｋＤＴＮＦを使用するこの固有の制限のため、好ましい免疫原はＴＮＦペプチド複合体である。

先のＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎの初期の仕事には、ネズミリンパ球と薬物選択性形質細胞とを融合してハイブリドーマを調製することが含まれた。続いて、ヒトモノクローナル抗体を分泌させるハイブリドーマ細胞系を産生ずるための技法を適用した。後者の手順は、Ａｂｒａ、ｍｓ、Ｐ、、１９８６．社旦工五ｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎ　ｍｏｌ　、１２１：　１０７に一般に記載されているが、池の変法は当業者には周知である。産生されるものがネズミ抗体であるかヒト抗体であるかにかかわらず、抗体分泌細胞は融合パートナ−と組み合わされ、そして細胞は適当な融合剤、好ましくはポリエチレングリコール、より好ましくはポリエチレングリコール１０００を用いて融合される。後者は、抗体分泌細胞及び融合パートナ−を含有する細胞ペレット：ミ穏やかな撹はんを伴い短期間で少量で加えられる。融合剤１り加佳、細胞混合物を洗浄して融合剤及びすべての細胞破片を除去し、そして融合及び未融合細胞から成る＃ａ抱抱合合物、選択増殖培地を含有する適当な細胞培養室（こ散布する。数週間後ハイフリット細胞か現れ、抗体産生に関して同定され、そしてサブクロー二ニクされて安定なハイフ゛リント細胞系の利用可能性を確実：こすることがてきる。

好ましい抗体は、よ旦　ｖｉｖ（＋または１旦　ｖｉｔ、ｒｏのとちらかて２６ｋＤ　Ｔ　Ｎ　Ｆて増感されたリンパ球から、抗体産生バイア１ル、Ｉド細胞系の不死化によって調製できるヒトモノクローナル抗体であり、よって所望の抗体源を永久に利用できる。１旦　ヱよヱ旦免疫化法は該技術分野；；おいて公知であるが、上旦ｖｉｔｒｏ法はＬｕｂｅｎ、Ｒ，ａｎｄ　Ｍｏｈｌｅｒ、Ｍ、、１９８０．Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｏｎｏｌｏ　、上ユニ６３５、Ｒｅａｄｉｎｇ、Ｃ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｆｌ又ｘ−ｍｏ上！ＩＪＬ１．１ｌ士（Ｐａｒｔ　０ｎｅ）：１８、またはＶｏｓｓ、Ｂ、、１９８６．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍ。

１旦にヱ、ユニユニ２７に一般的に記載されている。いくつかのｉｎ　ｖｉｔｒ立免疫化法がとトＢ細胞の増感に有効であることが示されている。Ｒｅａｄｉｎｇ、Ｃ，，１９８２，正工立１−エエ皿旦ユニＭ旦１ｈ旦亘盈、旦旦：２６１゜２６ｋＤＴＮＦで直接的に個体を免疫化する代わりに、敗血症の攻撃を受けているまたは既に受けた個体からリンパ球を単離できることは、当業者には明らかである。これらのリンパ球の画分は２６ｋＤＴＮＦｌ：！！Ｊ受性であり、そして永久抗体分泌ハイブリッド細胞系を調製するのに使用できる。例えば、免疫無防備状態のヒト患者、特に各種の悪性疾患やひどい火傷に苦しむ患者はバクテリア感染を一般に受け易く、それから単離されたリンパ球は抗体分泌細胞源になりつる。

増感リンパ球はウィルス形質転換によって不死化できる。ヒトリンパ球に対する好ましいウィルス形質転換技法はエプスタイン−バーウィルスの使用を含む。

該ウィルスはヒトＢ細胞を形質転換でき、ヒトモノクローナル抗体を調製するのに使用されている。Ｃｒａｗｆｏｒｄ、Ｄ、ｅｔ　塁」２．．１９８３．止一旦ヱＧｅｎｅｒａ１．　Ｖｉｒｏｌｏ　、６４：６９７；［（ｏｚｂｏｒ、Ｖ、ａｎｄ　Ｒｏｄｅｒ、Ｊ、、１［８３，Ｊ、±ｍｍｕｎ　Ｔｏｄａ　、４ニア２゜増感リンパ球を不死化できる別の手頃は、上述の二つの技法の組合せ、すなわちウィルス形質転換及び細胞融合から成る。好ましい組合せは、抗体分泌細胞をエプスタイン−バーウィルスで形質転換し、次いで形質転換細胞と適当な融合パートナ−とを融合することから成る。融合パートナ−はマウスミエローマ細胞系、ヘテロミエローマ系、もしくはヒトミエローマ系、または池の不死化細胞系であることができる。ＰＣＴ持許出願第８１／’００９５７号；Ｓｃｈｌｏｍ、ｑ工１よ、、１９８０．２ＸΔ旦一旦旦Ａ、ヱユ：６８４１；Ｃｒｏｃｅ、　旦１　ａよ、、１９８０．Ｎａｔｕｒｅ、２８８：　４８８゜好ましい融合パートナ〜はマウス−ヒトへテロハイブリッドであり、より好ましくはＦ３Ｂ６で識別される細胞系である。この細胞系はＡＴＣＣに寄託されており、受託番号は第ＨＢ８７８５号である。これは１９８５年４月１８日に寄託された。Ｆ３Ｂ６を調製する手順は欧州特許出願公報第１７４，２０４号明細書に記述されている。

エプスタイン−バーウィルス形質転換の使用及び不死化抗体分泌細胞系の調製に適用可能な技法は、Ｒｏｄｅｒ、Ｊ、ｅｔ　、Ｌｌ、、１９８６．　ｋ旦１且旦亘ｓ　ｉｎ　ｎｚ　ｍｏｌｏ　、１λよ＝１４０に示されている。基本的には、該手順は、適当な源、−ａ的には感染細胞系からエプスタイン−バーウィルスを単離する工程、及び該ウィルスを含有する上溝に目的の抗体分泌細胞を暴露する工程から成る。その細胞を洗浄し、適当な細胞培地において培養する。続いて、細胞培養に存在するウィルス形質転換細胞は、エプスタイン−バーウィルス値抗原の存在によって同定でき、そして形質転換された抗体分泌細胞は該技術分野において公知の標準的方法を用いて同定できる。

本発明の好ましい実施態様は、単独でまたは組合せで抗コンバターゼモノクロ− ナル抗体を中和する一方、該抗体は変化しうり、そして生物学的活性をなおも維持する。こうして本発明の範囲内には、様々な大きさのフラクメント例えばＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖなどに変化することによって改質された抗体か包含される。また、抗体を産生ずるハイフリソド細胞系は所望の抗体をコードするＤＮＡＪであると考えられ、それを公知の遺伝子工学技法により単離し且つ細胞に転移して遺伝子工学的抗体を産生させることかできる。佳者の例は、本明細書において記載したハイブリトーマの抗体結合部位を有する単鎖抗体の産生である。単鎖抗体は米国特許第４，７０４，６９２号明細書に記載されている。遺伝子工学的抗体の第二の例は、組み換えまたはキメラ抗体である。組み換え抗体の調製方法は、米国特許第４，８１６，５６７号明細書（発明者Ｃａｂｉｌｌｙら）；日本特許出願第８４１６９３７０号明細書（１９８４年８月１５日出願）；英国特許出願第８４２２２３８号明細書（１９８４年９月３日出願）；及び日本特許出願第８５２３９５４３号明細書（１９８５年ｌＯ月２８日出願）に示されている。

