JPH05501398A - 組換え産生したヒト細胞膜補助因子タンパク（ｍｃｐ） - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 え　生したヒト　因　タンパクＭｃＰ 隨肛立丘 本発明は、ヒトの治療薬および補体カスケードの調節に関する。さらに詳細には 、補体カスケードの調節に重要な因子であるヒトの細胞膜補助因子タンパク（Ｍ ＣＰ）の組換え産生に関する。

茸１」Ｅ度 補体系は、組織および細胞の破壊が可能で、そのため外来組織の侵入に対する防 衛システムの主要な要素である。しかし、自己の細胞の破壊を妨げるためには、 この系の制御が必要である。補体カスケードの制御に関与する多くのタンパクが 記載されている。

本発明に最も良く関連しているのは、第二補体経路および古典的補体経路の両方 でＣ３コンバターゼおよびＣ５コンバターゼを制御しているグループである。こ のグループには、ｃ４−結合タンパクの様な血清タンパクおよび因子ＨおよびＣ ３ｂレセプターの様な膜タンパク、Ｃ３ｄ／エプスタインバーウイルスレセプタ ー、崩壊加速因子（ＤＡＦ）、および本発明のタンパクである細胞膜因子タンパ ク（ＭＣＰ）、が含まれる。ＭＣＰは、遊離したＣ３ｂおよびＣ４ｂの両方、お よびこれらのタンパクの形態でフンバターゼに包含されるものを、不活性化する 。これらの様々な因子およびそれらの補体カスケード調節における役割に関する 総説は、Ｈｏ１ｅｒｓ、Ｖ、Ｍ、らの、」シ工上二銖Ｈ（１９８５）　６：１８ ８；　Ｒｏｓｓ、Ｇ、Ｄ　らの、Ａｄｖ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　（１９８５）　３７ ：２１７；　Ａｔｋｉｎｓｏｎ。

Ｊ、Ｐ、らの、Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｔｏｄａ　（１９ｇ？）　８Ｌ：２１２；　Ｈ ｏｕｒｃａｄｅ、Ｄ、らの、Ａｄｖ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　（１９８９）　４５：３ ８１−４１６：　Ｒｅ１ｄ、に、Ｂ、Ｍ、らの、Ｉｍｍｕｎ虹ユ匹■（１９８６ ）　７：２３０、において見いだされ得る。

ＭＣＰに関してを除くと、一本のクロモソームの同じ位置にコードされる、補体 活性化の調節因子（ＲＣＡ）の一群である、これらの調節タンパクに関しては多 くのことが知られている。これらは各々、保存されたｃｙｓ、　ｐｒｏ、　ｇｌ ｙ、　ｔｒｐ、　ｌｅｕ／ｉｌｅ／ｖａｌ。

およびｔｙｒ／ｐｈｅ、からなる、約６０個のアミノ酸のコンセンサス配列の多 数の繰り返しで構成されている（Ｒｅｉｄ、　Ｋ、らの、遣旺劇−ｎ止ｕ（１９ ８６）　（前出））。これらのタン／（りをコードする遺伝子は、ヒトクロモソ ーム１の長腕のバンド１ｑ３２に位置し、ＲＣＡ遺伝子群と呼ばれるマルチシー ンファミリーを形成している。以下に示す様に、ＭＣＰもこのファミリーの一員 である。

ＲＣＡにフードされたタンパクは、２つの主要な様式で補体経路を調節するーそ の様式とは、その構成成分タン１＜りの可逆的解離による経路で重要な、Ｃ３コ ンバターゼの崩壊の加速（崩壊加速機能）および、Ｉ因子（セリンプロテアーゼ の一つ）の媒介する不可逆なコンバターゼのタンパク分解性不活性化における補 助因子としての動き（補助因子活性）である（Ｈｏｕｒｃａｄｅ。

Ｄ、らの、Ａｄｖ　Ｉｍｍｕ’ｎｏ＋＜前出））。

本発明のＭＣＰに関連］５ている、このファミリーの良く研究された一員は、崩 壊加速因子（ＤＡＦ）であり最近、Ｌｕｂｌｉｎ、　Ｄ、Ｍ、らの、Ａｎｎ　Ｒ ｅｖ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　（１９８９）　７；３５−３８に総説された。ＤＡＦ　 Ｉよ、赤血球、顆粒球、ＴおよびＢＩＪンパ球、単球、および血小板を含む、事 実上全ての末梢血細胞に存在する；加えて、可溶性の形態のＤＡＦは、細胞外の 体液および組織培養上清中に見いだされている。ＤＡＦをコードする遺伝子は２ つの研究グループによりクローニングされ配列決定されている：　Ｍｅｄｏｆ、 　Ｍ、Ｅ、らの、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｅｔ　ＵＳＡ　（１９８７ ）　８４：２００７−２０１１；および、Ｃａｒａｓ、１．Ｗ、らの、Ｎａｔｕ ｒｅ　（１９８７＞　３２５：５４５−５４９゜２つのクラスのＤＡＦのｃＤＮ Ａが見いだされている（Ｃａｒａｓらの、Ｎａｔｕｒｅ（前出））。

この２つの形態の間の相違は、１つの形態のカルボ牛シ末端の近くの１１８　ｂ ｐの付加である；この挿入物はＡｌｕタイプの配列に類似しており、その内部の 境界領域はイントロンのコンセンサススプライシング配列と一致する。このこと は１つの研究グループ（Ｃａｒａｓら）を、このクラスのｃ　ＤＮＡはスプライ シングされない保持されたイントロンを含有するという仮説に導いた。

ｃａｒａｓによる、膜の形態のＤＡＦおよび可溶性の分泌形態のＤＡＦが、１つ のイントロンを含むかどうかというａ＋ＲＮＡの異なるスプライシングにより得 られる、という示唆は、Ｆ’ＣＴ出願ＷＯ３９１０１０４１号にもまた記載され ている。本発明の発明者により、挿入された配列はＤＡＦ遺伝子の工牛ソン１０ にコードされ、そしてこの二キソンはコンセンサススプライシング結合配列に隣 接していることが見いだされた（Ｐｏｓｔらの、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　（１９９ ０）　１４４：フ４０）。従ってＤＡＦをコードする２つのクラスのｃＤＮＡは 、１つの独特のエキソンのスプライシングのよくある変化に起因する。

