JPH10501797A - ＣＤ４４ｖ６に対するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＣＤ４４遺伝子のエキソンｖ６変異体によってコードされるエピトープに対して活性のある抗体に関する。該抗体は先行技術の抗体より優れており、治療及び診断の用途に適している。

Description

【発明の詳細な説明】 ＣＤ４４ｖ６に対するモノクローナル抗体 本発明は、ＣＤ４４遺伝子の変異体(variant)エキソンｖ６によってコードさ れるエピトープに対するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体から誘導さ れる抗体分子、及び診断及び治療の目的のための抗体又は抗体分子の利用に関す る。 近年、表面糖蛋白ＣＤ４４の変異体の発現が、非転移性ラット繊維肉腫細胞系 のみでなく、非転移性ラット膵臓腺癌細胞系の、いわゆる自発的な転移作用を引 き起こすことに必要且つ十分であることが示された(Gunthertら,1991)。最も小 さいＣＤ４４イソ型、標準型ＣＤ４４（すなわちＣＤ４４ｓｔｄ）は、上皮細胞 を含む種々の組織で遍在的に発現するが、ある種のＣＤ４４接合(splice)変異体 （ＣＤ４４ｖ、ＣＤ４４ｖａｒ）は上皮細胞のサブセット(subset)でのみ発現す る。ＣＤ４４変異体は、１０個のエキソン（ｖ１−ｖ１０）の配列がＣＤ４４ｓ 中で完全に除去されるような選択的なスプライシングによって生じるが、異なる 組み合わせ中でより大きな変異体に生じることができる(Screatonら,1992; Tolg ら,1993; Hofmannら,1991)。変異体は、タンパク質の細胞外部位の一定の部位に 種々のアミノ酸配列が挿入している点で異なっている。そのような変異体は、ヒ トの腫瘍組織及び種々のヒト腫瘍細胞において検出することができる。そこで、 結腸直腸の発癌の過程におけるＣＤ４４の発現が近年研究された(Heiderら,1993 a）。ＣＤ４４変異体の発現は、正常ヒト結腸上皮細胞では見られず、増殖する 腺窩細胞では弱い発現のみが検出される。腫瘍の進行の後期においては、例えば 、腺癌、全ての悪性腫瘍においてＣＤ４４の変異体が発現する。高濃度のＣＤ４ ４変異体の組織発現は、攻撃的なNon-Hodgkinリンパ腫においても見られる(Koop manら,1993)。 エキソンｖ６は、特に転移が広がる間に、特別の役割をするらしい(Rudyら，1 993)。動物モデルにおいて、ｖ６特異的エピトープに対する抗体は転移細胞の 定着及び転移の増大を妨げることができる(Seiterら,1993)。結腸癌においては 、ｖ６の発現は腫瘍の増殖と相関関係がある(Wielengaら,1993)。胃癌において は、ｖ６の発現は、腸管型腫瘍を拡散型腫瘍と区別するための重要な診断マーカ ーである(Heiderら,1993b)。後の２つの刊行物において、ｖ６の発現は、ｖ６特 異的エピトープに対する抗体を用いて検出されている。 エキソンｖ６によってコードされるエピトープに対するモノクローナル抗体は 当業界において知られている(Hofmannら,1991; Wielengaら,1993)。そのような 抗体には、診断及び治療において高い潜在的な有用性があるので、改良された特 性を有する抗体が必要とされる。 本発明は、従来のｖ６特異的抗体に比して明らかに優れた特性を有する抗体を 提供することを目的とする。 本発明は、この目的を達成した。本発明は、ＶＦＦ−１８と命名された抗体に 関する。更に、本発明はこの抗体を分泌し、DSM-Deutsche Sammlung fur Mikroo rganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschwei g，Germanyにおいて、番号ＤＳＭ ＡＣＣ２１７４で寄託されたハイブリドーマ 細胞系に関する。 