さらに、英国特許出願第８６７６７９号明細書（１９８６年３月２７日）は、Ｌ鎖またはＨＩＩｉの可変領域内の相補決定領域（ＣＤＲｓ）の少なくとも一部が、別の特異性抗体からのＣＤＲ５の類似部分によって置換された改変抗体の調製方法を記述している。そこに記述された手順を用いると、ＣＤＲ領域を置換した第二の種から抗体上にグラフト化したある種のＣＤＲＩＩ域を有する組み換え抗体を構築することが可能である。本明細書の好ましい実施態様はヒト抗体のＣＤＲ領域を置換したネズミ抗２６ｋＤＴＮＦ抗体ＣＤＲ１１［域である。

抗体の種類、ポリクローナルかモノクローナルかなどとは無関係に、該技術分野において周知の、またはＳｐｒｉｎｇｅｒ、１９８０．ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｊ、ｅｓ、＋１９４　（Ｋｅｎｎｅｔｔ、Ｔ、ＭｃＫｅａｒｎ　ａｎｄ　Ｋ、Ｂｅｃｈｔｏｌ、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）に記載されている標準技法によって抗体を精製することが望ましい。一般：こ、この技ｌ却よ５０％硫酸アシモニウム溶液を用いて少なくとも一回は抗体を硫酸アンモニウム沈澱させることから成る。抗体アフィニティーカラムを使用することも可能である。

Ｃ，２６ｋＤＴＮＦ　ス　リー１毛シニクじ一分子が低分子量形Ｔ　Ｎ　Ｆ　ｉ二開裂されるのを妨害または防止する抗２６　ｋＤＴＮＦ抗体を分泌する細胞系は、抗体について培養上清、腹水などを検定することによって同定できる。好ましいスクリーニング手順は二つの連続段階から成る。第一に、抗２６ｋＤＴＮＦ抗体を分泌しているハイ７リドーマを同定し、そして第二に、該抗体を検定してそれが開裂部位特異的であるがどうかを決定する。細胞培養上清に適用されたときには、最初のスクリーニング段階はＥＬＩＳＡ検定で行うことが好ましい。ＥＬＩＳＡ検定は、該技術分野において周知であり、２６ｋＤＴＮＦを固体マトリックスに結合させて、この２６ｋＤ分子への結合：こよって抗体の存在を検出することから成る。Ｌａｎｇｏｎｅ、Ｊ、ａｎｄ　ＶａｎＶｉｎａｋｉｓ、Ｈ，、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ　、９２゜Ｐａｒｔ　Ｅ（１９８３）、しかしながら、この方法は２６ｋＤＴＮＦまたは１７ｋＤ種に単独で向けられた抗体を区別できないので、それに代わる第一段階は、ＴＮＦペプチド複合体を固体マトリックスに結合して、該複合体に対してスクリーニングするか、あるいは以下に記載する免疫沈降検定によるポジティブＥＬＩＳＡの結果に従うことである。

２６ｋＤＴＮＦ抗体の別の初期検定は、均質相から２６ｋＤと１７ｋＤとのＴＮＦを別々に免疫沈降できる性能について抗体をスクリーニングすることである。

例えば、スクリーニングすべきモノクローナル抗体を含有する上清を標識した２６ｋＤまたは１７ｋＤＴＮＦで抗原／抗体捏合体を形成させるのに適当な時間インキュベートする。このインキュベーション後、スクリーニングすべきモノクローナル抗体に対する抗ゼノタイブまたは抗アイソタイプ抗体を用いてモノクローナル抗体をインキュベートする。これらの抗ゼノタイブまたは抗アイソタイプ抗体を例えばプラスチックビードに固定化する。例えば、スクリーニングすべきモノクローナル抗体が抗２６ｋＤ’ｒＮＦである場合には、標識２６ｋＤＴＮＦがヒートに結合し、よって免疫沈降する。該物質を標準的技法を用いてビードから解離させ、そして該技術分野；：おいて周知のゲル電気泳動ｉこよって２６ｋＤＴＮＦを同定することかできる。

２６ｋＤ′ｒＮＦ抗体が開裂部位特異的であるかどうかを決定するため、２６ｋＤ分子の低分子量形への変換を妨害または遅延させる抗体性能をモニターする。

この検定は、コンハターゼ活性源と試験すべき抗体とで２６ｋＤＴＮＦをインキュベートすることによって好ましくは行われる。２６ｋＤ分子は、その変換、または場合によっては非変換、かモニターできるように標識される。抗体が、コンハターゼの添加前または添加後に反応混合物に加えられることは当業者には理解できる。添加順序はめる抗体の同定を容易にしつるが、決定的ではない。抗体が阻害活性をもっており、２６ｋＤ分子の開裂を妨害した場合には、溶液の電気泳動分析によって２６ｋＤ種の変換がほとんどまたはまったく無く、それに付随して低分子量ＴＮＦ分子もほとんどまたはまったく無いことが示されつる。

検定を促進するために、いくつかの培養上清を組み合わせて同時に検定することは可能である。混合物が陽性である場合には、次いで各ウェルの培地を独立に検定して開裂部位特異的抗ＴＮＦ抗体を分泌するハイブリドーマを同定することができる。

コンハターゼ活性源として各種の生物学的材料が利用できる。これらには、好ましくは免疫学的起源のもの（しかし必ずしもそうである必要はない）である組織、細胞、もしくは抽出物、またはそれらと結合した流体が含まれる。さらに、確立細胞系もまた利用できる。適当な源には、ヒト末梢血単核細胞例えば白血球または白血球起源の細胞系例えばＨＬ６０細胞系が含まれる。こうして２６ｋＤ１ ’ＮＦ種の１．７　ｋ　Ｄ種への変換は、２６ｋＤ種とＨＬ　６０完全旧胞またはそれ由来の抽出物のどちらかと結合することによって影響されつる。さらに、コノハターゼ活性は部分的に膜結合性であるさめ、利用可能な膜画分を冴ることがてきる。

Ｉｌ、不ムＺヱヱ文イ別の実施態様；二おいて、本発明は、２６ｋＤＴＮＦを検出するのに利用でき、次いで２ＳｋＤ丁ＮＦと１７ｋＤ、またはより低分子量形［ＮＦとの比享を決定するのに利用できるイムノアッセイ法に向けられる。検出可能な１度は、どちらのＴＮＦ形でも約１ｎｇ／ｍ１〜約１μｇ　／　ｍ　１の範囲にある。本発明のイムノアッセイは本明細書で開示した抗体を使用するサンドイッチ検定であることが好ましいが、該技術分野において公知の他の検定様式もまた利用可能である。

本発明のイムノアッセイ法を実施する際には、Ｔ　Ｎ　Ｆの２６ｋＤ形または１７ｋＤ形に向けられた抗’ｒ　Ｎ　Ｆ抗体を固定化し、次いで未知濃度のＴＮＦ分子を含有する試験試料流体とインキュベートする。抗原−抗体複合体を形成させるために適当な期間インキュベートした後、固定化抗体を、標識したモノクローナルまたはポリクローナルのどちらかの第二の抗ＴＮＦ抗体を含有する指示溶液を用いてインキュベートする。この第二の抗ＴＮＦ抗体を固定化抗体と十分な時間インキュベートして、固定化モノクローナル抗体により結合したすべてのＴＮＦと標識した抗体との間に抗原−抗体複合体を形成させる。このインキュベート後、固定化モノクローナル抗体をすべての未結合標識抗体から分離し、そして固定化抗体に結合して残っている標識量を測定する。これは通常、固定化抗体に存在する標識量に関係するシグナルを測定することによって行われる。それゆえ、該シグナルが試験試料流体中のＴＮＦ量の測定値を提供する。