ＭＣＰは最初、表面を標識された末梢血球上でｉＣ３／Ｃ３ｂアフィニティーク ロマトグラフィーにより確認され、ｇｐ４５−７０と呼ばれ、５ＤＳ−ＰＡＧＥ で得られる分子量の範囲を示した（Ｃｏｌｅ、　Ｊ、Ｌ、らの、Ｐｒｏｃ　Ｎａ ｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（１９８５）　８２＋８５９＞。ＭＣＰは、 ヒト単核球細胞株から部分的に精製され、そして補助因子活性を有するが崩壊加 速機能は有さないことが示された（Ｓｅｙａ、　Ｔ、Ｊ、らの、Ｌｈｌ上赳（１ ９８６）工：８３７）。ＭＣＰは赤血球には存在しないが、ヒトのＴおよびＢＩ Ｊンパ球、顆粒球、単球、血小板、内皮細胞、上皮細胞、および線維芽細胞、に は膜結合タンパクとして存在する（Ｓｅｙａら、Ｅｕｒ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　 （１９８８）　１８：１２８９；ＭｃＮｅａｒｎｅｙ、　Ｔ、らの、Ｊ　Ｃ１１ ｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　（１９８９）　８４：５３８＞。広い範囲の宿主細胞上にＭ ＣＰが存在することは、補体による損傷から宿主細胞を保護するという役割と矛 盾しない（Ｈｏｕｒｃａｄｅ、　Ｄ、らの、Ａｄｖ　Ｉｍｍｕｎｏｌ（前出）： 　Ｌｕｂｌｉｎ、　Ｄ、Ｌ、およびＡｔｋｉｎｓｏｎ、　Ｊ、Ｐ、の、Ｃｕｒｒ ｅｎｔ　Ｔｏ　ｉｃｓ　ｉｎ　Ｍ４ｃｒｏｂｉａｌ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　 （１９８９）　１５ｉ：１２３−１４５）。これらの細胞の殆どの上に、５ＤＳ −ＰＡＧＥで確認される分子量６３　ｋｄおよび６８　ｋｄの２つの形態で存在 する。発現している２つの種の各々の量は、遺伝的制御下にあり、そして２つの 対立システム（ａｌｌｅｌｉｃ　ｓｙｓｔｅｍ）に関与している（Ｂａｌｌａｒ ｄ、Ｌ、らの、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　（１９ｇ？＞　１３８：３８５０−３８５ ５）。しかし、顆粒球の膜の免疫沈降反応により見いだされたＭＣＰは、この多 形性を示しそうにない（Ｓｅｙａ、　Ｔ、らの、Ｅｕｒ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　 （１９８ｇ）　１ｇ＋１２８９−１２９４）。

ヒトのＭＣＰに加え、様々な哺乳類の組織中にＭＣＰあるいはＭＣＰ一様あるい はＭＣＰ−関連物質が見いだされている。例えば、Ｎ１ｃｋｅｌｌｓ、　Ｍ、Ｗ 、らの、投稿中の論文（１９９０）に記載されている様に、オランウータンの赤 血球で見いだされるＭＷが６５　ｋｄおよび６９　ｋｄの２型性のタンパクは、 類似の０３と結合し、ヒトＭＣＰに対して生じたモノクローナル抗体と免疫反応 し、補助因子活性を有スる。マーモセノトおよびウサギの両者もまた、赤血球お よび血小板から各々、７５　ｋｄおよび６８　ｋｄ、　および、５５ｋｄおよび ４５　ｋｄの２型性のタンパクを示し、これらはＣ３と結合する（Ｇｏｕｊｅｔ −Ｚａｌｃ、Ｃ，らの、Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　（１９８７）　１ ０９：２８２；Ｍａｎｔｈｅｉ、　Ｕ、らの、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　（１９８８ ）　１４０：１２１）。さらに、ヒトの赤血球、マウスの殆どの細胞、およびウ サギの肺胞および腹膜のマクロファージは、６５　ｋｄのタンパクを産生じ、こ れはＣ３と結合可能である（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、　Ｄ、Ｊ、らの、Ｊ　Ｉｍ ｍｕｎｏｌ　（０４８；　５ｃｈｎｅｉｄｅｒ、Ｒ，Ｊ、らの、Ｎａｔｕｒｅ　 （１９８１）　１９０ニア８９；　Ｃｕｔ。

Ｗ、らの、ＦＡＳ［：Ｂ　Ｊｏｕｒｎａｌ　（１９８９）　ｉ：Ａ３００）。

以前に精製されたヒトＭＣＰが、このタンパクに対して単−特、異的なポリクロ ーナルのウサギ抗血清を調製するために用いられた。この抗血清は、５ｅｙａ、 　Ｔ、らの、ＬシＬ上ｅｄ　（１９８６）（前出）の記載に従い精製したＦｒｅ ｕｎｄの完全アジュノ４ント中のＭＣＰを、ウサギに繰り返し注射することによ り生じた。これらの抗血清は、種々の膜からの抽出物中のＭＣＰを確認するため に用いた。

本発明は、より高度に精製された形態のこのタンパクを提供し、そしてそれを組 換えで産生させることができるため、治療目的に使用できる実用的な量を提供で きる。さらに、以下に示す様に、このＭＣＰタンパクをグリコジル化および膜結 合のための変化した能力を有する一連の形態に組換えで作成し得、そのため、治 療用の形態の調節および最適化が可能である。

及朋ｊ」Ｌ玉 哺乳類の細胞膜補助因子タンパク（ＭＣＰ）は、補体系による自己破壊に対する 宿主組織の重要な保護物質である。このタンパクの多様な異性体、およびこれら と特異的な免疫反応性を有する抗体は、実用的な量で、ここに記述されているＭ ＣＰの組換え産生により入手可能となる。

従って、一つの局面においては、本発明は精製され単離された哺乳類、特にヒト のＭＣＰに同けられ、また組換え法により産生された該ＭＣＰに向けられる。他 の局面においては、本発明は、これらのタンパクの有用な量の製造をもたらすよ うな組換えための素材および方法に向けられる。本発明のひとつの局面はまた、 ＭＣＰの量の減少または増加と関連する疾患の診断法であり、個々のＭＣＰの異 性体と免疫反応性を有する抗体を利用するものである。さらに、本発明はＤＮＡ プローブを包含するが、このＤＮＡプローブはＭＣＰをコードする遺伝子の冬型 性を検出するうえで有用であり、そして、他の種における対応するＭＣＰまたは ヒトにおける対立遺伝子の変異体をフードする染色体および相捕的ＤＮＡを得る うえで有用である。

さらに進んだ局面においては、本発明は、本発明のＭＣＰタンパクを含有する薬 剤組成物、および、補体活性の過剰または誤指示によって媒介される炎症および 自己免疫状態を治療または改善する方法に向けられる。

さらに別の局面においては、本発明は免疫系の異常を診断する方法、特に、末梢 血球に存在するＭＣＰのレベルを評価することにより自己免疫疾患の有無を診断 する方法、および、胎盤中のＭＣＰのレベルの検査により再発性流産の可能性を 予測する方法に向けられる。

殴ｉ二ｉ見主旦匪 図１は、ＣＹＴ２Ｃ末端を有するヒトＭＣＰの一つのインフオーム（ｉｓｏｆｏ ｒｍ）の、ｃＤＮＡのヌクレオチド配列および推測したアミノ酸配列を示す。

図２は、図１のインフオームのｃ　ＤＮＡのヌクレオチド配列および推測したア ミノ酸配列を示し、ここで、ｃＤＮＡは、延長された３′側の非翻訳領域を反映 している。図２はまた、ＳＴ”およびＣＹＴ’をコードするｃＤＮＡ、　および それらの推測したアミノ酸配列を示す。

