JPH05501500A

JPH05501500A - ＴＧＦ―βの生合成構築物

Info

Publication number: JPH05501500A
Application number: JP3500412A
Authority: JP
Inventors: コーヘン，チャールズ・エム
Original assignee: クリエイティブ・バイオマリキュールズ・インコーポレーテッド
Priority date: 1989-10-18
Filing date: 1990-10-18
Publication date: 1993-03-25
Also published as: WO1991005565A1; EP0496833A1; EP0496833A4; CA2070393A1; AU6870791A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ＴＧＦ−βの生合成構築物＆盟凶背量本発明は、形質転換生長因子−ベータの生合成ペプチド構築物、形質転換生長因子−ベータ様生物活性を有するポリペプチドをコードする合成遺伝子、この合成遺伝子を組換えＤＮＡ技術を用いて製造する方法、およびこの生合成ペプチド構築物を細胞の増殖および生長の調節因子として使用することに関する。

形質転換生長因子−β（ＴＧＦ−β）は、怪我またはストレスに対する細胞または組織の応答を含む活動の多機能ペプチド調節因子である。この因子は間葉起源の細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を刺激する能力を有し、−力士皮細胞、胎児繊維芽細胞、内皮細胞およびＴおよびＢリンパ球の生長（ｇｒｏｗｔｈ）を抑制する能力を有する。さらにＴＧＦ−ベータは他の多くの調節活性を有し、これらの活性は特定の細胞タイプの特殊化された機能に独特の関連を有するようである０例えば、ＴＧＦ−βはマトリックス成分の生産を刺激し、例えばこれらのマトリックス成分に作用する蛋白分解酵素の合成および分泌を抑制し、これにより細胞間マトリックスの合成および分解を調節する（総説として、例えば５ｐｏｒｎら（１９８７）Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、１０５：１０３９−１０４５を参照）、ＴＧＦ−β−タイプの活性は多くの正常なフィブロネクチン−およびコラーゲン−生産繊維芽細胞中で確認されており、並びに種々組織例えば腎臓（ＲｏｂｅｒＬｓら（１９８３）Ｂｉｏｃｈｅｍ、２２：５６９２−５６９８）、胎盤（Ｆｒｏｌｉｋら（１９８３）Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　［、Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、（ＵＳＡ）８０：３６７６−３６８０）、および血小板（Ｃｈｉｌｄｓら（１９８２）Ｐｒｏｃ、ＮａＬｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）７９：５３１２−５３１６　；およびＡｓ５ｏｉａｎら（１９８３）Ｊ、Ｂｉｏ　１．Ｃｈｅｍ、２５８　：　７１５５−７１６０）　、さらに腫瘍細胞（Ｒｏｂｅｒｃｓら（１９８０）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）７７：３４９４−３４９８）中にも確認されている。

ＴＧＦ−βには四つの公知分子構造（コンフィギユレーション）が知られており、おのおの見掛は分子量が約２５，０００ダルトンである。これらの種のうちの三つはβ１およびβ２モノマーサブユニツトのホモダイマーの組み合わせ（ＴＧＦ−βｌ、　ＴＣ，Ｆ−β２）およびヘテロダイマーの組み合わせ（ＴＧＦ−β １．２）によりできζいる。四つ目の種はβ３サブユニツトのホモダイマーである。各サブユニットは約３９０アミノ酸の前駆体からプロセシングを受けて生じたもので、成急サブユニット蛋白質はそのＣ末端の約１１２アミノ酸を含存する。

ｉｌおよびβ２サブユニツトはそれらのＮ末端部分に８いて約７０％のアミノ酸配列ホモロジーを有し、種間に８いて非常に保存的である。ＴＧＦ−β３の推定アミノ酸配列は、β１およびβ２タイプのものと約８０％のホモロジーを有し、相違の多くは保存的置換によるものである。ＴＧＦ−β１は、ヒト直小板８よび胎盤から（ＥＰ　０１２８８４９）、およびウシ腎醗躊１ら（上記Ｒｏｂｅｒｔｓら）最初に単離された。ＴＧＦ−β２は最初ウシの骨から騙された軟骨−誘発因子（ＣＩＦ）として最初同定された（米国特許４．７７４．２２８）、ＴＣ；Ｆ−β１．２はβ１およびβ２Ｍを同時に発現するブタの血小板および他の細胞中に見出された（ＣｈｅｉｆｅＬｚら（１９８８）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６３：１０７８３−１０７８９）、ＴＧＦ−β３はヒトおよびニワトリの双方について確認されている（Ｄｕｋｅら（１９８５）Ｐｒｏｃ、Ｎａｉ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）８５：４７１５−４７１９）。

