JPH05501458A - 共焦点顕微鏡用レーザ - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 共焦点顕微鏡用レーザ え匪至メ１ 本発明は、共焦点顕微鏡検査に関し、特に、検体内の着色剤を励起するためにレ ーザ光を使用するレーザ走査型の共焦点顕微鏡検査に関する。

１１葛１遣 共焦点顕微鏡検査は、当該技術においてよく知られている。共焦点顕微鏡検査に おいては、像の被写界深度を制限することによって、顕微鏡によって観察される 像が極めて精確な焦点面に閉じ込められる。検体における焦点が合った部分のみ が、検出される。検体における焦点が合っていない部分は、暗く見える。焦点面 の位置を変化させることにより、この重要な原理により、光学的な特徴観察を実 現するための主要な方法が実現される。

最初の共焦点顕微鏡は、非干渉性照明による直視型の設計を使用していた。検体 における照明界は、照明軸上に設けられた小孔によって制限された。そして、こ の小孔の像は、集光レンズによって、検体上に投射された。

検体上の被照明点は、光を反射する（または、後述するように蛍光を発する）。

それから、像の反射光は、対物レンズを介して、検出器に集光される。該検出器 が検体の特定の領域から画素情報を収集できるよう、検体または像に焦点合わせ された光が、ラスターパターンで走査される。次に、画素情報は、検体全体の像 を発生可能なコンピュータに入力される。

走査型の共焦点顕微鏡は、この明細書において参照する、Ｍａｒｖｉｎ　Ｍｉｎ ｓｋｙに付与された米国特許第３，０１３，４６７号に記載されている。走査型 の共焦点顕微鏡の光路は、別々の集光レンズと対物レンズとが同軸内で使用され る、透過照明モードで構成されることができる。代案として、走査型の共焦点顕 微鏡の光路は、図１に示すように、単一の対物レンズを集光レンズおよび対物レ ンズの両方として機能させ、且つ、発せられた光を検出器に集めるために二色ミ ラーまたはハーフミラ−を使用するエビ（ｅｐｉ）照明モードで構成されてもよ い。

Ｍｉｎｓｋｙ特許においては、電磁石により直交する方向に振動する音叉によっ て検体が支持された台を動かすことによって、ラスター走査がなされる。前記台 がラスター走査パターンで動かされるので、検出器によって検出されるのは連続 したラスター走査像である。

観察される検体を着色するために蛍光着色剤を使用することにより、走査型の共 焦点顕微鏡検査が適用される範囲がさらに広くなった。特に、免疫蛍光性組織化 学の分野およびその他の神経解剖技術分野において、着色剤による検体の着色は 、生物組織内における様々な特徴を識別するのに有用である。着色剤は、光の吸 収のみを行なうもの、または、光を吸収するのに応じて光を発する（蛍光）もの で構成することができる。ある特定の蛍光標識は、適当なフィルタセットを用い て照明されたときのみに目視可能であるので、蛍光着色剤は、光の吸収のみを行 なう着色剤に比べて有効である。

蛍光は、光子と発蛍光団との相互作用の結果である。

光の光子が分子に吸収されるとき、光子は、電子をより高い軌道状態にすること により、分子の潜在エネルギを増加する。自然の状態からを高い軌道状態にされ た電子は、その後、自然状態に帰還する傾向がある。電子が高い軌道状態からよ り低い軌道状態になるとき、該２つの軌道状態の間のエネルギ差に等しいエネル ギが放出される。この際、エネルギの一部または全部は、放出エネルギに比例し た波長（スペクトル線）を持つ光子として放出される。その結果束じる冷光は、 蛍光（場合によっては蛍リン光）と呼ばれている。１つの波長における発蛍光団 分子の励起は、典型的には、より長い波長の蛍光を発生する。

走査型のレーザ共焦点顕微鏡は、干渉性の光を使用して着色された検体を走査す ることによって、走査型の共焦点顕微鏡の設計、および、発蛍光団の使用を改良 したものである。レーザ光の単色光、高強度および低い分散性が、発生される像 の改善に貢献した。図２に示すように、先行技術に係るエビ照明、レーザ走査型 の共焦点顕微鏡において、レーザ光２００は、ハーフミラ一または二色ミラー２ ０５を使用することにより、上方から検体２２０を走査し、入射光と同一の光路 に沿って検出器２１５に反射される。典型的には、検体は、該検体内の特定の特 徴を強めるために蛍光着色剤によって着色される。

図２に示されているＭＲＣ−６００レ一ザ走査型共焦点顕微鏡システムは、英国 のイングランド、ハーフ、ヘメル・ヘンブステッドにあるＢｉｏＲａｄ　Ｍｉｃ ｒ。

５ｃｉｅｎｃｅ社によって製造されたものである。このレーザ走査型共焦点顕微 鏡システムは、Ｎ１ｋｏｎＳＺｅｉｓｓ、ＯｌｙｍｐｕｓＳＬｅｉｔｚ等の顕微 鏡メーカーから入手可能な多くの起立型顕微鏡および倒立型顕微鏡とともに使用 可能である。干渉性の照明は、５１４ナノメータ（ｎｍ）および４８８ｎｍの主 要な線を有するアルゴンイオンレーザである。さらに、発せられるレーザ２００ は、アルゴンによって決定される複数のわずかなスペクトル線を有する。該スペ クトル線は、励起フィルタ２０３によって４８８ｎｍ（青色）または５１４ｎｍ （緑色）のスペクトル線を選択する、外部フィルタ２０３によってフィルタ処理 される。選択された光は、蛍光結像に使用される二色ミラーを含むビームスプリ ッタ２０５によって反射される。単純な反射結像が要求される場合、二色ミラー ２０５の代わりに半反射またはハーフミラ−を使用してもよい。