図３は、ヒトＭＣＰの６種の異なるインフオームをコードするｍＲＮＡを示す図 である。

図４は、ヒトＭＣＰをコードするゲノム領域を示す図である。

図５は、図４のゲノム配列の、エキフン／イントロン接合部における配列を示す 。

図６は、ゲノム上のエキソンと種々のＭＣＰインフオームとの対応関係を図示す る。

図７は、ヒｌ−ＭＣＰの４種のＳＣＲ配列の対応関係を示す。

図８は、６種のＭＣＰインフオームの、種々のＳＴ領領域よび２種のＣＹＴ領域 のアミノ酸配列を示す。

図９は、ＭＣＰインフオームをフードするＤＮＡのＰＣＲ合成に用いられたプラ イマーを示す。

発Ｂを　するための形態 ここで使用されるｒＭｃＰＪは、下記の標準的な溶血ア。

セイよる補体阻害活性を示し；ここで参照として取り入れられているＴｕｒｎｅ ｒ、　Ｊ、　Ｒ，らの修士論文（１９８４）　（ワシントン大学、セントルイス 、ミズーリ州）のアッセイによる補助因子活性を示し；そして、ここで参照とし て取り入れられているＨｏｆ　ｆｍａｎｎ、Ｅ、Ｍ、、１ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉ ｓｔｒ　（１９６９）ｉ：４０５−４１９のアッセイによるとき崩壊促進機能を 有さないタンパクを指す。哺乳類のＭＣＰは、このタンパクであって、「ヒトの ＪＭＣＰについて述べられたものと同様であって、哺乳類由来のタンパクのいず れによっても参照されるタンパクを指す。「ヒトのＪＭＣＰとは、ここで成熟し たインフオームの一つとして示されたものに参照されるアミノ酸配列を有するタ ンパクを指す。「参照される」とは、そのタンパクが、示されたものと同じアミ ノ酸配列を含んでいるか、示されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡの対立遺伝 子の変異体を発現するＤＮＡによってコードされているか、または、個々のまた は複数のアミノ酸残基の、述べられた活性の定量的パターンを変えることのない 、欠失、挿入および／または置換を有するアミノ酸配列を有することを意味する 。例えば、そして、インフオームのアミノ酸配列に参照されるアミノ酸配列のな かで特に包含されるものは、他の部分の対立遺伝子の変異体とともに、細胞膜結 合領域（ＨＹ）が欠失したものである。可溶型のタンパクが、こうして特に包含 される。この「可溶」型は、下記のような疎水性部分を含まない、いずれかの有 効な部分に相当する。こうして、可溶化ＭＣＰは非常に短いｍ−下記のショート ・コンセンサス・リピートのわずか一つか二つを含み、結合する糖類を伴うかま たは伴わない、ことが可能となる。

ＭＣＰの可溶化がその補助因子活性に影響し、その活性はアッセイの条件によっ て変化することは、さらに注目すべきである。この活性のスペクトラムは５ｅｙ ａ、Ｔ、、ａｔ　ａｌ、、ＢｉｏｃｈｅｍＪ（１９８９）２６４：５８１）に記 載され、またここで参照として取り入れられている。そこで述べられたアッセイ の結果は、可溶化ＭＣＰが、外的に加えられた場合には、赤血球に結合したＣ３ ｂの１Ｃ３ｂへの分解のための、およびザイモザンに結合したＣ３ｂの分解のた めの補助因子として低い活性しか有していないことを示した。逆に、ＭＣＰを保 持する細胞は、■因子による液相のＣ３ｂの分解については、弱い補助因子でし かなかった。しかし、外的に加えられたＭＣＰおよび■因子は、界面活性剤の濃 度が細胞を溶解するのに十分であるならば、またはＣ３ｂがある種の特定の可溶 化したアクセプター膜分子に結合しているならば、赤血球結合型のＣ３ｔ）を効 率よ（分解した。Ｃ３ｂを保持する別の可溶化したアクセプター膜分子は、同様 な反応性を示さなかった。液相および細胞結合型の３Ｃｔ）の、可溶化ＭＣＰお よびＩ因子による反応は、１３ｃｂを生成したが、Ｃ３ｃまたはＣ１６ｇは生成 しなかった。

要約すれば、可溶化ＭＣＰは、液相のＣ３ｂに対して、または可溶化分子に結合 したＣ３ｂに対して、強い補助因子活性を有するが、不溶体には有さない。従っ て、ＭＣＰタンノくりの補助因子としての能力は、公知としてまたは当該分野に おいて研究されているものとして天然物から単離されたＭＣＰについて述べられ ているように、アッセイの条件に依存することが予想される。将来の研究が、Ｍ ＣＰと同じ細胞に結合したＣ３ｂに対してＭＣＰが−一すなわち、内因性のＭＣ Ｐが、効率的な補助因子であるかどうかを決定する。

図１および２は、ｃＤＮＡが最初に回収されたＭＣＰのヒトイソフオームのアミ ノ酸配列を示す。これらのｃ　ＤＮＡは、その非翻訳領域の長さのみが異なる。

３′側の非翻訳の配列は異なるが、図２では相当長く、そして一般に見られるポ リアデニル化シグナルＡＡＴＡＡＡを利用しており、一方図１の３゛側の非翻訳 領域は、より短い（約０．３５ｋｂ）配列の中でＡＡＴＡＴＡまたはＡＡ　Ｔ　 Ｇ　Ａ　Ａを利用している。図３は、しかし、ｃＤＮＡが回収されたＭＣＰタン ｔ４りの６種のインフオームをコードするｍＲＮＡを図示する。これらのイソフ オームは、そのグリコジル化の能力において、およびその細胞質尾部領域の性質 において異なる。

図３に示すように、ｃ　ＤＮＡが調製されたＭＣＰのヒトイソフオームのすべて が、ある種の構造上の特徴を共宵している。図示したメノセノジャーＲＮＡにお いては　５１側の非翻訳領域があり、続いて、成熟したＭＣＰを膜への連結のた めにゴルジ体に運搬する際に機能する、シグナルタンパクをフードする配列があ る。これに続いて、ＲＣＡ遺伝子複合体によりコードされた他のタンパクと共通 する、４つのショート・コンセンサス・リピート（ＳＣＲ）がある。これらの約 ６０個のアミノ酸からなる繰り返しは、図１および２でアミノ酸１−２５１位の 間に示された配列を有し、このコンセンサスの性質は図７に詳細に示されている 。４つのＳＣＨの連続は、すべてのイソフオームで共通であり、これに続いて、 少なくとも一つのセリン−スレオニン・リッチ領域（ＳＴ領領域が、回収された インフオームのすべてにある。図３で明らかなように、インフオームのうち２種 はＳＴ’セリン−スレオニン・リッチ領域のみを含み；２種はＳＴｂおよびＳＴ ’の両方を含み、そして２ＦＪはＳＴ’Ｓ　ＳＴｂおよびＳＴ’を含む。

これらの領域は〇一連結のグリコジル化のための部位を提供するので、これらの 領域の性質および数が、単離されたタンパクにおいて５ＤＳ−ＰＡＧＥで検出さ れる分子量の範囲を説明し得る。これらの領域について推測したアミノ酸配列を 図８に示す。ＳＴｂおよびＳＴ’は、図１および２のインフオ−ムの中にアミノ 酸２５２−２８０位として含まれる。ＳＴｌに対するｃＤＮＡおよび推測したア ミノ酸の配列もまた図２に示すが、それはこの配列がこれらの図のインフオーム に含まれていないからである。