ＴＧＦ−βは、類似の調節活性を有する構造的に類似な蛋白質群をコードする大きな遺伝子ファミリーに属する（Ｍａｓｓａｇｕｅ　（１９８７）Ｃｅｌｌ　４９：４３７−４３８を参照）、このファミリーには次のものが含まれる：（１）Ｖｇｌ、アフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の発生時の中胚葉形成に関与する蛋白質：（２）胚の背腹のパターン（ｄｏｒｓｏｖｅｎｔｒａｌ　ｐａｔｔｅｒｎ）の発達に関与するＤｒｏｓｏｐｈｉ　ｌａ遺伝子によりコードされるポリペプチドである、デカペンタブレシック・コンプレックス（ｄｅｃａｐｅｎＬａｐｌｅｇｉｃ　ｃｏｍｐｌｅｘ：　ＤＰＰ）；（３）ＯＰｌ、本出願人により見出されたゲノムＤＮＡ配列のエクソンによりコードされる天然の骨形成蛋白質配列の一領域；（４）ウシの骨から単離された軟骨誘導因子（ＣＩＦ）！Ｉ（米国特許４，７７４．２２８）；（５）本出願人により発見された哺乳類の骨形成骨マトリックス蛍白質であるＣＢＭＰ−２ａ、ＣＢＭＰ−２ｂ、およびＣＢＭＰ− ３（ＷＯ８９１０１４５３）；＃よび（６）濾胞形成ホルモンの脳下垂体力・らの分泌を抑制する生殖蛋白質であるβ−インヒビンーａδよびｂｏこれらの蛋白質は全て、再折り畳み（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）の間にダイマー化すると考えられており、したがってモノマーに還元されると不活性であると考えられている。更に、これら蛋白質の多くは共通の前駆体ペプチド部分を含んでいる。

ＴＣＰ−βファミリーの蛋白質の４［部活性の同定およびアミノ酸配列の解明により、組換え法によるこれらの蛋白質の生産に向けての研究が始まった０例えば、巳Ｐ　０２００３４１は、宿主真核細胞中に形質転換されたとき発現できる、天然ＴＧＦ−βおよびその前駆体をコードする核酸配列を開示している。ＥＰ０１５０５７２は、ＴＧＦ−β１およびその類縁体をコードする構造遺伝子の製造およびそれらの遺伝子の微生物中での発現を開示している。しかしながら、ＴＣＦ−βファミリーの多くの蛋白質と相当の配列ホモロジーを有し、そしてＴＧＦ −β様活性を発揮するコンセンサスな蛋白質構築物の設計および発現は、現在まで考えられていなかった。

したがって、本発明の目的はＴＧＦ−ベータの生物学的活性を有するＴＧＦ−β の新規類縁体を提供することにある０本発明の他の目的は、新規で活性なＴＧＦ −β類縁体の効率的製造方法を提供することにある０本発明のさらに別の目的は、新規で非天然のＴＧＦ−β種をコードする遺伝子および組換えＤＮＡ技術を用いて新規で非天然のＴＧＦ−β種を製造する方法を提供することである。さらに別の目的は新規な短縮型のＴＧＦ−βおよびＴＣ，Ｆ−β生物活性を有する蛋白質の構造設計を提供することである。さらに別の目的はＴＧＦ−β類縁体を用いて細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｃｉｏｎ）をＩする方法を提供することである。

と記および他の本発明の目的並びに観点は、明細書、図面、および請求の範囲の記載から明らかにされる。

元型の概要Ｎ末端が短縮さ＆　システィン残基の数が天然の場合より少ない天然ＴＧＦ−β 体が、ｉｌ　ｖｉＬｒｏに８ける哺乳類の上皮細胞に対する増殖抑制作用を誘発する能力を含めてＴＧＦ−β様生物活性を奏することが発見された。関係の無い生物活性を存することが知られているＴＧＦ−βファミリーの他の構造的に類似の蛋白質の短！！類縁体もまた、予期に反してこのＴＧＦ−β様活性を有することも発見された。これらの発見により、新規、非天然蛋白質構築物類をコードするＤＮＡの設計および造成が可能になり、これらの構築物は単独でおよび組み合わせて培養中の哺乳類上皮細胞の増殖を抑制する能力を有する。