２６ｋＤ及び１７ｋＤ種は、同じ流体中で同時に、あるいは同じ流体の別のアリコートを用いて別々に検定することができる。これらを同時に測定する場合には、２６ｋＤ及び１７ｋＤ抗体は交差阻止してはならず、さらに２６ｋＤ及び１７ｋＤは、検出が交差反応しない第二の抗ｒＮＦ抗体を用いて達成できるようｉ二別種の起瀝のものであることか好ましい。好ましい組合せは、２６ｋＤＴＮＦをマウスモノクローナル抗体で、１７ｋＤＴＮＦをウサギ抗体で測定し、そしてこれらを、それぞれ別々に標識したマウス及びウサギの第二の抗体で検出することである。１７ｋＤウサギＴ＼ト抗体は該技術分野において周知であり、容易：；利用できる。

本発明に用いる抗体は、適当ないずれかのか法シこよって適当ないずれかの試験用固体支持体に固定化することができる。試験用固体支持体は、抗体結合用及び免疫検定用の適当ないずれの不溶性担体材料でもよい。これら材料の多くは該技術分野において公知であり、ニトロセルロース製シートもしくはフィルター；アガロース、樹脂、プラスチック（例、ＰＶＣもしくはポリスチレン）、ラテックス、または金属製のビーズ：プラスチック容器などが含まれるが、これらには限定されない。抗体を固定化する方法の多くは該技術分野において周知である。例えば、Ｓｉ１．ｍａｎ、ｅｔ　ａｌ、（１９６６）Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、３５：８７３；ＭｅｌｒＯ５ｅ　（１９７１）Ｒｅｖ、Ｐｕｒｅ　＆　Ａｐｐ。

Ｃｈｅｍ、２１：８３；Ｃｕａｔ、ｒｅｃａａｓ、ｅｔ　ａｌ、（１９７１）Ｍｅｔ、ｈ、Ｅｎｚｙｍ、、Ｖｏｌ、、２２を参照されたい。このような方法には、共有結合法、直接吸着法、物理的閉じ込め法、及びタンパク質塗布面への結合法が含まれる。渣者の方法では、表面に水不溶性タンパク質、例えばゼイン、コラ−ケン、フィブリノーゲン、ケラチン、グルテリンなどを最初にコーティングする。

このタンパク質塗布面を単に抗体水溶液に接触させ、そしてそれを乾燥させることによって抗体を結合させる。

本発明では、洗浄の際に結合したすべての抗原を維持できるよう：：抗体を十分に固定化し且つ抗体を免疫活性にさせておく、結合技法及び支持体のいずれの組合せでも使用できる。好ましい試験用固体支持体はプラスチックヒートである。

上述のように、本発明の検定は標識した抗ＴＮＦ抗体を使用して、固定化モノクローナル抗体に結合したＴＮＦ量を測定する。標識は、支持体：こ結合した場合に抗体の検出が可能ないずれの種類のものでもよい。一般に、標識は、試料中に存在する！識の量に関連し且つ測定可能なシグナルを直接的：こあるいは間接的に結果として生じる。例えば、直接測定可能な標識：二は放射線標識（例、１２５■、３５Ｓ、１４Ｃなど）が含まれつる。好ましい直接測定可能な標識は、適当な基質（例、西洋ワサビベルオキシダー上１０−フェニレンシアミン）の存在において色反応を生じる、抗ＴＮＦ抗体と複合化した酵素である。間接測定可能な標識はビオチニレート化された抗ＴＮＦ抗体である。この標識の存在は、これを標識化アビジン複合体を含有する溶液と接触させ、よってアビジンがビオチニレート化抗体と結合することによって測定される。次いでアビジンに結合した標識を測定する。間接標識の好ましい例は、上述のように色反応を生じるアビジン複合化酵素を使用するアビジン／ビオチン系である。しかしながら、「標識」という語句は最も広い意味において使用されており、そして例えば「標識」抗体が、直接検出可能な標識を有する抗ゼノタイブまたは抗アイソタイプ抗体でインキュベーションすることにより検出可能であるように、標識が固定化抗ＴＮＦ抗体とは異なるゼノタイプまたはアイソタイプである「標識」抗ＴＮＦ抗体を使用すること、が含まれうることを理解されるべきである。

どのような標識を選択しても、それは測定可能であり且つ試料中の標識量：：関係するシグナルを結果として生じる。通常のシグナルは、放射線レベル（ラジオアイソトープを使用した場合）、光学１度（酵素色反応を使用した場合）、及び蛍光（蛍光物質を使用した場合）である。酵素反応により生じる光学濃度（または色強度）のような非放射性シグナルを使用することが好ましい。適当なシグナルを発生できる多くの酵素／基質組合せが免疫検定技術分野において公知である。

例えば本明細書においてその開示を取り入れている米国特許第４，３２３．６４７号校び同第４，１９０．４９ｆ５号明細書を夢照されたい。

本出願人か本発明をとのよう・宗もの一〇あると考えているかを記述しているが、以下の例は本発明を例示するために提１・されるものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるへきものて：よない。例え；よ、抗体を産生させる源　種類、または８決における改変、別のｆ！識及び″またはシグナル、別の材料校ひ配置の試験用支持体、別の固定化法、並ひ′；こ別の種類の「ＮＦ、を本発明の範囲を逸脱することなく採用することはり能である。

実施例Ｉ２６ｋＤ　ＴＮＦまたはＴＮＦペプチド免疫原の調製Ａ、膜両分アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に受託番号６７、１０３で寄託されたベクターｐＦＶＸＭを使って、２６ｋＤ　ＴＮＦ種をコードするＤＮＡ配列を含むベクターｐＦＶＸＭ−ＴＮＦ６を作製した。次いてこのベクターを使って細胞系をトランスフェクトせしめ、そこから膜画分を単離し、２６ｋＤ　ＴＮＦの入手源として使用することができる。

ベクターｐＦＶＸＭ−ＴＮＦ６を作製するために、２６ｋＤ　ＴＮＦ種をコードするｃＤＮＡ配列を含むプラスミドＢｌｌをＰｓｔｌで処理し、該コード配列を切り出した。標準的な電気泳動技術を使ってＰｓｔ［断片を精製した。次に、ベクターｐＦＶＸＭをＰｓｔｌで処理し、２６ｋＤコ一ド配列を含むｐＢｌ　１からのＰｓｔｌ断片を、上記に記載したような標準技術を使って該ベクターのポリリンカー領域に挿入しｐＦＶＸＭ−ＴＮＦ６を得た。

ｐＦＶＸＭおよびプラスミドｐａｉｌの両者を大腸菌株ＨＢＩＯＩ中で増幅させた。標準条件を使って二断片の連結を行った。連結操作後プラスミドＤＮＡを単離し、そしてＴＮＦをコードする配列の正しい方向を制限分析により確かめた。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　７：１５１３　（１９７９）に記載されたＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙの方法に従ってプラスミドＤＮＡを調製した。プラスミドＤＮＡを塩化セシウム中で２回バンド沈降させ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨｓ、ｏおよび１ｍＭ　ＥＤＴＡから成るＴＥ緩衝液に対して徹底的に透析した。