「抗体」又は「抗体分子」という用語は、以後、完全な免疫グロブリンだけで なく、結合特異性及び親和性に関して同等の物質及び記載の抗体誘導体及び組み 換え抗体分子をいう。 抗体ＶＦＦ−１８は、実施例１の方法で調製された。抗体は、寄託されたハイ ブリドーマ細胞系からも得ることができる。本発明の抗体誘導体を調製すること 、又は抗体の配列分析から始め、及び／又はこの抗体を生産するハイブリドーマ 細胞系を用いることにより同じイディオタイプで組み換え抗体分子、即ち、抗原 結合部位（相補的決定部位、ＣＤＲ）に抗体ＶＦＦ−１８と同じアミノ酸配列を 有する抗体分子を調製することは、平均の熟練者の技術の範囲である。従って、 組み換え抗体分子だけでなくそのような誘導体は、明らかに本発明に含まれる。 例えば、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）₂フラグメント又はその他のフラグメントは ＶＦＦ−１８抗体の完全な免疫グロブリンから生成することができる(Kreitman ら,1993)。診断の手順のために、例えば、ＶＦＦ−１８抗体分子、それのフラグ メント又は同じイディオタイプの組み換え抗体分子を、¹³¹I,¹¹¹In,^99mTc等の放 射活性アイソトープ又は放射活性化合物(Larsonら,1991; Thomasら,1989; Sriva stava，1988)、パーオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ等の酵素(Catty及 びRaykundalia,1989)、蛍光色素(Johnson,1989)又はビオチン分子(Guesdonら,19 79)と結合させることができる。治療に適用するためには、ＶＦＦ−１８又はＶ ＦＦ−１８から誘導される抗体分子を、毒素(vitettaら,1991; Vitetta及びThor pe，1991; Kreitmanら,1993; Theuerら,1993)、細胞成長抑止剤(Schrappeら，19 92)、プロドラッグ(Wangら,1992; Senterら,1989)又は放射活性物質と結合させ ることができる。更に、抗体をサイトカイン又は免疫調節ポリペプチド、例えば 腫瘍壊死因子又はインターロイキン−２と結合させることができる。 更に、抗体ＶＦＦ−１８のアミノ酸配列の分析後、及び／又はこの抗体を生産 するハイブリドーマ細胞系の使用により、特にこの細胞内に含有される遺伝情報 の解析により、熟練者はＶＦＦ−１８と同じイディオタイプの組み換え抗体分子 を生産することができる。これを達成する方法が、技術水準の一部を形成する。 例えば、このような組み換え抗体は、抗体(Shinら,1989; Gussow及びSeemann,19 91)、二価特異的抗体(bispecific antibodies)(Weinerら,1993; Goodwin,1989) 、一本鎖抗体(scFV，Johnson及びBird，1991)、完全な又は断片的な免疫グロブ リン(Colomaら,1992; Nesbitら,1994，Barbasら,1992)、又は鎖をシャッフルす ることによって生成した抗体(Winterら,1994)を人体に適応させることができる 。人間に適応させる抗体は、例えば、ＣＤＲグラフティング(CDR grafting)によ って生成することができる(EP 0239400)。枠組み部分も修飾してもよい(EP 0519 596)。最近では、抗体を人間に適応させるために、ＰＣＲ（例えば、EP 0368684 ; EP 0438310; WO 9207075を参照されたい）等の方法又はコンピューターモデリ ング（例えば、WO 9222653を参照されたい）が用いられる。