ＳＴ領領域続いて、不明な（Ｕ　Ｋ）意義を有する配列があり、これは単離され たイソフオームのすべてについで同一である。この領域のアミノ酸配列は、長さ がアミノ酸１４個であり、図１および２に示したイソフオームのアミノ酸２８１ −２９４位として示される。ＵＫ領領域続いて、疎水性領域（ＨＹ）があり、こ れはおそらく、ＭＣＰタンパクの細胞膜への固定のために機能している。ＨＹ領 領域また単離されたイソフオームのすべてにおいて同一であり、図１でアミノ酸 ２９５−３２６位の下線を引いた配列として示す。ＨＹ領領域続いて、２種の細 胞質尾部（ＣＹＴ”またはＣＹＴ２）のうち一つがある。ＣＹＴ２のアミノ酸配 列は、図１および２でアミノ酸３２７−’３５０位として示すものである。図２ はまた、ＣＹＴ＋のｃＤＮＡおよび推測したアミノ酸配列も示す。ＣＹＴｌおよ びＣＹＴ２の両方のアミノ酸配列を図８に示す。ＣＹＴ２はアミノ酸１４個の細 胞質尾部をコードし、一方ＣＹＴ’はアミノ酸２３個からなる細胞質尾部をコー ドしていることがわかる。

以下に例示されるように、本発明のヒトＭＣＰインフオームは、ゲノム配列から の特異的なＲＮＡスプライシングによって説明できる。

本発明のＭＣＰは、前記のイソフオームのすべて、およびそれらの対立遺伝子の 変異体、および、他の哺乳類から由来するイソフオームを包含する、これらのイ ンフオームをコードするｃ　ＤＮＡとストリンシェド条件のもとでハイブリダイ ゼーションできるＤＮＡによってフードされたＭＣＰを包含する。典型的なスト リンジェント条件は、６５℃で６ｘＳＳＣでのハイブリダイゼーション、次いで 一晩の６５℃での洗浄０．２ｘＳＳＣにおいて一時間、または５０％ホルムアミ ドを用いる４２℃で４ｘＳＳＣでのハイブリダイゼーシヨン、次いで上記と同様 の一晩の洗浄を包含する。同様に、本発明のＭＣＰは、ここでのイソフオームに 参照されるが、アミノ酸の修飾を含みながら依然として上記のＭＣＰの活性を維 持しているタンパクを包含する。

アミノ酸の変更、欠失および挿入に関しては、成熟したタンパクの４つのＳＣＲ を含む最初の２５１位のアミノ酸配列のアミノ酸残基のわずか一つ、二つまたは 少数が変更、挿入または欠失したものが好ましい。多様なＭＣＰインフオームが 存在することで示されるように、より実質的な変更が下流でなされ得る。好まし い置換は、その状態を保持するようなアミノ酸−一すなわち、疎水性アミノ酸に 代えて置換された疎水性アミノ酸、陽電荷を有するアミノ酸に代えて置換された 陽電荷を有するアミノ酸など、である。従って、好ましい置換は、ａｓｐに代え たｇｌｕおよびその逆、ａｒｇに代えたｈｉｓに代えたｌｙｓおよびその順序を 変えたちの；１ｌｅＳｖａ　１．　ｍｅ　ｔ、　およびＩｅｕのグループ内での 置換；ｇｌｙ、ａｌａ、ｓｅｒおよびｃｙｓのグループ内での置換；およびｔｒ ｐ、ｔｙｒ、およびｐｈｅのグループ内での置換である。

当該分野において理解されているように、タンパクは、それらが調製される際の ｐＨ条件によって、多様なイオン化状態で存在し得る。従って、ＭＣＰタンパク は塩として存在し得る（カルボキシル基に対する塩基から形成される塩、または アミ７基に対する酸添加による塩）。さらに、タンパクは、グリコジル化、アシ ル化、硫酸化などを包含する、様々な方法で誘導体化され得る。グリコジル化は 翻訳後のプロセスであるので、グリコジル化のパターンはタンパクが産生される 細胞の性質に依存する、と考えられている。グリコジル化のパターンにおける違 いは本発明に関係することが特に理解される。例えば、多様な末梢血球の膜から 抽出されるＭＣＰの二形性は、部分的には、その二つの形態におけるシアル酸の 雪の違いによって説明される、ということが示されている（Ｂａｌ　１ａｒｄ、 　Ｌ、　Ｌ、ら、Ｊ　１ｍｍｕｎｏ１（１９８８＞１４１：３９２３−３９２９ 、ここで参照として取り入れられている）。この開示によれば、ヒト単核細胞お よび細胞株から由来する二つの形態のＭＣＰは、ペプチドマツピングによって得 られる四つのペプチドのうち三つを有することが示され、そしてそれは同一であ り、一方、最大である部分消化されたペプチドは異なっており、そして７アル酸 残基における違いは、その二種の間の分子量の違いの大部分を説明している。

本願発明者によってここに、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより示される６３ｋｄおよび６ ８ｋｄ種の違いが、遺伝子のエキリン８によりコードされたＳＴｂ領域の有無に よる、ということが示された。一般にグリコジル化の違いは、エキリン７　（Ｓ Ｔ・）、エキリン８（ＳＴｂ）、およびエキリン９（ＳＴＣ）によりコードされ るＳＴ領領域スプライシングにおける分子レベルの変化を反映している。

ヒトＭＣＰの６種のイソフオームをコードするＤＮＡが、今や当該分野において 入手可能である。これら特定の実施態様をコードするＤＮＡは、以下の実施例に 述べるようにして得られうるか、または既知の手法を用いて新たに合成し得る。

あるいは、部分的にクローン化した配列は合成した部分に連結し得る。ヒトＭＣ Ｐ配列の変更は、新たな合成の中に取り入れることができるか、または、それ自 体が当該分野において知られているように、位置特異的変異を用いて、あらかじ め合成またはクローン化したＤＮＡから得ることができる。

ＭＣＰインフオームの他の種類の、同様な単離、修飾および合成もまたなされ得 る。図１または２の残基１−２５１位に示されたように、補助因子として作用す るタンパクの、完全なアミノ酸配列の供給および開示は、関連する膜結合および ３７部分を伴うかまたは伴わない、この配列だけでなく、これらのタンパクに参 照される他の形態、およびヒトイソフオームをコードするｃＤＮＡと上記の条件 下でハイブリダイゼ−ジョンするＤＮＡによりコードされる他の種のＭＣＰタン パクに参照される他の形態もまたコードするＤＮＡの合成を可能とする。

ＭＣＰの改変した形態に関するかぎりでは、特に、そして例示として、図１のＭ ＣＰインフオームをコードする配列の中に、通常は２５５の位置でセリンをコー ドするコドンにおいて、ＴＡＧストップコドンが導入され、アミノ酸１−２５４ 位を含む短縮形のペプチドが得られる；さらなる実施態様においては、疎水性領 域の直前にある、図１の配列の２９３の位置でロイシンをフードするコドンの代 わりに、ＴＡＧスト、ブコドンが導入されている。これら可溶化形のタンパクは 、以下に述べられた組換え手法を用いて産生ずることができる。