アルゴンイオンレーザとしては、米国のユタ州、ツルトレイクシティにあるＪｏ ｎ　Ｌａ５ｅｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社の部品番号５４２５Ａが利用可能であ る。

アルゴンイオンレーザは、レーザ光のスペクトル線の励起波長に応じて検体内で わずかにずれた光を発する、検体内の蛍光着色剤を励起するのに使用される。着 色剤は、光に対する感度、検体内において観察することが所望の特徴との親和力 、および、蛍光能力に基づいて、選択される。

レーザからの光２００は、走査ユニット２０７におい夕走査される。それから、 レーザビームは、走査ユニット２０７によって発生された走査スポットが検体を 走査するよう、顕微鏡の接眼レンズを通って検体上に達する。

反射光つまり検体からの蛍光が、入射レーザ光と同一の光路に沿って走査ユニッ トに戻る。光の反射はミラーが位置シフトを行なわない程高速であり、その結果 、光は当初の光路を逆方向にさかのぼる。反射光つまり検体からの蛍光は、ハー フミラ一または二色ミラー２０５を通って、光電子増倍管に達する。

図２に示したＢｉｏＲａｄから入手可能なレーザ走査型共焦点結像システムは、 ２つの異なる蛍光着色剤を同時に結像しようとするものである。アルボイオンレ ーザ２０１からの５１４ｎｍのスペクトル線は、フルオレスセインおよびＴＥＸ ＡＳ　ＲＥＤ”（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社から入手可能）の両方を 励起するのに使用される。これは、検体における選択された特徴が異なる色に着 色され、−緒に観察される得るよう、異なる蛍光着色剤を同時に励起しようとす るものである。２つの像は、光電子増倍管２１３．２１５に取込まれる。

第２のビームスプリッタは、１つの波長の光が光電子増倍管２１３に向けられ、 その波長の光が光電子増倍管２１５に向けられるようにする二色ミラーである。

光電子増倍管２１３．２１５から取込まれる２つの像は、表示器２２４上におい て単一の焦点面に検体の像を形成するために、コンピュータ２２によって利用さ れる。

２つの異なる蛍光着色剤が全く同一の焦点面に結像することにより、同一の検体 における特定の異なる特徴を確認することが可能になる。先行技術による二色レ ーザ走査型共焦点顕微鏡システムの課題は、アルゴンイオンレーザの５１４ｎｍ のスペクトル線が２つの蛍光着色剤（フルオレスセインおよびＴ　ｅ　ｘ　ａ　 ｓ　Ｒｅ　ｄ　Ｔｌ″）を同時に励起する、ということである。この同時の励起 により、誤った結像がなされ、および、コンピュータによって発生される像にお いて、特徴の詳細が喪失することとなる。

図３はＢｉｏＲａｄ　Ｍｉｃｒｏｓｃｉｅｎｃｅによって発表されたグラフであ り、フルオレスセインおよびＴＥＸＡＳ　ＲＥＤ”の吸収、発光スペクトルを示 すものである。このグラフは、Ｂ　ｉｏ　Ｒａ　ｄから再生されたもので、スペ クトルを擬似したものにすぎない。曲線３ｏ１はフルオレスセインの吸収スペク トルを示し、曲線３０３はフルオレスセインの発光スペクトルを示す。曲！１３ ０５はＴＥＸＡｓ　ＲＥＤ”（７）吸収、２．ぺ’）／１４示し、曲＃ｉ！３０ ７はＴＥＸＡＳ　ＲＥＤ”の発光スペクトルを示す。図３から分かるように、５ １４ｎｍにおいて、ＴＥＸＡＳ　ＲＥＤ”の吸収スペクトルとフルオレスセイン とが重なる。このように、アルゴンレーザの単一の５１４ｎｍ線によって励起さ れると、フルオレスセインおよびＴＥＸＡＳ　ＲＥＤＴ’の励起および発光が同 時に起こる。さらに、図３には、フルオレスセインの発光スペクトルおよびＴ　 Ｅ　Ｘ　Ａ　Ｓ　ＲＥ　Ｄ　ＴＭの発光スペクトルの大きなエリアにおける重な りが示されている。

図３におけるフルオレスセインおよびＴＥＸＡＳ　ＲＥＤ７′″の吸収、発光ス ペクトルの下方には、比較目的で、フィルタおよび二色反射器の応答曲線が示さ れている。

アルゴンレーザを用いて着色剤を励起する場合、着色剤の５１４ｎｍ線のみが図 ２の励起フィルタ２０３を通過可能な線である。図３の狭小な波長応答曲線３０ ９は、励起フィルタ２０３に関するものである。応答曲線３１１は二色反射器２ ０５に関し、応答曲線３１３は二色反射器２０７に関するものである。応答曲線 ３１５は緑色チャンネルフィルタ２１１に関し、応答曲線３１７は赤色チャンネ ルフィルタ２０９に関するものである。

図３から分かるように、アルゴンレーザの単一の５１４ｎｍ線によりフルオレス セインおよびＴＥＸＡＳ　ＲＥＤｔ＋″の両方を励起する。そして、これら各々 の着色剤の発光スペクトルは、図２の光電子増倍管２１３．２１５に進み、独立 して検出されて、同一の焦点面において２色の像を再現する。この先行技術の問 題点は、アルゴンレーザからの励起線がＴＥＸＡＳ　ＲＥＤ”よりフルオレスセ インの方をより効率的に励起することである。