融合タンパク質、例 えば、一本鎖抗体／毒素融合タンパク質も生産される(Chaudharyら,1990; Fried manら,1993)。従って、この種の抗体分子は、本発明に含まれる。 更に、ＶＦＦ−１８の正確なエピトープを同定すること、及びこの知識をもっ て同じ結合特異性を有する等価の抗体を生産することは平均的な熟練者の技術範 囲である。正確なエピトープは、実施例２に示すペプチド結合研究、例えば、ペ プチドＨｕ１の配列を変えることにより同定される。従って、このような抗体も 本発明の範囲内である。 本発明の更なる面は、診断及び治療のための、ＶＦＦ−１８、ＶＦＦ−１８の 誘導体又は等価の抗体分子の利用である。 診断方法は、本発明の抗体分子を用いる公知の方法、例えば、酵素−結合免疫 アッセイ(ELISA，Catty及びRaykundalia，1989)、ラジオイムノアッセイ(Catty 及びMurphy，1989)、免疫組織化学的方法(Heiderら,1993b)又はウエスタンブロ ット等に基づいて行うことができる。このような方法は、適切には、例えば、生 検として体から得られる組織試料又は液体で行われる。このような分析は、定性 的、半定量的又は定量的に行われる。抗体又は抗体分子は、他のｖ６特異的抗体 について先行技術において記載されているように用いられ、本発明による抗体又 は抗体分子の有益な特性は、そのような工程に重要な改良を構成する。 in vitroの診断に加え、本発明の抗体分子はin vivoの診断、特に腫瘍の診断 に適している。抗体分子が検出できるラベルを有していれば、ラベルは診断の目 的のために、例えば、in vivoで腫瘍の像を描くため、又は放射線誘導手術(radi oguided surgery)のために検出できる。免疫シンチグラフィー（画像）のための 放射活性アイソトープと結合した抗体の利用としては、例えば、本発明を実施す ることができる多くの方法がある(Siccardiら,1989; Keenanら,1987; Perkins及 びPimm,1992; Colcherら,1987; Thompsonら,1984)。 治療への適用は、例えば、抗体ＡＳＭＬ1.1の利用に類似して行うことができ る(Seiterら,1993)。抗体分子は、例えば、静脈（丸薬又はパーマントインフュ ージョン）、腹膜内、筋肉内又は皮下注射又は点滴で全身又は局所に投与される 。また、単一の組織、又は手足が灌流される。結合した、又は非結合抗体の投与 のための計画案が論文に見出される(Mulshineら,1991; Larsonら,1991; Vitetta 及びThorpe，1991; Vitettaら,1991; Breitzら,1992; Pressら,1989; Weinerら, 1989; Chatalら,1989; Searsら,1982)。 ＶＦＦ−１８の、他の抗ＣＤ４４ｖ６抗体に比して優れた特性は、実施例２〜 ４に示されている。 図面 図１：ＧＳＴ−ＣＤ４４（ｖ３−ｖ１０）融合タンパク質の図による説明。Ｇ ＳＴ＝Schistosoma japonicumのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ。ｖ３ −ｖ１０＝ケラチン生成細胞ＣＤ４４の変異体挿入物。矢印は、トロンビン切断 部位。 図２：ヒト及びラットのＣＤ４４遺伝子のエキソンｖ６の配列の比較。抗体1. 1ＡＳＭＬ（抗−ラットＣＤ４４ｖ６）又はＶＦＦ−１８（抗−ヒトＣＤ４４ｖ ６）によって認識されるペプチドＲａ１及びＨｕ１の配列を、それぞれ太字で表 した。一致するアミノ酸をアステリスクで印をつけた。 図３：ＣＤ４４ｖ６特異的抗体の合成ペプチドへの結合。