したがって、一つの観点において、本発明は、宿主細胞中で岨換えＤＮＡの発現により産生されそしてｉｎ　ｖｉｚｒｏで哺乳類上皮細胞の抗増殖作用を誘発する能力を有する、短縮ＴＧＦ−β類総体を包含する。この蛋白質構築物は、二本のポリペプチド鎖を含み、各類は生物活性ドメインを有し、そして各類は９未満、そして好ましくは６または８のシスティン残基（Ｃｙｓ）を有する。この構築物は非グリコジル化状態であってよいこともさらなる特徴である。

他の観点において、本発明は原核宿主細胞中で組換えＤＮＡの発現により生産され、各々約１１２アミノ酸未満のペプチド鎖の対を含む蛋白質を特徴とする。

各類のアミノ酸配列は、この蛋白構築物がｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて哺乳類の上皮細胞に対して抗−増殖効果を誘発出来る程度に、ＴＧＦ−βの配列と十分に複製的である。好ましくは、ポリペプチド鎖は９未満、そしてより好ましくは６または８のシスティン残基を有し、さらに非グリコジル化状態であってもよい。

システィン残基は、鎖問および領内のジスルフィド結合の形成（折り畳み）に関与し、ジスルフィド結合の正しい形成はＴＧＦ−β様活性を有する活性構築物をもたらす、真核細胞においては、少なくともＴＧＦ−βを発現することが知られている細胞では蛋白質の正しい合成および折り畳みが生じ得る：原核細胞においては、折り畳みはｉｎ　ｖｉＬｒｏで行わねばならず、これは困難な芸当である；何故なら各々９未満好ましくは６または８個のシスティン残基を有する二本のポリペプチド鎖間に存在するジスルフィド結合の組み合わせは多数あるからである０本発明の重要な観点は、本明細書中に記載したタイプの短縮構築物を、翻訳後に修飾してｉｎ　ｖｉＬｒｏで折り畳み（Ｍ化により）、ＴＣＰ−β様活性を生じさせることができるという発見である。

天然にはいくつかの型のＴＧＦ−βモノマー、ｉｌ、β２、およびβ３が知られている。これら天然体の特性および構造の研究により、種々タイプの細胞の増殖を特異的にｉｌｌ？Ｉできる、非天然の（即ち天然では発現されることが知られていないもの）、短縮螢白質構築物のための合理的設計の発展が可能となった。

さらに、ある程度のアミノ酸配列ホモロノーをもつ無関係な蛋白質のいくつかを調べると、それらもＴＧＦ−β様活性を存することが予測に反して見出された。

この知見を基に活性ＴＧＦ−β類縁体の製造を目標として、一連のコンセンサスＤＮＡ配列を設計した。これらの配列は、天然ＴＧＦ−β種からおよびＴＧＦ− βファミリー（ＶｇｌおよびＤＰＰを含む）の蛋白質をコードする文献記載の遺伝子との観察されたホモロノーから得られた部分アミノ酸配列データを基礎にし、あるいは上記遺伝子がコードする推定されもしくは証明された発生機能を有するアミノ酸配列を基礎にしている。生合成したコンセンサス配列のいくつかは原核細胞内で融合蛋白質として発現され、精製さ九開裂されへ再折り畳みされ、哺乳類のｉｎ　ｖｉｔｒｏア７セイ系に適用さ瓜そしてＴＧＦ−β様の抗−増殖活性を有することが証明された。

本発明の好ましい態様において、これらコンセンサス配列によりコードされる蛋白質は、次の一般式のアミノ酸配列を存する：ＣＸＸＸＸＬＹＸＸＦ？ＯＣＤＸｃｗｘθｗｘｘｘｐｘａｙｘｘｘｘαＧＸＣＰＸＸＸＸ％ＸｅＸ）αｅｅｘθｍＬＹＸＸＦＸＸＤＸＧＷｘｅＷＸＸＸＰＸＧＹＸＡＸＸαＧＸ（Ｊ’ＫＸＸＸｅｅＸｅＫ）ＯＣｅｅＸｅＫＸＸ（ここで５アルフアベツトは標準的１文字標記によるアミノ酸残基を示し、Ｘは各々独立して天然に存在するアミノ酸の一つまたはそのｇＫ体を示し、そしてθは各々独立してアミノ酸またはペプチド結合を示す）。