例えば、図３に示すように、５１４ｎｍの波長でのフルオレスセイン着色剤の励 起率は、約５０％である。しかしながら、同じ５１４ｎｍの波長でのＴＥＸＡＳ 　ＲＥＤＴｌ″の励起率は、極めて低い（３％未満）。前記着色剤の発光スペク トルは該着色剤によって吸収されるエネルギの量に対応し、比例するので、ＴＥ ＸＡＳ　ＲＥＤ”により５１４ｎｍから吸収されるエネルギが少量であることに より、発光される蛍光は極めて少量となる。このため、赤色チャンネルに見られ るフルオレスセインの発光量は、フルオレスセインおよびＴＥＸＡＳ　ＲＥＤＴ Ｍの相対的な濃度に従って変化である。前記着色剤の相対的な濃度および飽和度 が精確に制御されないかぎり、ＴＥＸＡＳ　ＲＥＤ”の発光スペクトルは、フル オレスセイン発光スペクトルのより長い波長の“こぼれ出”によって圧倒される 。このような混乱により、フルオレスセインのみによって染色された特徴の多く が両方の像に現れることとなる。この問題点に対する１つの解決法は、両方の着 色剤をより効果的に励起できるよう、個別のレーザ線を使用することである。

２つのレーザを用いて異なる蛍光色素によって着色された検体を多くの線で励起 する技術も、当該技術分野において知られている。例えば、５ｐｅｃｔｒａ−Ｐ ｈｙｓｉｃｓの３ワット水冷式、２０２５アルゴンイオンレーザ（３５１ｎｍ〜 ５２８ｎｍの単一のアルゴンイオンに同調可能である）が、４８８ｎｍ〜５１４ ｎｍの固定波長を有する５ミリワツト、水冷式アルゴンイオンレーザと共通の焦 点に整列された。しかし、前記２つのレーザの整列は、はなはだしい焦点上の問 題を生じる。つまり、同一の焦点面が確実に実現されるよう、２つの光路が厳し い基準に従って整列される必要がある。

え肛旦ｎ 上述した先行技術の問題点、及び、本明細書を読んで理解すれば当業者に明白と なるその他の従来技術の問題点は、本発明によって解決される。本発明は、多線 出力を有する単一レーザを用いて複数の着色剤を同時に又は個々に励起する、顕 微鏡と共に用いる本当の多色レーザ走査型共焦点結像システムを提供する。異な る着色剤によって着色された検体の特徴を示す像を再生できるよう、像は複数の 光電子増倍管によって同時に観察される。また、時分割式に単一の検出器を用い 、且つ、像を形成するためのコンピュータを用いて、像を形成してもよい。

Ｋ血至盈ｊ 図面のいくつかを通じ、同様の部材には同様の符号が付されている。

図１は、先行技術に係る共焦点顕微鏡システムの概略図である。

図２は、先行技術に係るレーザ走査型の共焦点結像システムの概略図である。

図３は、図２の様々な構成要素のスペクトル応答を示す図である。

図４は、本発明における様々な構成要素の典型的な配置を示す配置図である。

図５は、２つの検出器を使用した二色共焦点顕微鏡システムを示す概略図である 。

図５ａは、図５の様々な構成要素のスペクトル応答を示す図である。

図６は、時分割多重式の単一の検出器を使用したレーザ走査型の共焦点結像シス テムを示す図である。

図７は、様々な蛍光着色剤の吸光スペクトルおよび発光スペクトル示す図である 。

図８は、図６に示した、時分割多重式の単一の検出器を使用したレーザ走査型の 共焦点結像システムを示す概略図である。

図９は、３つの検出器を使用した多検出器、多色共焦点顕微鏡システムの概略図 である。

の−な！Ｂ 以下の好適実施例の詳細な説明において、本明細書の一部をなし、本発明を包含 する好適実施例を例示する添付図面を参照する。これらの実施例は、当業者によ る実施を可能ならしめるに充分な程度に説明されている。また、他の実施例か可 能であるとともに、本発明の範囲内での構成上の又は物理的な変更ができる。従 って、以下の詳細な説明を制限的に解釈してはならず、本発明は請求の範囲に記 載した通りのものである。

図４は、この発明を構成する各種構成要素の典型的な配置を示す。この配置は、 ＢｉｏＲａｄ　Ｍｉｃｒｏｓｃｉｅｎｃｅ社によって製造されたＭＲＣ−６００ レ一ザ走査型共焦点結像システムのものと同様である。この発明の共焦点顕微鏡 システムは、Ｎ１ｋｏｎ、Ｚｅｉｓｓ、ＯｌｙｍｐｕｓＳＬｅｉｔｚ等の顕微鏡 メーカーから入手可能な起立型顕微鏡および倒立型顕微鏡とともに使用可能であ る。この発明の光学素子およびスキャナヘッドは、キャビネット４０１に収納さ れている。多線レーザ光がキャビネット４０１に進入するよう、レーザ光源４０ ３は、前記キャビネットに隣接して支持されている。図示の構成において、レー ザ光は、前記キャビネット４０１から出て顕微鏡４０５にその上方から進入する 。