ペプチドへの抗体の 結合は、ペプチドを固定し抗体溶液とインキュベーションするＥＬＩＳＡにより 検出した。適当な洗浄工程の後、結合した抗体をパーオキシダーゼ結合抗−マウ スＩｇＧ抗体で検出した。(A):最初の実験で、ＣＤ４４ｖ６ラット特異的抗体1. 1ＡＳＭＬのペプチドＲａ１(KWFEN EWQGK NPPT)への結合が証明された。(B):別 の実験で、Ｒａ１に同族であるがヒトＣＤ４４ｖ６配列由来のペプチドが合成さ れた。別の抗−ヒトＣＤ４４ｖ６ハイブリドーマの上清がＨｕ１(QWFGN RWHEG Y RQT)と呼ばれるペプチドに結合した。ＶＦＦ−１８が、試験した他の抗体よりも ペプチドに良く結合することが見出された。(C):定量的な評価のために、実験を 精製された抗体の種々の濃度で繰り返した。また、この実験で、ＶＦＦ−１８が 他の抗体に比較して高い結合アフィニティーを示すことがわかった。 図４：放射活性抗体の腫瘍細胞への結合。３種類の抗体、ＶＦＦ−７（抗−ｖ ６）、ＶＦＦ−８（抗−ｖ５）及びＶＦＦ−１８（抗−ｖ６）がＮ−スクシニミ ル[2,3-³Ｈ]プロピオネートで放射活性ラベルされ、種々の腫瘍細胞系で結合検 定に用いられた。以下の細胞系が用いられた：即ち、ＣＨＯ−ＣＤ４４ｖａｒ： 細胞表面でヒト変異体ＣＤ４４（エキソンｖ３−ｖ１０）を発現する組み換えハ ムスター細胞系（チャイニーズハムスター卵巣）；ＨＣＴ−１１６、ＣＸ−１、 ＨＴ−２９、ＣａＣｏ、ＣＯＬＯ ２０５、ヒト結腸癌細胞系；Ａ４３１：ヒト 扁平上皮細胞癌細胞系が用いられた。抗体の種々の細胞系への特異的結合が見ら れた。ｖ６特異的抗体ＶＦＦ−７及びＶＦＦ−１８の組み換え細胞系ＣＨＯ−Ｃ Ｄ４４ｖａｒへの結合は同じ程度であるが、抗体は、腫瘍細胞系に関しては異な る結合の作用を示す。いくつかのケースにおいては、ＶＦＦ−１８と少しの程度 のＶＦＦ−８の結合のみが見られ（ＨＴ−２９、ＣａＣｏ、ＣＯＬＯ ２０５） 、他のケースではＶＦＦ−１８はＶＦＦ−７よりも非常に良く結合する。 図５：ヒト正常血清中のエキソンｖ６を含む可溶性ＣＤ４４変異体の検出。３ 種類のｖ６に特異的な抗体、ＶＦＦ−４、ＶＦＦ−７及びＶＦＦ−１８が、サン ドウィッチＥＬＩＳＡにおけるコーティング抗体として用いられた。３種類の全 てのケースにおいて、検出抗体として、パーオキシダーゼ結合ＣＤ４４ｓｔｄ特 異的抗体（ＢＵ−５２、ｓｔｄ＝標準）が用いられた。種々の希釈における２種 類の正常ヒト血清のシグナルがこれらの検定((A)及び(B))で示された。両方のケ ースにおいて、他の２種類の抗体に比較してＶＦＦ−１８で、実質的に強いシグ ナルが示された。 図６：ｖ６を含むＣＤ４４変異体の血清中濃度。６人の健康なドナーの血清中 の可溶性ＣＤ４４ｖａｒの含量が２種のＥＬＩＳＡによって定量された。１つの 試験ではＶＦＦ−７が用いられ、他の試験ではＶＦＦ−１８がコーティング抗体 として用いられた。両方の抗体はエキソンｖ６を認識する。両方のケースにおい て、ＣＨＯ細胞中で生産された組み換え可溶性ＣＤ４４変異体（エキソンｖ３− ｖ１０）がコントロールとして供給された。平均で、ＶＦＦ−１８ ＥＬＩＳＡ は、ＶＦＦ−７ ＥＬＩＳＡに比して3.5倍高い値を示した。これは、血清中に 現れるＣＤ４４ｖａｒは、ＶＦＦ−７よりもＶＦＦ−１８によってより良く認識 されることを意味する。 実施例 実施例１：モノクローナル抗体ＶＦＦ−１８の製造 ｐＧＥＸ融合タンパク質のクローニング ＣＤ４４ｖのＨＰＫＩＩタイプの完全な変異部位をヒトケラチノサイトｃＤＮ Ａ由来のポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）で増幅した(Hofmannら， 1991)。