ｐＦＶＸＭ−ＴＮＦ６をｐｓｉ　ＡＭ細胞中ニトランスフエクトせしめ、２６ｋＤ　ＴＮＦ種を発現するＴＮＦ６．８と称する細胞系を生ぜしめた。

ｐＦＶＸＭ−ＴＮＦ６を、ＴＮＦを発現するトランスフェクト細胞の選択を促進する第二のベクターｐＥＶＸ−ｎｅｏと同時にトランスフェクトせしめた。ｐＥＶＸ−ｎｅｏはＫｒｉｅｇｌｅｒら、１９８４．　Ｃｅ１ｌ　３８：４８３により記載されている。トランスフェクションは、Ｗｉｇｌｅｒら。

１９７８、　Ｃｅ１ｌ　１４ニア２５のリン酸カルシウム法の変法を使って行った。簡単に言えば、無菌の１ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ８，１，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡで希釈した１０ｇｇの担体ＤＮＡを、１００　ｍｍのペトリ皿あたり５０〜１，０００　ｎｇのプラスミドＤＮＡと一緒に１００皿のベトリ皿に加え、次いで２．５Ｍ　ＣａＣ１ｚを添加した。この混合物を激しく攪拌して均一懸濁液にし、同容量の２ＸＨＥＰＥＳ　（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジンＮ′−２ −エタンスルホン酸）緩衝化塩溶液、ｐＨ７，１を加えた。この混合物を攪拌して均一懸濁液を与え、その後沈澱を形成させた。３０分後、ｌ艷の懸濁液を、１０％ウシ胎児血清が補足されたＤＭＥＭ　１０　ｒＩＬｌを含む１００　ｍｍのペトリ皿中のｐｓｉ　ＡＭ細胞に添加した。培養物を３７°Ｃで１６時間インキュベートし、次いで培地を新鮮な増殖培地と交換した。

次に、この増殖培地を、Ｇｉｂｃｏから得られた４００μｇ／イの６４１８が補足された新鮮な培地と再び交換した。

ＴＮＦ活性を発現するそれらのＧ４１８耐性コロニーを同定するために、培養皿に約７．３　ＸＩＯ’細胞／ａｉの密度でＬ９２９細胞を重層させた。細胞が付着した後、培地を吸引し、細胞の上に１０％ウシ胎児血清と０．９％Ｎｏｂｌｅ寒天が補足されたＤＭＥＭを重層させた。１８〜２４時間のインキュベーション後、標準的クローニングシリンダーを使ってＬ９２９細胞の溶解帯により囲まれたクローンを単離し、大量培養に拡大した。Ｌ９２９細胞を使ったＴＮＦアッセイは、米国特許第４．６７７、０６４号に詳細に記載されている。１つのクローンＴＮＦ６．８が２６ｋＤ　ＴＮＦを生産した。２６ｋＤ　ＴＮＦ種はこの細胞系から膜形態において単離することができ、免疫原として用いることができる。

５枚の半周密約１００ｍｍ皿から細胞を収得することから、ＴＮＦ６．８細胞から膜画分を調製する。細胞を収得する前に、それらを１０ｍＭ　ＫＰＯ４，ｐＨ７，０，１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリドから成るプロテアーゼ阻害剤含有緩衝液で洗浄する。

細胞からこの溶液を除去し、細胞を１．５ｍＩ！のエッペンドルフ超遠心管中にかき取り、超音波細胞破壊装置を使って細胞を超音波処理する。次いでこの溶解物を１，０００　Ｘｇで２０分間遠心し、上清ｓ−ｉを保持する。Ｓ−１上清を３０．０００　Ｘ　ｇで１０分間遠心する。それぞれ膜様物質とサイドシル画分を含むペレットと上清（Ｓ−３上清）を保持する。膜画分を下記に記載のようにしてマウスの免疫処置に使用する。

Ｂ、ペプチド接合体Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　Ｒ，Ｂ、　（１９８５）　Ｓｃｉ、　２３２：３４１− ３４７に詳細に記載された固相法を使って、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ　９５００自動ペプチド合成装置上で２６ｋＤ　ＴＮＦ上の開裂部位を含むペプチドを合成し、フッ化水素で切断し、そしてＷａｔｅｒｓ　Ｄｅｌｔａ　Ｐｒｅｐ　３０００機を使った１５−２０　ａｍ　Ｖｙｄａｃ　Ｃ４ＰｒｅｐＰＡＫカラム上での分取用ＨＰＬＣにより精製する。次のペプチドを合成する：ｉ）　Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−３ｅｒ−３ｅｒ−３ｅｒ　；自）　Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−３ｅｒ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ　；１ｉｉ）　Ｐｒｏ −Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−３ｅｒ−３ｅｒ−３ｅｒ −Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐ　ｒｏ−３ｅｒ−Ａ　ｓ　ｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａ　ｌ −Ａ　１ａ−１４１ｓ−Ｖａ　１−Ｖａ　１−Ａｌａ、　Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ　；およびｉｖ）　Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−３ｅｒ− ３ｅｒ−３ｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ。

該ペプチドを使って抗体を調製する前に、抗体応答の惹起を増強するためにそれらを適当な担体分子と接合する。この方法はＭｃＣｏｒｍｉｃｋらの発明者の米国特許第４．７６２．７０６号において記載されている。適当な担体はアオガイヘモシアニン（ＫＬＨ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。接合は、ペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端に付加されたシスティン残基のスルフヒドリル基を介して達成される。ヘテロ二価性架橋剤である１−ヒドロキシ− ２−二トロベンゼン−４−スルホン酸ナトリウム塩のＮ−マレイミド−６−アミノカプロイルエステルを下記の手順で調製する。

１モル当量（２，２４ｇ’）の４−ヒドロキシ−３−二トロベンゼンスルホン酸ナトリウム塩（ＨＮＳＡ）を、２５ｙｄのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で１モル当量（２，０６ｇ’）のジシクロへキシルカルボジイミドおよび１モル当量（２，１０ｇ）のＮ−マレイミド−６−アミノカプロン酸と室温で一晩混合する。ジシクロヘキシル尿素の白色沈澱が形成する。この沈澱を濾過し、母液に３００　ｄのジエチルエーテルを添加する。約ｌＯ分〜４時間後、母液から沈澱したガム状固体か形成する。この固体は活性ＨＮＳＡエステル５８％と遊離ＨＮＳＡ４２％を含むだろう。

分析は、少量の前記沈澱をｐＨ７，０のリン酸緩衝液中に溶解し、４０６　ｎｍての吸光度を測定することから成る。この読みはＨＮＳＡエステル調製物中の汚染物質である未反応の遊離ＨＮＳＡの量を提供する。ごく少量の濃強塩基（例えば５Ｎ　Ｎａ０Ｈ）の添加は形成されたエステルを即座に加水分解し、ここで第二の読みを与える。第二の読みから第一の読みを引くと、元の物質中のエステルの量を与える。次いでこの固体をＤＭＦ中に溶解し、ＬＨ２Ｏ５ｅｐｈａｄｅｘカラム上に負荷しＤＭＦで溶出させると、混入している遊離ＨＮＳＡからＨＮＳＡが分離する。精製の経過はクロロホルム、アセトンおよび酢酸（６：３：１．容量／容量）の溶離溶媒を使った薄層クロマトグラフィーによりモニタリングする。生成物は、アミンとの反応性によりｍａｔ−ｓａｃ　ＨＮＳＡエステルとして明確に同定される。純粋なエステルの収率は理論値の約３０％であると評価され；精製物質は９９％エステルから成る。