抄工ｍ先 組換え手法を利用したＭＣＰの産生のためには、上記のＤＮＡには、好ましくは 、クローニングおよび発現ベクターへの連結のためのリンカ−が付与される。そ のようなベクターの：Ａ製のための手法は、当該分野でよく理解されている。所 望のＭＣＰをコードするＤＮＡを、意図する組換え用の宿主細胞の性質に応じて 、プロモーター、上流のエンハンサー、終止配列などを包含するコントロール配 列と作動可能な結合状態で連結させる。種々の形態のＭＣＰを包含する異種遺伝 子を、原核生物の宿主、および酵母、哺乳類または鳥類または昆虫の細胞、およ び植物細胞を包含する種々の真核生物を包含する、多様な宿主において発現させ るための、技術が現在利用可能である。発現ベクターにおけるコントロール配列 およびマーカーの選択は、これらの宿主に対して適切に選ばれる。

例えば、原核細胞の宿主においては、ｔｒｐプロモーターおよびラムダファージ ＰＬプロモーターのような誘導プロモーターを包含する、種々のプロモーターを 用いることができる。

ｔｒｐポリメラーゼ結合領域をｌａｃオペレーターと組み合わせて含む、ｔａｃ プロモーターのようなハイブリッドプロモーターを使用することができる。適切 なマーカーは一般に、抗生物質耐性に関するものである。一方、哺乳類の培養細 胞においては、一般的に使用されるプロモーターは、初期および後期ＳＶ４０プ ロモーターおよびアデノウィルスプロモーターなどのような、ウィルス由来のも のである。いくつかの哺乳類のプロモーターは培地の条件によって制御すること も可能であり、例えば、メタロチオネイン−１１プロモーターがグルココルチコ イドまたは重金属により制御される。これらのプロモーター系は典型的な哺乳類 の宿主、最も一般的にはチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞、と適合 性がある。

もう一つの一般的に用いられる系は、昆虫細胞と適合性があるバ牛ユ口ウイルス の発現系である。例えばツバリン合成酵素プロモーターと共に使用される、植物 細胞、および解糖系において重要な酵素と関連のあるプロモーターと共に使用さ れる、酵母細胞もまた用いることができる。多数の適切な発現系が、ｒＣｕｒｒ ｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＢｉｏｌｏｇｙＪ　 Ａｕ５ｕｂｅｌ、　Ｆ、　Ｍ、ら編、Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ刊 、最新版の適切な章に見出せる。

はるかに多くの労力を要するものの、望ましいＭＣＰタンパクが、今やそのアミ ノ酸配列が遺伝子配列の解析から推定されたので、より小さなペプチドを得てそ れらを次に既知の手法を用いて結合させる、標準的なアミノ酸のカップリング法 によって合成することができる。

調製の方法に間係なく、組換えであれ合成（または、実際、天然源からの単離に よる）であれ、ＭＣＰは、５ｅｙａ　ら、Ｊ　ＥＸＬｌ説（１９８６）　工＋　 ８３７に述べられたものに類似の手法を用いて精製される。

髭生旦且盃 精製されまたは組換え産生された哺乳類のＭＣＰを、適切なを椎動物の被験体に おいて抗体を産生させるために用いることができる。５ｅｙａら、　ムシＬ上ｕ （１９８６）　１６３　＋８３７は、種々の細胞表面でＭＣＰの有年を検出する ための、精製したＭＣＰに対するポリクロ−チル抗血清の使用を述べている。さ らに、抗体分泌細胞の源として免疫化した哺乳動物を使用し、永久分裂能を与え て、Ｍ　Ｃ’Ｐと免疫反応性を有するモノクローナル抗体を分泌できる細胞株と することができる。一般には、１ｆｏｈｌｅｒおよびＭｉｌ　ｌ５ｔｅｉｎの標 準法の使用が好ましいが、細胞に永久分裂能を与える池の方法、例えばウィルス 感染を利用する方法もまた用いることができる。永久分裂能を与えることに成功 した細胞は、標準的なイムノアッセイ法を利用して、ＭＣＰと特異的に結合する 抗体の分泌に関してスクリーニングすることができる。

肱囲Ｊ」己月ｉ二 精製したタンパクは次に、過剰な補体活性に特徴づけられる疾患および状態の徴 候を治療しまたは軽減するために一般に知られている手法を利用して、投与のた めに製剤化される。

そのような疾患は、自己免疫疾患、例えばリューマチ性関節炎、全身性の紅斑性 狼癒、甲状腺炎、重症筋無力症、多発性硬化症；および炎症により特徴づけられ る他の疾患、例えば血清病による動脈炎、急性腎毒性腎炎におけるタンパク尿症 、糸球体炎を含む腎炎、およびインシュリン依存性の真性糖尿病を包含する。さ らに、本発明のＭＣＰは、心筋梗塞、脳卒中、急性の肺の損傷などのような疾患 により生じる組織の損傷に対して保護を与えるための治療薬として使用できる。

ＭＣＰは大体において、全身、または冒された組織、特に関節内など体腔へ直接 、のどちらかへの注射用に製剤化される。適切な製剤法は、例えばＲｅｍ１ｎ　 ｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ、ｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ　 Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎ ｉａ、最新版の中に見出すことができる。注射のためには、タンノ（りを液体溶 媒、例えばＩ＼ンクス溶液、リンゲ少溶液、ブドウ糖溶液、および種々の緩衝液 、の中に溶解または懸濁させる。

さらに安定化剤のような賦形剤もまた用いることができる。

注射の他に、本発明のペプチドは、座薬、経口投与、鼻腔内スプレーを包含する 経粘膜投与、および徐放性製剤によって、全身に投薬され得る。その他に、製剤 方法には、リポソームのようなカプセル化の製剤方法が包含される。

最後に、本発明のペプチドは、それらを所望の生物活性の部位まで運ぶために、 標的指向性のリガンドと結合させることができる。そのようなリガンドは、最も 一般的には、免疫グロブリンまたはその断片および細胞に関連するレセプターに 特異的なリガンドを包含し得る。標的型のＭＣＰは、同種移植片拒絶反応の治療 において外来の組織を標的とすることにより特に有用である。

治療薬としての有用性に加えて、ＭＣＰインフオームのそれぞれは、ポリクロー ナル抗血清を産生させるために、または、これらのＭＣＰインフオームに対して 特異的なモノクローナル抗体の産生源を得るために永久分裂性のパートナ−と融 合できる細胞を生産するために使用できる。これらの抗体は、受動性の治療薬と して、低い補体活性により特徴づけられる疾患の治療のために、または補体系の 欠損を治療するために、および、それ自体がまた治療上有用である抗イデイオタ イプ抗体を産生させるためにも、有用である。これらの抗体はまた、標準的なイ ムノアッセイ法を用いての、末梢血球または他の通常のＭＣＰを有する細胞での Ｍ　ＣＰレベルのアッセイのための、有用な診断用の手段である。

図１．２または３に示されたものと相同である、本発明のｃ　ＤＮＡはまた、ヒ トの他に多様な種において、ＭＣＰをフードする類似のＤＮＡを回収するための プローブとして有用である。このｃＤＮＡまたはその相同体は、診断において、 胎盤組織のＭＣＰのレベルを測定するためのプローブとして使用できる。このＭ ＣＰのレベルは、将来の妊娠における流産の可能性を予測できる。