用いられた２種のＰＣＲプライマー（Hofmannらによって記載されたＬ ＣＬＣ９７変異部位の２５〜５２位の５’−ＣＡＧＧＣＴＧＧＧＡＧＣＣＡＡＡ ＴＧＡＡＧＡＡＡＡＴＧ−３’、１０１３〜９８４位のＴＧＡＴＡＡＧＧＡＡＣ ＧＡＴＴＧＡＣＡＴＴＡＧＡＧＴＴＧＧＡ−３’）は、ベクターｐＧＥＸ−２Ｔ に直接ＰＣＲ生成物をクローンするために用いられるEcoRI認識部位を含有する( Smithら,1988)。得られた構築物（ｐＧＥＸ ＣＤ４４ｖ ＨＰＫＩＩ、ｖ３− ｖ１０）は、Schistosoma japonicumのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ とヒトＣＤ４４のエキソンｖ３−ｖ１０を含む、約70kdalの融合タンパク質をコ ードする（図１;Heiderら,1993a）。この融合タンパク質は大腸菌中で発現され 、次いでグルタチオンアガロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーに より精製された(Smithら,1988)。 免疫及びスクリーニング アフィニティー精製した融合タンパク質を用いて、以下に示す計画によりメス のBalb/cマウスを腹腔注射により免疫した。 1.免疫：Freundの完全アジュバント中の９０ｇの融合タンパク質 2.及び3.免疫：Freundの不完全アジュバント中の５０ｇの融合タンパク質 免疫は、それぞれ４週間隔で行った。最後の免疫の１４日後に、１０μｇの融 合タンパク質を含む食塩加リン酸バッファー（ＰＢＳ）で３日連続して追加免疫 した。次の日、抗体価の高い動物の脾臓細胞を、ポリエチレングリコール４００ ０を用いてＰ3.Ｘ６３−Ａｇ８.６５３マウス骨髄腫細胞と融合した。ハイブリ ドーマ細胞をＨＡＴ培地中のマイクロタイタープレート中で選択した(Kohler及 びMilstein,1975; Kearneyら,1979)。 血清中の抗体価の決定、又はハイブリドーマ上清のスクリーニングを、それぞ れ、ＥＬＩＳＡを用いて行った。この検定において、マイクロタイタープレート を、先ず、融合タンパク質(GST-CD44v3-10)又はグルタチオン−Ｓ−トランスフ ェラーゼでコートした。次いで、ウェルを連続希釈した血清又はハイブリドーマ 上清とインキュベートし、特定の抗体をマウス免疫グロブリンに対するパーオキ シダーゼ結合抗体で検出した。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとのみ反 応するハイブリドーマを廃棄した。次いで、残りの抗体を、領域特異的融合タン パク質（エキソンｖ３、エキソンｖ５＋ｖ６、エキソンｖ６＋ｖ７、エキソンｖ ８−ｖ１０）を用いて特徴づけた(Koopmanら,1993)。その後、ヒト皮膚切片でこ れらの抗体の免疫組織化学的反応試験を行った。次いで、抗体ＶＦＦ−１８を合 成ペプチドＨｕ１(QWFGNRWHEGYRQT)との結合によって同定した。Ｈｕ１の配列は ヒトＣＤ４４エキソンｖ６の断片である。 実施例２：ＣＤ４４ｖ６特異的抗体の合成ペプチドへの結合 ＣＤ４４ｖ６特異的抗体の合成ペプチドへの結合をＥＬＩＳＡにより検出した 。 溶液： コーティングバッファー： ０.０５Ｍ 炭酸ナトリウム，ｐＨ９.６ 検定バッファー： ＰＢＳ（食塩加リン酸バッファー） ０.５％ＢＳＡ（牛血清アルブミン） ０.０５％Tween20 基質溶液： Kierkegaard & Perry Laboratories，Gaithersburg MD， USA; TMBパーオキシダーゼ基質：パーオキシダーゼ溶液Ｂ （H₂O₂）1:1 ペプチド（コーティングバッファー中５０μｇ／ｍｌ濃度）をNUNC Maxisorp immunoplate(1.1ASML)又はBio Products由来のActi Aプレート（VFF 抗体）に４ ℃で一晩固定した。