現在好ましい活性ペプチド構築物は、ＴＣＰ−β（ｌ、２δよび３）の三つのモノマーサブユニット、ＤＰＰ、およびＯＰＩに由来するアミノ酸配列からなるものである。これらの蛍白質のアミノｆａ＆７１１は、ＴＧＦ−β１の配列と対比して図１に示されている。上記一般式の配列内での好ましいアミノ酸配列は次のものである：（ここで、一つより多いアミノ酸が縦に示されている各位置においては、それらアミノ酸の任意のものが種々の組合せで存在し得、そして”−″および”−”はペプチド結合を示す）、アミノ酸に付された番号は各配列間の比較を容易にするための目的で選ばれた番号にすぎない。これら一般式の配列は、分子間および／または分子内ノスルフィド結合を形成できる９個未満そして好ましくは６−８個のシスティン残基を有し、そして蛋白質の三次元構造に影響するために必要な他のアミノ酸を含んでいる。類似の構造特徴は、上に列記したアミノ酸配列が既に報告されている公知のＴＣＰ−βファミリーの蛋白質でも見られる。しかしながら、これらのうち、ｉｎ　ｖｉＬｒｏにおいて哺乳類上皮細胞に抗−増殖作用を誘発できることが報告されているのは、ＴＧＦ−β種（１，２，および３）のみである。

特に有用な配列には次のアミノ酸配列を有する類縁体が含まれる：ＴＧＦ−１３１ＴＧＦ−［３２ＴＧＦ−１３３ＣＣＶＲＰＬＹよりＦＲＱＤＬｆｆｌＰＫＧＹＹＡＮＦＣＳＧＰＣｒ’ＹＬＲ５ｌ）ＴＴＨ５ＴＶＬＧＩ。

ＶｇｌＰＰＣＲＲＨ３ＬＹＶＤＦＳＤＶＧＷＤＤＷＩＶＡＰＬＧＹＤＡＹＳ’ＣＨＧＫＣＰＦＰＬＡＤＨＦＮＳＴＮ）ＩＡＶＶ古、二も・°゛まブ＝（工　五　（−うξ墾−号１　（ｌ　ｓ、縁４ム　、釘ツ文、ｒｉ’　： τＧＦ−１３１ＴＧＦ−１３２ＴＧＦ−ｆ３３ｇ１ＰＰ上記配列の各々に付与された名称は、そのＴＣＰ−β類縁体と出願人が知る限り最も高いホモロジーを示すアミノ酸配列をコードする天然源のＤＮＡ配列に相当する。

本発明はさらに、上記構築物をコードするＤＮＡ配列およびそれらのＤＮＡ配列を発現するように遺伝子繰作された原核宿主細胞を包含する０本発明の好ましい態様においては、原核宿主細胞（例えば、Ｅ、ｃｏｌｉ）を、ＴＧＦ−β−コードＤＮＡ配列を含むベクターに感染（トランスフェクト）させる、形質転換細胞を培養して蛋白質を発現させ、これを精製して、ｉｎ　ｖｉｃｒｏでの酸化処理により活性化する。この処理を受けた蛋白質は培養哺乳類上皮細胞にたいする抗 −増殖作用を誘発する能力をもつ。

本明細書中に開示された生合成構築物は、増殖および生長のような細胞活動を調節するために使用可能であろう、この点に関して、セ記構築物は広範な臨床応用の可能性があり、例えば、種々の腫瘍細胞ラインの増殖の抑制、または免疫抑制愚者（例えばエイズ）のＴおよびＢリンパ球の増殖率向上が可能である。上記構築物はまた、種々のタイプの真核細胞の生長を変調させるためにも使用可能であろう。

１躯苅Ｉ狼裁朋本発明の上記のおよび他の目的、種々の態様ならびに発明自体は、以下の説明を図面と一緒に参照すれば一層理′Ｍされるであろう。

図１はＴＣ，Ｆ−βファミリーの種々の蛋白質のアミノ酸配列をＴＧＦ−β１と比較して示す。

図２八８よび２Ｂは、修飾し「ρ−しＥリーダー配列、プロティンＡの二つのＦＢドメイン、Ａｓｐ−Ｐｒｏ開裂部位のＤＮＡ配列および対応アミノ酸配列であり、そして（Ａ）には６個のＣｙｓを持つＴＧＦ−β１配列、および（Ｂ）には８個のＣｙｓを持つＴＧＦ−β１配列が示されている。

挽明短縮ＴＧＦ−β類縁体をコードするヌクレオチド配列は、文献に記載されている配列データ、既知アミノ酸配列から推定したコドン、およびＴＧＦ−βファミリーの既知遺伝子との部分的ホモロノーの観察に基づいて設計した。これらの配列はＴＧＦ−βファミリーの特定の調節遺伝子に存在する配列との比較により修正した。