以下の実施例は、本発明を例示することを意図しているが、限定することは意図 しない。

（以下余白） 宜１！１ １ヒトＭＣＰの−１ 前述の５ｅｙａ、　Ｔ、ら、　Ｌシｌ上封（１９８６）　１６３：８３７の方法 を用いた。これはここに参考文献として組み込まれる。Ｔ細胞株ＨＳＢ２からＮ Ｐ−４０に可溶化した後、クロマトフオーカシング、ヒドロキシアパタイト、Ｃ ３（メチルアミン）セファロース、およびモノＱカラムで順にクロマトグラフィ ーを行って、タンパクを精製した。このようにして得られた約２０μｇの部分精 製タンパクを１０％５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、６３ｋｄの分子量のバンドをＨｕ ｎｋａｐｉｌｌｅｒ、　Ｍ、Ｗ、ら、ル■坦ｊ□　＜１９８３）　９１：２２７ の方法に従い、電気溶出し電気透析した。得られたタンパクは、５ＤＳ−ＰＡＧ ＥおよびＨＰＬＣのもとに均一であった。

夫立見主 ＭＣＰをコードするｃＤＮＡの口収 ｏ＋ＲＮＡの供給源として単球Ｕ９３７細胞株を用いた。ｍＲＮＡはＣｈｉｒｇ ｖｉｎ、Ｊ、　Ｍ、ら、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　（１９７９）　１８：５２ ９４に記載のグアニジンインチオシアネート／ＣｓＣ１抽出と、それに続くオリ ゴ（ｄＴ）セルロースフ０フトグラフイー　（Ａｖｉｖ、　Ｈ，ら、　Ｐｒｏｃ 　ＮａｔｌＡｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（１９７２）　６９：１４０８）を用い たｍＲＮＡの単離を含む、標準的方法で調製した。Ｇｕｂｌｅｒ、　Ｕ、ら、　 Ｇｅｎｅ　（１９８３）　２５：２６３の方法に従い、５μｇの単離１ＲＮＡか らｃＤＮＡライブリーを調製した。ｌｋｂよりも大きいｃＤＮＡ挿入をλｇｔｌ ｏアームに連結し、ノく・ｙ’ｒ　−’、；　Ｌ　テＣ６００ｈｆｌＡ　Ｅ、　 ｃｏｌｉ上ニ撒キ、２ｘ　１０’個ノＭｆａ、を体を得た。ｃＤＮＡライブラリ ーは、実施例１の精製タンパクをアミノ酸配列決定して得た残基７〜１２位を元 にした、３２ｐで標識された６４種の縮退１７−ｍａｒアンチセンスオリゴヌク レオチドプローブを用いてプローブを行った。この１７−ｍａｒはＰｈｅ−Ｇｌ ｕ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｇ　１ｕ−Ｌｅｕの配列をコードする。ライブラリーはニ トロセルロースフィルター上に引き上げたプラークについて、１ｍｌ当り５ｘ　 １１０５ｃｐでラベルしたプローブとともに１００μｇの超音波処理ニシン精子 ＤＮＡを含有する６ｘ　５ＳＣ（ｌｘ　ＳＳＣは０．１５Ｍ塩化ナトリウム１０ ．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）１５Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’　ｓ液（Ｉ　Ｘ　 Ｄｅｎｈａｒｄｔ’　ｓ＝０．０２％ＢＳＡ７０．０２％フィフール１０．０２ ％ポリビニルピロリドン）７０．０５Ｍリン酸ナトリウム、　ｐＨ６，１１中で 、３７℃で一晩、フィルターをハイブリダイズさせてプローブした。フィルター は２×５ＳＣ１０，１％ＳＤＳで室温にて３０分間、２回洗浄した。

二反復の実験で陽性シグナルを得たプラークは、標準法でプラーク精製した。

陽性プラークをｐＵｃ−１９にクローニングし、標準的なジデオキシ配列法で配 列決定した。１．５ｋｂの挿入を含有する１つのクローンを配列決定して図１に 示す結果を得た。

図１に示すように、ｃＤＮＡは３８４個のアミノ酸をコードするオープンリーデ ィングフレームを含有する。最初の３４個のアミノ酸はシグナルペプチドとして 典型的な構造であり；続＜２４個のアミノ酸は、実施例１のタンパクをエドマン 分解して決定したＮ末端タンパク配列に適合する。３９ｋｄのシグナル以外の推 定タンパクは、Ｂａ１ｌａｒｄ、　Ｌ几、ら、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　（１’１８ ８）　１４ユニ３９２３−３９２９の生合成の実験で検出された、ＭＣＰ前駆体 の大きさに適合する。アミノ酸２５３−２７７位の間のｓｅｔ／ｌｈｒに富む領 域（残基２５個のうち１２個）には、３つのＮ−結合グリフシル化部位および多 数の潜在〇−結結合グリフルル化部位あることがわかる。

このことは、上記Ｂａｌ　１ａｒｄらが決定したオリゴサツカライド構造１こ一 致する。Ｈｏｐｐ、丁、Ｐ、ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳ Ａ　（１９８１＞　７８：３８２４に従う疎水性分析は、アミノ酸２９５−３１ ７位の２３個のアミノ酸領域は膜貫通疎水性ドメインの典型であり、これに続＜ ３３個のアミノ酸領域は細胞質尾部に相当することを示す。下流の非翻訳領域は ポリアデニル化部位に一致する。

しかし、Ｎ末端の大部分のタンパクは約６０個のアミノ酸からなる４個の隣接ド メインで構成されており、これらは補体調節タンパクの多重遺伝子ファミリーに 見いだされるコンセンサス配列に適合する。これらの４個のドメインは互いに１ ８−３５％のアミノ酸配列の相同性（保存アミノ酸配列（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉ ｖｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）が可能な場合には２９−４４ ％の相同性）を示し、これはファミリーの他のメンバーの相同性の度合に類似す る。

のイソフオームのｃＤＮＡの−、′ ＭＣＰをコードするｃＤＮＡの一つの供給源として、ヒト皮膚線維芽細胞のＣ１ ｏｎｅｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ、　ＣＡ）か らのλｇＬｌＯ中のｃＤＮＡライブラリーを用いた。第二のライブラシーはＣ１ ｏｎｅｔｅｃｈから得たｌＯμｇのＨｅＬａポリＡ”ｌ’ｌＮＡから、アガロー スゲル電気泳動で３ｋｂより大きいｃＤＮＡ挿入を分離し、これらの挿入をλＺ ＡＰＲｎに連結しＧｉｇａｐａｃｋ”にパッケージし、ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ　Ｅ、 ｃｏｌｉ（これらはすべて米国カリフォルニア州のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ 　Ｊｏｌｌａから入手した）上に撒いた。ライブラリーはランダムへキサヌクレ オチドプライミング法でラベル化した図１のｃＤＮＡを用いてプローブした。陽 性クローンはプラーク精製し、Ａｕ５ｕｂｅ１．　Ｆ、Ｍ、ら、　Ｃｕｒｒｅｎ ｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ。

１　（１９８７）　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、Ｉｒ＋ｃ、、　ｐ、 １に記載の小規模なバクテリオファージ調製物を用いて単離した。挿入されたＤ ＮＡを次に、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　 ：　Ａ　［、ａｂｏｒａｔ。

■」エユ［（１９８２）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）ｌａｒｂｏｒ、　ＮＹに記載のよう にｐＵｃＩ９のＥｃｏＲ１部位にサブクローン化した。