該顕微鏡４０５からは、入射レーザ光と同一の光路に沿って光が反射される。

キャビネット４０１は、この発明の好ましい実施例では光電子増倍管である検出 器を含む。検出器としては、ＣＣＤ、ビジコン管等のその他の検出器を使用して もよい。キャビネット４０１内の検出器およびスキャナは、検体の像を形成して 表示器４０９に表示するコンピュータ４０７に接続されている。

図５は、好ましい実施例による基本的な二色結像システムの略図である。図５に 示した走査型共焦点顕微鏡の走査ユニットおよびその他のミラー（後で詳述する ）は、明確さのために省略されている。図５ａは、図５の構成要素に関するスペ クトル応答曲線を示すグラフである。

図５および図５ａは、−緒に考察すべきである。レーザ光源５０１は、前出のＩ ｏｎ　Ｌａ５ｅｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手可能な、水冷クリプトン・ア ルゴンイオンレーザのモデル番号５４７０−ＫＢＲである。このレーザは、４８ ８ｎｍ、５６８ｎｍおよび６４７ｎｍの主要スペクトル線を発生する。このレー ザの設計によると、４８８ｎｍ、５６８ｎｍおよび６４７ｎｍの線のみが発せら れるよう、その他の主要でない線が抑制される。後で詳述するように、その他の レーザおよびその他の選択されたレーザ光線を用いて、好ましい実施例を実現し てもよい。

レーザ光５００は、励起フィルタブロック５０３を介してフィルタ処理される。

励起フィルタブロック５０３は、ユーザにより選択可能な複数のフィルタを含む 。選択されたフィルタは５０３ａであり、これは、４８８ｎｍおよび５６８ｎｍ の光を通過させる二帯域フィルタである。図５の応答曲線５５３ａおよび５５３ ｂは、二帯域フィルタ５０３ａのスペクトル応答を示す。レーザ５０１からの２ つの線を選択するのは、検体内の２つの着色剤を励起するためである。図５ａの 応答曲線５５１．５５２は、フィルタ５０３ｂ、５０３ｃに対応するものである 。フィルタ５０３ｂ、５０３ｃを用いて、レーザ５０１からの４８８ｎｍまたは ５６８ｎｍの線をそれぞれ選択してもよい。

フィルタ処理されたレーザ光は、二色フィルタブロック５０５に進む。二色フィ ルタブロック５０５は、４８８ｎｍおよび５６８ｎｍの両方の線を反射するため に選択され、また、フルオレスセインから発せられた蛍光における５　００〜５ ４０　ｎ　ｍの線、および、ＴＥＸＡＳＲＥ　Ｄ　”から発せられた蛍光におけ る５８５〜６５０ｎｍの線を伝えるために選択される。図５の応答曲線５５５は 、二色ミラー５０５のスペクトル応答を示す。

フルオレスセインの励起により、着色剤からは、励起光より長い波長の光が発せ られる。４８８ｎｍおよび５６８ｎｍの線を有する入射レーザ光が、検体５０７ に向けられる。検体は、該検体の特徴を強調するために、フルオレスセインおよ びＴ　Ｅ　Ｘ　Ａ　Ｓ　ＲＥ　Ｄ　”によって着色されたものである。前記着色 剤から発せられた光は、励起レーザ光と同じ光路をたどって二色フィルタブロッ ク５０５に達する。上述の如く、このフィルタブロック５０５は、フルオレスセ インに関する５００〜５４００ｍの波長の光、および、ＴＥＸＡＳ　ＲＥＤ”に 関する５８５〜６５０ｎｍの波長の光を通すように選択されたものである。図５ の応答曲線５５５は、二色ミラー５０５の三帯域通過スペクトル応答を示してい る。

発せられた光はその全体が反射器５０９で示されたいくつかの反射器に達し、該 反射器５０９では、前記光を第２のフィルタブロック５１１に向ける。フィルタ ブロツク５１１は、５８５〜６５０ｎｍの範囲の光を通し、５００〜５４０ｎｍ の範囲の光を反射する。図５の応答曲線５６１は、二色ミラー５２１のスペクト ル応答を示している。光電子増倍管５１３は、二色ミラー５１１から伝えられ、 低域通過フィルタ５１５によりフィルタされた光を検出する。好ましい実施例に おいて、フィルタ５１５は、Ｏｍｅｇａ社から入手可能な５８５ＬＰ低域通過フ ィルタである。図５の応答曲線５６２は、フィルタ５１７のスペクトル応答を示 している。光電子増倍管５１３はコンピュータ（図５では図示せず）に接続され ており、該コンピュータでは、検出された情報を用いて、検体の選択された焦点 面に像を作る。簡略化のため、スキャンヘッドも図５に示されていない。

フィルタブロック５１１から反射された５００〜５４０ｎｍの範囲の光は、Ｏｍ ｅｇａ社から入手可能な低域通過フィルタであるのが好ましい、フィルタ５１７ に向けられる。図５の応答曲線５６３は、フィルタ５１５のスペクトル応答を示 している。フィルタ５１７を通過した光は、光電子増倍管５１９によって検出さ れる。検出された情報は光電子増倍管５１３に接続されたものと同じコンピュー タに送られ、該コンピュータによって、検体５０７におけるフルオレスセインに よって着色された特徴を示す第２の像がつくられる。光電子増倍管５１３によっ て検出された像は、ＴＥＸＡＳ　ＲＥＤＴＭ着色剤によって着色された特徴を示 すものである。部品を移動することなしに検体の同一の焦点面を走査するために 同一のレーザ光ビームが使用されるので、２つの光電子増倍管により検出され、 コンピュータにより作られた像は、正確な焦点面にあることとなる。このように して、着色剤が同一のレーザからの異なる線によって個々に励起される、本当の 多色同時結像システムが構成される。