Ｎ末端ドメインが大部分保存されまたは殆ど保存されておらず、そして７つのシスティン（Ｃｙｓ）残基のパターンが高度に保存されている特徴的Ｃ末端ドメインを有する、ＴＧＦ−βファミリーの天然存在蛋白質類を前駆体とされる。これらのＣｙｓ残基に加えて、ファミリーのメンバー内において他の特定のアミノ酸が非常に近似の相対位１に見出さ娠これは次のようである：（ここで、Ｘは各々独立して天然アミノ酸を示し、θまたはθθはアミノ酸またはペプチド結合を示す）。

成ＰＴＧＦ−βおよび他の関連蛋白質のＮ末端配列は、可変数のＣｙｓ残基を有し、これらは各々の間であるいは他のアミノ酸鎖の残基との間で架橋しているが、しかし、Ｃ末端ドメインのＣｙｓ残基とは架橋していないようである。これらの蛋白質の前駆体から成塾体への成簾ヒは、前駆体および成熟蛋白質の間のトリプシン様開裂により生し、そして他の類似の開裂部位が前駆体中に存在するから、おそらく前駆体内でのトップノン様開裂によっても生しる。

ＴＧＦ−βファミリー（Ｖｇｌ、ＤＰＰ、ＯＰＩ、ＣＢＭＰ−２ａ、ＣＢＭＰ− ２ｂ、およびＣＢＭＰ−３を含む）のＶｇｌ関連サブグループの全員は、保存的Ｃ末端ドメイン内の第−Ｃｙｓに続く二つの塩基性残基（即ち、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ）の特徴を共存する。この保存的な二塩基残基は、もう一つの二次的成急部位である可能性がある。トリプシンまたは関連プロテアーゼによる開裂は、Ｃｙｓ残基を６個のみ含むＣ末端ドメインを遊離する。ＴＧＦ−βの前駆体領域は、Ｃ末端ドメインへ架橋していない５個までのＣｙｓ残基を含むから、７個のＣｙｓ残基の最初の残基もＣ末端下メインに架橋していないと思われる。したがって、Ｃｉ端ドメインが正しく折り畳まれるためには６個のＣｙｓ残基で十分であるらしい。

この開示に照らして、Ｐ＆ｉｌ、た遺伝子工学技術者は多くの適当なアミノ酸配列をコードする遺伝子を設計および合成できる。そのような遺伝子は種々のタイプの真核細胞内で発現できるが、しかしながら、効率の上から、好ましくは原核宿主細胞内で製造さねへこれにより天然ＴＧＦ−βの生物活性（培養哺乳類上皮細胞に対する抗増殖作用を誘発する能力を含む）を模倣した大量の活性合成蛍白質（例えば短縮類縁体、ミニ−ティン、融韻白質、および他の構築物）を提供できる。

より詳細には、上記基準および理論にしたがって設計されるＤＮＡ配列は、ＤＮＡ合成装置内で製造されたオリゴヌクレオチドの集成を含む公知の技術を使用して構築された。そのような配列は種々の原核宿主細胞内で十分に確立された組換えＤＮＡ技術を用いて発現でき、そして発現された蛋白質は前駆体から開裂し、酸化し、そしてｉｌ　ｖｉｔｒｏで再折り畳んで生物活性とすることができる、この方法は（出願人が知る限り）天然に存在しない、ＴＧＦ−β様活性（！Ｉｌｌち培養哺乳類の上皮細胞に対する抗−増殖効果を誘発する能力）を有する多数の新規蛋白質構築物を製造するために成功裡に用いられた。

そのような生合成蛋白質の設計および製造、ならびに性質、用途に関する他の重要な観点、並びに特許請求の範囲している主題の実現法および用途は、以下に記載する、本発明の種々の観点の実施について現在知られている最良の方法である、非限定的実施例の記載により、さらに理解されるであろう。

実施例ｌ、コンセンサス６ｉＪ１１の設計ＴＧＦ−β２、”ＩＣ；Ｆ−β３、Ｖｇｌ、およびＤＰＰ−Ｃ（７）既に報告さレテイるアミノ酸配列を用いて、どのアミノ酸西ツリがＴＧＦ−βｌ配列と強いホモロジーを有するか調べた０図１はこれらの蛍白質のアミノ酸配列をＴＣＰ− βｌの配列と比較したものであり（１は一致部分を示す）、そして表１はホモロジーの程度をまとめたものである。