Acti Aプレートの場合は、ペプチドはプレートに共有結合で 結合した。次いで、プレートをＰＢＳ／０.０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、 プレート表面のフリーの吸着部位を検定バッファーを用いてブロックし（室温で １時間）、再びＰＢＳ／０.０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。Acti Aプレー トを、１０ｍＭ硼化水素ナトリウム加２０ｍＭ炭酸水素ナトリウム，ｐＨ９.０ で希釈し（室温で１時間攪拌しながら）、次いで３回洗浄した。０.０２〜１０. ０μｇ／ｍｌの濃度のハイブリドーマ上清又は抗体溶液を、それぞれウェルに加 え、室温で２時間振盪させた。その後、プレートをＰＢＳ／０.０５％ Ｔｗｅ ｅｎ２０で３回洗浄した。次いで、検定バッファー中に適当に希釈された、西洋 ワサビパーオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体を１００μｌ／ウェル加えた。 振りながら２時間室温でインキュベートした後、プレートを３回洗浄し、基質溶 液をウェルに 加えた。１０〜１５分後、２Ｍ硫酸で現像を止め、分光光度計で４５０ｎｍ（対 照：６９０ｎｍ）の吸光度を測定した。 最初の実験で、ラットＣＤ４４ｖ６特異的抗体１.１ＡＳＭＬのペプチドＲａ １(KWFEN EWQGK NPPT)ヘの結合が検出された(表１、図３(A))。 別の実験では、Ｒａ１と相同のヒトＣＤ４４ｖ６配列由来のペプチドが合成さ れた(Hul，QWFGN RWHEG YRQT)。種々の抗−ヒトＣＤ４４ｖ６抗体がＨｕ１と結 合した。驚くことに、ＶＦＦ−１８が、試験した他の抗体に比して、このペプチ ドと高い結合アフィニティーを示した(表２、図３(B))。 定量的な評価のために、種々の濃度における精製抗−ヒトＣＤ４４ｖ６抗体を ペプチドＨｕ１と結合させた。ここでも、他の抗体に比して、ＶＦＦ−１８の実 質的に良い結合アフィニティーが見られた(表３、図３(C))。 実施例３：放射活性ラベルしたＣＤ４４ｖ６特異的抗体の腫瘍細胞系への結合 抗体の放射活性ラベル 1mCiのＮ−スクシニミジル−[2,3-³H]−プロピオネート（[³H]-NSP,Amersham ，1mCi/ml）を、０℃で、シリコーンで処理した試料容器中で、水流ポンプ中で 、ほとんど乾燥するまで蒸発させた。１５μｇの抗体（ＰＢＳ，ｐＨ７.４中、 １ｍｇ／ｍｌ濃度）を加え、４℃で４８時間インキュベートした。次いで、３０ μｌの１Ｍグリシン加ＰＢＳと室温で２０分間反応させることにより、過剰の[³ H]-NSPを消滅させた。[³H]-グリシンからのラベル化抗体の分離は、セファデッ クスＧ−２５−Ｍ（カラム容積：１５ｍｌ）、及び溶出バッファーとしてＰＢＳ ／０.５％ＢＳＡを用いて行った。[³H]-ラベル化抗体はボイドボリュームに現れ た。抗体の量を、マウス免疫グロブリンとしてＥＬＩＳＡを用いて定量し、特異 的活性を計算した。 放射ラベル化抗体の腫瘍細胞への結合 ３種の抗体、ＶＦＦ−７（抗−ｖ６）、ＶＦＦ−８（抗−ｖ５）及びＶＦＦ− １８（抗−ｖ６）をＮ−スクシニミジル−[2,3-³H]−プロピオネートで放射ラベ ルし、種々の腫瘍細胞系で結合検定に用いた。以下の細胞系を用いた：即ち、Ｃ ＨＯ−ＣＤ４４ｖａｒ：細胞表面でヒト変異体ＣＤ４４（エキソンｖ３−ｖ１０ ）を発現する組み換えハムスター細胞系（チャイニーズハムスター卵巣）：ＨＣ Ｔ−１１６、ＣＸ−１、ＨＴ−２９、ＣａＣｏ、ＣＯＬＯ ２０５、ヒト結腸癌 細胞系：Ａ４３１：ヒト扁平上皮細胞癌細胞系が用いられた。 細胞を１２ウェルの組織培養プレートに接種し、ＣＯ₂インキュベーター中で ３７℃で一晩培養し、ＰＢＳで洗浄しエタノールで固定した（室温で１分）。