励起フィルタブロック５０３は、フルオレスセインおよびＴＥＸＡＳ　ＲＥＤＴ ｌ″に対応する着色エリアを個々に選択し、観察するため、帯域通過フィルタ５ ０３ｂ。

５０３ｃを含む。励起フィルタを切り替える際、二色ミラーを含むフィルタブロ ックは移動されないので、形成される像は、焦点面に対して完全に整列される。

このようにして、ユーザは１、コンピュータによってつくられるべき単一色像、 または、完全に整列した多色像を選択できる。

クリプトン・アルゴンレーザ５０１による着色剤の励起は、レーザ光のスペクト ル線を選択することによって容易化される、といことが当業者により理解される であろう。また、４７６ｎｍ／４８２ｎｍ、５２０ｎｍ、５６８ｎｍおよび／ま たは６４７ｎｍの主要な線を有するクリプトンレーザを用いて、選択された着色 剤を励起し、図５に関して前述したものと同様な結果を得るようにしてもよい。

こうして、フィルタおよび二色ミラーにわずかな調整を施したクリプトンレーザ が、この発明に許容可能な結果を発生することとなる。

図６は、この発明の変更例による多色、単一検出器、レーザ走査型の共焦点結像 システムを示す。多色像は、コンピュータにより情報を時分割多重式に収集する ことによって、単一の検出器から連続的につくられる。この実施例で使用される レーザも、Ｉｏｎ　Ｌａ５ｅｒ　Ｔｅｃｈｎｏ　Ｉｏｇｙ社か、ら入手可能な水 浴クリプトン・アルゴンイオンレーザ、モデル５４７０−ＫＢＲである。

フィルタおよび二色ミラーを適当に選択することにより、Ｉｏｎ　Ｌａ５ｅｒ　 Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から入手可能な水冷クリプトン・アルゴンイオンレーザ 、モデル５４７０−にその他のクリプトンレーザを使用することができる、とい うことが当業者にとって自明であろう。

その他のメーカーが製造するレーザも、この発明に使用可能である。

クリプトン・アルゴンイオンレーザ６０１は、４８８ｎｍ、５６８ｎｍおよび５ ４７ｎｍの主要なスペクトル線を発生する。表１は、クリプトン・アルゴンイオ ンレーザ６０１とともに使用されるフィルタおよびミラーを示す。図６に関して 説明する好適実施例において、励起フィルタ６０７、二色ミラー６０９および発 光フィルタ６１１は、すべて、単一のフィルタブロック６０５に設けられている 。このようにして、単にフィルタブロック６０５を取り外すことにより、他の光 学素子を妨害することなく、これらのフィルタの組合わせセットを容易に交換可 能である。

表１ フィルタ　レーザ線　励起　二色　発光ブロック　フィルタ　フィルタ　フィル タ青色　４８８ｎｍ　４８８ＤＦ１０　５００ＤＣＬＰ　５２２ＤＦ３５黄色　 ５６８ｎｍ　５６８ＤＦ１０　５８５ＤＣＬＰ　６００ＤＦ２０赤色　６４７ｎ ｍ　６４７ＤＦ１０　６６０ＤＣＬＰ　６６５ＬＰ前記レーザのクリプトンガス は、特に、４７６／４８２ｎｍ、５２０ｎｍ、５６８ｎｍおよび６４７ｎｍのス ペクトル線を発生する。アルゴンガスは、特に、４８８ｎｍおよび５１４ｎｍの スペクトル線を発生する。クリプトン・アルゴンレーザは、４８８ｎｍ、５６８ ｎｍおよび６４７ｎｍの線を除くすべての線を抑制するよう設計されている。ア ルゴンガスからの４８８ｎｍの線はフルオレスセインをより効率的に励起するの で、クリプトン・アルゴン混合ガスレーザが好ましい。しかし、クリプトンの４ ７６　／　４８２　ｎ　ｍ線からの十分なエネルギがこの発明に使用されるフル オレスセインを励起できる、ということは当業者に自明であろう。このため、適 当なフィルタおよび二色ミラーの組合せと共に、クリプトンレーザをこの発明に 使用してもよい。

Ｉｏｎ　Ｌａ５ｅｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から入手可能なりリプトン・アル ゴンレーザは、コストが安く容易に冷却されるので、水で冷される。液体つまり 水で冷されるレーザは、冷却剤用の管の周囲において液体を汲み出す作用により 振動を受けるので、空気により冷却されるレーザが好ましい。もちろん、空冷式 の高性能レーザと水冷式の高性能レーザとのコスト差のため、空冷式のレーザも 好ましい。

図６を再度参照するに、検体６０３は、３つの着色剤、つまり、フルオレスセイ ン、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ　ロダミン（またはＴＥＸＡＳ　ＲＥＤ”）およびシア ニン５゜１８によって、着色される。これらの着色剤は、前記クリプトン・アル ゴンレーザに関して説明したレーザ線によって励起され、他の着色剤からの干渉 なしに光電子増倍管によって検出可能である。しかし、場合によっては、光電子 増倍管が赤色光に対して感度が低いので、シアニン５．１８に関してより高いレ ベルの光が必要となるかもしれない。