表１比較　−Ω数　ホモロジーの％ＴＧＦ−β２／ＴＧＦ−β１　７８／１１５　６７．８ＴＧＦ−β３／ＴＧＦ− β１　８５／１１５　７３．９ＤＰＰ／ＴＧＦ−β１　３４／１１５　２９．６Ｍｇｌ／ＴＧＦ−β１　３５／１１５　２９．６ＴＧＦ−β類縁体について適当なコンセンサスアミノ酸配列を調べて、この配列をコードするヌクレオチド配列の決定を可能ならしめるに際して、次の点を考慮した：（１）天然、ＩｊＴＧＦ −β１．　２．ｉｊよび３の公知アミノ酸配列には最高のランキングを与えｋ　；　（２）配列中のアミノ酸が三つの蛍白質の全てで一致するときは、合成遺伝子配列中でこれを採用した；（３）ＤＰＰ＃よびＶｇｌの一致アミノ酸配列は使用した；（４）ＶｇｌまたはＤＰＰが不一致であるが、何れか一方がＴＧＦ−β １．２または３と一敗しているときはこの一致アミノ酸を選択した：および（９全ての配列が不一致のときは、アミノ酸配列として二次構造が保持されることを条件としてアラニンを選択した。

上記基準を用いて、好ましい配列は次のものである：ＣＣＶＲＱＬＹ　ＩＤ　ＦＫＲＤＬＧＷＫＷＶ’ＨＥＰＫＧＹＡＡＮＦＣＡＧＡＣＰＹＬＷＳＡＤＴＱＨＳ　ＲＶＬＡＬＹＮＴＡＮＰＥＡＳＡＡＰＣＣＶＰＱＤＬＥＰＬＴ！ＬＹＹＶＧＲＴＰＫＩ７ＥＱＬＳＮＭＶ’ＶＫＳＣＫＣ３゜加えて、第一コンセンサス配列はジスルフィド架橋の８つおよび関連蛋白質の間の見掛は構造ホモロジーを保存するように設計し、そして第二のより高度に短縮したコンセンサス配列は６個のジスルフィド結合を保存するように設計した。

その配列は次のとおりである：２、遺伝子の調製および発現上記基準を用いて設計した合成遺伝子は、化学的に合成したオリゴヌクレオチドの集成により製造する。１５−１５−１Ｏ０のオリゴヌクレオチドを、バイオサーチ（Ｂｒｏｓｅａｒｃｈ）　ＤＮＡ　モデル　８６００　シンセサイザーを用いて合成し、トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡバッファー（ＴＢＥ）中でポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡ（、Ｅ）により精製する。このＤＮＡを次いでゲルから電気溶出する。オーバーラツプするオリゴマーをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、次にライゲートしてより大きいブロックとし、これもまたＰＡＧＥで精製できる。その代わりに、天然遺伝子配列およびｃＤＮＡを発現に用いることも可能である０図２Ａおよび２Ｂに、融合配列の後半部分として、生じた二つの遺伝子を示す０図２Ａに示す配列は２Ｂの短縮形であり；Ｎ末端の５つのアミノ酸が削除されている。

図２Ａに示される合成遺伝子をＥ、ｃｏｌｉ宿主内で発現可能ならしめるには、遺伝子をカセノトミエーテーンヲン法で修飾する。リーダーからのＴＧＦ−β蛋白質の遊離のため、Ｎ末端をＣｌａｌ部位まで、リーダーペプチドに結合させるためのＢａｍ旧部位を前に存するヒンジ領域で置換する６次いでこの修飾遺伝子をＢａｍ旧部位でＦＢダイマーに結合させる。完成した融合遺伝子を図２Ａに示す。

この融合遺伝子を次いで、ＥｃｏＲＩからＰｓＬ［のフラグメントとして発現ベクターに挿入するが、この発現ベクターはρＢＲ３２２を基本とし、合成トリプトファン（ｃｒｐ）プロモーター／オペレーターおよび修飾し「ρ−ＬＥ　（ＭＬＥ）リーダーを含む（この修飾ＭＬＥリーダーは、１（ｕｔｓｏｎらがＰｒｏｃ、Ｎａｃｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）（１９８８）８５：５８７９−５８８３に記載したものと類似しているが、但しＭＬＥリーダーのヒンジに唯一つの単−ＥｃｏＲ１部位を有する）、このベクターをＥｃｏＲＩおよびＰｓｔｌの制限部位で開環し、その間にＦＢ−ＦＢ／ＴＧＦ−β遺伝子フラグメントを挿入する（ここで、ＦＢはスタフィロコッカスのプロティンＡのフラグメントＢである）、得られる発現ベクターはＦＢをコードするフラグメントにＴＧＦ−β遺伝子を含む。