図１に示すインフオームをコードするが長い非翻訳領域を有する、もう一つのｃ ＤＮＡを図２に示す。このｃＤＮＡは３．２ｋｂクローンとして、皮膚線維芽細 胞ライブラリーから上記のように回収された。このクローンは５°非翻訳配列に さらに１０２個のヌクレオチド、および３°非翻訳配列にさらに１５８２個のヌ クレオチドを含有する。コードするタンパクは図１と同一である。

第二のＭＣＰインフオームは、Ｈｅ１ａ　ｃＤＮＡライブラリーを、図１のｃＤ ＮＡを上記のようにラベルしたものを用いてスクリーニングして得た。このクロ ーンの翻訳領域は図３でＨ−２７と名付けられており、疎水性領域の直後に、終 止コドンを含む９３個のヌクレオチド挿入物を含有する点で異なる。この挿入の 結果、図１および２に示す２３個のアミノ酸のＣＹＴ’ではなく、わずか１６個 のアミノ酸からなる、異なる細胞質尾部（Ｃ罫１）が生じる。図１および２のＣ ＹＴ２細胞質尾部をコードするＤＮＡは、このイソフオームをコードするｍ　Ｒ Ｎ　Ａの、非翻訳配列中に含まれよび３°非計訳領域に由来するＭＣＰ−特異的 プライマーを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってＭＣＰのコーディング 領域を含むクローンを産生ずるのに用いた。プライマーの配列は好都合な制限酵 素部位を含有し、それは図９に示されている。赤面白血病細胞株に−５６２およ びヘパトーマ細胞株ＨＥｐ−２の、全ＲＮＡから調製されたＰＣＲ産物を、エタ ノール沈澱させ、ＥｃｏＲＩで消化し、ゲル精製し、ｐＵｃＩ　９のＥｃｏＲ１ 部位に毎ブクローン化し、次に大きさと５ａｌｌを用いた消化とにより特徴付（ チた。次に、異なるサブクローンを配列決定した。

この配列決定の結果により、図３に示す６個のインフオームが得られたことが示 される。図３はこれらの回収された配列についてのｃＤＮＡマツピングを、　Ｕ ９３７細胞および図１と２に示す皮膚線維芽細胞から得たものと比較して図示し ている。

得られる６個のイソフオームは、ＳＴ領領域よびＣＹＴ領域の性質のみが異なる 。

Ｋ宣匹土 里立ｊｊｌＬ旦玉旦１虱 ＥＣ０ＲＴおよびＢａｍＨＩによって消化した全ゲノムのＤＮＡのサザノブロノ テイングを、上記のようにラベル化された図１のｃＤＮＡクローンでプローブし 、その結果ラベル化された断片の複雑なパターンを生じた。適切な配列を回収す るために、３種のゲノムライブラリーをプローブした：アメリカン・カルチャー ・タイプ・コレクシシンからのＣｈａｒｏｎ−４Ａにクローン化したＥｃｏＲＩ ライブラリー、Ｓｔｒ’ａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍから得 られるλＤＡＳＨにクローン化した５ａｕ３ＡＩライブラリー、およびＥｃｏＲ Ｉでのｔ角化およびＣｈａｒｏｎ−２１Ａへの挿入により構築された、ＡＴＣＣ から得られるクロモソーニー１特異的ライブラリー。これらのライブラリーの上 述のようなスクリーニングの結果、約４３ｋｂの長さにわたって広がるが完全に は重なり合わない、１４個のエキソンを含む５つのゲノム性バクテリオファージ のクローンを得た。図４に示すように、ＭＣＰ遺伝子は１４個のエキソンおよび １３個のイントロンからなる。エキソンの配列は、ＭＣＰのＣＤＮＡおよびＰＣ Ｒクローンについて得られたものと正確に一致した。すべてのエキラン／イント ロン境界領域は、図５に示すように、ＧＴ／ＡＧコンセンサス・シーフェンス則 に従う。遺伝子の地図、および６種の開示されたインフオームを生じるスプライ ソングの図を図６に示す。

最初のエキソンは５゛非翻訳／シグナルペプチド領域をコードするが、しかしこ のエキソンの長さは、転写開始１部位が決定されていないので未知である。次の ５つのエキソンは４つのＳＣＲの繰り返しをコードする。５ＣＲＩ、３および４ はそれぞれ単一のエキソンがコードするが、エキソン２は２つのエキソンがコー ドする。エキソン７はＳＴ”をコードし、エキソン８はＳＴｂをコードし、およ びエキソン９はＳＴＯをフードする。異なるインフオームは、示したように、転 写されたエキソンのどれかスプライスされて結果として生じるｍＲＮＡに入るか によって決定されるものと見られる。

エキソン１０は、全てのインフオームに共通する意義不明の（ＵＫ）１３個のア ミノ酸の配列をコードし、エキソン１１および１２は疎水性膜貫通領域および塩 基性アミノ酸のアンカーをコードする。

エキソン１３は、ＣＹＴ’をコードする９３個のヌクレオチドの配列で、含まれ る場合には細胞質尾部を１６個のアミノ酸の後で終止させるものをコードする。

この転写されたエキソンがＲＮＡから欠けた場合、二手ソン１４の存在が、結果 としてＣＹＴ２の２３個のアミノ酸からなる細胞質尾部の、枠内での読み込みを もたらす。

１皿一旦 組ヵえＭＣＰの　生 ＭＣＰ−１，Ｈ２−１５、Ｈ２−１４、およびに５−２３（Ｈ−２７）（、図３ を見よ）をフードするｃＤＮＡ、および２５５または２９３の位置に挿入された 終止コドンを伴う図１のｃ　ＤＮＡを、ＣＯ８およびＣＨＯ細胞内でのタンパク の組換え産生に適切な発現ベクターに連結した。これらの組換えタンパクが多量 に、ＣＯ８細胞の一時的な系、およびＣＨＯ細胞に含まれる安定な発現系の両方 で産生された。

膜結合型および分泌型ＭＣＰの両方を多量に発現させるために、適切なｃＤＮＡ を、ＳＶ４０後期プロモーターの制御のもとに、ｐＳＶＬ　ＳＶ４０後期発現ベ クターにクローン化する。ｐＳＶＬベクターにクローン化したＭＣＰを次に、ジ ヒドロ葉酸リダクターゼ（ｃｌｈｆｒ）遺伝子を有するｐＳＶ３−ｄｈｆｒと共 に、ｄｈｆｒ変異ＣＨＯ細胞株ヘコトランスフェクションさせる。コトランスフ エクションの結果、ＭＣＰを合成するｄｈｆｒ”クローンが生じる。ＭＣＰの高 産生株を次に、高濃度のメトトレキセートの存在下でのインキュベートにより選 択する。

個々のイソフオームの分析のために、それぞれのｃ　ＤＮＡをｐＳＦＦＶ、ｎｅ ｏまたはｐＨｂｒｔａＡｐｒｌ、ｎｅ。

中に配置する。ｃ　ＤＮＡを含むベクターを次に、一時的な株をつくるためにＣ ｏＳ細胞にトランスフェクションするか、または永続的な細胞株をつくるために ＣＨＯまたはＮＩＨ−３７３細胞にトランスフェクションする。永続的な細胞株 が、ＭＣＰの６種の主要なイソフオームに関してつくられ、ＦＡＣ８を使用して 高産生株を選択した。