こうして得られたエステルは、水に完全に溶解することがわかり請求核試薬が添加されない限り数時間水中で安定である。ＩＮアンモニア中に置くと、該エステルは対応するアミドを生成し、一部遊離酸に加水分解される。精製したエステルは乾燥保存すると長期間に渡り安定であることがわかる。

約０．５■の精製したｍａｌ−ｓａｃ　ＨＮＳＡｃステルを１ｉｉの蒸留水に溶解する。この溶液の１０μ！アリコートを１−の１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７，０で希釈する。上述したように４０６　ｎｍでの吸光度を用いて遊離ＨＮＳＡの濃度を算出する。エステルの希釈下りコートに５０μβの４．８Ｎ水酸化ナトリウム溶液を添加し混合すると、該溶液の４０６　ｎｍての吸光度が存意に増加する。これは水酸化物求核試薬がエステルを酸成分と遊離ＨＮＳＡＴニオンとに迅速に加水分解することを示す。

塩基添加後と最初の遊離ＨＮＳＡ濃度との間の差はエステルの濃度を表す。エステルとタンパク質アミノ基の実際濃度から、所望の置換率を達成するためにタンパク質溶液に添加すべきエステルの量を算出することができる。

次いで精製したＨＮＳＡエステルを次のようにしてＢＳＡと反応させる（　ＫＬＨとの反応はこの手順と同様である）。

全部で２２ｍｇ　（２０μモル）のＢＳＡ（分子量６６、２９６）を２．０ｍＩ！の０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７，５＋：ｌ−溶解し、１１あたり１．ＯＸｌ０−２モルの全アミン濃度（５９リジン／ＢＳＡ分子と仮定）を与える。

計算量（１１■、　２．３５Ｘ１０−’モル）の上記で調製した粉末形のｍａｌ −ｓａｃ　ＨＮＳＡ＋−ステル（純度９７．７％）を２．０ＴＬｌのＢＳＡ溶液に溶解する。反応を室温で行う。決められた時間間隔で１０μ！アリコートを溶液から取り出し、各々を１．０ｍ７の０．０１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７，０中に希釈する。各希釈アリコートのスペクトルをＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ分光光度計を使って記録し、４０６　ｎｍでの吸光度を測定する。次いで各アリコートに全部で５０μｌの４．８Ｎ　ＮａＯＨを添加し、各アリコートを混合し、再度スペクトルを取り、４０６　ｎｍでの吸光度を測定する。

塩基の添加前と添加後の４０６　ｎｍにおける吸光度がら、残っているエステルの濃度および反応するエステルの％を反応混合物について決定する。その結果は、反応速度が１５分間に渡り本質的に直線であることを示す。

反応時間の１５分目に、０．１ＭＩＪン酸緩衝液、ｐＨ６，０で平衡化されたＰＤＩＯ脱塩用５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｉｎｃ、　）に反応混合物を適用することにより、反応を停止させる。２．６Ｘ　１０−”モル／ｌのエステルか反応し、よっておそら＜　ＢＳＡの５９のε−アミノ基の２５．９％か置換されることがわかる。従って、生成物は１分子あたり１６個のｍａｌ−ｓａｃ基を含む。

０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６，０で平衡化されたＰＤＩＯ脱塩用５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５カラムに反応混合物を適用することにより、最初の反応の生成物であるｍａｌ−ｓａｃ　ＢＳＡ　（またはｍａｌ−ｓａｃ　ＫＬＨ）を単離する。このカラムを１．Ｏｍ１画分において０．１Ｍリン酸緩衝液で溶出させる。カラム溶出後、吸光スペクトルのモニタリングにより追跡し、ｍａｔ−ｓａｃ　ＢＳＡを含むピーク分画をプールする。上記のようにして合成したＴＮＦペプチドを添加し、プールした混合物を室温で一晩攪拌する。生じた接合体を蒸留水に対して徹底的に透析し、凍結乾燥し、そして成る場合にはアミノ酸組成の変化について分析する。それらのＴＮＦペプチド接合体は、動物を免疫処置するため、または抗−２６ｋＤＴＮＦ抗体を生産せしめるために試験管内でリンパ球を免疫処置するために用いることができる。

実施例■ 下記に免疫処置リンパ球を単離しマウスハイブリドーマを製造する目的での２６ｋＤ　ＴＮＦまたはＴＮＦペブチ下免疫原てのマウスの免疫処置を記載する。一般的には、次の参考文献に記載された方法に従う。Ｓｈｕｌｍａｎら（１９７８）　Ｎａｔｕｒｅ　２７６：２６９　；Ｏｌら、５ｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　［ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ｐ３５１（Ｍｉｓｃｈｅｌｌ　＆　Ｓｃｈｉｉｇｉ編、　１９８０）　；　Ｆｏｕｎｇら（１９８３）　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７９ニア４８４　、モノクローナル抗体を含む組成物を生産する細胞系を包含する、モノクローナル抗体含有組成物を調製する方法は当業界において周知である。例（Ｇ、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ、　Ｕ、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ　＆　Ｊ、Ｋｅａｒｎｅｙ編、　１９８１）　＋ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｌｉｎｅｓ　（Ｒ，Ｋｅｎｎｅｔｔ、　Ｋ、Ｂｅｃｈｔｏｌ　＆　Ｔ。

５ｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　［ｍｍｕｎｏｌｏｇＹ、　ｐｐ３５１−３７１ＣＢ、Ｍｉｓｃｈｅｌｌ　＆　Ｓ、Ｓｃｈｉｉｇｉ編、１９８０）　；　Ｆｏｕｎｇら（１９８３）　Ｐｒｏ。

Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７９ニア４８４−７４８８を参照のこと。

簡単に言えば、リン酸塩緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）中のマウス１匹あたり５■の実施例■て単離した膜様物質または０．５■のＴＮＦペプチドを３週間間隔で２回腹腔内（１，Ｐ、　）または静脈内（＋、Ｖ、）的にＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫処置し、次いで融合３日前にＰＢＳ中の０．１■を尾静脈中に［、Ｖ、ブースター注射する。ｒ、　ｖ。

ブースター注射３日後、マウスを犠牲にし、膵臓を取り出し、牌細胞を単離し、そして不死化された薬剤選択可能なミエローマ融合相手細胞系と融合させる。そのようなミエローマ系は当業界で多数知られており、その大部分がＨＡＴ補足細胞培養培地中で増殖することができない。典型的なミエローマ細胞系はＳＰ−２１０Ａｇ１４である。こうして牌細胞とミエローマ細胞とを５：工の比で混合する（通常１×１０７個の牌細胞対２ＸｌＯ″個のミエローマ細胞から成る）ことによりハイブリドーマを形成せしめる。細胞混合物をペレット化し、培地を除去し、１．０−の４０％（Ｖ／Ｖ）ポリエチレングリコール１５００溶液を室温で６０秒間に渡り滴下添加し、次いで３７°Ｃで６０秒間インキュベートすることにより融合を行う。穏やかに攪拌しながら細胞懸濁液に９−のダルベツコ改良イーグル培地を５分間に渡り添加する。混合物中の細胞塊を穏やかに再懸濁し、細胞を洗浄して残余のＰＥＧを除去し、次いで２０％ウシ胎児血清が補足されたＤＭＥＭ中約２　ＸＩＯ’細胞／ウェルにおいてミクロタイタープレートに接種する。２４時間後、細胞にヒボキサンチンおよびアザセリン選択培地の２×溶液を供給する。約２〜３週間後、目に見えるハイブリドーマコロニーが出現し、上述したようにして培地を抗体スクリーニングする。当業界に周知のようにしてブリスタン感作マウスを使って抗体を含む腹水を生産し、該抗体を精製することができる。