３、活性類縁体の製造蛋白ｉｉｒ構築物は、農小培地（Ｍ９）中で生育したＥ、ｃｏｌｉ宿主ストレインＪＭＩＯＩ（例示）中で、ｔｒｐの欠乏後、およびインドアクリリック・アシッド（ＩＡＡ）による誘導により発現される。細胞を溶解し封入体を不連続遠心分層により集める。融合蛋白質を封入体から尿素またはグアニジンによる可溶化により精製する０次にＴＧＦ−β蛋白質構築物からＦＢ配列を該融合蛋白質のヒンジ領域で化学的に開裂する。ヒンジ領域の配列はＡｓｐ−Ｐ　ｒ　ｏ−Ａｓ　ｎ−０１ｙであり、これは希酸によりＡｓｐ−Ｐｒｏ部位で、またはヒドロキシラミンによりＡｓｎ−Ｇｌｙ部位で開裂可能である。生じる開裂生成物を５ｅｐｈａｃｒｙｌ−２００ＨＲカラムに通過させ、これにより未開裂融合生成物の大部分をＴＧＦ−β類縁体から分離する。

蛋白質の再折り畳みは、５０１トリス塩酸、ｐＨ８，０，３Ｍグアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）、１０ｍ−ジチオスレイト−ＪしくＤＴＴ）、ｉｃ；よびｌ　ｌ（ｂ＋−の酸化型グルタチオンの条件下で行う。

４、ＴＧＦ−β活性のアッセイこのアッセイは、ミンクの肺の上皮細胞株、ＡＴＣＣｎｏ、ＣＣＬ　６４内でＴＧＦ−βがＤＮＡ合成を阻害する能力に基づ＜、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ　）　、２００１４ｆｆ／ｍｌペニシリン、および２００μｇ／ｍｉストレプトマイシンを添加したイーグルの最小基本培地（ＥＭＥＭ）中に維持されたＣＣＬ− ６４のコンフルエント培養細胞を、４８ウエルの細胞培養プレートにウェル当たり２００．０００個の細胞密度でまく、このカルチャーがコンフルエントに達したとき、培地を１％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＥＭＥＭの０、　５＋＋１に交換する。カルチャーを３７°Ｃで２４時間インキュベートする９次に０．５％ＦＢＳを含有するＥＭＥＭ中のＴＧＦ−βの試験サンプルをウェルに添加し、そして細胞をさらに１８時間インキエペートする。インキュベーションの後、１０μｌ中の１．０ＡＩＣｉのｚＨ−チミジンを各ウェルに添加する。細胞を３７℃で４時間インキュベートする０次に培地を除去し、細胞を水冷リン酸緩衝液化塩類液で一度洗浄する。１０％ＴＣＡを０．５＋＋＋１各ウエルに添加し、室温で１５分間インキュベートしてＤＮＡを沈澱させる０次に細胞を水冷蒸留水で３回洗浄し、０．４ＭのＮａＯＨの０．５■ｌで溶解する。各ウェルの溶解物をシンチレーシシンバイアルに移し、シンチレーシ町ンカウンター（Ｓｍｉ　Ｌ　ｈ−Ｋ　ｌ　ｉｎｅ　Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いて放射活性を記録する。

各試験サンプルを三速でアッセイする。各アッセイにはＴＧＦ−βコントロールを含める。各サンプルの抑制活性は５０％有効用量（ＥＤ５０）で表さ瓢これは１Ｈ−チミジン取込みの最大値を５０％減少させるために必要な物質のｎｇ／ｓｌ量として定義される。

本発明は発明の精神またＬｕ１Ａ頃の特徴を離れることなく、他の特定の態様で具体化可能である。したがって、記載した態様はあらゆる点において例示的なものであり、限定的ではない０本発明の範囲は上記の記載よりは請求の範囲の記載により定まり、したがって請求の範囲に記載した文言内およびその均等範囲内の全ての変更は本発明の範囲内である。