実ＪＬＩ号」− 試パとしてのモノクローナル Ｅ４．３、ＧＢ−２４およびＴＲＡ−１０と命名した、マウスのモノクローナル 抗体３種を、ヒトＭ　ＣＰに対して調製した。これらの抗体はすべて、ＦＡＣ３ 分析および免疫沈降反応によりＭ　ＣＰと結合し、また、精製され、ｌ−１２５ でラベル化されて、ＭＣＰのエピトープマノピングに関して研究された。

ＴＲＡ２−１０はＥ４．３の結合を阻害し、またＭＣＰのエピトープ上でＥ４． ３を置換し、両者が同一のエピトープに結合することおよびＴＲＡ２−１０がよ り高い親和性を有することを示している。これらの抗体はＧＢ−２４とは競合し ない。

ＧＢ−２４はＭＣＰの補助因子活性を阻害し、一方Ｅ４゜３およびＴＲＡ２−１ ０は阻害しない。

以上のモノクローナル抗体はまた、細胞株およびヒト末梢血球でのＭＣＰのコピ ー数を定量するための、直接的な結合の研究に利用される。例えば、一つのアッ セイでは、プラスチック製のくぼみにコーティングされたＴＲＡ２−１０を利用 し、ＭＣＰについて調べるべきサンプルを加え、洗浄の後、１２５−１でラベル 化したＧＢ−２４を加える。別のアッセイでは、細胞を、ヒト′マウスＩｇと共 に、続いてラベル化したＴＲＡ２−１０と共にインキュベートする；このアッセ イを用いて、種々のヒト末梢血球および細胞株におけるＭＣＰのコピー数／′細 胞を評価する、表１に示した結果が得られ表１ ＭＣＰのコピー数／細胞δ 竺上困１１」巳 赤血球　陰性 血小板　３００から４００ 顆粒球　１０．０００から１２．０００単核　８．０００から１０．０００ ヒト細胞株Ｃ Ｋ　５６２　７６．０００　赤血球性白血病Ｕ９３７　９２，０００　単球状 Ｈｅ　Ｌ　ａ　１００，０００　上皮 Ｈｅ　ｐ−２２５０，０００上皮 ＨＬ−６０６４，０００前骨髄球性臼血病Ｄ　ａ　ｕ　ｄ　ｉ　１２．０００　 Ｂ−リンパ球Ｍｏ　ｌ　ｔ　４　１２．０００　Ｔ−リンパ球Ｒａ　ｊ　ｆ　７ ，０００　Ｂ−リンパ球ＳＫＷ　２５，０００　Ｂ−リンパ球 ＥＢ−１９３８，０００ＥＢウィルス転転換８冫２１ＥＢ−１６／１９　２９， ０００　ＥＢウィルス転転換８冫２１ＥＢ−１９／２５　３３，０００　ＥＢウ ィルス転換Ｂリンパ球ａ、精製したヒト末梢血球群（単核細胞、赤血球、顆粒球 、血小板）またはヒト細胞株をヒト／マウスＩｇＧと共に３０分間４℃で、次に 精製した１２５■−ラベル化モノクローナル抗ＭＣＰと共に１時間４°Ｃでイン キュベートしたくこれらの実験ではＴＲＡ２−１０を利用した）。

ｂ、これらのデータは、別々の二度の機会に測定された二人の正常な個体の範囲 を表す。

Ｃ１少なくとも２回の独立した測定の平均値。

ｏｆ　Ｆｉｇ、１　２５２−２６６　２６７−２８０　ｏｆ　Ｆｉｇ、１ｏｆ　 Ｆｉｇ、　１　ｏｆ　Ｆｌｇ、　１ｏｆ　Ｆｉｇ、　１ ｏｆ　ｆｉｇ、　１ 宝際調査報告 Ｗ＋、＊ａ嘲、＋１＋畠会＾”Ｉ”””＝ＰＣＴ／ｌｌ５９ｏ１０／ｉ１０７１ ｍｖ′ａ＋＋ｅｗｌ＾帥１１０−竜＝”ＰＣＴ／ＩＪＳ９０１０４１０７

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．本明細書で定義した、単離し精製した形態である、哺乳類の細胞膜補助因子 タンパク（ＭＣＰ）。
2. ２．本明細書で定義した、ヒト由来ではない宿主中で組換え産生された、ヒトの 細胞膜補助因子タンパクパ（ＭＣＰ）。
3. ３．図１あるいは図２のアミノ酸１−２５１位に示すアミノ酸配列をコードする ＤＮＡに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ ている、請求の範囲第１項に記載のＭＣＰ。
4. ４．ＭＣＰ活性特性を保持した、図３のヒトイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）に より示されるアミノ酸配列、あるいは、その断片である、請求の範囲第１項に記 載のＭＣＰ。
5. ５．図１のアミノ酸１−２５１位に示すアミノ酸配列に、０個、１個あるいは２ 個のアミノ酸修飾を有する、請求の範囲第４項に記載のＭＣＰ。
6. ６．哺乳類ＭＣＰをコードするＤＮＡ分子でなる、ＤＮＡ分子の組成物。
7. ７．哺乳類ＭＣＰをコードするＤＮＡ分子を含む発現システムであって、該発現 システムが、宿主細胞中に形質転換された時に、該ＭＣＰをコードするＤＮＡの 発現が可能である、発現システム。
8. ８．請求の範囲第７項に記載の発現システムで形質転換された、組換え宿主細胞 。
9. ９．組換えＭＣＰを産生する方法であって：ＭＣＰをコードするＤＮＡの発現を 可能とする条件下で、請求の範囲第８項に記載の細胞をインキュベートする工程 、および、産生されたＭＣＰを回収する工程、 を包含する、方法。
10. １０．請求の範囲第１項に記載のＭＣＰを有効成分として、適切な薬学的な賦形 剤と共に混合して含有する、薬学的組成物。
11. １１．請求の範囲第２項に記載のＭＣＰを有効成分として、適切な薬学的な賦形 剤と共に混合して含有する、薬学的組成物。
12. １２．変化した補体活性により特徴付けられる疾患あるいは状態を処置するため の方法であって、この様な処置が必要な被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ）に、請求の範 囲第１項に記載のＭＣＰあるいはその薬学的組成物の有効量を投薬する工程を含 む、方法。
13. １３．増大した補体活性により特徴付けられる疾患あるいは状態を処置するため の方法であって、この様な処置が必要な被験体に、請求の範囲第２項に記載のヒ トＭＣＰあるいはその薬学的組成物の有効量を投薬する工程を含む、方法。
14. １４．自己免疫疾患を診断する方法であって、標準的な免疫アッセイにおいて、 請求の範囲第１項に記載のＭＣＰと特異的に免疫反応する抗体を使用する工程を 含む、方法。
15. １５．自己免疫疾患を診断する方法であって、標準的な免疫アッセイにおいて、 請求の範囲第２項に記載のとトＭＣＰと特異的に免疫反応する抗体を使用する工 程を含む、方法。
16. １６．哺乳類ＭＣＰをコードするＤＮＡ分子の存在を検出するために有効な、図 １、２および３に示すＤＮＡ配列の部分を含む、ＤＮＡプローブ。