図７は、図６のレーザ６０１の説明とともに考察すべきであり、図６の検体６０ ３を着色するために使用可能な選択された着色剤の吸光スペクトルおよび発光ス ペクトルを示すグラフである。図７のグラフは、相互の強度を示すため０〜１０ ０の段階で正規化されたスペクトル応答を示す。曲線７０１はフルオレスセイン の吸光スペクトルに対応し、曲線７０３はフルオレスセインの発光スペクトルに 対応する。曲線７０５はＬｉｓｓａｍｉｎｅ　ロダミンの吸光スペクトルに対応 し、曲線７０９はＬｉｓｓａｍｊｎｅ　ロダミンの発光スペクトルに対応する。

曲線７１１はシアニン５．１８の吸光スペクトルに対応し、曲線７１３はシアニ ン５．１８の発光スペクトルに対応する。励起光を適当に選択することにより、 様々な選択された着色剤の吸光スペクトルおよび発光スペクトルが、図６に示す ように別個の光電子増倍管によるフィルタリングおよび検出かできる程度に、取 り出される。

図８は図６の様々なフィルタの応答曲線を示すものである。応答曲線は、青色、 黄色および赤色の３つのフィルタブロックの１つの一部分として示されている。

応答曲線８０１は、Ｏｍｅｇａ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社から入手可能な４８８ 発光フイルタ、部品番号４８８ＤＦ１０の応答曲線に対応している。応答曲線８ ０３は、Ｏｍｅｇａ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社から入手可能な二色ミラー５００ ＤＣＬＰロングパスフイルタに対応する。

応答曲線８０５は、Ｏｍｅｇａ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社から入手可能な発光フ ィルタ５２２ＤＦ３５に対応する。応答曲線８０１．８０３．８０５は、青色の フィルタブロックの一部分である。

黄色のフィルタブロックに関して、応答曲線８０７は、１０ｎｍ幅の発光フィル タ、部品番号５６８ＤＦ１０に対応している。応答曲線８０９は、Ｏｍｅｇａ　 Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社から入手可能な二色ミラー５８５ＤＣＬＰに対応する。

応答曲線８１１は、Ｏｍｅｇａ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社から入手可能な発光フ ィルタ、部品番号６００ＤＦ２０に対応する。

赤色フィルタのセットは、応答曲線８１３．８１５．８１７に対応する。応答曲 線８１３は、励起フィルタ、部品番号６４７ＤＦ１０の応答曲線である。応答曲 線８１５は、Ｏｍｅｇａ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社から入手可能なロングパス二 色ミラーフィルタ６６０ＤＣＬＰに対応している。応答曲線８１７は、Ｏｍｅｇ ａ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社から入手可能なロングパスフィルタ６６５ＬＰであ る発光フィルタに対応している。

再び図６を参照するに、時分割多重式の、３色共焦点顕微鏡は、検体６０３内の 観察しようとする色に対応するフィルタブロック６０５を変化することによって 実現される。フィルタブロック６０５は、励起フィルタ６０７、二色ミラー６０ ９および発光フィルタ６０９は、観察される特定の着色剤に対応するようまとめ て変化される。レーザ６０１からの多スペクトル線レーザ光は、前記クリプトン ・アルゴンレーザから発生可能なレーザ線の１つを選択する、選択された励起フ ィルタ６０７に進入する。選択された線を有するレーザ光は、選択された線に対 応する、予め選択された二色ミラー６０９によって反射される。

二色ミラー６０９は、選択された線を含むレーザ光を、ＸＹ走査ユニット６１３ 上に反射する。ＸＹ走査ユニ・ノド６１３により、レーザビームが検体上をラス ク走査する。ＸＹ走査ユニット６１３は、ＢｉｏＲａｄ　Ｍｉｃｒｏｓｃｉｅｎ ｃｅ社のＭＲＣ−６００共焦点結像システムで利用可能である。ＸＹ走査ユニッ ト６１３は２つのミラーを含み、該２つのミラーは、選択された走査速度でミラ ーを動かす検流計に接続されている。前記ミラーの一方はＸ軸走査を行なうため のものであり、前記ミラーの他方はＹ軸走査を行なうためのものである。走査は 、光電子増倍管による像入力、ならびに、コンピュータ６２０における走査カー ドおよびフレームスドアによるコンピュータ像の発生に同期される。

上記のレーザ線を含む走査されたレーザ光は、顕微鏡の対物レンズを介して検体 ６０３上に投射される。選択されたレーザ線に対応する着色剤は、励起に呼応し て、蛍光を発し、より長い波長の光を発する。該より長い波長の光は、同一の光 路に沿って、走査ユニット６１３を通って二色ミラー６０９に戻った後、発光フ ィルタ６１１に達する。発光フィルタ６１１、前記選択されたレーザ光および観 察すべき着色剤に対応する上述のグループから選択される。

フィルタ６１１を介して発せられる光は光電子増倍管６１５に達する。、該光電 子増倍管６１５では、走査された像を入力し、電気的な像に変換し、コンピュー タ６２０に送る。コンピュータ６２０では、前記選択された線によって励起され ている特定の着色剤に関する像を作りなおす。

この処理は、観察しようとする各色について行なわれる。フィルタ６０７．６１ １および二色ミラー６０９を含むフィルタブロック６０５は、レーザ、検体また は光電子増倍管の整列を乱すことなく、容易に変更可能である。こうして、検体 は、第２の着色剤のためのフィルタブロックを用いて走査可能になる。しかしな がら、フィルタブロックを変更することにより、フィルタブロックにおける二色 ミラーのわずかな角度差により、焦点面における走査領域が、Ｘ７面においてわ ずかに移動する。