Ｂ、ヒトハイブリドーマ／ヒトモノクローナル抗体敗血症患者から末梢血リンパ球を単離し、次いでエプスタイン−バーウィルスで感染させ、感染したリンパ球を選択可能なミエローマ細胞系との融合により不死化し、こうして作製されたハイブリッド細胞系を単離し、抗体産生に関して特徴づける。

更に詳しくは、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で単核細胞を分離し、プラスチックへの粘着により混合物から単核細胞を涸渇させる。この操作を行うのに標準的実験技術を使った。

次に、非粘着細胞を抗原特異的選別することにより抗体生産者を豊富にする。選別は当業界で一般に既知の技術であり、適当な抗原、この場合は２６ｋＤ発現細胞から膜様画分を単離することにより実施例Ｉに記載のように製造した２６ｋＤ　ＴＮＦまたはＴＮＦペプチド、がコーティングされたプラスチック表面上で抗体分泌細胞の集団をインキュベートすることを含む。それらの表面上に抗体を発現する細胞は抗原と結合し、結果としてプラスチック表面上に付着するが、一方細胞表面抗体を発現しない細胞は付着せず、洗浄により除去することができる。

よって、この技術により特異的抗体分泌細胞が富化される。

より詳しくは、２６ｋＤ　ＴＮＦを発現する細胞系ＴＮＦ６．８からの膜画分により６ウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）をコーティングする。

リン酸塩緩衝化塩溶液中ウェルあたり１５０μｇの膜様物質を４°Ｃで一晩コーティングする。−晩のインキュベーション後、１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸塩緩衝化塩溶液を使って４℃にて少なくとも１時間ウェルをブロックし、次いでＰＢＳ／ＢＳＡで洗浄する。次に、ｌイのＰＢＳ／ＢＳＡ中のｌＯ７リンパ球を６ウエルプレートの各ウェルに添加する。プレート上で７０分間リンパ球をインキュベートした後、吸引により非粘着細胞を除去する。１０％ウシ胎児血清を含む細胞培養培地（ＩＭＤＭ、　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）と共に粘着細胞をインキュベートする。

エプスタイン−バーウィルスに感染したキヌザル細胞系Ｂ９５−８を増殖させて得られた該ウィルスを含む培地を等量添加することにより、粘着細胞をエプスタイン−バーウィルス形質転換にかける。細胞をこの環境下で３７°Ｃにて３時間培養し、こうして粘着細胞集団中のリンパ球をエプスタイン−バーウィルスにより感染させる。感染期間の後、細胞を洗浄し、１０％ウシ胎児血清および３０％順化培地を含むＩＭＤＭ中約１０４〜１０’細胞／ウェルの密度で９６ウエルミクロタイタ：プレート上に接種する。順化培地はリンパ芽球様細胞系、好ましくはＪＷ５から誘導される。該培地は５Ｘ　１０−’Ｍの２−メルカプトエタノール、５０μｇ／ｍｌの硫酸ゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ）および６００ｎｇ／− のシクロスポリンＡ（Ｓａｎｄｉｍｍｕｎｅ、　５ａｎｄｏｚ、　Ｂａ５ｅｌ。

Ｓｗｉ　ｔｚｅｒｌａｎｄ）を更に含む。

約１４〜２１日間のインキュベーション後、細胞培養上清を一緒にし、下記に記載のようにして２６ｋＤ　ＴＮＦ結合活性についてスクリーニングする。陽性ハイブリドーマを低密度で継代培養し、活性について再試験し、増殖させ、そしてポリエチレングリコールと当業界で既知のプレート融合技術を使って細胞系Ｆ３Ｂ６と融合させる。後者の技術は、Ｌａｒｒｉｃｋ、　Ｊ、Ｗ、（１９８５）によりＨｕｍａｎ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ　ａｎｄ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　Ｅ、Ｇ。

Ｅｎｇｌｅｍａｎ、　Ｓ、に、Ｈ，Ｆｏｕｎｇ、　Ｊ、Ｗ、　ＬａｒｒｉｃｋおよびＡ、Ａ、　Ｒａｕｂｉｔｓ−ｃｈｅｋ編、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　４４６頁に記載されている。

Ｆ３Ｂ６は、１００μＭヒポキサンチン、５μｇ／−アザセリンおよび５μＭウアバインを含む培地中ての増殖に対して感受性であるヘテロミエローマ細胞系である。最後に、得られたハイブリッドを再びスクリーニングし、それらか抗２６ｋＤ　ＴＮＦ抗体を産生することを保証する。

マウスもしくはヒトハイブリドーマを含む組織培養ウェルからの培地、またはマウス抗体を含む腹水を、下記の実施例に記載のようにして、抗２６ｋＤ　ＴＮＦ抗体について、更に特定的には開裂部位特異的である抗体についてスクリーニングする。

最初に培地を２６ｋＤ　ＴＮＦ抗体についてスクリーニングし、そして２６ｋＤ　ＴＮＦに結合する抗体を更にスクリーニングして、それがプロホルモンのタンパク質分解的開裂を阻止することができるかどうかを決定する。

実施例Ｉに記載の細胞系ＴＮＦ６．８を使って２６ｋＤ　ＴＮＦを含む膜画分を単離し、これをＥｌ、ＩＳＡアッセイにおいて使って２６ｋＤ抗体を同定することができる。ＥＬＩＳＡアッセイはＫｌｏｔｚ。

Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　８４巻、バー）Ｄ、　９．１９４−２０１　（１９８２）により示されている。簡単に言えば、該アッセイは９６ウ工ル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）をＴＮＦ６．８からの膜画分でコーティングすることから成る。リン酸塩緩衝化塩溶液中ウェルあたり　１５０μｇの膜様物質を４°Ｃで一晩コーティングする。−晩のインキュベーション期間の後、１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸塩緩衝化塩溶液で４°Ｃにて少なくとも１時間ウェルをブロックし、次いで同溶液で洗浄する。培地の１００μｌアリコートを組織培養プレートに添加し、プレートを室温で３０分間インキュベートした後、１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸塩緩衝化塩溶液でウェルを３回洗浄する。次に、アルカリホスファターゼと接合したヤキ抗マウス抗血清をウェルに添加し、室温で更に３０分間インキュベートし、次いで１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸塩緩衝化塩溶液でウェルを３回洗浄する。最後に、各ウェルに１ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含む炭酸緩衝液、　ｐＨ９，８中のアルカリホスファターゼ基質ｐ−ニトロフェニルホスフェート（５ｍｇ／ｍｌ）　１５０　μ４７を添加する。３０分後、０．１ −の２Ｍ　ＮａＯＨの添加により反応を停止させる。基質の加水分解は黄色により指摘され、これは４１０　ｎｍでの溶液の吸光度を測定することにより容易にモニタリングできる。陽性の組織培養ウェルからのハイブリドーマ、即ち抗−２６ｋＤ　ＴＮＦ抗体を分泌しているハイブリドーマを増殖させる。４１０　ｎｍにおける吸光度が２６ｋＤ　ＴＮＦ抗体の存在のためであることを保証するために、細胞培養プレートから２６ｋＤ　ＴＮＦを削除することから成る対照実験を行う。