次 いで、細胞を培養培地（ＲＰＭＩ １６４０／１０％牛胎児血清）で洗浄し、放 射活性抗体（培養培地に溶解したもの、250000dpm/ウェル）を加えた。振盪しな がら室温で２５時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳ／０.５％ＢＳＡ で３回洗浄し、０.１Ｍ水酸化ナトリウム／１％Triton X-100で細胞を可溶化し 放射活性をシンチレーションカウンターで測定した。１００倍過剰のラベルして いない抗体の存在下、非特定的結合を検出した。結合は、標準細胞数と相関関係 があ った（４０００００細胞）。抗体の特異的活性を検出した後、結合抗体の量をfm olで表した。 表４及び図４に、抗体の種々の細胞への特異的結合を示した。ｖ６特異的抗体 ＶＦＦ−７及びＶＦＦ−１８の組み換え細胞系ＣＨＯ−ＣＤ４４ｖａｒへの結合 はほぼ同じ程度であるけれども、これらの抗体は、腫瘍細胞系に対しては実質的 に異なる結合作用を示す。いくつかのケースにおいては、ＶＦＦ−１８のみが結 合を示し、より小さい範囲でＶＦＦ−８の結合も見られ（ＨＴ−２９、ＣａＣｏ 、ＣＯＬＯ ２０５）、他のケースではＶＦＦ−１８がＶＦＦ−７よりも顕著に 結合した。 実施例４：血清中の可溶性ＣＤ４４ｖ６の検出のためのＥＬＩＳＡ 溶液： コーティングバッファー： ０.０５Ｍ炭酸ナトリウム，ｐＨ９.６ 検定バッファー： ＰＢＳ（食塩加リン酸バッファー） ０.５％ＢＳＡ（牛血清アルブミン） ０.０５％Tween 20 試料希釈液： Bender MedSystems，Vienna，Austria 基質溶液： Kierkegaard & Perry Laboratories，Gaithersburg MD， USA; TMBパーオキシダーゼ基質：パーオキシダーゼ溶液Ｂ (H₂O₂)1:1 マイクロタイタープレート(Nunc-Immunoplate MaxiSorp F96)を５μｇ／ｍｌ のＣＤ４４ｖ６特異的抗体でコートした（４℃で一晩インキュベート）。その後 、プレートをＰＢＳ／０.０５％Tween 20で洗浄し、プレート表面のフリーの吸 着部位を検定バッファーを用いてブロックし（室温で１時間）、プレートを再び 洗浄した。血清試料を検定バッファーで予め少なくとも１：５に希釈し、ウェル 内で更に連続的に１：２に希釈した。次いで、検定バッファーで適当に希釈した (1:3000 - 1:10000)西洋ワサビパーオキシダーゼ結合抗−ＣＤ４４std抗体(Clon e BU-52，The Binding Site，Birmingham)を５０μｌ／ウェル加えた。振盪しな がら室温で３時間インキュベートした後、プレートを３回洗浄し、基質溶液を加 えた。１０〜１５分後、２Ｍ硫酸で発色を止め、分光光度計で４５０ｎｍ（対照 ：６９０ｎｍ）の吸光度を測定した。 定量化のために、可溶性ＣＤ４４標準試料の検定バッファーによる連続希釈液 を血清試料と平行して準備した。この試料は、可溶性ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０を発 現する組み換えハムスター細胞（ＣＨＯ）の上清から精製した。ＣＤ４４ｖ３− ｖ１０は、エキソンｖ３〜ｖ１０を含むヒトＣＤ４４変異体である。 表５及び図５は、正常ヒト血清中にエキソンｖ６を含む可溶性ＣＤ４４変異体 が存在することを示す。３種のｖ６特異的抗体ＶＦＦ−４、ＶＦＦ−７及びＶＦ Ｆ−１８を、サンドイッチＥＬＩＳＡにおけるコーティング抗体として用いた。 ３種の全てのケースにおいて、パーオキシダーゼ結合ＣＤ４４std特異的抗体(BU -52,std＝標準)を検出抗体として用いた。種々の希釈において２種の正常ヒト血 清のシグナルが見られた((A)及び(B))。