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Claims

【特許請求の範囲】

１．インビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）において哺乳類上皮細胞に抗−増殖効果を誘発する能力を有し、２本のポリペプチド鎖からなり、各ポリペプチド鎖は９個より少ないシステイン残基を含む活性ドメインを含んでなる、宿主細胞内での組換えＤＮＡの発現により生産された短縮された形質転換生長因子−ベータ構築物。
２．各々の活性ドメインが８個のシステイン残基を含む、請求項１記載の構築物。
３．原核宿主細胞内で組換えＤＮＡの発現により生産され、一対のポリペプチド鎖からなり、各鎖は約１１２個より少ないアミノ酸を形質転換生長因子−べータの配列と十分に複製的な配列中に含み、ｉｎ　ｖｉｃｒｏにおいて哺乳類上皮細胞に抗−増殖効果を誘発する能力を有する蛋白質。
４．各々のポリペプチド鎖が７個より少ないシステイン残基を有する、請求項３記載の蛋白質。
５．各々のポリペプチド鎖が６個のシステイン残基を有する、請求項４記載の蛋白質。
６．グリコシル化されていないことを特徴とする、請求項１または３記載の蛋白質。
７．下記アミノ酸配列：【配列があります】（式中、Ｘは各々独立して天然に存在するアミノ酸の一つもしくはその誘導体を表し、そしてθは各々独立してアミノ酸またはペプチド結合を表す）を有する、請求項１または３記載の蛋白質。
８．下記アミノ酸配列：【配列があります】（式中、Ｘは各々独立して天然に存在するアミノ酸の一つもしくはその誘導体を表し、そしてθは各々独立してアミノ酸またはペプチド結合を表す）を有する、請求項１または３記載の蛋白質。
９．下記アミノ酸配列：【配列があります】（式中、一つ以上のアミノ酸が示されている各位置において、示されている任意のアミノ酸がその位置に存在してよく、そして“−”および“−−”はペプチド結合を表す）を有する、請求項７記載の蛋白質。
１０．下記アミノ酸配列：【配列があります】を有する、請求項９記載の蛋白質。
１１．下記アミノ酸配列：【配列があります】を有する、請求項９記載の蛋白質。
１２．下記アミノ酸配列：【配列があります】を有する、請求項９記載の蛋白質。
１３．下記アミノ酸配列：【配列があります】を有する、請求項９記載の蛋白質。
１４．下記アミノ酸配列：【配列があります】を有する、請求項９記載の蛋白質。
１５．下記アミノ酸配列：【配列があります】を有する、請求項９記載の蛋白質。
１６．下記アミノ酸配列：【配列があります】（式中、一つ以上のアミノ酸が示されている各位置において、示されている任意のアミノ酸がその位置に存在してよく、そして“−”および“−−”はペプチド結合を表す）を有する、請求項８記載の蛋白質。
１７．下記アミノ酸配列：【配列があります】を有する、請求項１６記載の蛋白質。
１８．下記アミノ酸配列：【配列があります】を有する、請求項１６記載の蛋白質。
１９．下記アミノ酸配列：【配列があります】を有する、請求項１６記載の蛋白質。
２０．下記アミノ酸配列：【配列があります】を有する、請求項１６記載の蛋白質。
２１．下記アミノ酸配列：【配列があります】を有する、請求項１６記載の蛋白質。
２２．下記アミノ酸配列：【配列があります】を有する、請求項１６記載の蛋白質。
２３．請求項１または３記載の構築物の一対の鎖の一つのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列。
２４．請求項１または３記載の構築物の一対の鎖の一つのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を発現するように遺伝子操作された原核細胞。
２５．Ｅ．ｃｏｌｉである請求項２４記載の原核細胞。
２６．下記の工程よりなる、形質転換生長因子−ベータ活性を有する蛋白質構築物の製造方法：（ａ）請求項２３に記載したＤＮＡ配列を含むベクターで原核宿主細胞を形質転換し；（ｂ）該形質転換宿主細胞を培養して上記蛋白質構築物を発現させ；（ｃ）該蛋白質構築物を精製し；そして（ｄ）該蛋白質構築物をｉｎ　ｖｉｔｒｏで酸化してジスルフィドでつながった二本鎖の形質転換生長因子−ベータ類縁体にすることにより活性化し、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて哺乳類の上皮細胞に対して抗−増殖効果を有する活性化蛋白質構築物とする。
２７．活性化蛋白質がダイマーである請求項２６記載の方法。
２８．活性化蛋白質が９個より少ないシステイン残基を含む請求項２６記載の方法。
２９．活性化蛋白質が６ないし８個のシステイン残基を含む請求項２８記載の方法。
３０．活性化蛋白質が８個のシステイン残基を含む請求項２８記載の方法。
３１．活性化蛋白質が６個のシステイン残基を含む請求項２８記載の方法。
３２．活性化蛋白質がグリコシル化されていない請求項２８記載の方法。