像が得られると、コンピュータでは、２つの像を組合せ、整列させることにより 、実際の２色像または擬似カラー像を作る。しばしば、コンピュータによって作 られた像の１つの色が検体から検出された色に対応する、擬似カラー像が作られ る。検体から取込まれる実際の色よりきわだったコントラストの色を見るほうが 美感的であるので、検体から検出される色は、特定の着色剤により着色された特 徴を強調するためにコンピュータによって使用される色に対応しないことがある 。

さらに、フィルタブロック６２０を第３のフィルタセットによって置き換え、第 ３の色を走査し、該走査した第３の色をその前の２つの像に組合せて、コンピュ ータ６１５によって実際の３色像を作るようにしてもよい。

図９は、三色像を作るためにフィルタブロックを交換することを必要としない、 三色レーザ走査型の共焦点顕微鏡を示す。図９の実施例において、３つのレーザ 線が着色剤を同時に励起することにより、３色の像が同時に走査されてもよい。

レーザ６０１は、上述のようにクリプトン・アルゴンレーザである。多線レーザ 光６００は、広帯域通過フィルタ９０７を通過することにより、多通過帯域二色 ミラー９０９によって反射される。レーザ励起光６００は、走査ユニット９１３ によってラスク走査され、顕微鏡の接眼レンズに進入する。

検体６０３は、励起されたときに蛍光を発する前述の着色剤によって着色される 。発せられた光は、走査ユニット９１３を介して、励起レーザ光がたどったのと 同一の光路をたどる。発せられた光は、励起光より長い波長を有するものであり 、多通過帯域二色ミラー９０９を通過した後、青色を反射しその他の色を通過す るよう選択された第２の二色ミラー９１７に達する。光電子増倍管９１５は、発 光フィルタ６０７によってフィルタされたフルオレスセインによって発せられた 青色光を取込む。

前記より長い波長の光は、第２の二色ミラー９１７を通過することにより、赤色 の光を反射しより長い波長の赤色の光を通過するよう選択された、第３の二色ミ ラー９１９に達する。光電子増倍管９２１は、発光フィルタ９２５によってフィ ルタされたＬｉｓｓａｍｉｎｅロダミン（またはＴ　Ｅ　Ｘ　Ａ　Ｓ　ＲＥ　Ｄ 　？１′）により発せられた赤色の光を取込む。光電子増倍管９２３は、シアニ ン５゜１８により発せられたより長い波長の赤色の光を取り込む。

フルオレスセイン結合着色剤は、検体を着色し選択された特徴を検査するために 、この発明の好ましい実施例に使用可能ないくつかの着色剤の１つである。表２ は、この発明に使用可能な多数の着色剤を示す。

表２ １１Ｊ フルオレスセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）ボラート・ディピロメタン（ Ｂｏｄｉｐｙ）ルシフエールイエロー テトラメチルロダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ　 ロダミン ＴＥＸＡＳ　ＲＥＤ”　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社から入手可能） アロピコシアニン Ｕｌｔｒａｌｉｔｅ　Ｔ−６８０”（シアトルのＵｌｔｒａ　Ｄｉａｇｎｏｓｔ ｉｃｓ社）Ｕｌｔｒａｌｉｔｅ　Ｔ−７００”（シアトルのＵｌｔｒａ　Ｄｉａ ｇｎｏｓｔｉｃｓ社）カルボキシシアニン派生物（例えば、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｐｒｏｂｅｓ社またはペンシルベニア州のＪａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅ ｓｅａｒ−ｃｈ　Ｌａｂｓ社から入手可能なシアニン５．１８）挟ｌユ溝 シロモマイシン　Ａ３（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社）（フルオレスセイン に特有且つスペクトル的に類似のＤＮＡ）臭化エチジウム ヨウ化プロピジウム ＬＤ７００（オハイオ州のＥｘｃｉｔｏｎ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社）アクリジンオ レンジ パラローザニリン（フォイルゲン反応の最終生成物）生」Ｌ芥１」【累 Ｆｌｕｏ−３”　（カルシウム指示薬）　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ 社）Ｒｈｏｄ−２”　（カルシウム指示薬）ＳＮＡＦＬＴＭ（ｐ　ｈ指示薬） ＳＮＡＲＦＴＭ（ｐ　ｈ指示薬） ＦＩＧ、　５ ＦＩＧ、　５Ａ ４５０　５００　５５０　６００　６５０　ｎｍ４５０　５００　５５０　６０ ０　６５０　ｎｍスｌよ 要　約　書 多線出力を有する単一レーザを用いて複数の着色剤を同時に又は個々に励起する 、顕微鏡と共に用いる本物の多色レーザ走査型共焦点結像システムが提供された 。異なる着色剤によって、着色された検体の特徴を示す像を再生できるよう、像 は複数の光電子増倍管によって同時に観察される。また、時分割式に単一の検出 器を用い、かつ、像を形成するためのコンピュータを用いて、像を形成してもよ い。