両方のケースにおいて、ＶＦＦ−１８で は、他の抗体に比して実質的に強いシグナルが観察された。 表６及び図６は、ＣＤ４４変異体を含むｖ６の血清中の濃度を示す。６人の健 康人ドナーの血清中の可溶性ＣＤ４４varの量を２種のＥＬＩＳＡで定量した。 １つの試験ではＶＦＦ−７を、他の試験ではＶＦＦ−１８をコーティング抗体と して用いた。両方のケースにおいて、コントロールとしてＣＨＯ細胞中で生産さ れる組み換え可溶性ＣＤ４４変異体（エキソンｖ３−ｖ１０）を用いた。ＶＦＦ −１８ ＥＬＩＳＡはＶＦＦ−７ ＥＬＩＳＡに比して平均３.５倍高い値を示 した。これは、組み換えタンパク質と比較しての値を意味する。血清中に存在す る可溶性ＣＤ４４varは、ＶＦＦ−７よりもＶＦＦ−１８により良く認識される 。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/02 9454−4Ｃ Ａ６１Ｋ 49/02 Ａ 15/09 9735−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 21/08 9282−4Ｂ Ｃ Ｇ０１Ｎ 33/53 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ Ａ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＵＡ， ＵＳ，ＶＮ (72)発明者 アドルフ ギュンター エル オーストリア アー1070 ウィーン シュ ティフトガッセ 15−17−10 (72)発明者 パッツェルト エリック オーストリア アー3002 プンケルスドル フ ハンス ブッフミューラー ガッセ ８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２１７４のハイブリドーマ細胞系によって生産され る、ＣＤ４４遺伝子の変異性エキソンｖ６によってコードされるアミノ酸配列中 のエピトープに対する抗体ＶＦＦ−１８。 ２．寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２１７４のハイブリドーマ細胞系。 ３．請求項１記載の抗体の化学的又は酵素的修飾によって得ることができる抗体 分子。 ４．請求項１記載の抗体の断片であることを特徴とする、請求項３記載の抗体分 子。 ５．Ｆａｂ又はＦ（ａｂ'）₂断片であることを特徴とする、請求項４記載の抗体 分子。 ６．抗体が他の分子に結合していることを特徴とする、請求項３記載の抗体分子 。 ７．他の分子がポリペプチドであることを特徴とする、請求項６記載の抗体分子 。 ８．放射活性アイソトープに結合していることを特徴とする、請求項３〜５の何 れか１項記載の抗体分子。 ９．請求項１記載の抗体のイディオタイプの組み換え抗体分子。 10．キメラ分子、人間に適用される、又は一本鎖抗体であるか、又は鎖をシャッ フルして生成したことを特徴とする、請求項９記載の組み換え抗体分子。 11．他の分子又は放射活性アイソトープに結合していることを特徴とする、請求 項９又は１０記載の組み換え抗体分子。 12．請求項１記載の抗体と同一のエピトープを認識する抗体分子。 13．ヒト又は動物の体の外部での診断方法における、請求項１又は３〜１２のい ずれか１項に記載の抗体又は抗体分子の使用。 14．上記方法が酵素結合免疫アッセイ又はラジオイムノアッセイであることを特 徴とする、請求項１３記載の使用。 15．上記方法が免疫組織化学的方法であることを特徴とする、請求項１３記載の 使用。 16．薬学的利用のための請求項１又は３〜１２のいずれか１項に記載の抗体又は 抗体分子。 17．in vivoの診断用の試薬を調製するための請求項１又は３〜１１のいずれか １項に記載の抗体又は抗体分子の使用。