抗−２６ｋＤ　ＴＮＦ抗体についての別のアッセイ法は、上述のＥＬＩＳＡを使って細胞培養培地をＴＮＦペプチドに対してスクリーニングすることである。このアッセイでは、陽性のシグナルを与える抗体はプロホルモン上の開裂部位のところにまたは開裂部位のごく近くに結合するだろう。これは、２６ｋＤ分子のタンパク質分解を阻止する抗体の能力についてアッセイすることにより確かめることができる。

膜様２６ｋＤ　ＴＮＦまたはＴＮＦペプチドに結合する抗体を、２６ｋＤ分子から低分子量形態への開裂を阻止する能力についてアッセイする。２つの最も顕著な低分子量形態は約１７．０００と１５、０００の分子量を有する。好ましいアッセイは、上記のような２６ｋＤ分子の試験管内転写／翻訳、次いで開裂阻止活性について試験しようとする抗体の存在下または非存在下におけるコンバターゼでの処理から成る。この方法は、プラスミドＢｌｌによりコードされる２６ｋＤ分子の試験管内転写／翻訳を伴う。

Ｐｓｔ［消化によりｐＢｌｌから該配列を取り出し、ｐＧＥＭ−３（ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｃから入手可能）のＰｓｔ１部位中に挿入する。得られたｐＧＥＭ−ＴＮＦ１４と称するプラスミドを確立された技術を使って大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）中で増幅させ、ＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙ、前掲の方法に従ってプラスミドＤＮＡを調製する。プラスミドＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで直鎖状にし試験管内転写させ、直鎖状のプラスミド鋳型を使って、Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃにより供給された試験管内転写キットとＴ７　ＲＮＡポリメラーゼを用いてキャップ付転写産物を調製する。転写は製造業者により提案された標準技術を使って行う。

得られたｍＲＮＡを３ＳＳ−システィンの存在下で試験管内翻訳して３５３−システィン標識２６ｋＤ　ＴＮＦを生産する。この方法は、同じ＜　Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃにより供給されたウサギ網状赤血球溶解物翻訳キットを使い、製造業者により推奨される条件に従うことから成る。

次のようにして２５３−システィン標識２６ｋＤ　ＴＮＦを用いて抗体阻止活性についてアッセイする。まず２５μ！の試験管内翻訳物質を２５０μｌの未誘導ＨＬ６０コンバターゼ活性、および阻止活性についてアッセイしようとする化合物と混合する。該コンバターゼは、２　ＸＩＯ”　ＨＬ６０細胞を収得し、そしてそれぞれ計１８１ｎＩ！および６ｒｎｌのＳ−１画分およびＰ−３０画分を単離することにより製造する。Ｐ−３０画分の２５０ｕλを使用するが、ｓ−１画分を使ってもよい。本質的には上述した通りに３０”Ｃで１時間アッセイを行う。次に、抗−ＴＮＦポリクローナル抗血清とプロティンＡセファロースを使って反応混合物を免疫沈澱せしめ、ペレット化し、洗浄する。結合したタンパク質を溶出し、電気泳動する。１２％５Ｏ３−Ｆ’ＡＧεゲルがあらゆる２６ｋＤ断片の良好な分解を与える。電気泳動はＬａｅｍｍｌｉ　（１９７０）　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）２２７：６８０の手順に従って行う。ゲルを乾燥し、−７０″Ｃにおいて映像強化膜を用いてＸ線フィルム（ＤｕＰｏｎｔ、　Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ。

ＤＢ）に暴露しＣＢｏｎｎｅｒら（１９７４）　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎ、　４６：８）、次いで現像する。ＨＵ６０コンバターゼと阻止抗体とで処理した２６ｋＤ　ＴＮＦのゲル電気泳動プロフィールは、プロホルモンの低分子量断片の形跡を殆どまたは全く示さない。

実施例■ 体液中の２６および１７ｋＤ　ＴＮＦについてのア・ソセイ下記の記載は、本発明に係る体液中の２６ｋＤおよび１７ｋＤ　ＴＮＦについてのイムノアッセイを記載する。該イムノア・ソセイは、この実施態様では、ポリスチレンビーズ上でのエンザイムイムノメトリックアッセイ（ＥＩＭＡ）である。

第一に、２６ｋＤ　ＴＮＦに結合するものと１７ｋＤ　ＴＮＩ’に結合するものの２つの抗体を同定することが望ましい。後者の抗体は当業界で周知であり、容易に入手可能である。Ｆｅｎｄｌｙら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ第６巻、第４号、３５９頁（１９８７）。本質的にそれらの抗体は非交差反応性である。

第二に、゛既知量の標識２６ｋＤおよび１７ｋＤ　ＴＮＦを使って標準曲線を作成する。そのような方法は当業界で周知である。簡単に言えば、該方法は、正常ヒト血清中の２６ｋＤ　ＴＮＦと１７ｋＤ　ＴＮＦの両方を滴定することから成るだろう。各希釈液の１／２　ｒｎＩを個々の１２Ｘ７５ｍｍガラス試験管中に入れる。次いで０．２％グルタルアルデヒドを使って６．４ｍｍのポリスチレンビーズを抗−２６ｋＤ抗体かまたは抗−１７ｋＤ抗体のいずれかでコーティングする。次に、該ビーズを各試料に添加し、室温で６０分間インキュベートした後、ビーズを１〜２−のリン酸塩緩衝化塩溶液で洗浄し、カウントする。ビーズは同一分離試験管に添加してもよい。未知の試料中の２６ｋＤ　ＴＮＦと１７ｋＤ　ＴＮＦの量を決定するために、同じ操作を繰り返し、結果を標準曲線と比較する。

実施例■ ２６ｋＤ　ＴＮＦ開裂阻止抗体は、敗血症を処置するのに予防的にまたは治療的に使用することができる。敗血症にかかる危険のある個体、特に手術を受ける患者、または敗血症を有する患者に、該病気を予防するかまたは病気の重度を減らすのに有効な量の阻止抗体を投与することができる。典型的な処置体制は、患者の体重１ｋｇあたり約５〜１０■の抗体を投与することから成るだろう。予防的には、該用量を手術直前に投与し、そして手術直後に少なくとも１回繰り返す。

治療的には、病気の後退が明白になるまで該用量を２４〜４８時間ごとに投与する。初回治療量は患者の体重１ｋｇあたり２５■であり、その後はＩｋｇあたり５〜ｌＯ■に減らされるだろう。抗体は任意の経路により投与することができるが、好ましい経路はｉ、　Ｖ、投与である。

次の請求の範囲に記載されるような本発明の範囲を逸脱しない上記の実施態様の変形は当業者に容易に明白であろう。

国際調査報告１ｍ＊ＭＩｌｌａＭａＩ　Ａｌ１１１ｅ＃１１６．１１＊、　ＰＣＴ／ＵＳ　９０１０４５３６ＩｌｌＩＩｌ１，１Ｉｌｌｌい、１工７．。１．い、。ＰＣＴ／ＵＳ　９０１０４５３６−１１譜１ＩＩＩ訃６１ＩＩ喝＾１−１ｖＣ・１＝酬！ −炉一（シＰＣＴ／ｕｓ９ｎ／ｎ４５：シ６国際調査報告マｈ：＋＃ＲＲ＠＋１１１１１１ＭＩｉｌｐＨずＩｆｆｉｌｌ１ｍｅｍｂｅｍｍｌｌｌＲ９１６１ｈ＊Ｄｌｌｆｎ１１ｘｕｍｅｎ＋＋＋ｕｅSｉｎｔｈｅｍｈａｖａｎ警鴫＊＋１＊ｅｄ１ＭｅＬｎａ書ｏｎ＆番藝懺ＨｒｃｈｒｅｐｏａＴｈｅ、＋ｐｍ、、ｌ、。ｌ＋ａｘ＋ａ、＋ｎｌ。＝−［、、−、、、Ｐ−１−−９Ｏｕ、、、ｔｏｐ＋、＋−−０１／１１／９０Ｔ１ｗｌｕｒｏ−鴫１ｍＦｊｌｅＩＩｌａｌ酸ｓＩＮＩＡＭ＋ｔｙＩＩ＠Ｉｌｆずｙｌｈｅ＋１ｐａｎｌｃｖｌｊｎ峠１＋ｈａデ１ｔｉ門−o−マ１１四ａｊａｒｌｈ備−Ｍ＋−ロｎｏｄ響Ｒ１ｏ１ｆｆｉｌｌｌ＋−〜