国際調査報告 国際調査報告

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．特定の周波数の光によって励起された時に蛍光を発する複数の着色剤によっ て着色された検体を観察する際、光学顕微鏡と共に使用される多色共焦点顕微鏡 システムであって、 単一のレーザ光源から、各々が前記着色剤のうちの１つの励起周波数に対応する 多数の励起線、を含んだ多線入射レーザ光を発生するレーザ手段と、前記入射レ ーザ光を前記顕微鏡に導き入れ、且つ、前記顕微鏡から発せられ、各々が前記着 色剤のうちの１つの励起周波数に対応する多数の蛍光、を含む光を取り込むため の取込み手段と、 前記顕微鏡から発せられる光を取り込むよう配置されていて、前記光を電気信号 に変換する検出手段と、前記検出手段に接続されていて、前記電気信号を累積し 、正確な焦点面に、各々が前記レーザの線の１つに対応する前記検体の複数の像 、を作る制御手段とを具備した多色共焦点顕微鏡システム。
2. ２．前記レーザ手段に接続されていて、２つ以上の前記着色剤を励起することと なる前記多数の励起線の発生を抑制するための手段を含む、請求項１の多色共焦 点顕微鏡システム。
3. ３．前記入射レーザ光の光路に配設されていて、前記レーザ手段からの前記励起 線のうち選択された励起線を選択的に通過させるフィルタ手段を含む、請求項１ の多色共焦点顕微鏡システム。
4. ４．前記顕微鏡から発生される光の光路に配設されていて、前記蛍光のうち選択 された蛍光を前記検出手段に対して選択的に通過させるフィルタ手段を含む、請 求項１の多色共焦点顕微鏡システム。
5. ５．前記フィルタ手段が、各前記蛍光を分離した光路に分離し、各前記光路を前 記複数の検出器のうちの１つに導き入れるため前記顕微鏡から発生される光の光 路に配設された二色ミラーを含む、請求項４の多色共焦点顕微鏡システム。
6. ６．前記検出手段が、一度に１つの線を検出し、時分割多重式に多色の光学像を 作るための手段を含む、請求項３の多色共焦点顕微鏡システム。
7. ７．前記取込み手段が、前記入射レーザ光により前記検体をラスタ走査するため の手段を含み、前記検出手段が、前記反射された光を走査するための手段を含む 、請求項１の多色共焦点顕微鏡システム。
8. ８．前記制御手段が、複数の擬似色で前記検体を表示する表示手段を有するコン ピュータを含み、各前記擬似色が前記着色剤のうちの１つの着色剤の発光に係る 蛍光に対応するものである、請求項１の多色共焦点顕微鏡システム。
9. ９．前記レーザ手段が、単一のクリプトン・アルゴンレーザを含む、請求項１の 多色共焦点顕微鏡システム。
10. １０．前記クリプトン・アルゴンレーザは、各線がフルオレスセイン着色剤、リ ザミンロダミン着色剤およびシアニン５．１８着色剤のうちのせいぜい１つを励 起するような、複数のレーザ線を発生するものである、請求項９の多色共焦点顕 微鏡システム。
11. １１．前記検出手段が光電子増倍管を含むものである、請求項１の多色共焦点顕 微鏡システム。
12. １２．複数の着色剤によって着色された検体を観察する光学顕微鏡と共に使用さ れる多色共焦点顕微鏡システムであって、 複数の線を有するレーザ光を発生する多線レーザであって、前記線のうちのある ものは前記レーザから発するのが選択的に阻止され、前記線のうちの他のものが 前記レーザから励起線として選択的に発せられるようになっており、各前記発せ られる励起線が前記複数の着色剤のうちのただ１つ着色剤の励起周波数に対応す るものである、多線レーザと、 各々が前記レーザ光の光路に選択的に配置された複数の励起フィルタと、 前記励起フィルタの後方において前記レーザ光の光路に配置されており、励起線 を反射し、発せられた蛍光を通過するよう選択された第１の二色フィルタと、前 記第１の二色フィルタから前記レーザ光を取り込み、前記レーザ光を前記顕微鏡 中にラスタ走査パターンで反射するよう配設されており、さらに、前記顕微鏡か ら前記蛍光を取り込み、前記ラスタ走査パターンを走査し、前記第１の二色フィ ルタを介して前記蛍光を反射するよう配設されている走査ユニットと、 前記第１の二色フィルタの後方において前記蛍光の光路に配置されており、前記 発せられる光の前記蛍光のいくつかの波長を反射し、その他の波長を通過するよ う選択された第２の二色フィルタと、 前記第２の二色フィルタを通過した前記蛍光を取り込むよう配設された第１の検 出器と、 前記第２の二色フィルタから反射された前記蛍光を取り込むよう配設された第２ の検出器と を具備した多色共焦点顕微鏡システム。
13. １３．特定の周波数の光によって励起された時に蛍光を発する複数の着色剤によ って着色された検体を観察する方法であって、 単一のレーザ光源から、各々が前記着色剤のうちの１つの励起周波数に対応する 多数の励起線、を含んだ多線入射レーザ光を発生する工程と、 前記入射レーザ光を前記検体を保持している前記顕微鏡に導き入れる工程と、 前記顕微鏡から発せられ、各々が前記着色剤のうちの１つ着色剤の励起周波数に 対応する多数の蛍光、を含む光を取り込む工程と、 前記顕微鏡から発せられる光を取り込んで、該光を電気信号に変換する工程と、 前記電気信号を累積し、正確な焦点面に、各々が前記レーザの線の１つに対応す る前記検体の複数の像、を作る工程 とからなる方法。
14. １４．２つ以上の前記着色剤を励起することとなる前記多数の励起線の発生を抑 制する工程を含む、請求項１３の方法。
15. １５．前記入射レーザ光をフィルタ処理し、前起励起線のうち選択された１つの 励起線を選択的に通過させる工程を含む、請求項１３の方法。
16. １６．前記発生される光をフィルタ処理し、前記蛍光のうち選択された蛍光を選 択的に通過させる、請求項１３の方法。