Claims

【特許請求の範囲】

１．プロホルモンに結合し、よって前記プロホルモンの生物学的活性フラグメントのタンパク質加水分解的生成を妨害する抗体。
２．前記プロホルモンがＴＮＦプロホルモンである、請求の範囲１記載の抗体。
３．前記プロホルモンの前記生物学的活性フラグメントが約１７ｋＤ　ＴＮＦの分子量を有する、請求の範囲２記載の抗体。
４．前記プロホルモンの前記生物学的活性フラグメントが約１５ｋＤ　ＴＮＦの分子量を有する、請求の範囲２記載の抗体。
５．前記抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、二重特異性抗体、及び組み換え抗体より成る群から選択された、請求の範囲１記載の抗体。
６．前記抗体がヒト抗体またはヒト化抗体を含んで成る、請求の範囲５記載の抗体。
７．プロホルモンに結合し且つその開裂を阻止し、よって前記プロホルモンからの生物学的活性フラグメントのタンパク質加水分解的生成を妨害する抗体。
８．前記プロホルモンがＴＮＦプロホルモンである、請求の範囲７記載の抗体。
９．前記フラグメントがＦ（ａｂ′）２、Ｆａｂ、及びＦｖより成る群から選択された、請求の範囲８記載の抗体。
１０．プロホルモンに結合し、よって前記プロホルモンからの生物学的活性フラグメントのタンパク質加水分解的生成を妨害する抗体を産生する細胞系。
１１．プロホルモンの開裂部位特異的エピトープに結合し且つその開裂を阻止する抗体であって、前記エピトープが、前記プロホルモンの低分子量の生物学的活性形へとタンパク質加水分解される特性を有する前記抗体。
１２．前記プロホルモンの低分子量の生物学的活性形へとタンパク質加水分解される特性を有する前記開裂部位特異的エピトープが、ＴＮＦプロホルモンに存在する、請求の範囲１１記載の抗体。
１３．前記プロホルモンの前記低分子量の生物学的活性形が約１７ｋＤである、請求の範囲１２記載の抗体。
１４．前記プロホルモンの前記低分子量の生物学的活性形が約１５ｋＤである、請求の範囲１２記載の抗体。
１５．前記抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、二重特異性抗体、及び組み換え抗体より成る群から選択された、請求の範囲１２記載の抗体。
１６．前記抗体がヒト抗体またはヒト化抗体を含んで成る、請求の範囲１５記載の抗体。
１７．プロホルモンの開裂部位特異的エピトープに結合し且つその開裂を阻止する抗体フラグメントであって、前記エピトープがタンパク質加水分解され、よって前記プロホルモンの低分子量の生物学的活性形を生じる特性を有する前記抗体フラグメント。
１８．前記プロホルモンがＴＮＦプロホルモンである、請求の範囲１７記載の抗体フラグメント。
１９．前記フラグメントがＦ（ａｂ′）２、Ｆａｂ、及びＦｂより成る群から選択された、請求の範囲１８記載の抗体フラグメント。
２０．プロホルモンの開裂部位特異的エピトープに結合し且つその開裂を阻止する抗体を産生する細胞系であって、前記エピトープが、前記プロホルモンの低分子量の生物学的活性形へとタンパク質加水分解される特性を有する前記細胞系。
２１．プロホルモンが大きい及び小さいタンパク質加水分解フラグメントに開裂することを妨害する組成物であって、ａ）前記プロホルモンに結合する第一及び第二の非交差反応抗体（前記第一抗体は前記大フラグメントの生成を妨害し、そして前記第二抗体は前記小フラグメントの生成を妨害する）を含んで成る前記組成物。
２２．前記プロホルモンがＴＮＦプロホルモンである、請求の範囲２１記載の組成物。
２３．前記大及び小ＴＮＦプロホルモンフラグメントが、それぞれ約１７，０００及び１５，０００の分子量を有する、請求の範囲２２記載の組成物。
２４．前記抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、二重特異性抗体、及び組み換え抗体より成る群から選択された、請求の範囲２３記載の組成物。
２５．前記抗体がヒト抗体またはヒト化抗体を含んで成る、請求の範囲２４記載の組成物。
２６．患者体内に存在するプロホルモンフラグメントによって引き起こされる疾患に対して前記患者を予防的にまたは治療的に処置する方法であって、前記プロホルモンに結合しよって前記プロホルモンフラグメントの生成を妨害する有効量の抗体を前記患者に適用することを含んで成る前記方法。
２７．前記プロホルモンがＴＮＦであり、そして前記フラグメントが１７，０００及び１５，０００より成る群から選択されたおよその分子量を有する、請求の範囲２６記載の方法。
２８．前記プロホルモンがＴＮＦプロホルモンであり、そして前記フラグメントが約１７，０００の分子量を有する、請求の範囲２７記載の方法。
２９．流体試料においてＴＮＦ成熟ホルモン存在下でＴＮＦプロホルモンを検定する方法であって、ａ）ＴＨＦプロホルモンに結合するが前記成熟ホルモンには実質的に非結合性である抗体にＴＮＦプロホルモンを接触させることを含んで成る、第一の複合体を形成させる段階；ｂ）前記第一の複合体をレポーター分子に接触させることを含んで成る、第二の複合体を形成させる段階；及びｃ）前記第二の複合体中の前記レポーター分子を検定する段階、を含んで成る前記方法。
３０．前記第二の複合体を形成させる段階が、前記第一の複合体を前記レポーター分子に接触させる前にＴＮＦプロホルモンに結合する抗体及び未結合ＴＮＦプロホルモンを実質的に含まない前記第一の複合体を単離することを含んで成る、請求の範囲２９記載の方法。
３１．前記レポーター分子を検定する段階が、前記第二の複合体を前記レポーター分子に接触させる前に前記第二の複合体を単離し、そして前記レポーター分子を有する前記第二の複合体を単離することを含んで成る、請求の範囲２９記載の方法。
３２．流体試料中のＴＮＦプロホルモン及びＴＮＦ成熟ホルモンを検定する方法であって、ａ）ＴＮＦプロホルモンに結合するが前記成熟ホルモンには実質的に非結合性である抗体にＴＮＦプロホルモンを接触させることを含んで成る、第一の複合体を形成させる段階；ｂ）ＴＮＦ成熱ホルモンに結合するが前記プロホルモンには実質的に非結合性である抗体にＴＮＦ成熟ホルモンを接触させることを含んで成る、第二の複合体を形成させる段階；ｃ）前記第一及び第二の複合体を識別可能なレポーター分子に接触させることを含んで成る、第三の複合体を形成させる段階；及びｄ）前記第三の複合体中の前記識別可能なレポーター分子を検定する段階、を含んで成る前記方法。